CN102046782A - 产生酪蛋白水解物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用微生物内肽酶产生酪蛋白水解物的方法。
Description
涉及序列表
本申请含有计算机可读形式的序列表，所述计算机可读形式通过提述并入本文。
发明领域
本发明涉及使用微生物内肽酶产生酪蛋白水解物的方法。
发明背景
酪蛋白用于(例如，运动饮料中的)蛋白质强化(protein fortification)，以及用于其他膳食饮料(dietary drink)、干混饮料(dry blended beaverage)、营养条(nutritional bar)、婴儿配方(infant formula)等中。在一些情况下，发现酪蛋白水解物的过敏原性(allergenic)比乳清蛋白水解物低，这使得它们在，例如，婴儿配方中可能更加有用。可使用蛋白水解酶水解酪蛋白来制备酪蛋白水解物。在酪蛋白水解物的工业生产中，所述水解蛋白的高溶解度或可悬浮性无论从加工的角度，单纯产量/经济(yield/economical)的角度而言，还是口感和感觉特点(sensory attribute)而言都是重要的。因此，对本发明人来说一个目的是鉴定对于制备具有高溶解度(如在低pH具有高溶解度和/或在低或中等水解度具有高溶解度)的酪蛋白水解物有用的蛋白水解酶。
之前已经描述了发现可适用于本发明的内肽酶。例如，来源于拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)菌种NRRL 18262的内肽酶公开于WO 88/03947(其中，该菌株称为拟诺卡氏菌属菌种菌株10R)以及WO 01/58276。其他相关的根据本发明有用的内肽酶公开于WO88/03947、WO04/111220、WO04/111222、WO04/111223、WO05/123911和WO04/072279。
发明内容
本发明人鉴定了下述内肽酶，其被发现适用于制备具有高溶解度并得到均一悬浮物的酪蛋白水解物。所述内肽酶与本领域使用的其他内肽酶相比，当以等量的酶蛋白相比时更加有效，这导致酪蛋白水解物生产者的产物更经济。因此，本发明涉及产生酪蛋白水解物的方法，包括：a)将与SEQ ID NO：1具有至少50％同一性的内肽酶添加至包含酪蛋白的组合物；和b)温育以水解所述酪蛋白。
发明详述
内肽酶
本文中所使用的术语内肽酶是水解内肽键(internal peptide bond)的酶(具有内肽酶活性)。
对于根据本发明使用的内肽酶的来源并无限制。因此，术语内肽酶不仅包括天然或野生型的内肽酶，还包括其显示内肽酶活性的任何突变体、变体、片段等，以及合成的内肽酶，如经改组的内肽酶。可如本领域所公知的制备经遗传工程改造的内肽酶变体，例如，通过定点诱变，通过PCR(使用包含所需突变的PCR片段作为所述PCR反应中的引物之一)，或通过随机诱变。内肽酶变体的实例，如用于本上下文中，是其中一个或多个氨基酸被缺失、插入或以其他氨基酸取代的内肽酶。
根据本发明使用的内肽酶的实例是：
(i)来源于拟诺卡氏菌菌种NRRL 18262的内肽酶，其公开于WO01/58276，其序列如本申请文件的SEQ ID NO：1所示；
(ii)与(i)的内肽酶具有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90或至少95％氨基酸同一性的内肽酶；
(iii)(i)或(ii)的内肽酶显示内肽酶活性的突变体、变体或片段。
