CN103146791A

CN103146791A - 多种蛋白酶水解蛋清蛋白的方法

Info

Publication number: CN103146791A
Application number: CN2013100808589A
Authority: CN
Inventors: 赵国琦; 袁宇; 霍永久; 林淼; 徐嗣昌; 金晓君; 邓波波
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2013-03-13
Filing date: 2013-03-13
Publication date: 2013-06-12

Abstract

本发明属于食品加工领域，涉及利用蛋白酶水解鸡蛋清蛋白的方法。该方法是首先获取鸡蛋清并加热变性，然后利用复合蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶中的两种或以上进行同时或者分阶段水解鸡蛋清蛋白。本发明联合使用不同的酶，在酶作用位点方面可以产生互补性，提高水解度，增加蛋清蛋白肽得率。

Description

多种蛋白酶水解蛋清蛋白的方法

技术领域

本发明属于食品加工领域，涉及利用蛋白酶水解鸡蛋清蛋白的方法。

背景技术

蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，按水解多肽方式可将蛋白酶分成内肽酶和外肽酶两大类。内肽酶从蛋白质分子内部将肽键切断，外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基末端逐个将肽键水解，而游离出氨基酸，前者为氨基肽酶，后者为羧基肽酶。按其活性中心和最适pH值，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶等。按其反应的最适pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。工业生产上应用的蛋白酶，主要是内肽酶。

蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。蛋白酶对所作用的底物有专一性，一种蛋白酶只水解蛋白质中特定肽键，如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。工业上蛋白酶制剂生产以利用枯草杆菌、栖土曲霉等发酵制取为主。

蛋白酶具有特异性，由于不同蛋白酶的酶解位点不同，同样的蛋白质在不同的水解酶作用下可产生不同的肽片段，虽能根据原料蛋白的组成和酶的专一性作为参考，但仍存在较大的盲目性。许多生物活性肽用胃肠道蛋白酶水解，常用的胃蛋白酶和胰蛋白酶，如血管紧张素转换酶抑制活性肽、钙结合磷酸肽，常用胰蛋白酶来制取。目前商业用酶以微生物酶为主，包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶及复合酶等。植物蛋白酶及少量动物蛋白酶也有应用。针对不同的底物，选择蛋白酶应考虑到的因素：1、避免水解过程中产生苦味肽；2、能有效的降低游离氨基酸数量；3、水解反应结束后蛋白酶易于变性失活；4、蛋白酶安全性与经济性。

鸡蛋蛋白主要在鸡蛋清中，蛋清中除水分外，主要成分是蛋白质，含有人体所必需的多种氨基酸，包括赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苏氨酸等，氨基酸配比均衡性好，是机体利用率最高的一种蛋白质，鸡蛋蛋白一般被认为是全价蛋白质，常用作评价其它食物蛋白营养价值的参比蛋白。

蛋清蛋白本身的某些性质，如不耐热及易凝固，限制了其在食品加工中的应用范围。鸡蛋清蛋白质作为一种全价蛋白，其序列中以非活性状态存在具有生物活性的肽段，采用适当的水解方法将这些生物活性肽释放出来并发挥生理调节作用，同时改善蛋清蛋白质的功能性质，拓宽其应用范围，也是生产蛋白饮料的一种加工手段。

蛋白质水解一般分为酸法水解和酶法水解。酸法水解虽水解迅速彻底，但会产生腐黑质，而且如色氨酸、丝氨酸等氨基酸被破坏。酶对蛋白质的水解是一种不完全、不彻底的水解反应，其水解产物主要是肽而不是氨基酸，水解过程中不产生消旋作用，氨基酸未被破坏，与基因工程、化学合成等方法相比，酶法水解安全性极高、反应条件温和、易于控制水解度，而且水解产物除氨基酸外，还含有大量生物活性肽，国内外已有利用蛋清蛋白肽液生产功能性饮料。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用多种蛋白酶同时或分阶段水解鸡蛋清蛋白的方法。

本发明的技术方案是：首先获取鸡蛋清并加热变性，然后利用复合蛋白酶（Protamex）、中性蛋白酶（Neutrase）、碱性蛋白酶（Alcalase）和风味蛋白酶（Flavourzyme）中的两种或以上进行同时或者分阶段水解鸡蛋清蛋白（酶来自诺维信公司），制得鸡蛋清蛋白水解液。

