CN107002111A

CN107002111A - 用于生产蛋白质水解产物的方法

Info

Publication number: CN107002111A
Application number: CN201580064828.6A
Authority: CN
Inventors: G·B·林格雷夫
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2014-12-01
Filing date: 2015-12-01
Publication date: 2017-08-01
Also published as: EP3227456A1; CA2967538A1; NZ731727A; AU2015357195B2; AU2015357195A1; WO2016087427A1; US20190032102A1; US10619177B2

Abstract

本发明涉及生产蛋白质水解产物的方法，该方法包括在高温下进行酶促蛋白质水解的步骤。

Description

用于生产蛋白质水解产物的方法

对序列表的引用

本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。

发明领域

本发明涉及蛋白质水解产物的酶促生产。

发明背景

蛋白质水解产物是使用部分或完全水解从蛋白质来源生产的多肽、寡肽和/或氨基酸的混合物。对具有许多用途(例如，在人类营养中，例如，作为能量饮料、体重控制产品和运动营养产品中的成分，作为老年人和体重不足患者的营养来源，以及在风味行业中的用途)的蛋白质水解产物制剂的兴趣日益增长。该蛋白质可以来源于植物，例如大豆、小麦或玉米，或来源于动物，例如奶、蛋、肉或鱼。

食品工业中蛋白质水解产物的生产涉及酶促、酸性或碱性蛋白质水解。化学水解难以控制，并降低了产品的营养质量。酶促水解工作不会破坏氨基酸，并且通过避免化学水解所需的极端温度和pH水平，蛋白质水解产物的营养特性在很大程度上不受影响。

然而，对于酶促水解的蛋白质，获得的蛋白质产率和水解度(DH)通常是有限的。

限制水解产率和水解度的关键因素是待水解的底物蛋白质的构象。未展开的蛋白质，例如球蛋白将通常比展开的蛋白质更难以降解，因为对于这些蛋白酶更难以降展开的蛋白质。各种试剂和条件都可能引起变性，并导致该蛋白质的二级结构和三级结构的破坏。热可用于破坏氢键和非极性疏水相互作用(负责二级和三级结构)等；加热导致分子如此迅速和剧烈地振动，使得这些键/相互作用被破坏。

通常的做法是在添加蛋白质水解酶之前进行热处理来使底物蛋白质展开或变性；然而，这不是最佳方法，因为展开或变性通常需要高温，在该高温下所应用的蛋白质水解酶是不稳定的和/或不处于其最佳活性。特别是外肽酶具有低的热稳定性。在展开后降低温度将使得蛋白质能够以降低蛋白质降解效率的方式再聚集。

本发明的目的是提供具有改进特性，如高溶解度、高水解度、高蛋白质产率和/或令人愉悦的风味的蛋白质水解产物。

发明概述

本发明提供两步程序，其中底物蛋白质首先在足够高的温度下被内肽酶降解，以确保底物蛋白质是展开的/变性的，并且还防止底物蛋白质再聚集。通过使用热稳定性内肽酶进行此水解。优选地，该热稳定性内肽酶是非特异性的。非特异性使得该内肽酶将底物蛋白质降解到具有有限再聚集能力的相对小的肽。

在高温下进行第一水解步骤后，降低温度，并且使用具有高氨基肽酶活性的蛋白酶制剂进行第二水解步骤。优选地，该蛋白酶制剂还具有高的羧肽酶活性。此第二水解步骤提供了肽的深度水解。

本发明提供了用于生产蛋白质水解产物的方法，该方法包括：

a)向包括底物蛋白质的组合物中添加热稳定性内肽酶；

b)通过在至少75℃的温度下将步骤a)的组合物孵育至少10分钟来进行第一水解步骤；

c)向步骤b)的组合物中添加蛋白酶制剂，该制剂具有至少200LAPU/g的氨基肽酶活性；并且

d)通过在比步骤b)中使用的温度低至少10℃的温度下将步骤c)的组合物孵育至少10分钟来进行第二水解步骤。

本发明还提供了用于生产蛋白质水解产物的方法，该方法包括：

a)向包括底物蛋白质的组合物中添加热稳定性内肽酶，该内肽酶(i)与SEQ IDNO:3的多肽具有至少60％序列一致性，(ii)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性的多核苷酸编码，或(iii)是在一个或多个位置处包括取代、缺失和/或插入的SEQ ID NO:3的多肽的变体；并且

b)在至少75℃的温度下将步骤a)的组合物孵育至少10分钟。

发明详细说明

底物蛋白质

在本发明所述方法中使用的底物蛋白质可以是大豆蛋白质。可以使用各种大豆蛋白质材料。通常，大豆蛋白质材料根据本领域已知的方法可以来源于全大豆。全大豆可以是标准大豆(即非转基因大豆)、转基因大豆或其组合。大豆蛋白质材料的合适实例包括大豆提取物、大豆奶、大豆奶粉、大豆凝乳、大豆面粉(soy flour)、分离的大豆蛋白质、大豆蛋白质浓缩物、及其混合物。

该大豆蛋白质可以是大豆蛋白质分离物(也称为分离的大豆蛋白质或ISP)。一般来说，大豆蛋白质分离物在无湿度的基础上具有至少约90％的大豆蛋白质的蛋白质含量。大豆蛋白质分离物可以包括完整的大豆蛋白质，或者其可以包括部分水解的大豆蛋白质。

大豆蛋白质可以是大豆蛋白质浓缩物。通常，大豆蛋白质浓缩物在无水基础上具有约65％至小于约90％的蛋白质含量。可替代地，大豆蛋白质可以是与大豆蛋白质分离物共混的大豆蛋白质浓缩物，以取代一部分大豆蛋白质分离物作为大豆蛋白质材料的来源。典型地，如果将大豆蛋白质浓缩物取代一部分大豆蛋白质分离物，则大豆蛋白质浓缩物按重量计最多取代多达约40％的大豆蛋白质分离物，并且更优选地按重量计取代多达约30％的大豆蛋白质分离物。