就本发明而言，两个氨基酸序列的比对可以通过使用EMBOSS程序包(http://emboss.org)版本2.8.0的Needle程序来确定。Needle程序执行Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453中描述的全局比对算法(global alignment algorithm)。使用的取代矩阵是BLOSUM62，缺口产生罚分(gap opening penalty)是10，并且缺口延伸罚分(gap extension penalty)是0.5。
两个氨基酸序列之间的同一性程度这样计算，用两个序列的比对中的精确匹配的数目除以两个序列中最短序列的长度。结果以百分比同一性表示。
当两个序列在重叠的相同位置具有相同的氨基酸残基时，出现精确匹配。序列的长度为序列中的氨基酸残基的数目(例如SEQ ID NO：1的长度是188)。
作为可适用于本发明的细菌内肽酶的实例，还可提及的是WO88/03947中公开的来自白拟诺卡氏菌(Nocardiopsis alba)(先前为达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)NRRL 18133的内肽酶；来自达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种(Nocardiopsis dassonvillei subsp.dassonvillei)DSM 43235、白拟诺卡氏菌DSM 15647、拟诺卡氏菌属菌种DSM 16424的内肽酶和合成的蛋白酶22，全部四种公开于WO04/111220中；WO04/111222中公开的来自葱绿拟诺卡氏菌(Nocardiopsis prasina)DSM 15648的内肽酶；WO04/111223中公开的来自葱绿拟诺卡氏菌DSM 15649的内肽酶；来自葱绿拟诺卡氏菌(先前为白拟诺卡氏菌)DSM 14010、嗜碱拟诺卡氏菌(Nocardiopsis alkaliphila)DSM44657和卢森坦拟诺卡氏菌(Nocardiopsis lucentensis)DSM 44048的内肽酶，全部三种公开于WO05/123911中；来自Brachysporiella gayana CGMCC 0865、绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、粘帚酶属菌种(Gliocladium sp.)CBS 114001、黑团孢属菌种(Periconia sp.)CBS 114002、黑团孢属菌种CBS 114000和新月弯孢(Curvularia lunata)CBS 114003的内肽酶，全部六种公开于WO04/072279中；以及这些显示内肽酶活性的突变体、变体或片段。
根据本发明使用的内肽酶是微生物内肽酶，优选细菌内肽酶，术语“细菌的(bacterial)”表明所述内肽酶衍生自或起源于细菌，或是源自细菌的类似物、片段、变体、突变体或合成内肽酶。其可在原始野生型细菌菌株中、在另一微生物菌株中或在植物中产生或表达；即所述术语涵盖野生型、天然存在的内肽酶的表达，以及重组内肽酶、遗传工程内肽酶或合成内肽酶在任何宿主中的表达。
在本发明的方法中，内肽酶可以是纯化的。术语“纯化的”用于本文包括富集了所述酶蛋白的酶蛋白制备物。上述富集可为，例如，去除了产生胞外酶蛋白的生物的细胞，通过蛋白质特异性沉淀去除非蛋白物质，或使用色谱法，其中所述酶蛋白被选择性吸附并从色谱基质中洗脱。所述内肽酶可经纯化至这样的程度使得仅仅存在少量的其他蛋白质。表述“其他蛋白质”具体而言指其他酶。用于本发明方法的内肽酶可为“基本上纯的(essentially pure)”，即，基本上不含来自产生它的生物的其他组分，所述生物可为天然存在的微生物，或经遗传修饰的供重组产生所述内肽酶的宿主微生物。
