CN114874315B - 一种卵清多肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种卵清多肽的制备方法。包括将卵清蛋白稀释混匀调pH至酸性后离心沉淀，分离得到上清和沉淀；将所得上清进行酸性蛋白酶处理，得到酶处理液A；将所得沉淀进行碱性溶液溶解，再碱性蛋白酶处理，得到酶处理液B；将所得酶处理液A和酶处理液B混合后调pH为6.5‑8.5，再用中性蛋白酶处理得到组合处理液，再碱性热处理分离出上清液，该上清液即为卵清多肽。利用该方法制备的卵清多肽具有增强免疫力的功效。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白多肽制备技术，尤其涉及一种卵清多肽的制备方法。
背景技术
鸡蛋清也被称为“蛋白”或“卵白”、“卵清”、“蛋清”，是鸡蛋里围绕蛋黄的透明液体部分。蛋清起初是单细胞卵子细胞质，其目的是给发育中的胚胎提供全方位的营养。这也是卵清蛋白作为理想营养滋补品的原因所在。鸡蛋清是最纯最丰富的蛋白质来源之一。许多健美运动员使用的蛋白质营养品都是由蛋清分离而得。研究发现，卵清蛋白氨基酸比例非常均衡，与人体非常一致，根据世界健康组织报道,鸡卵白蛋白是日常食物中消化率最高，是天然食物中人体利用率最高的优质蛋白质。
食物蛋白质的生物价(英文为：biological value，BV)，是一种反映食物蛋白质消化吸收后，被机体利用程度的一项指标，生物价越高，说明蛋白质被机体利用率越高，即蛋白质的营养价值越高，最高值为100％。比较不同来源的蛋白质的生物价，发现：鸡蛋蛋白的生物价高达94％，脱脂牛奶为85％，鱼肉为83％，牛肉76％，猪肉74％，大豆57％，大米77％，小麦67％；也就是说，鸡蛋蛋白被机体利用率最高，营养价值也最高。
虽然鸡蛋蛋白富含优质蛋白质，目前还局限于餐桌上的美味佳肴，没有得到高价值应用开发。究其原因，主要制约因素是：1)生鲜鸡蛋蛋白有一股腥味难以被普通人接受，2)卵清蛋白为含有超大分子粘蛋白，为非水溶性蛋白，不利于制备液体类体产品，3)卵清中含有蛋白酶抑制剂对蛋白酶水解有抵抗作用，并不利于消化吸收。
发明内容
为了克服上述问题，本发明的目的在于提供一种卵清多肽的制备方法，利用该方法制备的卵清多肽具有增强免疫力的功效。
为实现上述目的，本发明提供一种卵清多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，
前处理：将卵清蛋白稀释混匀调pH至酸性后离心沉淀，分离得到上清和沉淀；
上清处理：将所得上清进行酸性蛋白酶处理，得到酶处理液A；
沉淀处理：将所得沉淀进行碱性溶液溶解，再碱性蛋白酶处理，得到酶处理液B；
卵清多肽的获得：将所得酶处理液A和酶处理液B混合后调pH为6.5-8.5，比如pH＝6.5,7.0,7.5,8.0,8.5，再用中性蛋白酶处理得到组合处理液，再热处理分离出上清液，该上清液即为卵清多肽。
进一步，所述前处理是在生卵清液中加水稀释混匀，然后调pH至3-6；优选的pH为3.5-4.5，再打浆后静置，分离得到上清和沉淀；优选的，所述打浆后静置为：5000-20000转/分打浆2-5分钟后，再静置4-8小时。继续优选10000-20000转/分打浆2-5分钟后，再静置4-8小时。
进一步，所述前处理中稀释是将卵清蛋白用纯净水稀释2-6倍；优选稀释3-4倍。
进一步，所述前处理中预先将生卵清液在稀释前或稀释后加热至100℃保持1-15分钟，优选的5分钟，然后再打浆及处理。
进一步，所述上清处理步骤为，往上清中直接加入酸性蛋白酶至100-50000酶单位30-45℃保温4-24小时，优选的加入酸性蛋白酶至500-3000酶单位35-48℃保温8-16小时；得到酶处理液A。
进一步，所述沉淀处理步骤为，往所得沉淀中加入50mM pH9-11的碳酸钠-碳酸氢钠溶液，加入量按每克10-100ml的量，再加入碱性蛋白酶至100-50000酶单位36-55℃保温4-16小时；优选的，加入碱性蛋白酶至300-1000酶单位45-50℃保温8-10小时；得到酶处理液B。