大豆蛋白质可以是大豆面粉。通常，大豆面粉在无水基础上具有约49％至约65％的蛋白质含量。大豆面粉可以是脱脂大豆面粉、部分脱脂大豆面粉或全脂大豆面粉。大豆面粉可以与大豆蛋白质分离物或大豆蛋白质浓缩物共混。

在本发明材料的方法中使用的底物蛋白质可以来源于除大豆以外的植物。作为非限制性实例，合适的植物包括苋菜、竹芋、大麦、荞麦、卡诺拉、木薯、鳢属(channa)(鹰嘴豆)、豆类、扁豆、羽扇豆、玉蜀黍、小米，燕麦、豌豆、马铃薯、稻、黑麦、高粱、向日葵、木薯、黑小麦、小麦及其混合物。特别优选的植物蛋白质包括大麦、卡诺拉、羽扇豆、玉蜀黍、燕麦、豌豆、马铃薯、稻、小麦及其组合。在一个实施例中，植物蛋白质材料可以是卡诺拉粕、卡诺拉蛋白质分离物、卡诺拉蛋白质浓缩物、及其组合。在另一个实施例中，植物蛋白质材料可以是玉蜀黍或玉米蛋白质粉、玉蜀黍或玉米蛋白质浓缩物、玉蜀黍或玉米蛋白质分离物、玉蜀黍或玉米胚芽、玉蜀黍或玉米谷蛋白、玉蜀黍或玉米谷蛋白粕、玉蜀黍或玉米面粉、玉米蛋白质、及其组合。在再另一个实施例中，植物蛋白质材料可以是大麦粉、大麦蛋白质浓缩物、大麦蛋白质分离物、大麦粕、大麦面粉及其组合。在替代实施例中，植物蛋白质材料可以是羽扇豆面粉、羽扇豆蛋白质分离物、羽扇豆蛋白质浓缩物、及其组合。在另一替代实施例中，植物蛋白质材料可以是燕麦片、燕麦面粉、燕麦蛋白面粉、燕麦蛋白质分离物、燕麦蛋白质浓缩物、及其组合。在又另一个实施例中，植物蛋白质材料可以是豌豆面粉、豌豆蛋白质分离物、豌豆蛋白质浓缩物、及其组合。在再另一个实施例中，植物蛋白质材料可以是马铃薯蛋白质粉、马铃薯蛋白质分离物、马铃薯蛋白质浓缩物、马铃薯面粉、及其组合。在另外的实施例中，植物蛋白质材料可以是大米面粉、大米粕、大米蛋白粉、大米蛋白质分离物、大米蛋白质浓缩物、及其组合。在另外的替代实施例中，植物蛋白质材料可以是小麦蛋白质粉、小麦谷蛋白、小麦胚芽、小麦面粉、小麦蛋白质分离物、小麦蛋白质浓缩物、溶解的小麦蛋白质、及其组合。

在本发明材料的方法中使用的底物蛋白质可以来源于动物来源。在一个实施例中，动物蛋白质材料可以来源于蛋。合适的蛋蛋白质的非限制性实例包括粉末状蛋，干蛋固体，干蛋白蛋白质，液蛋白蛋白质，蛋白蛋白质粉，分离的卵白蛋白蛋白质及其组合。蛋蛋白质可以来源于鸡、鸭、鹅、鹌鹑或其他鸟类的蛋。在替代实施例中，蛋白质材料可以来源于乳源。合适的乳蛋白包括非脂干奶粉、奶蛋白质分离物、奶蛋白质浓缩物、酸性酪蛋白、酪蛋白酸盐(例如酪蛋白酸钠、酪蛋白酸钙等)、乳清蛋白质分离物、乳清蛋白质浓缩物、及其组合。奶蛋白质材料可以来源于牛、山羊、绵羊、驴、骆驼、骆驼科动物、牦牛、水牛等。在另外的实施例中，蛋白质可以来源于陆上动物或水生动物的肌肉、器官、结缔组织、或骨骼。作为实例，动物蛋白质可以是动物胶，其通过对从牛或其他动物的骨、结缔组织、器官等中提取的胶原蛋白进行部分水解而产生。

在本发明材料的方法中使用的底物蛋白质可以是以上列出的蛋白质材料中的两种或更多种的组合。

在优选的实施例中，底物蛋白质选自大豆蛋白质、小麦谷蛋白蛋白质或乳清蛋白质。在更优选的实施例中，底物蛋白质是大豆蛋白质。

在本发明所述的方法中使用的底物蛋白质通常混合或分散在水中以形成包括底物蛋白质的水性组合物。

包括底物蛋白质的组合物可以具有至少1％(w/w)，优选至少5％(w/w)，更优选至少8％(w/w)的干物质含量。包括底物蛋白质的组合物可以具有1％-75％(w/w)，优选5％-40％(w/w)，更优选8％-30％(w/w)的干物质含量。

可以根据本领域通常已知的方法调节和监测包括底物蛋白质的组合物的pH。可以调节组合物的pH并保持在从约pH 5至约pH 10。在一个实施例中，可以调节组合物的pH并保持在从约pH 6.5至约pH 9。在优选的实施例中，可以调节组合物的pH并保持在约pH 7-8。在另一个实施例中，不调整包括底物蛋白质的组合物的pH。

热稳定性内肽酶

在本发明所述的方法中，将热稳定性内肽酶添加到包括底物蛋白质的组合物中。

可以通过使用实例所述的测定之一来确定内肽酶活性。

在本发明的上下文中，热稳定性内肽酶可以被定义为一种内肽酶，在80℃和在该内肽酶表现出其最大活性的至少40％的pH下孵育15分钟后，相对于其在37℃下孵育后的活性，该内肽酶具有至少80％的残留活性。