然而，对于本发明的使用，内肽酶不需要那么纯。其可以例如包括其他酶，甚至其他内肽酶。
在一个优选方面，用于本发明方法的内肽酶经纯化以含有总蛋白质中至少20％、优选至少30％、至少40％或至少50％(w/w)的所述内肽酶。内肽酶的量可由制备物活性测量值除以所述内肽酶的比活性(活性/mg EP)来计算，或可通过SDS-PAGE或本领域已知的任何其他方法来量化。总蛋白质的量可(例如)通过氨基酸分析来测定。
本发明的内肽酶的使用可以与其他酶(例如其他蛋白酶)的使用组合。在一个优选的实施方案中，将内肽酶，例如源自拟诺卡氏菌属菌种NRRL 18262的内肽酶，与外肽酶组合，或与具有外肽酶活性的蛋白酶制备物组合，例如源自米曲霉(Aspergillus oryzae)的蛋白酶制备物，如WO94/25580中所述，如Flavourzyme
(Novozymes A/S，Denmark)。
在一个具体实施方案中，当通过对酪蛋白的水解和后续的TCA可溶性肽与邻苯二醛(o-phthaldialdehyde)及2-巯基乙醇的反应，然后测量所得复合物在340nm的吸光度来进行测定时，用于本发明的内肽酶具有接近中性的pH-活性最优值(最适pH)。
术语pH活性最优值接近中性可意为所述内肽酶具有pH 5.5-11，优选pH7-11，更优选pH 8-11，甚至更优选pH 9.5-10.5的区间中，且最优选在大约pH 10的最适pH。
在另一具体实施方案中，用于本发明的内肽酶是热稳定的。
术语热稳定可意为，当如上所述通过酪蛋白水解确定时，在pH 9的最适温度为至少50℃或至少55℃，优选至少60℃，更优选至少65℃，且甚至更优选至少67℃，如约70℃。
酪蛋白水解物
在本发明的上下文中，酪蛋白是奶中主要的蛋白质组，其可构成奶和奶酪中所有蛋白质的75-80％。酪蛋白的可溶性形式可由酸和/或由干胃膜(rennet)来凝结(coagulate)。
在一个优选实施方案中，所述酪蛋白来自牛奶。
用于本发明方法的酪蛋白可为，例如，酪蛋白酸钠、酪蛋白酸钾或酪蛋白酸钙的形式。
在本发明方法中，所述酪蛋白物质通常在水中混合或分散以形成浆料，其包含按重量计约1％到约25％的蛋白质。在一个实施方案中，所述浆料可包含按重量计约1％到约5％的蛋白质。在另一个实施方案中，所述浆料可包含按重量计约6％到约10％的蛋白质。在另一个实施方案中，所述浆料可包含按重量计约11％到约15％的蛋白质。还在另一个实施方案中，所述浆料可包含按重量计约16％到约20％的蛋白质。还在另一个实施方案中，所述浆料可包含按重量计约21％到约25％的蛋白质。在一个优选实施方案中，所述浆料按重量计可包含约5％到约25％的蛋白质。
在将所述蛋白质物质分散于水中后，可调整所述蛋白质浆料的pH和/或温度从而优化水解反应，特别是保证用于所述水解反应的内肽酶的功能接近其最优活性水平。所述蛋白质浆料的pH可根据本领域公知的方法进行调整并监测。所述蛋白质浆料的pH可调整至约5到约10。在一个实施方案中，所述蛋白质浆料的pH可调整至约6到约9。在一个优选实施方案中，所述蛋白质浆料的pH可调整至约6.5到约8。所述蛋白质浆料的pH可在水解反应过程中保持在上述水平，或可允许随着水解反应的进行而减少。在水解反应过程中根据本领域公知的方法将所述蛋白质浆料的温度优选地调整并维持在约45℃到约70℃。在一个优选实施方案中，在水解反应过程中可将所述蛋白质浆料的温度调整并维持在约63℃到约70℃。一般而言，高于该范围的温度可能使所述内肽酶失活，而低于或高于该范围的温度会降低(slow)所述内肽酶的活性。
所述水解反应通常通过将所述内肽酶添加到蛋白质物质的浆料来起始。或者，所述酶可分散于水中，并一边搅拌一边缓慢添加所述蛋白质物质。在制备浓缩的蛋白质浆料以避免粘度过高时，后一方法可为有利的。