进一步，所述卵清多肽的获得步骤为，将所得酶处理液A和酶处理液B混合后调pH为6.5-8.5，再用中性蛋白酶处理得到组合处理液，其中加中性蛋白酶至100-10000酶单位36-55℃保温2-16小时；优选的，加中性蛋白酶至500-1000酶单位42-50℃保温2-6小时,再加温至80-90℃并保持5-30分钟后进行分离处理，所得到的上清液即为卵清多肽。
进一步，所述卵清多肽的获得步骤中，酶处理液A和酶处理液B的混合液中两者的体积比例为1:(1-3)；优选的，体积比例为1：2。
进一步，还包括将由所述制备方法制得的卵清多肽进一步用超滤器或分子筛分离出分子量在1-5KD的卵清多肽；优选的，将所得的卵清多肽用5KD截留膜的超滤器过滤卵清多肽，滤过液进一步用1KD截留膜的超滤器过滤至余液为滤前的1/3-1/5时收集截留液，便得浓缩的分子量在1-5KD的卵清多肽。
进一步，还包括将所得的卵清多肽或1-5KD的多肽混合物用磷酸盐缓冲液调配至pH为6-9，优选的pH为7-8，再罐装并经100-120℃灭菌5-30分钟后常温保存。
本发明还保护所述制备方法制备得到的卵清多肽。
附图说明
图1是卵清蛋白对小鼠免疫力的影响实验结果图。
图2是卵清蛋白对小鼠免疫力的影响实验结果图。
图3是脾脏淋巴细胞增殖反应实验结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：卵清多肽的制备
前处理：在1L生卵清液中加2L体积的纯净水稀释、混匀(记为样品1)，然后加适量柠檬酸/柠檬酸钠，调pH至4.2，再以10000转/分打浆2分钟后，再静置6小时，分离得到上清(约2.85L)和沉淀(约0.15L)；
上清处理：往上述所得的上清中直接加入酸性蛋白酶至500酶单位45℃保温12小时，得酶处理液A,约2.85L(记为样品2)；
沉淀处理：往沉淀(约150克)中再按质量比加4倍(约600ml)的50mM pH11的碳酸钠-碳酸氢钠溶液，混合后以10000转/分的高速组织破碎机打浆3分钟，再加入碱性蛋白酶至500酶单位45℃保温12小时，得酶处理液B约700ml(记为样品3)；
卵清多肽的制备：将上述所得酶处理液A和酶处理液B混合后调pH至7.2，再加中性蛋白酶至300酶单位，37℃保温3小时；然后加温至90℃并保持10分钟，再冷却至常温，再以8000转/分离心分离，收集上清液即为卵清多肽，约3.5L(记为样品4)。可将所得卵清多肽罐装并经120℃、20分钟灭菌后常温保存。注：所得到的卵清多肽的保存方法有常温或干燥保存。
常温保存：将得到的卵清多肽罐装并经120℃灭菌20分钟后常温保存。
干燥保存：将得到的卵清多肽经低温冷冻干燥或喷雾干燥后罐装保存。
实施例2：分子量在1-5KD(1-5千道尔顿)多肽混合物的提取
本实施例以5ml样品制备为例，取实施例1中制得的卵清多肽(样品4)10ml，选用1KD截留膜的Centricon超滤管和5KD截留膜的Centricon超滤管；
在5KD截留膜的Centricon超滤管中加5ml卵清多肽，5000rpm离心15分钟(至截留液的体积等于或小于滤前的1/5时为准)，得0.5ml截留液(主要为分子量≧5KD的多肽，记为样品5)和4.5ml滤过液(主要为分子量小于5KD的多肽)；用同样方法将该4.5ml滤过液进一步用1KD截留膜的Centricon超滤管滤过，得0.5ml截留液(主要为分子量大于1KD和小于5KD的多肽，记为样品6)和4ml滤过液(主要为分子量小于1KD的多肽，记为样品7)。由于该制备过程中截留液中的成分被浓缩，为了更好地和滤过液比较各组分的功能，将5KD截留液和1KD截留液用PBS缓冲液稀释成和滤过液等同的体积。于是得如下各组分：
·卵清多肽(样品4)，
·5KD截留液，主要为分子量等于和大于5KD的多肽(样品5)，