在本发明的上下文中，热稳定性内肽酶可以被定义为一种内肽酶，在80℃和pH 9下孵育15分钟后，相对于其在37℃下孵育后的活性，该内肽酶具有至少80％的残留活性。

可以使用如实例中所述的残留活性测量测定来确定残留活性。

优选地，热稳定性内肽酶是一种内肽酶，在90℃和在该内肽酶表现出其最大活性的至少40％的pH下孵育15分钟后，相对于其在37℃下孵育后的活性，该内肽酶具有至少80％的残留活性。更优选地，热稳定性内肽酶是一种内肽酶，在95℃和在该内肽酶表现出其最大活性的至少40％的pH下孵育15分钟后，相对于其在37℃下孵育后的活性，该内肽酶具有至少80％的残留活性。

热稳定性内肽酶可以是一种内肽酶，其在80℃、优选90℃、更优选95℃和pH 9下孵育15分钟后，相对于其在37℃下孵育后的活性，具有至少80％的残留活性。

热稳定性内肽酶可以具有至少20％，优选至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的SEQ ID NO:3的多肽的内肽酶活性。技术人员将知道如何确定内肽酶活性，例如通过使用实例所述的测定之一。

在优选的实施例中，在80℃和pH 9下孵育15分钟后，该热稳定性内肽酶具有至少20％，优选至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的SEQ ID NO:3的多肽的内肽酶活性，其中根据相对活性测定测量内肽酶活性。

在优选的实施例中，热稳定性内肽酶是非特异性内肽酶。技术人员将知道内肽酶是否是特异性内肽酶，其例如在Arg或Lys之后切割，或者内肽酶是否是非特异性内肽酶。非特异性内肽酶也可以表征为具有广泛特异性的内肽酶。

非特异性内肽酶特征在于，在该内肽酶表现出其最大活性的至少40％的温度和pH下，将0.5％(w/w)BSA与内肽酶孵育4小时导致至少10％，优选至少15％的水解度。

在一些实施例中，已经分离了热稳定性内肽酶。

在一些实施例中，该热稳定性内肽酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、在至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。该热稳定性内肽酶可以与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有多达10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的差异。

在本发明的上下文中，术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N末端加工、C末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸111至523。在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达一种多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生一种不同的成熟多肽(例如，具有一个不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。

已经使用SDS-PAGE凝胶内消化和液相色谱和高分辨质谱法将SEQ ID NO:2的成熟多肽经实验地确定为氨基酸111-523。已经制作了肽图，其涵盖了包括N-末端和C-末端的成熟序列的68％。

在本发明的上下文中，术语“序列一致性”是两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性的量度。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的尼德尔的输出(使用非简化选项(nobrief option)获得)用作一致性百分比并且计算如下：

(相同残基x100)/(比对的长度-在比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的尼德尔的输出(使用非简化选项获得)用作一致性百分比并且计算如下：

(相同脱氧核糖核苷酸x100)/(比对的长度-在比对中的空位总数)。

在一些实施例中，该热稳定性内肽酶与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、在至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。该热稳定性内肽酶可以与SEQ ID NO:3的多肽具有多达10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的差异。

在一些实施例中，该热稳定性内肽酶包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其等位变体，或由其组成。

在一些实施例中，该热稳定性内切酶由如下的多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在本发明的上下文中，术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有内肽酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸331至1569。

在一些实施例中，热稳定性内肽酶是SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体，该变体包括在一个或多个(例如，若干个)位置处的取代、缺失和/或插入。在一些实施例中，引入SEQ IDNO:2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在一些实施例中，热稳定性内肽酶是SEQ ID NO:3的多肽的变体，该变体包括在一个或多个(例如，若干个)位置处的取代、缺失和/或插入。在一些实施例中，引入SEQ ID NO:3的多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在本发明的上下文中，术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的具有内肽酶活性的多肽。取代意指用不同的氨基酸置换占用位置的氨基酸；缺失意指去除占据位置的氨基酸；并且插入意指邻近于并且紧跟着占据位置的氨基酸之后添加一个或多个(例如，若干个)氨基酸(例如，1-5个氨基酸)。

这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；小缺失，典型地为1-30个氨基酸；小的氨基或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能，如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域，来促进纯化的小的延伸。

保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979，在蛋白质(The Pro-teins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。

可替代地，这些氨基酸改变具有如下此种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，这些氨基酸改变可以影响多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。

可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一种技术中，在分子中的每个残基上引入单一丙氨酸突变，并且测试所得的突变型分子的内肽酶活性以鉴别对分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contract site)氨基酸进行突变。参见，例如德沃斯(de Vos)等人，1992，科学255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生物化学学会联盟通讯(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴定必需氨基酸。

可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；Ner(内尔)等人，1988，DNA 7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量的自动化筛选方法进行组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(NatureBiotechnology)17:893-896)。可以从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

在本发明所述方法中使用的热稳定内肽酶可以从任何属的微生物获得。出于本发明的目的，如在此与给出的来源结合使用，术语“从…获得”应当意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，将从给定来源获得的多肽分泌至细胞外。

热稳定性内肽酶可以从表征为超嗜热菌的生物获得。该内肽酶可以从超嗜热细菌获得，例如从热孢菌属、栖热腔菌属、闪烁杆菌属、产水菌属、热杆菌属、Thermocrinis，或者可以从古细菌获得，例如从硫化叶菌属、金属球菌属、酸菌属、憎叶菌属、硫化小球菌属、Sulfurisphaera、热变形菌属、热棒菌属、热丝菌属、热分支菌属、暖枝菌属、硫还原球菌属、葡萄热球菌属、厌硫球菌属、施铁特菌属(Stetteria)、气火菌属、燃球菌属、热球形菌属、热盘菌属、热网菌属、超热菌属、火叶菌属、高温球菌属、火球菌属、古生球菌属、铁球菌属、甲烷嗜热菌属、产甲烷球菌属、甲烷火菌属。