当采用同时水解方法时，其步骤为：（1）先将新鲜鸡蛋洗净，然后分离出蛋清，蛋清与灭菌蒸馏水按照体积比1:3混合后在95℃加热变性20分钟，得酶水解用的原料；

（2）以上述蛋清原料为酶水解底物，先后加入碱性蛋白酶和风味蛋白酶：调节蛋清体积：蒸馏水体积为1:3，pH7.5，水浴预热到55℃，加入碱性蛋白酶4.0%，pH7.5，反应4小时，然后用NaOH溶液调节pH至6.0，温度55℃，加入风味蛋白酶2%，反应2小时；进行分步水解，获得鸡蛋清的蛋白水解液。

当采用分阶段水解时，可按前述步骤（1）制得酶水解用的原料；然后先后加入复合蛋白酶（Protamex）、中性蛋白酶（Neutrase）、碱性蛋白酶（Alcalase）和风味蛋白酶（Flavourzyme）中的至少两种进行分步水解；各种酶的水解条件可按各自的酶解条件进行调控。

复合蛋白酶（Protamex）的最佳水解条件为：温度55℃、pH7.0、酶量为7%、蛋清浓度为1:5，Protamex6h酶解物的蛋白残留率为6.82%，水解度达7.40%。

中性蛋白酶（Neutrase）最佳水解条件为温度55℃、pH6.0、酶量为5%、蛋清浓度为1:5，Neutrase6h酶解物的蛋白残留率为24.28%，水解度达3.71%。

碱性蛋白酶（Alcalase）最佳水解条件为温度55℃、pH7.5、酶量为6%、蛋清浓度为1:3或1:4，Alcalase6h酶解物的水解度可达18.73%。

风味蛋白酶（Flavourzyme）最佳水解条件为温度55℃、pH6.5、酶量为6%、蛋清浓度为1:5，Flavourzyme6h酶解物的蛋白残留率为27.68%，水解度达38.75%。

例如，先后加入碱性蛋白酶和风味蛋白酶进行分步水解，获得鸡蛋清的蛋白水解液的步骤是：以上述经变性的蛋清原料为酶水解底物，调节蛋清浓度为1:5（纯蛋清体积：蒸馏水体积），pH7.5，水浴预热到55℃，加入碱性蛋白酶2.0%，pH7.5，反应4小时，然后用NaOH溶液调节pH至6.0，温度55℃，加入风味蛋白酶4.0%，反应2小时。

由于单一的蛋白酶水解蛋白质具有专一性，单一使用只能使底物中相应的肽键断裂，当联合使用不同的酶，在酶作用位点方面可以产生互补性，提高水解度，增加蛋清蛋白肽得率。

具体实施方式

1）获得酶水解用的底物原料

将新鲜鸡蛋洗净，然后分离蛋清蛋黄，获得蛋清，蛋清与灭菌蒸馏水水按照体积比1:3混合，95℃加热变性20分钟，得酶水解用的原料。

实例1：以此蛋清原料为酶水解底物，加入复合蛋白酶（Protamex）中性蛋白酶（Neutrase）、风味蛋白酶（Flavourzyme）同时水解，获得鸡蛋清的蛋白水解液。

调节蛋清浓度为1:5（蛋清体积：蒸馏水体积），用HCl调节到pH6.5，水浴预热到55℃，加入复合蛋白酶（Protamex）1.5%、中性蛋白酶（Neutrase）1.5%、风味蛋白酶（Flavourzyme）3.0%（占稀释后蛋清重量的比），于恒温水浴振荡器(120r/min)中进行酶解反应，酶解反应期间用pH计监测蛋清液的pH，并通过滴加NaOH溶液来调节pH，使pH保持在6.5，反应6小时后，收集蛋清蛋白水解液，置沸水浴中灭活酶20min，使酶解反应终止。

凯氏定氮法测水解物总含氮量，甲醛滴定法测定水解物游离氨基酸含量。

在本水解条件下，获得的蛋清蛋白水解液水解率为53.24%。

筛选数据如下：

对于最适温度和pH相近的蛋白酶（Protamex，Neutrase，Flavourzyme），可将多种蛋白酶一起加入进行同时水解。Protamex，Neutrase，Flavourzyme三酶同时水解的温度设定为55℃，酶总量设定为6%，对水解时间、pH、酶比例和蛋清浓度4个因素进行正交设计，因素水平表如表1所示：