·1KD截留液，主要为分子量1KD-5KD的多肽(样品6)，
·1KD滤过液，主要为分子量小于1KD的多肽(样品7)。
实施例3：卵清多肽的制备
前处理：在1L生卵清液中加3L体积的纯净水稀释、混匀，然后加适量柠檬酸/柠檬酸钠，调pH至4.5，再以15000转/分打浆5分钟后，再静置8小时，分离得到上清(约2.85L)和沉淀(约0.15L)；
上清处理：往上述所得的上清中直接加入酸性蛋白酶至50000酶单位30℃保温4小时，得酶处理液A,约2.85L；
沉淀处理：往沉淀(约100克)中再按质量比加4倍的50mM pH11的碳酸钠-碳酸氢钠溶液，混合后以10000转/分的高速组织破碎机打浆3分钟，再加入碱性蛋白酶至50000酶单位36℃保温4小时，得酶处理液B约500ml；
卵清多肽的制备：将上述所得酶处理液A和酶处理液B混合后调pH至7.8，再加中性蛋白酶至1000酶单位，40℃保温4小时；然后加温至82℃并保持20分钟，再冷却至常温，再以8000转/分离心分离，收集上清液即为卵清多肽，约3350ml。可将所得卵清多肽罐装并经120℃、20分钟灭菌后常温保存。注：所得到的卵清多肽的保存方法有常温或干燥保存。同实施例1的方法。
实施例4：卵清多肽的制备
前处理：在1L生卵清液中加4L体积的纯净水稀释、混匀(记为样品1)，然后加适量柠檬酸/柠檬酸钠，调pH至3.5，再以20000转/分打浆4分钟后，再静置6小时，分离得到上清(约2.85L)和沉淀(约0.15L)；
上清处理：往上述所得的上清中直接加入酸性蛋白酶至100酶单位45℃保温24小时，得酶处理液A,约2.85L；
沉淀处理：往沉淀(约150克)中再按质量比加4倍的50mM pH11的碳酸钠-碳酸氢钠溶液，混合后以10000转/分的高速组织破碎机打浆3分钟，再加入碱性蛋白酶至500酶单位45℃保温12小时，得酶处理液B约750ml；
卵清多肽的制备：将上述所得酶处理液A和酶处理液B混合后调pH至8.5，再加中性蛋白酶至5000酶单位，37℃保温3小时；然后加温至80℃并保持30分钟，再冷却至常温，再以8000转/分离心分离，收集上清液即为卵清多肽(约2550ml)。可将所得卵清多肽罐装并经120℃、20分钟灭菌后常温保存。注：所得到的卵清多肽的保存方法有常温或干燥保存。同实施例1的方法。
实施例5：混合酶解卵清多肽的制备
前处理：将1L生卵清液中加2L体积的纯净水稀释、混匀，然后加适量柠檬酸/柠檬酸钠，调pH至4.2为止，然后再以10000转/分转速打浆2分钟备用；
混合酶处理：在上述打浆卵清液中直接加入500酶单位酸性蛋白酶，500酶单位碱性蛋白酶，500酶单位中性蛋白酶，45℃保温酶解12小时，然后加温至90℃并保持10分钟，再冷却至常温，用8000转/分转速离心分离，收集上清液即为混合酶解卵清多肽液(记为样品8)。
随后按实施例2所述方法制得分子量为1KD-5KD的多肽(记为样品9)。
实施例6：卵清多肽的制备
前处理：将1L生卵清液中加2L体积的纯净水稀释、混匀,加热至100℃保持5分钟，然后再以10000转/分转速打浆2分钟(记为样品10)，然后用柠檬酸/柠檬酸钠，调pH至4.2，再静置6小时，分离得到上清和沉淀；后续处理同实施例1：
上清处理：往上述所得的上清中直接加入酸性蛋白酶至500酶单位45℃保温12小时，得酶处理液A(记为样品11)；
沉淀处理：往沉淀中再按质量比加4倍的50mM pH11的碳酸钠-碳酸氢钠溶液，混合后打浆,10000转/分的高速组织破碎机打浆3分钟，再加入碱性蛋白酶至500酶单位45℃保温12小时，得酶处理液B(记为样品12)；
卵清多肽液的制备：将上述所得酶处理液A和酶处理液B按照体积比为1:2混合后调pH至7.2，再加中性蛋白酶至300酶单位，37℃保温3小时；然后加温至90℃并保持10分钟得到多肽混合液，然后冷却至常温，8000转/分离心分离，收集上清液即为卵清多肽(记为样品13)。