在一些优选的实施例中，该热稳定性内肽酶可从火球菌属获得。在一些优选的实施例中，该热稳定性内肽酶可以从强烈火球菌获得。

火球菌属的株系可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)、以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该热稳定性内肽酶。用于直接地从自然生活环境分离微生物和DNA的技术是本领域中熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该热稳定性内肽酶的多核苷酸。一旦已经用一个或多个探针检测到编码热稳定性内肽酶的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的多种技术来分离或克隆该多核苷酸(参见，例如萨拉布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。

在一些优选的实施例中，热稳定性内肽酶可以是从火球菌属获得的内肽酶的变体。在一些优选的实施例中，热稳定性内肽酶可以是从强烈火球菌获得的内肽酶的变体。

热稳定性内肽酶可以是从任何生物获得的内肽酶的变体，例如来自表征为超嗜热菌的生物，例如来自上文列出的超嗜热生物中之一。可替代地，热稳定性内肽酶可以是从不是超嗜热菌的生物获得的内肽酶的变体，如具有较高热稳定性的变体。

在一些实施例中，内肽酶是S8内肽酶，例如来自火球菌属，优选来自强烈火球菌的S8蛋白酶。

在一些实施例中，该热稳定性内肽酶与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、在至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。该热稳定性内肽酶可以与SEQ ID NO:4的多肽具有多达10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的差异。

在一些实施例中，该热稳定性内肽酶包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其等位变体，或由其组成。

在一些实施例中，热稳定性内肽酶是SEQ ID NO:4的成熟多肽的变体，该变体包括在一个或多个(例如，若干个)位置处的取代、缺失和/或插入。在一些实施例中，引入SEQ IDNO:4的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在一些优选的实施例中，热稳定性内肽酶可从葱绿拟诺卡菌(Nocardiopsisprasina)获得。

在一些实施例中，热稳定性内肽酶可以是从拟诺卡菌属获得的内肽酶的变体。在一些实施例中，热稳定性内肽酶可以是从葱绿拟诺卡菌获得的内肽酶的变体。

在一些实施例中，热稳定性内肽酶可以是丝氨酸蛋白酶，例如来自拟诺卡菌属(Nocardiopsis)，优选来自葱绿拟诺卡菌的丝氨酸蛋白酶。

在一些实施例中，该热稳定性内肽酶与SEQ ID NO:6的成熟多肽，例如SEQ ID NO:6的氨基酸183-368具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。该热稳定性内肽酶可以与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有多达10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的差异。

在一些实施例中，该热稳定性内肽酶包括SEQ ID NO:6的成熟多肽的氨基酸序列或其等位变体，或由其组成。

在一些实施例中，热稳定性内肽酶是SEQ ID NO:6的成熟多肽的变体，该变体包括在一个或多个(例如，若干个)位置处的取代、缺失和/或插入。在一些实施例中，引入SEQ IDNO:6的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在一些实施例中，该热稳定性内肽酶与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、在至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。该热稳定性内肽酶可以与SEQ ID NO:8的多肽具有多达10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的差异。

在一些实施例中，热稳定性内肽酶包括SEQ ID NO:8的多肽的氨基酸序列或其等位变体，或由其组成。

在一些实施例中，热稳定性内肽酶是SEQ ID NO:8的多肽的变体，该变体包括在一个或多个(例如，若干个)位置处的取代、缺失和/或插入。在一些实施例中，引入SEQ ID NO:8的多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在一些优选的实施例中，热稳定性内肽酶可以从嗜热双岐菌属(Thermobifida)获得。在一些优选的实施例中，热稳定性内肽酶可从嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)获得。

在一些实施例中，热稳定性内肽酶可以是从嗜热双岐菌属获得的内肽酶的变体。在一些实施例中，热稳定性内肽酶可以是从嗜热裂孢菌获得的内肽酶的变体。

在一些实施例中，热稳定性内肽酶可以是S1A蛋白酶，例如来自嗜热双岐菌属，优选来自嗜热裂孢菌的S1A蛋白酶。

热稳定性内肽酶可以是WO 2011/072191中披露的具有较高热稳定性的来自金黄色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的蛋白酶的变体之一。

添加到包括底物蛋白质的组合物中的热稳定性内肽酶的量可以且将根据底物蛋白质的来源、所需的水解度和水解反应的持续时间而变化。热稳定性内肽酶的量的范围可以从约1mg酶蛋白质至约5000mg酶蛋白质/千克干物质。在另一个实施例中，该量范围可以从10mg酶蛋白质至约2000mg的酶蛋白质/千克干物质。在又另一个实施例中，该量范围可以从约50mg酶蛋白质至约1000mg酶蛋白质/千克干物质。

用热稳定性内肽酶水解底物蛋白质

添加热稳定性内肽酶后，将组合物在至少75℃的温度下孵育至少10分钟。在一些优选的实施例中，将组合物孵育至少30分钟，例如至少1小时或至少2小时。在一些优选的实施例中，将组合物孵育10分钟至20小时，例如30分钟至10小时或1-8小时。

在一些优选的实施例中，将组合物在至少80℃，例如至少85℃，至少90℃或至少95℃的温度下孵育。在一些优选的实施例中，将组合物在75℃-120℃，例如80℃-115℃，85℃-110℃，90℃-105℃或95℃-100℃的温度下孵育。

用具有氨基肽酶活性的蛋白酶制剂进行第二水解

在本发明的一些方面，在用热稳定性内肽酶进行第一水解步骤之后，将具有至少200LAPU/g的氨基肽酶活性的蛋白酶制剂添加到组合物中，并且在比第一水解步骤中使用的温度低至少10℃的温度下孵育至少10分钟来进行第二水解步骤。

