CN1920049A - 小分子生物活性肽及其制法、组合物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小分子生物活性肽,所述的生物活性肽来源于含大豆蛋白、乳清蛋白、鸡蛋和牛奶的混合物,所述小分子生物活性肽中90%以上活性肽的分子量小于5KDa。本发明还公开了所述的小分子生物活性肽的制备方法。本发明还公开了所述生物活性肽的组合物,含有所述的小分子生物活性肽,以及适当的药学上或食品上可接受的载体。本发明的小分子生物活性肽能够提高免疫力、促进机体组织创伤愈合和增强体能。
Description
技术领域
本发明涉及生物活性肽领域,更具体的,本发明涉及一种小分子生物活性肽及其制法、组合物和应用。
背景技术
肽是由两个以上的氨基酸以肽键相连的化合物。生物活性肽是指能够调节生物机体的生命活动或具有某些生理活性作用的一类肽的总称。生物活性肽对人的机体生理作用可以表现为以下几个方面:①调节激素的分泌;②调节免疫能力;③抗菌;④抗癌;⑤呈味;⑥结合矿物质和促进矿物质的吸收;⑦抗氧化;⑧抗高血压。由于小分子活性肽具有上述生理功能,因此,其在医学、食品及动物饲料等领域越来越受到广泛的重视。
由于肽是涉及生物体内多种细胞功能的生物活性物质。生物体内已经发现并定性了几百种多肽,它们是机体完成各种复杂的生理活动所必不可少的参与者。在自然界所有细胞都能合成多肽物质,其细胞功能活动也受多肽的调节控制。例如,物质代谢、激素分泌、神经、细胞生长及繁殖等所有生命活动的领域,其主要作用机制是调节体内各个系统器官及细胞的各类生命活动,调节激活体内的有关酶类,保障代谢途径的畅通,或通过控制DNA的转录或通过控制蛋白质的翻译而影响特殊功能的蛋白质合成,最终产生特定的生理效应或发挥其药理作用。
生物活性肽种类繁多,来源广泛。主要有机体内源性生物活性肽和天然外源性生物活性肽以及化学合成的外源性生物活性肽三大类。
天然外源性生物活性肽主要是由食物中酶解产生。目前研究应用的天然外源性生物活性肽主要有乳品肽、大豆肽、小麦肽、玉米肽、动物性胶原肽、蛋清肽、畜血肽、水产肽及其他来源的肽。他们的共同的特点都是由生物酶降解大分子蛋白质所产生的小分子多肽。来源不同、处理方式不同、分子量大小、结构不同的多肽其各自生理活性功能均有较大的差异。
除了天然的外源性生物活性肽外,人们目前还通过化学合成方式合成了一些外源性生物活性肽,例如,生长抑制素类物质,澳曲肽和兰瑞肽分别用于神经内分泌病和胃肠功能失调的诊断和治疗,伐普肽用于治疗囊体瘤、胃泌素瘤和某些腺瘤。胸腺素32肽、28肽、5肽用于免疫调节。尤其近年来国内外已经发现和合成了许多用于临床诊断、治疗、预防各类严重危害人类健康的各种疾病的多肽。
目前国内外制备生物活性肽的方法主要有以下方法:
第一、从动植物组织器官中提取,由于原料来源有限和提取难度大,产品成本较高,只局限于生产某些有特殊疗效的肽类药物。
第二、通过化学方法(液相法或固相法)合成,可以按人们的意愿任意合成活性肽,但这种方法存在成本高、副反应物多等问题,严重制约着其发展,目前化学合成法只限于某些肽类药物和某些生物活性肽理论方面的研究。
第三、水解法生产活性肽方法。主要有碱水解法、酸水解法及酶水解法。碱水解法由于产物有异味,食品工业中通常不采用;酸水解法能使蛋白质变性生成有毒物质,也很少采用;酶水解法是选择合适的蛋白酶水解各种蛋白质来获得活性肽。
综上所述,现有的生物活性肽原料主要采用单一的乳源蛋白、大豆蛋白或蛋清蛋白等,所形成多肽结构相对比较单一,功能也相对较为简单。因此本领域迫切需要开发具有多种功能的生物活性肽。
发明内容
本发明的目的就是提供一种具有多种功能的生物活性肽,尤其是提供具有提高免疫力、促进机体组织创伤愈合和增强体能的功能的生物活性肽。
本发明的目的就是提供所述生物活性肽的制法和用途。
在本发明的第一方面,提供了一种小分子生物活性肽,所述的生物活性肽来源于含大豆蛋白、乳清蛋白、鸡蛋和牛奶的混合物,所述小分子生物活性肽中90%以上活性肽的分子量小于5KDa。所述的小分子生物活性肽的平均分子量为0.1-5KDa,较佳地为0.2-4KDa,更佳地为0.3-3KDa。并且所述的生物活性肽具有提高免疫力、促进机体组织创伤愈合和增强体能的活性,其中所述的混合物含有以下成分:
大豆蛋白:40-70重量份;
乳清蛋白:5-30重量份;
鸡蛋: 5-20重量份;
牛奶: 10-30重量份。
在本发明的一个优选例中,所述的混合物含有以下成分:
大豆蛋白:50-65重量份;
乳清蛋白:20-30重量份;
鸡蛋: 10-20重量份;
牛奶: 15-25重量份。
在本发明的一个优选例中,分子量为0.1-3kDa的小分子生物活性肽占全部小分子生物活性肽的重量百分比为40-90%。
在本发明的一个优选例中,50%以上的活性肽集中在0.1~1.5KDa(Mass/charge)范围之内。
在本发明的一个优选例中,所述的小分子生物活性肽是用以下方法制备的:
(a)在40-90℃,用蛋白酶对混合物酶解3-8小时,酶解的pH值为6.0-9.0,其中,所述的混合物含有以下成分:
大豆蛋白:40-70重量份;
乳清蛋白:5-30重量份;
鸡蛋: 5-20重量份;
牛奶: 10-30重量份;
所述的蛋白酶的用量为混合物重量的0.1-3%,并且所述的蛋白酶选自下组:中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、或其组合;
(b)分离平均分子量为0.1-5KDa的肽,获得小分子生物活性肽。
在一个进一步的优选例中,所述的酶为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的组合。
在本发明的第二方面,提供了所述的小分子生物活性肽的制备方法,其包含以下步骤:
(a)在40-90℃,用蛋白酶对混合物酶解3-8小时,酶解的pH值为6.0-9.0,其中,所述的混合物含有以下成分:
大豆蛋白:40-70重量份;
乳清蛋白:5-30重量份;
鸡蛋: 5-20重量份;
牛奶: 10-30重量份;
所述的蛋白酶的用量为混合物重量的0.1-3%,并且所述的蛋白酶选自下组:中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、或其组合;
(b)分离平均分子量为0.1-5KDa的肽,获得小分子生物活性肽。
在本发明的一个优选例中,所述的蛋白酶为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶、胰蛋白酶的组合。
在本发明的第三方面,提供了一种组合物,含有0.001-99.99wt%(较佳地0.01-90wt%,更佳地0.1-80wt%)所述的小分子生物活性肽,以及药学上或食品上可接受的载体。
在本发明的第四方面,提供了一种所述的生物活性肽在制备提高机体免疫功能、促进机体组织创伤愈合、或增强体能的制品方面的用途。