随后将该卵清多肽液(样品13)按实施例2所述方法制得分子量为1KD-5KD的多肽液(记为样品14)。
实施例7：效果验证试验---卵清多肽对小鼠免疫力的影响
小鼠：昆明小鼠，雄性，鼠龄50-60天，体重30-35克，每组5只小鼠；
各组处理：
正常组(无药物)为：每只小鼠腹腔每天注射1次生理盐水，注射20天；
药物组为：每只小鼠每天注射1次，腹腔注射环磷酰胺40mg/kg.d，(浓度为4mg/ml的环磷酰胺注射0.10ml/10g)注射20天；
实验组1(药物+喂食样品1)为：与药物组一样注射环磷酰胺的同时，每天每只小鼠灌胃10mg卵清多肽样品1；
实验组2(药物+样品2)为：与药物组一样注射环磷酰胺的同时，每天每只小鼠灌胃10mg卵清多肽样品2；
实验组3(药物+样品3)为：与药物组一样注射环磷酰胺的同时，每天每只小鼠灌胃10mg卵清多肽样品3；
实验组4(药物+样品4)为：与药物组一样注射环磷酰胺的同时，每天每只小鼠灌胃10mg卵清多肽样品4；
3周后，取各组小鼠精确称取体重，再剖腹取其脾脏进行称重，得到每组每只小鼠的脾脏系数(脾脏质量与体重的比值)，再取其组平均值即为组的脾脏系数。结果见图1。
从图1可以看出，正常组的小鼠的脾脏系数在3～4mg/g之间，药物组的脾脏系数(脾脏质量与体重的比值)增大，说明有炎症和水肿。而药物+不同卵清多肽样品组中，天然卵清样品1几乎没有明显有降低脾脏系数效果，而样品2、3和4有明显降低了脾脏系数作用，尤其是经过全处理的样品4比半成品样品2和样品3更有显著效果，一加一大于二。说明本发明所制备的卵清多肽对因药物引起的炎症和水肿有一定缓解作用，有保护免疫力作用。
实施例8：效果验证试验---不同KD卵清多肽对小鼠免疫力的影响：
试验方法同上述实施例7，测试样品为：正常组、药物组、样品4、样品5、样品6、样品7。试验结果从图2可以看出，正常组的小鼠的脾脏系数在3～4mg/g之间，药物组的脾脏系数(脾脏质量与体重的比值)增大，说明有炎症和水肿。而药物+不同卵清多肽样品4和样品6有明显降低了脾脏系数，而样品5和样品7没有明显效果。
可以看出，未经水解的卵清蛋白没有显著增强免疫力作用，酶解卵清多肽中只有1-5KD的肽是增强免疫力的主要活性成分。
实施例9：脾脏淋巴细胞增殖反应实验：
小鼠：昆明小鼠，雄性，鼠龄50-60天，体重30-35克，1只，备用1只。
脾脏淋巴细胞制备：小鼠放血处死,70％酒精浸泡消毒5分钟,在洁净柜台中解剖取岀脾脏,置于盛有10ml RPMI1640培养液的平皿中。剥膜后用注射器內芯轻轻碾碎,经100目铜网滤过。移入10mL离心管,1000r/min离心10min,吸弃上清液,加TrinH4Cl,弯头吸管吹打,除去红细胞。静置3分钟,1000rpm离心l0分钟,吸弃上清液,沉淀用RPMI1640培养液清洗3次,最后,用RPMI1640培养液重悬,弯头吸管吹打,调整细胞密度为5×10-5个/ml。
细胞培养及检测试验：在96孔细胞培养板中按试验设计方案分别加入上述细胞悬浮液100ul及100ul下述培养液：
正常组(无添加)：2％小牛血清的RPMI1640，
ConA(刀豆蛋白A)组：2％小牛血清的RPMI1640含10ug/ml的ConA，
样品1组：2％小牛血清的RPMI1640含10mg/ml样品1，
样品2组：2％小牛血清的RPMI1640含10mg/ml样品4，
样品3组：2％小牛血清的RPMI1640含10mg/ml样品6，
每组设3个重复孔，置37℃5％CO2孵箱中培养3天后取出离心弃去上清，在超净工作台内,各孔加140ul RPMI1640+10ul 5mg/ml的MTT,继续培养4h后取出弃上清再加100L二甲基亚砜，室温放置20min,用酶标仪测OD570nm的光吸值。
结果见图3。脾脏淋巴细胞是机体免疫力的重要指标之一。图3为脾淋巴增殖反应实验结果图，从该试验结果，可以看出两组含有1-5KD卵清多肽的样品4和样品6具有促进脾淋巴细胞增殖功效，其效果不亚于阳性效应物(已知对机体免疫反应具有正调节作用)的Con A(刀豆蛋白A)。而天然卵清(样品1)以及只含小于1KD的卵清多肽(样品7)和大于5KD的卵清多肽(样品5)却没有明显促进脾淋巴细胞增殖作用。