在第一水解步骤之后，可以根据本领域通常已知的方法调节组合物的pH。可以调节组合物的pH并在第二水解步骤期间保持在从约pH 5至约pH 10。在一个实施例中，可以调节组合物的pH并保持在从约pH 7至约pH 9，例如约pH 8。在优选的实施例中，在第二水解步骤之前不调节组合物的pH。

蛋白酶制剂可以具有至少300LAPU/g，优选至少500LAPU/g，更优选至少1000LAPU/g的氨基肽酶活性。一个LAPU(亮氨酸氨基肽酶)被定义为在37℃，pH 8.0下每分钟水解1mmol L-亮氨酸对硝基苯胺的量。在405nm处测量产物对硝基苯胺的吸收增加，并且该增加与酶活性成比例。

该蛋白酶制剂可以具有200-5000LAPU/g，优选500-2000LAPU/g的氨基肽酶活性。

优选地，以至少1LAPU/g干物质，优选至少5LAPU/g干物质，更优选至少8LAPU/g干物质的总量添加的蛋白酶制剂。

优选地，该蛋白酶制剂具有至少5CPDU/g，优选至少10CPDU/g，更优选至少20CPDU/g的羧肽酶活性。一个CPDU(羧肽酶单位)被定义为在37℃，pH 5.8下每分钟水解1微摩尔N-(3-[2-呋喃基]丙烯酰)-Ala-Lys的酶的量。在340nm处测量吸收减少，并且该减少与酶活性成比例。

该蛋白酶制剂可以具有5-2000CPDU/g，优选10-1000CPDU/g的羧肽酶活性。

优选地，以至少0.02CPDU/g干物质，优选至少0.1CPDU/kg干物质，更优选至少0.15CPDU/kg干物质的总量添加的蛋白酶制剂。

在优选的实施例中，该蛋白酶制剂包括至少五种蛋白水解组分，每种蛋白质水解组分分别具有选自23kD、27kD、31kD、32kD、35kD、38kD、42kD、47kD、53kD和100kD的近似分子量。在另一个优选的实施例中，该蛋白酶制剂包括分别具有近似分子量23kD、31kD、35kD、38kD和53kD的至少五种蛋白水解组分。

优选地，该蛋白酶制剂衍生自真菌，更优选地丝状真菌。

在优选的实施例中，该蛋白酶制剂衍生自曲霉属，优选地衍生自米曲霉。

该蛋白酶制剂可以是衍生自在WO 94/25580中所述的米曲霉的蛋白酶制剂。

该蛋白酶制剂可以是衍生自由诺维信公司(Novozymes A/S)以商品名提供的米曲霉的蛋白酶制剂。该蛋白酶制剂可以是来自米曲霉(天野公司(Amano))菌株的蛋白酶制剂蛋白酶A“Amano”2SD。

在第一水解步骤之后，将组合物的温度调节至比第一水解步骤中使用的温度低至少10℃的温度。可以在添加蛋白酶制剂之前、期间或之后调节温度。优选地，在添加蛋白酶制剂之前调节温度。

添加蛋白酶制剂后，将该组合物在此温度下孵育至少10分钟。在一些优选的实施例中，将该组合物在添加蛋白酶制剂后孵育至少30分钟，优选至少1小时，例如至少2小时或至少4小时。在一些优选的实施例中，将该组合物在添加蛋白酶制剂后孵育10分钟至72小时，例如1-48小时或2-24小时。

在一些优选的实施例中，将该组合物在30℃-65℃，例如35℃-60℃、40℃-60℃或45℃-55℃的温度下孵育。

可以在添加蛋白酶制剂的同时或之后添加能够将Gln转化成Glu的酶。它可以是例如谷氨酰胺酶或γ-谷氨酰基转肽酶。

获得的蛋白质水解产物

通过本发明所述的方法获得的蛋白质水解产物的水解度可以并将根据底物蛋白质的来源、所使用的蛋白酶和水解反应的完成度而变化。

水解度(DH)是指切割的肽键与肽键的起始数目的百分比。例如，如果包含五百个肽键的起始蛋白质被水解直到五十个肽键被切割，则所得水解产物的DH为10％。水解度可以使用三硝基苯磺酸(TNBS)比色法或邻苯二醛(OPA)方法来确定，如实例中详述的。水解度越高，蛋白质水解的程度越大。

如果底物蛋白质是大豆蛋白质，则通过本发明所述的方法获得的蛋白质水解产物的水解度可以为至少10％，更优选至少15％、至少20％或至少30％。在一些实施例中，蛋白质水解产物的水解度为10％-100％，优选15％-80％或20％-60％。优选地，使用OPA方法确定水解度。

通过本发明所述的方法获得的蛋白质水解产物的溶解度可以并且将根据底物蛋白质来源、所用蛋白酶和组合物的pH而变化。溶解度是固体(即多肽片段)在蛋白质水解产物中的溶解度的量度。可溶性固体的量可以通过测量离心前后溶液中固体的量来估算(例如约500-1000x g持续约5-10min)。可替代地，可以通过使用本领域熟知的技术(例如二辛可宁酸(BCA)蛋白质测定)来估算离心前后的组合物中的蛋白质的量或如实例中所述的相对于整个样品的蛋白质含量，通过测量上清液的蛋白质含量(通过在1200下离心5min获得)来确定可溶性固体的量。

优选地，通过本发明所述的方法获得的蛋白质水解产物的溶解度为至少60％，更优选至少65％或至少70％。在一些实例中，蛋白质水解产物的溶解度为60％-100％，优选65％-100％或70％-100％。

实例

实例中使用的实验热稳定性蛋白酶(PFus)是SEQ ID NO:3的内肽酶。

实例1

与现有技术的酶Alcalase 2.4L相比，用实验热稳定蛋白酶(PFus)水解大豆粕(SBM)