进一步的,所述的制品可以是药物组合物、饮食补充剂、保健品、或食品组合物。
进一步的,所述的制品可以是片剂、颗粒剂、悬浮剂、胶囊、口服液、或糖浆。在本发明一个较佳的实施方式中,所述的制品是胶囊。
本发明的小分子生物活性肽由于含有多种小分子肽,因此具有多种多样的功效。在提高机体免疫功能、促进机体组织创伤愈合(包括皮肤溃疡、皮肤割伤、胃溃疡、烫伤等)、抗疲劳、促消化等方面具有显著的效果。
附图说明
图1不同蛋白原料的配比的水解曲线,其中,纵坐标表示水解率(DH),横坐标表示水解时间。
图2原料酶解前后凝胶电泳结果对比,其中,泳道1为样品1酶解前的电泳状况,泳道2为样品1酶解后的电泳状况,泳道3为样品2酶解前的电泳状况,泳道4为样品2酶解后的电泳状况,泳道5为蛋白标记。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,发现将乳清蛋白,大豆蛋白,鸡蛋和牛奶作为混合蛋白原料,用适当的蛋白酶水解成5KDa以下的具有生物活性的小分子肽,可明显提高免疫力、促进机体组织创伤愈合和增强体能,基于该发现,完成了本发明。其中,采用的蛋白酶较佳的为胰蛋白酶,木瓜蛋白酶,中性蛋白酶及凝乳蛋白酶。
本发明中,术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此,术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明中,“药学上或食品上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。
本发明中,“药学上或食品上可接受的载体”是用于将小分子生物活性肽传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。
为了得到具有多种生物活性的多肽,最好的方法是选择多种原料,并根据原料的特点性质选择适宜的复合蛋白酶。本发明人通过大量的实验,确定了以乳清蛋白,大豆蛋白,鸡蛋,牛奶作为混合蛋白原料,并确定了其各自的含量比例。根据原料性质,本发明人选择了胰蛋白酶,木瓜蛋白酶,中性蛋白酶及凝乳蛋白酶作为水解酶,并通过正交实验确定各种酶的含量比例,及复合酶作用的最佳工艺条件。本发明利用多种不同的食物源蛋白质,通过不同生物酶的工艺处理,使酶分解产物中的多肽组分、分子量大小分布、多肽的功能更趋于合理。
自然界中存在的蛋白质种类很多,不同蛋白质原料水解产生的活性肽由于氨基酸组成、结构有差异,其功能也有很大差异。现已发现的各种原料中活性肽的功能如表1所示。
表1各种原料所具有的某些功能
原料种类 | 功能 |
酪蛋白乳清蛋白乳铁蛋白荞麦蛋白质丝胶蛋白胶原蛋白水产品大豆畜产类玉米小麦无花果鸡蛋 | 促消化吸收,类吗啡活性,降血压,免疫调节,促进钙吸收,抑制血小板凝集,抗血栓,抗菌,促有益微生物生长发育,抑制肿瘤促消化吸收,促双歧杆菌增殖,抗病原菌感染抗菌降胆固醇抗氧化,抑制酪氨酸酶(即抑制黑色素合成)抑制皮肤老化及各种损伤,促胶原合成,减轻并治疗关节炎,提高骨质强度,抗溃疡,降血压,低过敏降血压,降胆固醇,促钙、铁吸收促消化吸收,降胆固醇,降血压,增强免疫,抗肥胖,降血糖,抗氧化,抗疲劳,低过敏,促进微生物发育促消化,抗疲劳,促铁吸收,改善关节炎,脂质代谢改善,抗氧化降血压.防治肝病、肾病,抗疲劳,降胆固醇,抑制肿瘤细胞增殖具吗啡活性,降血压降血压促消化吸收,抗氧化,低过敏 |
在本发明中,采用大豆蛋白、乳清蛋白、鸡蛋、牛奶作为底物原料。其中,从乳清蛋白原料获得的活性肽功能为促消化吸收,促双歧杆菌增殖,抗病原菌感染;从大豆蛋白原料获得的活性肽功能为促消化吸收,降胆固醇,降血压,增强免疫,抗肥胖,降血糖,抗氧化,抗疲劳,低过敏,促进微生物发育;从鸡蛋蛋白原料中获得的活性肽功能主要为促消化吸收,抗氧化,低过敏等;从牛奶蛋白原料中获得的活性肽功能为促消化,抗疲劳,促铁吸收,改善关节炎,脂质代谢改善,抗氧化。不同来源的蛋白原料经水解获得的多肽的功能是多样化的,从营养学角度来看,机体对合适比例的动、植物源复合蛋白的吸收及利用,也是优于单一蛋白来源的。
蛋白酶的作用是水解蛋白质中的肽键,将大分子长链蛋白质变成长短不一的肽段和氨基酸。不同的蛋白酶不仅对肽链两端的氨基酸有特异性的要求,而且组成蛋白质的氨基酸还必须是L型的。由于不同蛋白酶酶解位点不同,因此,同样的蛋白质在不同酶作用下可产生不同的多肽片段。
蛋白酶按其来源有植物蛋白酶、动物蛋白酶和微生物蛋白酶,这些酶活性部位和化学性质各不相同,能在一定的PH、温度下内切或端切蛋白质形成多肽链,常用的蛋白酶及其来源,作用特异性如表2所示。
表2常用蛋白酶及其特性表
种类 | 来源 | 最适pH | T(℃) | 特异性 |
胃蛋白酶胰蛋白酶凝乳酶木瓜蛋白酶碱性蛋白酶中性蛋白酶酸性蛋白酶链霉蛋白酶 | 猪或其他动物的胃动物胰胃、内寄生毛霉属木瓜地衣芽孢杆菌枯草芽孢杆菌黑曲霉链霉菌 | 1.8-2.07.0-9.03.2-4.55.0-7.010.0-11.07.0-7.52.5-4.07.0-9.0 | 40-655535-4560-7540-5045-554035-60 | 作用于蛋白水解物及多肽,特别是邻近芳香族氢基酸或二羟基L-氨基酸的肽链专一性地与Lys或Arg残基相结合水解多肽、酰胺及脂,特别是连接L型芳香族氨基酸羧基侧的键专一性较宽,水解多肽、酰胺及脂中连接碱性氡基酸Leu、Gly的链主要断裂疏水氨基酸的C端广谱内切肽成小肽和氨基酸广谱 |
不同的蛋白酶对底物的水解作用位点不同,其产生的多肽结构和功能有较大的差异。在本发明中,可使用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶、胰蛋白酶或其组合作为水解酶。其中,凝乳蛋白酶能够水解蛋白、酰胺及脂,特别是连接L-型芳香族氨基酸羟基的键;木瓜蛋白酶能够水解蛋白、酰胺及脂中连接碱性氨基酸Leu、Gly的链;中性蛋白酶几乎没有生成氨基酸的能力,其作用为内肽酶分解蛋白质生成多肽的水溶性蛋白质及生产极微含量的氨基酸;胰蛋白酶则专一性水解Lys或Arg残基,其较多用于动物源蛋白质原料水解。
可将本发明的酶解获得的小分子生物活性肽与适当的载体一起,制备成组合物的形式。本发明的小分子生物活性肽的组合物可以以多种剂型存在。小分子生物活性肽一般与药学上或食品上可接受的载体混合。载体可以是固态的或液态的,一般根据所用的给予方式而选择类型。小分子生物活性肽可以以片剂或胶囊形式(作为附聚的粉末),或者以液体形式一起给予。固态载体的例子包括(但并不限于):乳糖、蔗糖、明胶和琼脂。胶囊或片剂可以容易地制备,并且便于吞咽或咀嚼;其他的固体形式包括颗粒。片剂可含有适当的粘合剂、润滑剂、稀释剂、崩解剂、着色剂、调味剂等。液体剂型的例子包括:在水、药学上可接受的脂肪或油、醇或其他有机溶剂(包括酯)中的溶液或悬浮液、乳剂、糖浆、酏剂、用非泡腾颗粒再生的溶液和/或悬浮液、以及用泡腾颗粒再生的泡腾制剂。这样的液体剂型可含有,例如,适当的溶剂、防腐剂、乳化剂、悬浮剂、稀释剂、甜味剂、增稠剂和助溶剂。口服剂型可含调味剂和着色剂。肠胃外和静脉内给予的剂型还可含有矿物质和其他物质,以便使它们与注射或所选的释放系统类型相配伍。