优选地，用于本发明方法的内肽酶量是每kg酪蛋白约0.005到约100AU(定义如下)，优选每kg酪蛋白约0.01到约50AU，更优选每kg酪蛋白约0.02到约30AU。
一个Anson单位(AU)定义为在标准条件下(即，25℃，pH7.5和10分钟反应时间)以下述初始速率消化血红蛋白的酶量，所述速率使得每分钟释放的TCA可溶性产物的量与一毫当量的酪氨酸在与酚试剂作用时得到相同的颜色。当确定AU活性时，血红蛋白的浓度可优选为约1.3％。
添加至蛋白质物质的内肽酶的量能够且会依赖于所述蛋白质物质的来源、所需的水解程度和水解反应的持续时间而变化。内肽酶的量的范围可为每千克酪蛋白约1mg酶蛋白到约5000mg酶蛋白。在一个优选实施方案中，所述量的范围可为每千克酪蛋白1mg酶蛋白到约1000mg酶蛋白。在另一个优选实施方案中，所述量的范围可为每千克酪蛋白约5mg酶蛋白到约500mg酶蛋白。
如本领域技术人员所理解的，水解反应的持续时间能够且会变化。一般而言，水解反应的持续时间的范围可为几分钟到许多小时，如约30分钟到约48小时。
优选地，用内肽酶处理具有约0.1％到约20％，更优选约0.5％到约10％，或约0.5％到约8％，甚至更优选约2％到约8％的水解度(DH)的酪蛋白水解物。
水解度(DH)表示通过所述方法获得的蛋白质水解的程度。在本发明的上下文中，水解度(DH)定义如下：
DH＝(被切割的肽键的数目/肽键总数)x100％
本领域技术人员会知道如何测量DH。其可，例如，使用如Adler-Nissen，J.，1986，Enzymatic Hydrolysis of Food Proteins，第5章，第122-124页所述的方法进行。
在完成步骤b)之后，可将所述内肽酶失活。上述失活可通过本领域任何抑制方法进行，例如，通过加热至至少75℃，如至少80℃或至少85℃。
在一个实施方案中，本发明方法进一步包含用一种或多种另外的具有蛋白酶活性的酶处理所述酪蛋白组合物。上述另外的蛋白水解酶可为一种或多种内肽酶和/或一种或多种外肽酶。所述一种或多种外肽酶可为，例如，一种或多种氨肽酶和/或一种或多种羧肽酶。
用具有与SEQ ID NO：1至少50％的同一性的内肽酶进行温育，和用一种或多种另外的具有蛋白酶活性的酶进行温育可不同时进行。即，如果所述蛋白水解酶并不在相同的pH和/或相同的温度下起作用，则可将所述酪蛋白组合物先与一种(或多种)蛋白水解酶温育，然后是任选地调整pH和/或温度和随后与其他蛋白水解酶温育。
当使用一种或多种另外的具有蛋白酶活性的酶时，所得的酪蛋白水解物可具有高于上面所示的水解度(DH)。其可，例如，具有约5-25％的水解度。
由本发明方法获得的酪蛋白水解物可用于食品，例如，饮料。本发明的食品可为任何意欲供人食用的产物。上述食品的非限制性实例包括营养条、干混饮料、运动饮料、能量饮料(energy drink)和婴儿配方。通过本发明方法获得的酪蛋白水解物还可用于临床营养(clinical nutrition)，例如，在医院中。
实施例
用来自拟诺卡氏菌菌种NRRL18262具有SEQ ID NO：1所示的序列的内肽酶和Alcalase
2.4L(Novozymes A/S，Denmark)水解酪蛋白酸钠的比较。
用蛋白酶水解：
蛋白质制备
来自Arla Foods，Denmark的酪蛋白酸钠，Miprodan 30，88％蛋白质：15g+285g水。
将所述酪蛋白酸(盐)产物用脱矿物质水(demineralised water)(Milli Q)悬浮为5％w/v悬液。将水加热至60℃，并将所述蛋白质添加至所述Milli Q水中同时在混合器(blender)中搅拌1-2分钟，或直至所述蛋白质悬浮或溶解。