已经在12％大豆溶液中进行水解测定。通过将42g大豆粕悬浮在308g脱矿质水(Milli Q水)中来制备溶液。用4N NaOH将pH调节至pH 8。将40g SBM悬浮液分别加热至70℃和95℃；将0.25％Alcase 2.4L添加到70℃SBM悬浮液中，并将50或100mg ep/kg SBM的PFus添加到95℃的SBM悬浮液中。对于两种温度，已经包括没有添加酶的对照。将这些样品在搅拌下孵育30、60和120min。在30、60和120min后取出少量，即1.5ml每种样品，并且针对PFus通过将这些样品置于冰浴中以及针对这些Alcalase样品通过在95℃下加热这些样品15min来立即停止酶促水解。样品通常被冻结直到分析并在使用时在冰上处理。通过OPA在悬浮液中一式两份测量DH％，并通过BCA方法一式两份测量溶解度。

通过使用邻苯二醛(OPA)测定来测定每种水解产物的水解度(DH％)。为此，将各水解产物(和非水解起始材料)稀释至2.5％的干物质，并随后以1:20稀释。将每个样品/标准品的20μl等分试样转移到微量滴定板(MTP)中，并添加200μl OPA试剂(OPA试剂：在100ml的量瓶中称量以下试剂并溶解于milli Q水中，milli Q水添加至100ml：0.504g碳酸氢钠，0.4293g十水碳酸钠，100mg十二烷基硫酸钠(SDS)，88g二硫代醇(DTT)，溶于2ml 96％乙醇的80mg邻苯二醛(OPA))。在340nm处读取吸光度。还包括具有L-丝氨酸(0-0.5mg/ml)的标准曲线。计算与丝氨酸标准相关的水解度。

溶解度分析：使用基于二喹啉甲酸(BCA)的蛋白质测定(例如Micro BCA蛋白测定试剂盒；Sigma BCA1)通过测量可溶性蛋白质来测定每种水解产物的可溶性固体比例。就在该样品和上清液上测量BCA。将全样品稀释至2.5％的干物质，并将1.5ml的2.5％干物质样品在500G下离心10min。将所有样品以1:20稀释。在每个MTP中包括BSA(牛血清白蛋白)标准稀释液(0-1.0mg/ml)。将20μL的每个样品和标准品转移至MTP(微量滴定板)中。添加160μLBCA试剂(8ml二喹啉甲酸+硫酸铜4％w/v溶液)。将MTP板在37℃下孵育30min，并测量582nm处的吸光度。在582nm处的吸光度与蛋白质浓度成正比，并然后将溶解度计算为相对于该样品上清液中的蛋白质浓度。

结果如下表所示。清楚地看出，在所有方面，用热稳定性蛋白酶PFus处理的样品的DH％和溶解度都优于Alcalase。

表1：基于两个参数DH％和溶解度，比较PFus和Alcalase 2.4L

实例2

与现有技术酶Alcalase 2.4L和Flavourzyme 1000L相比，用实验热稳定蛋白酶(PFus)和Flavourzyme 1000L的组合水解大豆粕(SBM)。

水解测定已经在两步水解程序中进行。通过将42g大豆粕悬浮在308g脱矿质水(Milli Q水)中制备12％大豆溶液。用4N NaOH将pH调节至pH 8。将30g SBM悬浮液分别加热至70℃和95℃，将0.25％Alcase 2.4L添加到70℃SBM悬浮液中，并将100mg ep/kg SBM的PFus添加到95℃的SBM悬浮液中。已经包括没有添加酶的对照。将这些样品在搅拌下孵育120min。然后将所有样品调节至50℃，并分别添加0.5％、1.5％和3.0％的Flavourzyme1000L(具有至少1000LAPU/g和至少20CPDU/g)。将这些样品在50℃下放置20h。在开始后2、4和20小时取出少量，即1.5ml每种样品，并且通过将这些样品置于冰浴中或通过在100℃下加热这些样品10min来立即停止酶促水解。样品通常被冻结直到分析并在使用时在冰上处理。通过OPA在悬浮液中一式两份测量DH％，并通过BCA方法一式两份测量溶解度。结果如下表所示。

清楚地看出，基于分析的参数，单独或与Flavourzyme组合的热稳定性酶的DH％和溶解度都优于Alcalase。

表2：基于两个参数DH％和溶解度，比较与Flavourzyme 1000L组合的PFus和Alcalase 2.4L

实例3

与Alcalase 2.4L相比，PFus的小麦谷蛋白水解性能

15％的小麦谷蛋白，通过将75g谷蛋白悬浮于425g Milli Q水中制备TereosSyrah，用4N NaOH将pH调节至pH 8.0。对于每个测试样品，将100g悬浮液分别加热至70℃和95℃；将0.25％Alcase 2.4L添加到70℃的谷蛋白悬浮液中，并将100mg ep/kg谷蛋白的PFus添加到95℃的谷蛋白悬浮液中。已经包括没有添加酶的对照。将这些样品在搅拌下孵育60、120和240min。240min后，分别将具有PFus和Alcalase的样品分成两个50g样品。然后将所有样品调节至50℃，并向每个样品添加1.0％w/w或3.0％w/w Flavourzyme 1000L。将具有+3％Flavourzyme的样品在50℃下放置4h，并将具有+1％Flavourzyme的样品在50℃下放置16h。在各步骤60、120、240min、4h、16h后取出少量，即1.5ml每种样品，并且通过将这些样品置于冰浴中或通过在100℃下加热这些样品10min来立即停止酶促水解。样品通常被冻结直到分析并在使用时在冰上处理。通过OPA在悬浮液中一式两份测量DH％，并通过BCA方法一式两份测量溶解度。结果如下表所示。单独或与Flavourzyme组合的热稳定性酶的溶解度都优于Alcalase。