上述实验结果提示：经过本发明所述制备流程经多种蛋白酶处理后获得的分子量在1-5KD之间的卵清多肽具有降低药物对小鼠脾脏的不良影响，起到保护免疫器官脾脏的作用，同时能促进小鼠脾淋巴细胞增殖，显示提升小鼠免疫力的功效。天然存在的卵清多肽并没有此功效。
实施例10：检测上述实施例1-2,5-6中各样品(包括中间产物及提取多肽中)蛋白质含量及促淋巴细胞增殖活性。
各样品中蛋白质含量用公知的考马斯亮蓝法检测，即以考马斯亮蓝G250作为蛋白质染色剂、牛血清蛋白作标准曲线，样品和G250染色剂混合后2分钟内在595nm波长测吸光度，其吸光值与蛋白质含量成正比，再通过标曲计算出蛋白质浓度；促淋巴细胞增殖活性检测按实施例7方法进行。检测结果归纳在表1中：
表1.各样品中总蛋白质含量及促淋巴细胞增殖活性检测结果表
上述实验结果分析：
实施例1所述的制备方法中单独经酸性蛋白酶水解后所得的多肽或碱性蛋白酶水解后所得的多肽，对促淋巴细胞增殖活性很低，而将二者混合后再用中性蛋白酶酶解所得的卵清多肽其活性显著提高，起到1+1大于2的效果。而未酶解卵清没有显示促淋巴细胞增殖活性。
实施例1所制备的卵清多肽按分子量分离提取，分子量在1KD-5KD的多肽(样品6)具有很显著的促进促淋巴细胞增殖活性，而分子量大于5KD(样品5)和小于1KD的多肽(样品7)仅有微弱促促淋巴细胞增殖活性(可能还是由微量残留的1KD-5KD的多肽所致)。
各样品促淋巴细胞增殖活性顺序：未酶解卵清(样品1)<酸性蛋白酶水解多肽(样品2)<碱性蛋白酶水解多肽(样品3)<样品2+3再用中性蛋白酶水解多肽(样品4)<1-5KD多肽提取物。
实施例1中所述的制备方法(酸性蛋白酶、碱性蛋白酶分开酶解后再混合用中性蛋白酶酶解)比实施例5的制备方法(把酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶混合在一起对卵清蛋白进行酶解处理)所得的卵清多肽得率更高：72％(样品4)比62％(样品8)，尤其活性1-5KD多肽得率差异更大：26％(样品6)比10％(样品9)。说明实施例1的制备方法优于实施例3。
在实施例6中，生卵清蛋白原料预先经100℃热处理后再进行后续处理(后续处理同实施例1所述)，所得的卵清多肽得率为86％(样品13)高于实施例1中的72％(样品4)，但其活性1-5KD多肽得率低很多，13％(样品13)比26％(样品6)。这可能是热处理后卵清蛋白变性更有利于酶解，因此提供卵清肽得率，但也会因此酶解过头使活性1-5KD多肽含量减少。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种卵清多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，
前处理：是在生卵清液中加水稀释2倍混匀，然后调pH至3.5-4.5，再打浆后静置，分离得到上清和沉淀；
上清处理：将所得上清进行酸性蛋白酶处理，得到酶处理液A；
所述上清处理为往上清中直接加入酸性蛋白酶至500酶单位45℃保温12小时，得到酶处理液A；
沉淀处理：往所得沉淀中按质量比加入4倍的50mM pH 11的碳酸钠-碳酸氢钠溶液，混合后打浆,10000转/分的高速组织破碎机打浆3分钟，再加入碱性蛋白酶至500酶单位45℃保温12小时；得到酶处理液B；
卵清多肽的获得：将所得酶处理液A和酶处理液B混合后调pH为6.5-8.5，再用中性蛋白酶处理得到组合处理液，其中加中性蛋白酶至300酶单位37℃保温3小时；再加温至90℃并保持10分钟后分离出上清液，该上清液即为卵清多肽。
2.如权利要求1所述卵清多肽的制备方法，其特征在于，所述前处理中，所述打浆后静置为：10000-20000转/分打浆2-5分钟后，再静置4-8小时。