在本发明的一个实施方式中,将小分子生物活性肽制备成胶囊的形式,便于服用和存放。
在本发明中,作为活性成分的小分子生物活性肽可用任何合适的剂量,取决于动物或人的体重、身体状况等因素。一般地,小分子生物活性肽合适的剂量是约2-500mg/kg体重,较佳地5-100mg/kg体重。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则所有的百分比为重量百分比,份数为重量份数。
实施例
实施例中,采用的主要原料如下:
乳清蛋白 深圳市标青健美用品有限公司(蛋白含量为80%以上);
大豆蛋白 上海深远食品(集团)有限公司(蛋白含量为80%以上);
新鲜鸡蛋 市售无公害鸡蛋(卫生标准:GB 2748-1981);
鲜牛奶 符合GB19301-2003标准。
采用的蛋白酶如下:
木瓜蛋白酶 广西南宁庞博生物工程有限公司(100万u/g);
中性蛋白酶 广西南宁庞博生物工程有限公司(20万u/g);
胰蛋白酶 无锡酶制剂厂生产(2200u/g);
凝乳蛋白酶 广西南宁庞博生物工程有限公司。
实施例1小分子生物活性肽的制备
1、原料配比的确定
以底物蛋白水解度DH为指标,木瓜蛋白酶和中性蛋白酶各50%复合酶,加酶量为1%,分别在PH7.0,温度55℃下酶解不同比例原料,检测底物的水解度,确定最佳原料配比。
在木瓜蛋白酶∶中性蛋白酶=50%∶50%、加酶量1%、pH7、温度50℃、水解作用时间5小时的条件下,以底物蛋白水解度DH为指标,对不同蛋白原料的配比进行单因素分析,确定最佳原料配比。
各蛋白原料的重量配比(以干物质计算)如下:
底物1:大豆蛋白∶乳清蛋白∶鸡蛋∶牛奶=50%∶20%∶15%∶15%;
底物2:大豆蛋白∶乳清蛋白∶鸡蛋∶牛奶=55%∶15%∶10%∶20%;
底物3:大豆蛋白∶乳清蛋白∶鸡蛋∶牛奶=60%∶10%∶5%∶25%;
底物4:大豆蛋白∶乳清蛋白∶鸡蛋∶牛奶=65%∶5%∶5%∶25%。
不同蛋白原料的配比的水解曲线见图1,确定最佳原料配比为底物2,即大豆蛋白∶乳清蛋白∶鸡蛋∶牛奶=55%∶15%∶10%∶20%。
2、酶解工艺条件的确定
在底物原料配比确定的条件下,以所选择的4种不同酶比例(中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶∶凝乳蛋白酶∶胰蛋白酶),复合酶量、酶解温度、pH、酶解时间为试验因素,具体见表3和表4。按L16(45)正交实验表进行配比组合,以制得的多肽产品水解度(DH)为指标,确定最佳工艺参数。
表3不同因素水平表L16(45)
水平 | A酶配比(重量比) | B酶量 | C温度(℃) | D时间(h) | E pH |
1234 | 25%/55%/5%/15%30%/60%/5%/5%35%/50%/5%/10%40%/45%/7%/8% | 0.5%1%1.5%2% | 50556065 | 4567 | 6.57.07.58.0 |
表4酶作用效果正交试验与结果L16(45)
所在列 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
因素 | 酶配比(A) | 酶量(B) | 温度(C) | 时间(D) | pH(E) | 实验结果 |
实验1实验2实验3实验4实验5实验6实验7实验8实验9实验10实验11实验12实验13实验14实验15实验16均值1均值2均值3均值4极差 | 111122223333444422.65022.82522.47522.2250.600 | 123412341234123421.00023.67522.95022.5502.675 | 123421433412432122.60023.07522.50022.0001.085 | 123434124321214322.10022.87522.50022.8000.800 | 123443212143341221.82522.90022.67522.7751.075 | 20.024.823.122.722.024.522.622.221.622.323.322.720.423.122.822.6 |
*因素主次关系:B>C>E>D>A
结果,获得的最优组合为:A2B2C2D2E2。
3.产物酶解前后凝胶电泳分析
原料酶解前及酶解后凝胶电泳图谱对照见图2。由图可见,原料中大分子蛋白多数已被降解为分子量5000Da以下的小分子多肽。
实施例2小分子生物活性肽组合物的制造和检测
本发明的小分子生物活性肽可制备成胶囊的形式。按照常规制备药物或保健品胶囊的方式,将前述制备的小分子生物活性肽进行冷冻干燥,过100目筛后,与固体载体一起机制填充0号胶囊,每粒装量0.3g,压塑铝箔板,每板12粒。检验合格后,可包装为成品。
1.理化指标检测
选取3批次的前述制备的胶囊样品,分别为样品1、样品2、样品3。依据GB/T5009-2003和《药典》2000版等规定的检测方法分别对产品、蛋白质、水分、灰分、崩解时限、铅、砷、汞等项目指标检测。获得的理化指标检测结果见表5。
表5理化指标检测结果
项目(单位) | 样品 | ||
样品1 | 样品2 | 样品3 | |
净含量偏差(%)水分(%)灰分(%)崩解时限(分)蛋白质(g/100g)不溶性膳食纤维(g/100g)铅(以Pb计,mg/kg)砷(以As计,mg/kg)汞(以Hg计,mg/kg) | -3.606.563.98753.43.260.230.160.004 | -1.576.573.81853.63.370.230.040.002 | -3.306.083.54853.53.320.230.030.004 |
2.5KD以下的多肽含量测定
同时取前述样品1、样品2、样品3,沸水浴5分钟。经SDS-PAGE凝胶电泳3-4小时,考马斯亮兰R250染色2小时,脱色至背景清晰,7%乙醇固定。电泳完成后由美国Bio-Rad公司凝胶图像分析仪Del Doc2000扫描分析。
根据凝胶电泳分析,各样品中蛋白质中分子量5KD以下的多肽含量均在95%以上,结果见表6。
表6样品中多肽的含量测定结果
检验项目 | 样品 | ||
样品1 | 样品2 | 样品3 | |
蛋白质中分子量5KD以下的多肽含量 | 均在95%以上 |
3.多肽分子量分布状况检测
取前述样品1、样品2、样品3,采用激光飞行时间质谱仪测定各样品多肽的分子量分布状况。
根据质谱分析,各样品蛋白质中多肽分子量分布主要集中在Mass/charge0.1~1.5KD范围之内,分子量在3KD以下的多肽含量占44%左右。质谱分析结果见表7。
表7样品中多肽分子量分布状况检测结果
检验项目 | 批号 | ||
样品1 | 样品2 | 样品3 | |