表3：小麦谷蛋白水解：基于两个参数DH％和溶解度，比较与Flavourzyme1000L组合的PFus和Alcalase 2.4L

实例4

实验热稳定性蛋白酶(PFus)的表征

pH活性曲线

测定原理：

使用动力学Suc-AAPF-pNA测定来记录pH活性曲线。监测OD₄₀₅随时间的增加，以作为蛋白酶活性的量度。

测定缓冲液：

100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH调节至pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。

测定底物溶液：

将50mg Suc-AAPF-pNA(Bachem L-1400)溶解于1.0mL DMSO中，并用0.01％TritonX-100进一步稀释45倍。

测定条件：

使用0.01％Triton X-100稀释经纯化的蛋白酶原液，以确保在选定的测定条件下具有足够的反应。将20μL蛋白酶溶液与微量滴定板中的100μL测定缓冲液混合。通过添加100μL pNA底物溶液开始测定，并随时间监测OD₄₀₅的增加。

pH	相对活性(％)
		2	0.2
3	0.3
		4	4.7
5	31.6
		6	69.7
7	82.4
		8	82.7
9	84.5
		10	90.3
11	100.0

如通过残留活性测量评估的pH稳定性

测定原理：

使用动力学Suc-AAPF-pNA测定在37℃下获得pH稳定性曲线。监测OD₄₀₅随时间的增加，以作为蛋白酶活性的量度。

孵育缓冲液：

测定缓冲液：

0.5M Tris/HCl，2mM CaCl₂，pH 9.0。

测定底物溶液：

测定条件：

使用孵育缓冲液在选定的pH下稀释经纯化的蛋白酶原液，以确保正确的孵育pH和约0.1mg/mL的蛋白酶浓度。然后在37℃下孵育2hr。随后在测定残留活性之前，通过在测定缓冲液中稀释将这些蛋白酶样品转移成相同的pH(pH 9)，以确保在残留活性测定中的足够反应。通过在微量滴定板中将20μL蛋白酶溶液与100μL测定缓冲液混合来测量样品中的残留活性。通过添加100μL pNA底物开始测定。随着时间监测OD₄₀₅的增加。参考样品在整个孵育步骤中保持在5℃。下表中列出的数据是相对于在5℃孵育的样品所记录的活性的残留活性。

pH	残留活性(％)
		2	1.5
3	1.0
		4	96.3
5	95.7
		6	101.5
7	102.1
		8	100.8
9	99.1
		10	98.7
11	104.1
		5℃	100.0

如通过残留活动测量评估的温度稳定性

测定原理：

使用动力学Suc-AAPF-pNA测定获得在pH 9下温度稳定性曲线。监测OD₄₀₅随时间的增加，以作为蛋白酶活性的量度。

测定缓冲液：

100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01％Triton X-100，pH 9.0。

测定底物溶液：

测定条件：

使用孵育缓冲液稀释纯化的蛋白酶原液，以确保正确的测定pH和约0.1mg/mL的蛋白酶浓度。然后在选定的温度下孵育15min。孵育后，通过在微量滴定板中将20μL蛋白酶溶液与100μL测定缓冲液混合来测量这些样品中的残留活性。通过添加100μL pNA底物开始测定。随着时间监测OD₄₀₅的增加。下表列出的数据是相对于在37℃下孵育所记录活性的残留活性。

温度(℃)	残留活性(％)
		37	99.0
50	99.8
		60	100.0
70	99.9
		80	99.5
90	97.9
		99	84.6

温度-活动曲线

测定原理：

使用终点Suc-AAPF-pNA测定以获得在pH 9下的温度-活性曲线。记录OD₄₀₅作为蛋白酶活性的量度。

测定缓冲液：

测定底物溶液：

将50mg Suc-AAPF-pNA(Bachem L-1400)解于1.0mL DMSO中，并用测定缓冲液进一步稀释50倍。

测定条件：

使用0.01％Triton X-100稀释经纯化的蛋白酶原液，以确保在选定的测定条件下具有足够的反应。将200μL测定底物溶液在Eppendorf管中移液并置于冰上。添加20μL稀释的蛋白酶溶液，并通过将Eppendorf管转移到设定为测定温度的Eppendorf恒温混匀仪中来开始测定。将管以最高的摇动速率(1400rpm)孵育15分钟。通过将管转移到冰浴并添加600μL 500mM琥珀酸(pH3.5)来停止孵育。将200μL上清液转移到微量滴定板中，并读取OD₄₀₅作为肽酶活性的量度。在该测定中包括空白缓冲液(buffer blind)(代替酶)。

实例5

内切蛋白酶活性测定

测定原理：

使用来自麦格酶公司(Megazyme)的Protazyme AK底物(AZCL-酪蛋白)或Protazyme OL底物(AZCL-胶原蛋白)的终点测定。终止反应后记录OD₅₉₀。吸光度的增加反映了溶解的染料偶联酪蛋白/胶原蛋白片段，并且是蛋白酶内切酶活性的量度。Protazyme OL特别适用于酸性pH最佳的蛋白酶。

测定缓冲液：

选择以符合待测试的内切蛋白酶的要求(例如包含已知的所需辅因子)。满足许多需求的广泛的混合物缓冲液可以是：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH调节至pH值为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。

测定底物悬浮液：

将Protazyme AK或Protazyme OL片剂(来自麦格酶公司)通过轻轻搅拌悬浮于2.0mL 0.01％Triton X-100中。

测定条件：

将500μL测定底物悬浮液和500μL测定缓冲液在Eppendorf管中混合并置于冰上。添加20μl蛋白酶样品(稀释在0.01％Triton X-100中)。通过将Eppendorf管转移至设定为测定温度的Eppendorf恒温混匀仪来启动测定。将管在Eppendorf恒温混匀仪上在最高振摇速率(1400rpm)下孵育15分钟。通过将该管转移返回至冰浴停止孵育。随后将管在冰冷的离心机中离心数分钟并将200μL上清液转移至微量滴定板。读取OD₅₉₀作为蛋白酶活性的量度。在该测定中包括空白缓冲液(buffer blind)(代替酶)。