3.如权利要求1或2所述卵清多肽的制备方法，其特征在于，所述前处理中预先将生卵清液在稀释前或稀释后加热至100℃保持1-15分钟；然后再打浆及处理。
4.如权利要求3所述卵清多肽的制备方法，其特征在于，所述前处理中预先将生卵清液在稀释前或稀释后加热至100℃保持5分钟。
5.如权利要求1所述卵清多肽的制备方法，其特征在于，所述卵清多肽的获得步骤中，酶处理液A和酶处理液B的混合液中两者的体积比例为4:1。
6.如权利要求1所述卵清多肽的制备方法，其特征在于，还包括将由权利要求1-5任一所述制备方法制得的卵清多肽进一步用超滤器或分子筛分离出分子量在1-5KD的卵清多肽。
7.如权利要求6所述卵清多肽的制备方法，其特征在于，将所得的卵清多肽用5KD截留膜的超滤器过滤卵清多肽，滤过液进一步用1KD截留膜的超滤器过滤至余液为滤前的1/3-1/5时收集截留液，便得浓缩的分子量在1-5KD的卵清多肽。
8.如权利要求1或7所述卵清多肽的制备方法，其特征在于，还包括将所得的卵清多肽或1-5KD的多肽混合物用磷酸盐缓冲液调配至pH为6-9，再罐装并经100-120℃灭菌5-30分钟后常温保存。
9.如权利要求8所述卵清多肽的制备方法，其特征在于，所述pH为7-8。
10.权利要求1-9任一所述制备方法制备得到的卵清多肽。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1920049A (zh) * | 2005-08-26 | 2007-02-28 | 上海弭阳生物技术有限公司 | 小分子生物活性肽及其制法、组合物和应用 |
| CN102094057A (zh) * | 2009-12-10 | 2011-06-15 | 陈栋梁 | 一种以微波促酶解制备卵清蛋白多肽的方法 |
| CN103146791A (zh) * | 2013-03-13 | 2013-06-12 | 扬州大学 | 多种蛋白酶水解蛋清蛋白的方法 |
| CN111067046A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-04-28 | 福建鼍龙实业有限责任公司 | 一种鳄鱼蛋清水解物及其制备方法和应用 |
-
2021
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1920049A (zh) * | 2005-08-26 | 2007-02-28 | 上海弭阳生物技术有限公司 | 小分子生物活性肽及其制法、组合物和应用 |
| CN102094057A (zh) * | 2009-12-10 | 2011-06-15 | 陈栋梁 | 一种以微波促酶解制备卵清蛋白多肽的方法 |
| CN103146791A (zh) * | 2013-03-13 | 2013-06-12 | 扬州大学 | 多种蛋白酶水解蛋清蛋白的方法 |
| CN111067046A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-04-28 | 福建鼍龙实业有限责任公司 | 一种鳄鱼蛋清水解物及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Enzymatic Degradation of Ovalbumin by Various Proteases;Matsumoto, Kiyoshi等;九州大学学術情報リポジトリ;第239-245页 * |
| 蛋清白蛋白酶解工艺的研究;郑云;蔡木易;范慰慰;;食品与发酵工业(第12期);第69-71页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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