多肽分子量分布 | 分子量3KD以下的多肽含量占44%左右,主要集中在Mass/charge 0.1~1.5KD范围之内 |
实施例3小分子生物活性肽组合物的毒性试验
1、大鼠急性经口毒性试验
SD大鼠(购自第四军医大学实验动物中心)20只,雌、雄各半,体重180-220g,于试验前隔夜禁食16小时,将实施例2制备的生物活性肽胶囊按15.0g/kg.bw剂量(相当于人体推荐量的750倍),以1.5mL/100g/kg.bw的灌胃容量,分三次灌胃给予(间隔4小时)。然后观察动物的表现,连续14天。灌胃时用蒸馏水混合胶囊内容物,配制各剂量浓度。结果见表8。
表8大鼠急性经口毒性试验结果
性别 | 动物数(只) | 途径 | 剂量(g/kg.bw) | 死亡情况 | MTD(g/kg.bw) |
雌性雄性 | 1010 | 经口经口 | 15.015.0 | 观察期内无死亡观察期内无死亡 | >15.0>15.0 |
根据观察显示,本发明的小分子生物活性肽组合物对雌、雄大鼠经口最大耐受剂量(MTD))均大于15.0g/kg.bw,其剂量相当于人体推荐用量的750倍,未发现任何毒副作用。
2、大鼠30天喂养试验
SD大鼠80只,体重50-70g,按体重半随机分为4组,每组20只动物,雌、雄各半。受试物设3个剂量组,分别为2.0g/kg.bw(相当于人体推荐用量的100倍)、1.0g/kg.b w和0.5g/kg.bw。灌胃容为1.0mL/100g.bw,每天一次灌胃给予受试物(溶剂对照组灌胃等容的蒸馏水),连续30天。灌胃时用蒸馏水混合胶囊内容物,配制各剂量浓度。动物自由进食和饮水,每天观察并记录动物的一般表现,每周称体重及进食量,最后计算食物利用率。试验结束时,拔眼球取血,用美国产AGII型全自动生化分析仪测定血清生化指标(谷草转氨酶、谷丙转氨酶、尿素氮、总蛋白、白蛋白、总胆固醇、肌酐、甘油三酯、血糖、白血球)。用瑞典产AC-900+型细胞计数仪测定血液学指标(血红蛋白、红细胞计数、白细胞计数、白细胞分类计数等)。然后将试验动物脱颈椎处死进行大体解剖,观察有无异常,取肝、肾、脾、睾丸等脏器称重,并将溶剂对照组和高剂量组动物的肝、肾、脾、睾丸(卵巢)固定,进行组织病理学检查。
对大鼠体重影响的试验显示,各剂量组雌、雄动物体重与溶剂对照组比较差异均无显著性(p>0.05)。对大鼠总食物利用率影响的试验显示,各剂量组总食物利用率与溶剂对照组比较差异均无显著性(p>0.05)。大鼠血常规检验显示,各剂量组和溶剂对照组血红蛋白含量、红细胞计数、白细胞计数及分类均在正常参考值范围内。大鼠生化检验显示,各剂量组和溶剂对照组各项生化指标均在正常参考值范围内。对大鼠脏器重量的影响试验显示,各剂量组脏器重量数值和脏体比数值与溶剂对照组脏器重量数值和比数值比较差异均无显著性(p>0.05)。
因此可见,在试验剂量2.0g/kg.bw~0.5g/kg.bw范围内(最高剂量相当于人体推荐用量的100倍),对试验大鼠的生长发育、血液学、血液生化学及病理学方面相关指标的检验均未发现明显不良影响。
3、遗传毒性试验
(1)小鼠骨髓细胞微核试验
小鼠(购自第四军医大学实验动物中心)50只,体重25-30g,随机分为5组,每组10只,雌、雄各半。将实施例2制备的生物活性肽胶囊设3个剂量组,分别为4.0g/kg.bw、2.0g/k g.bw、1.0g/k g.bw,同时设溶剂对照组(蒸馏水)和阳性对照组(环磷酰胺40mg/k g.b w)。以0.2mL/10g.bw的灌胃容量,经口二次灌胃给予受试物,间隔24小时。灌胃时用蒸馏水混合胶囊内容物,配制各剂量浓度。第二次给受试物后6小时,颈椎脱臼处死动物,取其股骨骨髓制片,镜检后结果进行卡方检验,试验结果见表9。
表9小鼠骨髓细胞微核试验
性别 | 剂量(g/kg.bw) | 动物数(只) | 观察嗜多染红细胞数(个) | 含微核嗜多染红细胞总数(个) | 微核率(‰)X±S | PCE/RBCX±S |
雌 | 4.0 | 5 | 1000×5 | 7 | 1.44±0.55 | 1.29±0.17 |
2.0 | 5 | 1000×5 | 6 | 1.20±1.10 | 1.17±0.12 | |
1.0 | 5 | 1000×5 | 8 | 1.60±1.14 | 1.26±0.13 | |
溶剂对照 | 5 | 1000×5 | 7 | 1.40±1.34 | 1.38±0.27 | |
阳性对照 | 5 | 1000×5 | 111 | 22.20±2.59 | 0.52±0.10 | |
雄 | 4.0 | 5 | 1000×5 | 7 | 1.40±0.89 | 1.28±0.16 |
2.0 | 5 | 1000×5 | 7 | 1.40±1.14 | 1.26±0.17 | |
1.0 | 5 | 1000×5 | 6 | 1.20±0.84 | 1.30±0.19 | |
溶剂对照 | 5 | 1000×5 | 8 | 1.60±1.14 | 1.26±0.15 | |
阳性对照 | 5 | 1000×5 | 124 | 24.80±2.78 | 0.55±0.12 |
由表9可见,阳性对照组微核率明显高于溶剂对照组,其差异有高度显著性(p<0.01);受试物各剂量组微核率与溶剂对照组比较差异无显著性(p>0.05)。即本发明的小分子生物活性肽组合物在试验剂量4.0g/kg.bw~1.0g/kg.bw范围内小鼠骨髓细胞微核试验结果为阴性。
(2)小鼠精子畸形试验
雄性小鼠25只,体重25-30g,随机分为5组,每组5只动物。将实施例2制备的生物活性肽胶囊设3个剂量,分别为4.0g/kg.bw、2.0g/kg.bw、1.0g/k g.bw,同时设溶剂对照组(蒸馏水)和阳性对照组(环磷酰胺40mg/k g.bw)。以0.2mL/10g.b w的灌胃容量,每天经口给予受试物一次,连续5天。灌胃时用蒸馏水混合胶囊内容物,配制各剂量浓度。于首次给受试物后的第35天,颈椎脱臼处死动物,取其双侧附睾制片,镜检后结果进行卡方检验。结果见表10。
表10小鼠精子畸形试验
剂量(g/kg.bw) | 动物数(只) | 受检精子数(个) | 畸形精子总数(个) | 精子畸形率(%)X±S |
4.02.01.0溶剂对照阳性对照 | 55555 | 1000×51000×51000×51000×51000×5 | 112118110115563 | 2.24±0.232.36±0.392.20±0.312.30±0.5111.26±1.62 |
由表10可见,阳性对照组小鼠精子畸形率明显高于溶剂对照组,其差异有高度显著性(p<0.01),受试物各剂量组小鼠精子畸形率与溶剂对照组比较差异均无显著性(p>0.05)。即本发明的小分子生物活性肽组合物在试验剂量4.0g/kg.bw~1.0g/kg.bw范围内小鼠骨髓细胞微核试验结果为阴性。
(3)Ames试验
菌种:Ames试验标准菌株由河南省疾病预防控制中心提供,经本室按GB15193.4-2003方法进行菌种鉴定,5种特性良好,液氮罐贮存备用。