表1 P+N+F三酶同时水解鸡蛋清L₉(3⁴)正交试验因素水平表

以水解度为考察指标，Protamex,Neutrase,Flavourzyme三酶同时水解鸡蛋清的正交结果如表2所示，由极差分析可知，在55℃条件下，影响酶解反应的主次因素依次为：水解时间>pH>酶比例>蛋清浓度。Protamex,Neutrase,Flavourzyme三酶同时水解鸡蛋清的最优组合为A₂B₂C₂D₃，即水解时间为6h、pH6.5、酶比例为1:1:2、蛋清浓度为1:5。在此条件下，Protamex,Neutrase,Flavourzyme三酶同时水解鸡蛋清蛋白的水解度可达53.24%。

表2 P+N+F三酶水解蛋清蛋白正交结果水解度(%)

实例2：以此蛋清原料为酶水解底物，先后加入碱性蛋白酶（Alcalase）和风味蛋白酶（Flavourzyme）进行水解，获得鸡蛋清的蛋白水解液。

调节蛋清浓度为1:5（纯蛋清体积：蒸馏水体积），用NaOH调节到pH7.5，水浴预热到55℃，加入碱性蛋白酶（Alcalase）2.0%，于恒温水浴振荡器(120r/min)中进行酶解反应，酶解反应期间用pH计监测蛋清液的pH，并通过滴加NaOH溶液来调节pH，使pH保持在7.5，反应3小时后，用NaOH溶液调节pH至6.0，维持反应温度55℃，加入风味蛋白酶（Flavourzyme）4%，于恒温水浴振荡器(120r/min)中进行酶解反应，酶解反应期间用pH计监测蛋清液的pH，并通过滴加NaOH溶液来调节pH，使pH保持在6.0，反应3小时后，收集蛋清蛋白水解液，置沸水浴中灭活酶20min，使酶解反应终止。

在本水解条件下，获得的蛋清蛋白水解液水解率为45.05%。

筛选数据如下：

对于最适温度和pH相差较大的蛋白酶（Alcalase，Flavourzyme），应在前一种蛋白酶的最适温度、pH条件下(Alcalase：55℃，pH7.5)反应一定时间后，将反应底物溶液调至后一种蛋白酶的最适温度、pH(Flavourzyme：55℃，pH6.0)再加入后一种蛋白酶进行分阶段水解。Alcalase，Flavourzyme分阶段水解蛋清蛋白酶总用量设定为6%，对蛋清浓度、酶比例和水解时间3个因素进行正交设计，因素水平表如表3所示：

表3 A&F分阶段酶解鸡蛋清L₉(3⁴)正交试验因素水平表

以水解度为考察指标，Alcalase、Flavourzyme分阶段酶水解鸡蛋清的正交结果如表4所示，由极差分析可知，影响酶解反应的主次因素依次为：酶比例>蛋清浓度>水解时间。Alcalase,Flavourzyme分阶段酶水解鸡蛋清蛋白的最优组合为A₃B₁C₂，即蛋清浓度1:5、酶比例为1:2、水解时间各为3h。在此条件下，Alcalase,Flavourzyme分阶段酶水解鸡蛋清蛋白的水解度可达45.05%。

表4 Alcalase、Flavourzyme分阶段水解鸡蛋清蛋白正交结果水解度(%)

Claims

1.一种多种蛋白酶水解蛋清蛋白的方法，其特征在于首先获取鸡蛋清并加热变性，然后利用复合蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶中的两种或以上进行同时或者分阶段水解鸡蛋清蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）先将新鲜鸡蛋洗净，然后分离出蛋清，蛋清与灭菌蒸馏水按照体积比1:3混合后在95℃加热变性20分钟，得酶水解用的原料；

（2）以上述蛋清原料为酶水解底物，调节蛋清与蒸馏水体积比为1:4，按稀释后蛋清的重量比加入复合蛋白酶1.5%、中性蛋白酶3.0%、风味蛋白酶1.5%同时水解；在pH 6.5，55℃条件下反应5小时，获得鸡蛋清的蛋白水解液。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于具体步骤如下：

（2）以上述蛋清原料为酶水解底物，先后加入碱性蛋白酶和风味蛋白酶：调节蛋清体积：蒸馏水体积为1:3，pH 7.5，水浴预热到55℃，加入碱性蛋白酶4.0%， pH 7.5，反应4小时，然后用NaOH溶液调节pH至6.0，温度55℃，加入风味蛋白酶2%，反应2小时；进行分步水解，获得鸡蛋清的蛋白水解液。