pH调整：
将pH用4N NaOH调整为8.0，并在水解反应过程中保持。
酶剂量：
将所述拟诺卡氏菌属蛋白酶和Alcalase 2.4L以10、50和100mg酶蛋白(ep)/kg蛋白质剂量添加。在操作时将酶储存于冰上。
酶处理：
温度：60℃+/-1℃
时间：120分钟
在磁搅拌器上在水浴中将酶添加至所述蛋白质悬液。当蛋白质溶液的温度达到60℃时添加酶。
热失活/储存：
在酶处理后，立刻将试样在85℃在振荡水浴中热处理15分钟。将试样在冰上冷却，并冷藏于4℃过夜。
在4℃温育过夜后，评价溶解度和水解度。
溶解度：
使用Leco FP 528蛋白质/氮分析仪在pH 4.0和6.5测量溶解度，其通过燃烧法(combustion method)测定蛋白质和氮含量。所述氮含量在可溶性级分中测定，且将溶解度计算为总干物质含量中氮含量的百分比。
水解度：
如Adler-Nissen，J.，1986，Enzymatic Hydrolysis of Food Proteins，第5章，第122-124页所述通过pH恒定法(pH stat)来测量所述悬液的水解度。
结果：
水解度：
溶解度pH 6.5：
溶解度pH 4.0：
结论：
可见，在给定蛋白酶浓度，来自拟诺卡氏菌属的内肽酶给出与Alcalase相似或适度较低的水解度。然而，在pH 6.5，发现无论在给定蛋白酶浓度还是在给定水解度，用拟诺卡氏菌属内肽酶得到的溶解度通常高于用Alcalase得到的。而且在pH 4.0，用拟诺卡氏菌属内肽酶获得的水解物的溶解度/DH明显高于用Alcalase获得的水解物。在pH 6.5，未水解的对照的溶解度高于经水解的产物的溶解度。然而从功能的角度而言，即，考虑到乳化能力和过敏原性，常常期望具有一定的蛋白质水解(DH增加)，而从感觉的角度而言，DH不应过高，因为DH增加常常导致所述酪蛋白水解物苦味增加。
此外，当使用拟诺卡氏菌属内肽酶作为催化剂时，视觉观察(visual inspection)发现均一的悬浮液，而Alcalase在所述给定条件下得到的悬液则不均一(块状物形成)。
Claims (14)
1.一种产生酪蛋白水解物的方法，包括：
a)向包含酪蛋白的组合物添加与SEQ ID NO：1具有至少50％同一性的内肽酶；和
b)温育以水解所述酪蛋白。
2.权利要求1的方法，其中所述内肽酶与SEQ ID NO：1具有至少60％的同一性。
3.权利要求1的方法，其中所述内肽酶与SEQ ID NO：1具有至少80％的同一性。
4.前述任一项权利要求的方法，其中所述内肽酶的最适pH为pH 9.5至pH 10.5。
5.前述任一项权利要求的方法，其中在pH 9时所述内肽酶的最适温度为至少60℃。
6.前述任一项权利要求的方法，其中所述内肽酶来自拟诺卡氏菌属。
7.前述任一项权利要求的方法，其中所述内肽酶以每kg酪蛋白1到1000mg酶蛋白的浓度添加。
8.前述任一项权利要求的方法，其中所述内肽酶以每kg酪蛋白0.01到50AU的活性添加。
9.前述任一项权利要求的方法，其中所述组合物包含约5％到约25％酪蛋白。
10.前述任一项权利要求的方法，其中所述酪蛋白水解物具有至少2％的水解度。
11.前述任一项权利要求的方法，其进一步包括用一种或多种另外的具有蛋白酶活性的酶处理所述酪蛋白组合物。
12.前述任一项权利要求的方法，其进一步包括用一种或多种外肽酶处理所述酪蛋白组合物。
13.由前述任一项权利要求的方法产生的酪蛋白水解物。
14.由权利要求1-12任一项所述的方法产生的酪蛋白水解物在食品中的用途。
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