肝S-9:2003年4月河南省疾病预防控制中心提供,经阳性对照物进行测定,结果活性良好,液氮罐储存备用。肝S-9混合液试验用量为0.5mL/皿。
将本发明的小分子生物活性肽组合物设计为为5000μg/皿、1000μg/皿、200μg/皿、40μg/皿、8μg/皿五个剂量组。另设自然回变对照组、溶剂对照组和阳性对照组,用Ames试验标准菌株TA97、TA98、TA100和TA102,在加与不加肝S-9混合液的条件下,分别对本发明的小分子生物活性肽组合物做平板掺入法Ames试验。各菌株每剂量做三个平行皿,每皿加菌加样各0.1mL,整个试验重复二次。培养48h后,记录各皿回变菌落数,如果受试物的回变菌落数是自发回变菌落数的二倍以上,并且有剂量反应关系者则定为阳性。试验结果见表11。
表11 Ames试验结果(
X±S)
TA97菌株 | TA98菌株 | TA100菌株 | TA102菌株 | |||||
S-9(-) | S-9(+) | S-9(-) | S-9(+) | S-9(-) | S-9(+) | S-9(-) | S-9(+) | |
自然回变数/皿 | 163±9 | 156±9 | 36±4 | 38±4 | 177±13 | 176±15 | 308±30 | 310±28 |
5000μg/皿 | 156±10 | 160±11 | 36±4 | 35±4 | 182±9 | 178±20 | 309±33 | 296±31 |
1000μg/皿 | 155±14 | 153±22 | 36±2 | 37±4 | 181±16 | 175±14 | 321±53 | 276±30 |
200μg/皿 | 145±19 | 147±17 | 35±5 | 35±2 | 180±16 | 179±16 | 298±21 | 294±20 |
40μg/皿 | 142±17 | 150±18 | 36±4 | 35±3 | 191±11 | 182±14 | 294±39 | 298±38 |
8μg/皿 | 150±17 | 152±16 | 34±1 | 36±5 | 178±15 | 179±14 | 293±36 | 294±34 |
溶剂对照 | 150±16 | 149±20 | 36±2 | 34±1 | 180±16 | 170±22 | 284±30 | 290±33 |
阳性对照 | 2886±365 | 1426±102 | 1937±47 | 3497±336 | 2420±223 | 2478±252 | 2312±287 | 2080±266 |
阿的平100μg/皿 | 2AF10.0μg/皿 | 柔毛霉素6.0μg/皿 | 2AF10.0μg/皿 | NaN31.5μg/皿 | 2AF10.0μg/皿 | 丝裂霉素C0.5μg/皿 | 顺铂25.0μg/皿 |
结果可见,每剂量组各菌株回变菌落数均未超过自然回变菌落数的二倍,而阳性对照组超过自然回变菌落数的二倍以上。本次Ames试验为阴性结果,即表明本发明的小分子生物活性肽组合物在试验剂量8μg/皿-5000μg/皿范围内未发现诱变作用。
经上述试验,小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、Ames试验结果均为阴性,即本发明的小分子生物活性肽组合物未见遗传毒性作用。
实施例4小分子生物活性肽组合物增强免疫功能的测定
依据《保健食品检验与评价技术规范》(卫生部2003版)所规定的检测项目和检测方法进行。以下试验均采用40只小鼠(购自第四军医大学实验动物中心)随机分为4组,每组10只,各项试验受试物剂量均为:0.4g/kg.bw、0.2g/kg.bw和0.1g/kg.bw三个剂量组和一个溶剂对照组。其剂量分别相当于人体推荐用量的20倍、10倍和5倍。按上剂量各组每天灌胃一次(灌胃容量均为0.2mLg/10g.bw)。灌胃时用蒸馏水混合胶囊内容物,配制各剂量浓度。连续给予30天后分别对动物进行各项免疫指标测定。
1.血清溶血素测定(体液免疫功能测定)
灌胃第26天给小鼠腹腔注射2%SRBC(0.2mL/只),于免疫后第四天摘眼球采血,分离血清并在微量血凝板上进行血清溶血素测定。37℃孵育3小时后,统计血球凝集度,计算相应抗体积数,各剂量组结果与溶剂对照组比较进行方差分析,结果见表12。
表12小鼠血清溶血素测定结果
组别(g/kg.bw) | 动物数(只) | 抗体积数( X±S) | p值 |
0.40.20.1溶剂对照 | 10101010 | 238.5±32.8231.0±15.9228.0±32.2178.5±37.9 | 0.0000.0020.003 |
由表12可见,各剂量组抗体积数均高于溶剂对照组,且差异均有高度显著性(p<0.01)。
2.单核-巨噬细胞功能测定
(1)小鼠碳廓清试验
按顺序给各组小鼠尾静脉注射印度墨汁(4倍稀释)0.1mL/10g.bw。每鼠均于注射墨汁后2分钟及10分钟分别准时内眦采血20ul,并迅速加入到2m10.1%碳酸钠溶液中并摇匀。以752-C紫外可见分光光度计600nm波长处测光密度值(OD)。同时取小鼠肝、脾称重,按公式计算吞噬指数(a),各剂量组结果与溶剂对照组比较进行方差分析,结果见表13。
表13小鼠碳廓清试验
组别(g/kg.bw) | 动物数(只) | 吞噬指数 | p值 |
0.40.20.1溶剂对照 | 10101010 | 5.067±1.0154.506±0.7073.799±0.6733.880±1.225 | 0.0250.1960.762 |
由表13可见,高剂量组小鼠碳廓清吞噬指数高于溶剂对照组,且差异有显著性(p<0.05)。低剂量组小鼠碳廓清吞噬指数与溶剂对照组间差异无显著性(p>0.05)。
(2)腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验
于末次给予受试物后各组小鼠均腹腔注射20%鸡红细胞悬液1ml/只,间隔30分钟处死小鼠,腹腔注入生理盐水2mL/只,振摇一分钟后取腹腔洗液制片,37℃温育30分钟,漂洗、固定后染色镜检。计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数和巨噬细胞吞噬鸡红细胞数,以各剂量组吞噬率和吞噬指数与溶剂对照组比较进行方差分析,结果见表14。
表14小鼠巨噬细胞吞噬试验结果
组别(g/kg.bw) | 动物数(只) | 计数巨噬细胞数 | 吞噬率(%)( X±S) | p值 | 吞噬指数( X±S) | p值 |
0.40.20.1溶剂对照 | 10101010 | 100×10100×10100×10100×10 | 59.0±5.257.0±7.058.8±6.350.8±5.4 | 0.0120.0690.014 | 2.09±0.641.26±0.361.25±0.400.91±0.18 | 0.0000.0000.000 |
由表14可见,各剂量组小鼠巨噬细胞吞噬吞噬鸡红细胞吞噬率及巨噬细胞吞噬指数均高于溶剂对照组,且高、低剂量组小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率与溶剂对照组间比较差异均有显著性(p<0.05);各剂量组小鼠巨噬细胞吞噬指数与溶剂对照组间比较差异均有高度显著性(p<0.01)。
由实验结果可知,本发明的小分子生物活性肽组合物对小鼠体液免疫功能及单核-巨噬细胞功能测定两项试验结果均为阳性,故可判定本发明的小分子生物活性肽组合物具有增强免疫力功能的作用。
实施例5小分子生物活性肽组合物促进皮肤创伤愈合的测定
1、小分子生物活性肽对大鼠消炎痛性溃疡的作用
实验分组:Wistar大鼠(购自兰州医学院实验动物中心)体重200-240g,雄性,灌胃给药组60只,随机分为以下6组:
第1组:空白对照组;
第2组:法莫替丁(40mg/kg);
第3组:小分子生物活性肽(100ng活性肽/kg);
第4组:小分子生物活性肽(200ng活性肽/kg);
第5组:小分子生物活性肽(400ng活性肽/kg);
第6组:小分子生物活性肽(800ng活性肽/kg)。
给药方法:大鼠禁食(不禁水)24小时后给药。按1ml/100g给予上述成分,空白对照组给予等体积生理盐水。
给药后60分子时背部皮下注射消炎痛溶液33mg/kg(10ml/kg),12小时颈椎脱臼处死,将10%福马林10ml注入胃内,固定30分钟后取胃沿胃大弯剪开,平铺后用摄像机摄像,用真彩色图象分析仪测量溃疡面积。
结果见表15。灌胃给药组小分子生物活性肽100-200ng/kg虽可使溃疡面积缩小,但和空白对照组比较,差别不显著(P>0.05),法莫替丁、小分子生物活性肽400、800ng/kg使大鼠消炎痛性溃疡面积显著缩小,和对照组比,差别高度显著(P均<0.01)。
表15各给药组对大鼠消炎痛性溃疡形成的影响
药物 | 剂量 | 溃疡面积/mm2 | 抑制率/% | P值 |
空白对照组法莫替丁小分子生物活性肽小分子生物活性肽小分子生物活性肽小分子生物活性肽 | -40mg/kg100ng/kg200ng/kg400ng/kg800ng/kg | 20.18±8.508.28±3.4515.52±12.3413.56±6.799.92±2.629.75±5.25 | 58.923.032.850.851.7 | ** ** ** |
和空白对照组比,*P<0.05,**P<0.01。
2、小分子生物活性肽对大鼠慢性胃溃疡(醋酸性胃溃疡)的作用
实验分组和给药方法同前。
Wistar大鼠禁食24小时后,乙醚麻醉,无菌切开腹腔,暴露胃,在胃窦与胃体交界处浆膜下用微量注射器注入30%醋酸50μl,敷适量青霉素粉,缝合腹壁肌层与皮肤,术后立即随机分组(每组10只)。给药12天后停药禁食,于次日颈椎脱臼处死,开腹,胃内注入10ml 10%福马林溶液固定,取胃,在福马林溶液内继续固定12小时,沿胃大弯纵行切开,用生理盐水冲净胃内容物,将溃疡标本平铺在平板上,用带近摄镜摄像机摄像,图象分析仪测量溃疡面积。
结果见表16。和空白对照组比较,灌胃给药组法莫替丁、小分子生物活性肽200、400、800ng/kg使大鼠醋酸性溃疡面积显著缩小,和对照组比,差别均有显著性。
表16灌胃给药对大鼠醋酸性溃疡面积的影响
药物 | 剂量 | 溃疡面积/mm2 | 愈合率/% | P值 |
空白对照组法莫替丁小分子生物活性肽小分子生物活性肽小分子生物活性肽小分子生物活性肽 | -40mg/kg100ng/kg200ng/kg400ng/kg800ng/kg | 14.96±6.213.20±1.5411.39±4.169.78±4.288.13±2.847.80±2.83 | 78.623.834.645.747.8 | ** * ** ** |
和空白对照组比,*P<0.05,**P<0.01。
3、小分子生物活性肽对大鼠皮肤烫伤的治疗作用
Wistar大鼠,雌雄各半,体重200-250g。背部剪毛后用脱毛剂脱毛(5×5cm),24小时后进行烫伤模型制备。衡温、衡压、定时烫伤。烫伤时用乙醚麻醉,背位固定,使背部皮肤充分平展、且与地面平行。烫伤器用铜管制成。底面直径20mm,水由底部进入,由上部流出,不再返回。烫伤器自重加水重共1kg。进水管接10000ml衡温水浴锅(82℃),出水管水温80℃。将烫伤器垂直置动物皮肤上,底面与皮肤保持平行。烫伤时间10秒,形成深II°烫伤。每鼠烫伤1处。烫伤面积314mm2,约占体表面积的1%。
动物分组:阳性对照组:因目前尚无同剂型(注射用)的促创面愈合的阳性对照药物,本实验选已被国家批准的外用药物重组牛碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作为阳性对照药。实验分组:大鼠68只。烫伤后立即随机分组给药,共分以下7组:
空白对照组8只,生理盐水0.1ml/100g,创面滴生理盐水0.2ml/只;
对照组10只,肌肉注射赋形剂0.1ml/100g,创面滴生理盐水0.2ml/只;
bFGF组10只,肌肉注射赋形剂0.1ml/100g,创面喷涂bFGF溶液0.2ml/只(480AU);
小分子生物活性肽100ng/kg组10只,肌肉注射受试药0.1ml/100g,创面滴生理盐水0.2ml/只;
小分子生物活性肽200ng/kg组10只,肌肉注射受试药0.1ml/100g,创面滴生理盐水0.2ml/只;
小分子生物活性肽400ng/kg组10只,肌肉注射受试药0.1ml/100g,创面滴生理盐水0.2ml/只;
小分子生物活性肽800ng/kg组10只,肌肉注射受试药0.1ml/100g,创面滴生理盐水0.2ml/只;
另取2只大鼠,烫伤后72小时处死,取皮肤创面用10%福马林固定,石蜡包埋切片,光镜下检查烫伤深度。
注射用药1日量分2次给予,空白组肌肉注射生理盐水,对照组和bFGF组肌肉注射赋形剂溶液,受试组肌肉注射小分子生物活性肽。外用bFGF每日1次,每次0.2ml/创面,空白组、对照组和小分子生物活性肽受试组同时滴以等体积生理盐水。从第4日起,每3-4日用摄像机摄取创面图象1次(距离53cm),输入微机,用千分尺定标,用图象分析仪测创面面积。
结果见表17。大鼠皮肤烫伤后7天内创面缩小速度较慢,各组之间亦无显著性差别。9天后开始脱痂,且创面缩小速度明显加快。10天时bFGF组缩小最为明显,但该组在其后创面缩小速度慢于小分子生物活性肽治疗组,实验终点时(17天),以小分子生物活性肽400-800ng/kg组创面面积最小,和对照组比较,差别均有显著性意义。空白组和赋形剂对照组比较,差别无显著性意义(P>0.05),说明赋形剂对本实验结果无显著性影响。
表17小分子生物活性肽对大鼠皮肤烫伤后创面缩小速度的影响
组别 | 动物数/只 | 创面面积/mm2 | ||||
3天 | 7天 | 10天 | 14天 | 17天 | ||
空白组对照组bFGF480AU/创面小分子生物活性肽100ng/kg小分子生物活性肽200ng/kg小分子生物活性肽400ng/kg小分子生物活性肽800ng/kg | 8101010101010 | 261.1±38.5258.4±47.5263.9±34.0258.2±20.5246.9±37.0246.2±47.1243.7±36.0 | 237.4±41.7226.8±37.2213.0±27.9215.2±43.0213.7±40.0213.4±41.3215.3±21.2 | 201.6±25.0200.9±29.4149.9±32.1**181.7±46.8189.4±37.7170.8±31.0*166.4±33.7* | 159.5±37.1156.5±34.2112.5±32.9*131.1±69.9137.6±32.9105.5±49.2*72.1±26.5** | 128.6±39.7129.7±37.661.7±19.7**125.8±36.7107.7±65.352.3±35.7**42.3±22.5** |
和对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。初始创面面积314mm2。
4、小分子生物活性肽对小猪皮肤切割伤的作用
中国小型猪24只,体重10-15kg,按体重、性别随机分4组,每组5雄1雌,分别为对照组,阳性对照组和低、高剂量小分子生物活性肽受试药组:
对照组,肌肉注射赋形剂溶液;
阳性对照组,局部喷bFGF溶液0.2ml(480AU);
小分子生物活性肽低剂量组,肌肉注射小分子生物活性肽,日剂量125ng/kg;
小分子生物活性肽高剂量组,肌肉注射小分子生物活性肽,日剂量250ng/kg。
用硫贲妥钠25mg/kg麻醉(0.5ml/kg)。背部剪毛,剪毛范围30×25cm。用温肥皂水浸洗去毛部位后,用剃头刀剃毛,用温水冲洗去毛部位,棉布吸干水份。碘复消毒皮肤及打孔器。用特制打孔器在背部皮肤打孔,打孔时方向垂直,深度至皮下(约4mm),各圆孔各周边深度一致。用手术刀片水平切去皮片全层,深度恰到皮下(皮片厚约4mm)。无菌棉球压迫止血。碘复棉球消毒切口及周围皮肤,灭菌纱布敷盖切口,用胶布2条绕腹部成腹带状固定。术后立即开始用药治疗:
对照组:肌肉注射赋形剂溶液(甘露醇3.125mg/ml)0.1ml/kg,1日2次;
阳性对照组:每个创面喷以外用bFGF溶液0.2ml(480AU),1日1次;
小分子生物活性肽低剂量组:小分子生物活性肽625ng/ml,0.1ml/kg,肌肉注射,1日2次,日剂量125ng/kg,按体表面积折算,此剂量与大鼠0.4μg/kg等效;
小分子生物活性肽高剂量组:小分子生物活性肽1250ng/ml,0.1ml/kg,肌肉注射,1日2次,日剂量250ng/kg,按体表面积折算,此剂量与大鼠0.8μg/kg等效。
为使各组处理相同,对照组、小分子生物活性肽低、高剂量组每天涂以0.2ml生理盐水,而bFGF阳性对照组每天肌肉注射赋形剂溶液(3.125mg/ml甘露醇),0.1ml/kg。
于术后次日、3、7、10、14、17天分别用数字照相机照像,拍照距离50cm,,无影灯照明,千分尺定标。经Photoshop6.0软件输入PII 350微机,转变为bmp格式后用图象分析仪对创面面积进行分析。肉芽组织充填速度:用肉芽组织填平创面时间来表示。观察方法为:第5日后每天肉眼观察创面一次,待肉芽组织充填创面使其距皮肤表面<0.3mm时,即判定为创面已被肉芽组织填平,记录肉芽组织填平创面时间,反映肉芽组织生长速度。
猪皮肤切割伤后,3-4天时即可见肉芽组织自伤口底部长出,色红或因血痂的存在而呈深红色,触之出血,表面凸凹不平,难测深度。等肉芽组织接近填平创面时,肉芽表面较平,故创面肉芽组织填平时间较易判断。结果见表18,对照组创面肉芽组织填平时间为11.16±1.33天,较bFGF组(6.33±0.81天)明显为长。小分子生物活性肽低、高剂量组创面肉芽组织填平时间分别为7.67±1.36天和7.00±1.09天,较对照组明显为短,且和对照组比较差别均非常显著。
表18对猪皮肤切割伤后皮肤创面肉芽组织填平时间的影响
组别 | 药物剂量 | 动物数/只 | 创面肉芽组织填平时间/天 |
对照组BFGF小分子生物活性肽小分子生物活性肽 | -480AU/创面125ng/kg250ng/kg | 6666 | 11.17±1.336.33±0.81**7.67±1.37**7.00±1.09** |
和对照组比较,**P<0.01。
猪皮肤切割伤后3天时创面轻度缩小,但各组间无显著性差别。肉芽组织填平创面后上皮自周边向中心生长,创面开始明显缩小。7天时bFGF组切口创面面积较对照组缩小13.7%,且差别有显著性。小分子生物活性肽组皮肤创面面积缩小速度快于对照组,而慢于bFGF组,14天时小分子生物活性肽125、250ng/kg组切口创面面积较对照组明显缩小,差别有显著性。17天时对照组、bFGF组、小分子生物活性肽125、250ng/kg组每组6只动物中创面愈合例数分别为0、5、4、5例;对照组尚残留创面18.6%时,bFGF组和小分子生物活性肽低、高剂量组创面已基本愈合,结果见表19。
表19各组对猪皮肤切割伤后皮肤创面愈合速度的影响
组别 | 动物数/只 | 3天 | 7天 | 10天 | 14天 | 17天 |
对照组BFGF480AU/创面小分子生物活性肽125ng/kg小分子生物活性肽250ng/kg | 6666 | 224.8±12.3233.8±19.4237.8±27.2228.8±25.9 | 230.2±18.0198.7±27.5*222.1±23.7229.9±17.4 | 206.4±21.5155.4±39.9*195.2±22.7190.4±18.9 | 182.2±26.946.8±28.8**126.4±39.0*114.5±20.1** | 47.2±29.00.38±0.94**5.62±11.2**1.67±4.08** |
和对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。初始创面面积254mm2。
以上研究结果说明,灌胃给予小分子生物活性肽200ng/kg(1日量分2次灌胃或肌注)对大鼠慢性醋酸性溃疡具有明显的治疗作用,表现为溃疡面积较对照组明显为小;最佳有效剂量为400ng/kg,当剂量继续增大时,疗效不再增加。小分子生物活性肽不影响胃液分泌量及其pH值、游离酸和总酸度,也不影响胃蛋白酶排出量及其活性,表明小分子生物活性肽的抗溃疡作用机理可能与侵袭因子胃酸和胃蛋白酶活性无关,与传统抗溃疡药在作用机理上有较大差别。
小分子生物活性肽400、800ng/kg肌肉注射对大鼠深II度皮肤烫伤具有明显的治疗作用,可明显加快愈面愈合速度,治疗终点时疗效强于外用bFGF。小分子生物活性肽125、250ng/kg肌肉注射对小型猪皮肤切割伤模型也具有明显的治疗作用,可加快创面肉芽组织充填速度,加快皮肤创面愈合速度,和对照组比较,差别显著。
实施例6小分子生物活性肽组合物对水上运动员生化指标的影响
选取皮艇、轻量级赛艇和皮划艇各类专业水上运动员20名,平均年龄24.24±1.00岁、身高174.33±4.42cm、体重66.90±5.47kg,运动等级为1.00±0.84级。受试者身体健康状况良好,无心血管系统和呼吸系统疾病,测试期间无运动系统损伤。
将运动员随机分为对照组和补肽组。实验共进行5周,每周训练7天,每天训练5~6小时,要求各组受试对象在5周大强度训练中的计划基本相同。实验期间,除正常饮食和服用本发明的小分子生物活性肽外,受试者不使用其他营养保健品。
实验前和实验后安静状态下各进行一次测试,肘静脉取血,一部分抗凝处理用于血象测试,另一部分制备血清。
1、蛋白质合成分解代谢评定指标的测试
采用放射免疫法测定血睾酮(T),试剂盒购自天津DPC公司,使用仪器为BECKMANGama 5500型γ计数仪;使用日立7020型全自动生化分析仪测定尿素氮(BUN),试剂盒由上海荣盛公司提供。
2、骨骼肌组织损伤评定指标的测试
使用日立7020型全自动生化分析仪测定肌酸激酶(CK),试剂盒由上海荣盛公司提供。
3、血象测试
使用瑞典MEDONICCA 530型全自动血细胞分析仪测试红细胞(RBC)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞比积(HCT)、血小板(PLT)、血色素(Hb)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)和平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)。各项指标的测试结果见表20和表21。
表20对照组生化指标对比
项目 | 编号 | 血睾酮 升高率 | 血色素 升高率 | 尿素氮 降低率 | 肌酸激酶 降低率 |
皮艇对照组 | 1 | 569.73-15.14%483.45 | 15.7-2.55%15.3 | 8+25%6 | 406-53.69%624 |
2 | 569.73-54.30%260.34 | 15.31.96%15.6 | 8+37.50%5 | 527+39.28%320 | |
3 | 531.42-24.10%403.36 | 16.1-2.48%15.7 | 6-16.67%7 | 121-59.50%193 | |
平均值 | -31.18% | -1.02% | +15.28% | -24.64% |
表21实验组生化指标对比
项目 | 编号 | 血睾酮 升高率 | 血色素 升高率 | 尿素氮 降低率 | 肌酸激酶 降低率 |
皮艇实验组 | 1 | 715.33-2.31%698.81 | 14.9+4.70%15.6 | 8+37.50%5 | 571+77.06%131 |
2 | 360.69+1.43%365.83 | 14.4-0.69%14.3 | 7+14.29%6 | 448+81.92%81 | |
3 | 501.03+48.08%741.93 | 15.3+2.61%15.7 | 60.00%6 | 266+69.92%80 | |
平均值 | +15.73% | +2.21% | +17.26% | +76.30% |
由表20、表21可见,服用本发明的小分子生物活性肽后,运动员实验组与对照组相比各血液生化指标有显著性差异,血睾酮提高了近46.91%,血色素水平提高了近3.23%,而尿素氮下降达1.98%,同时肌酸激酶水平明显下降,下降达100.94%。
应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种小分子生物活性肽,其特征在于,所述的生物活性肽来源于含大豆蛋白、乳清蛋白、鸡蛋和牛奶的混合物,所述小分子生物活性肽中90%以上活性肽的分子量小于5KDa,并且所述的生物活性肽具有提高免疫力、促进机体组织创伤愈合和增强体能的活性,其中所述的混合物含有以下成分:
大豆蛋白:40-70重量份;
乳清蛋白:5-30重量份;
鸡蛋:5-20重量份;
牛奶:10-30重量份。
2.根据权利要求1所述的小分子生物活性肽,其特征在于,所述的混合物含有以下成分:
大豆蛋白:50-65重量份;
乳清蛋白:20-30重量份;
鸡蛋:10-20重量份;
牛奶:15-25重量份。
3.根据权利要求1所述的小分子生物活性肽,其特征在于,分子量为0.1-3KDa的小分子生物活性肽占全部小分子生物活性肽的重量百分比为40-90%。
4.根据权利要求1所述的小分子生物活性肽,其特征在于,所述的小分子生物活性肽是用以下方法制备的:
(a)在40-90℃,用蛋白酶对混合物酶解3-8小时,酶解的pH值为6.0-9.0,其中,所述的混合物含有以下成分:
大豆蛋白:40-70重量份;
乳清蛋白:5-30重量份;
鸡蛋:5-20重量份;
牛奶:10-30重量份;
所述的蛋白酶的用量为混合物重量的0.1-3%,并且所述的蛋白酶选自下组:中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、或其组合;
(b)分离平均分子量为0.1-5KDa的肽,获得小分子生物活性肽。
5.一种权利要求1所述的小分子生物活性肽的制备方法,其特征在于,包含以下步骤:
(a)在40-90℃,用蛋白酶对混合物酶解3-8小时,酶解的pH值为6.0-9.0,其中,所述的混合物含有以下成分:
大豆蛋白:40-70重量份;
乳清蛋白:5-30重量份;
鸡蛋:5-20重量份;
牛奶:10-30重量份;
所述的蛋白酶的用量为混合物重量的0.1-3%,并且所述的蛋白酶选自下组:中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、或其组合;
(b)分离平均分子量为0.1-5KDa的肽,获得小分子生物活性肽。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述的蛋白酶为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶、胰蛋白酶的组合。
7.一种组合物,其特征在于,含有权利要求1所述的小分子生物活性肽,以及药学上或食品上可接受的载体。
8.一种权利要求1所述的生物活性肽在制备提高机体免疫功能、促进机体组织创伤愈合、或增强体能的制品方面的用途。
9.如权利要求8所述的用途,其特征在于,所述的制品是药物组合物、饮食补充剂、保健品、或食品组合物。
10.如权利要求8所述的用途,其特征在于,所述的制品是片剂、颗粒剂、悬浮剂、胶囊、口服液、或糖浆。
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