实例6

使用来自嗜热裂孢菌的实验热稳定蛋白酶(嗜热裂孢菌蛋白酶)，来自葱绿拟诺卡菌(拟诺卡菌属蛋白酶)的热稳定丝氨酸蛋白酶或现有技术的酶Alcalase 2.4L(每种均与与Flavourzyme 1000L结合)来进行大豆粕(SBM)的水解

该拟诺卡菌属蛋白酶具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

嗜热裂孢菌蛋白酶的野生型DNA和氨基酸序列如SEQ ID NO:5和6所示。该蛋白酶已经在用适当的信号序列置换天然的序列并在C末端具有HQHQHQH标签的枯草芽孢杆菌中表达。该表达构建体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。使用埃德曼降解，已将N末端确定为AAIIGGN(SEQ ID NO:6的氨基酸183-189和SEQ ID NO:7的氨基酸179-185)。SEQ ID NO:8显示了基于本文所述的嗜热裂孢菌蛋白酶的成熟氨基酸序列。

拟诺卡菌属蛋白酶和嗜热裂孢菌蛋白酶均具有在80℃或以上的最佳温度。

水解测定已经在两步水解程序中进行。通过将12g大豆粕悬浮在88g脱矿质水(Milli Q水)中来制备12％大豆溶液。将溶液搅拌30分钟，然后用4N NaOH将pH调节至8.0。

对于每种处理，在5ml Eppendorf管中称量5g底物溶液，并在Eppendorf恒温混匀仪中加热，混合速度＝1000rpm。在室温下添加蛋白酶，随后立即加热到如下3种酶的最适温度：Alcalase在70℃下，拟诺卡菌属蛋白酶在80℃下和嗜热裂孢菌蛋白酶在80℃下。达到最佳温度的时间范围为从10-30min。添加剂量为5.7AU/kg蛋白质的Alcalase 2.4L，200mg/kg的嗜热裂孢菌蛋白酶和100mg/kg的拟诺卡菌属蛋白酶。4小时后，取出1.5ml样品并置于冰上。将剩余样品材料的温度降至50℃，并以1.5％添加Flavourzyme 1000L。16小时后，将这些样品置于冰上。将所有样品(4小时和20小时)储存在冷冻器中直至进行分析。将所有样品如实例1所述分析DH％，并如下所述分析溶解度％。相对于整个样品的蛋白质含量通过测量上清液的蛋白质含量(通过在1200离心5分钟获得)来分析溶解度％。通过LECO FP628分析整个样品和上清液的蛋白质含量。LECO分析是基于通过燃烧分析检测氮含量。所用的氮转化因子为6.25。

表4：基于两个参数DH％和溶解度，比较与Flavourzyme 1000L组合的热稳定性嗜热裂孢菌蛋白酶、拟诺卡菌属蛋白酶和Alcalase 2.4L

观察到单独或与Flavourzyme组合的热稳定酶的大豆样品的溶解度均优于Alcalase。与Alcalase相比，热稳定性酶的DH％也是相同的或更高的。

序列表

<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）

<120> 用于生产蛋白质水解产物的方法

<130> 13036-WO-PCT

<160> 8

<170> 专利版本3.5

<210> 1

<211> 1572

<212> DNA

<213> 强烈火球菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1572)

<400> 1

atg gca cct gag aag aaa gtt gag caa gtt cgc aac gta gag aaa aac 48

Met Ala Pro Glu Lys Lys Val Glu Gln Val Arg Asn Val Glu Lys Asn

1 5 10 15

tac ggt ctt ctt aca cca ggc ctt ttc cgc aaa atc caa aaa ctt aac 96

Tyr Gly Leu Leu Thr Pro Gly Leu Phe Arg Lys Ile Gln Lys Leu Asn

20 25 30

cct aac gag gag atc agc act gta atc gtt ttt gag aac cat cgc gag 144

Pro Asn Glu Glu Ile Ser Thr Val Ile Val Phe Glu Asn His Arg Glu

35 40 45

aag gag atc gct gtt cgc gtt ctt gag ctt atg ggt gcg aag gta cgc 192

Lys Glu Ile Ala Val Arg Val Leu Glu Leu Met Gly Ala Lys Val Arg

50 55 60

tac gtt tac cat atc att ccg gct att gcg gct gac ctt aag gtt cgc 240

Tyr Val Tyr His Ile Ile Pro Ala Ile Ala Ala Asp Leu Lys Val Arg

65 70 75 80

gac ctt ctt gtt atc tct ggt ctt act ggt ggc aaa gcg aaa ctt tca 288

Asp Leu Leu Val Ile Ser Gly Leu Thr Gly Gly Lys Ala Lys Leu Ser

85 90 95

ggc gtt cgc ttc atc caa gag gac tac aaa gtt act gta tct gct gag 336

Gly Val Arg Phe Ile Gln Glu Asp Tyr Lys Val Thr Val Ser Ala Glu

100 105 110

ctt gag gga ctt gac gag tca gcg gca caa gta atg gca aca tac gta 384

Leu Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gln Val Met Ala Thr Tyr Val

115 120 125

tgg aac ctt ggc tac gac ggt tct ggc atc act atc ggc atc atc gac 432

Trp Asn Leu Gly Tyr Asp Gly Ser Gly Ile Thr Ile Gly Ile Ile Asp

130 135 140

acg ggc atc gac gct tca cac cct gac ctt caa ggt aag gta atc ggt 480

Thr Gly Ile Asp Ala Ser His Pro Asp Leu Gln Gly Lys Val Ile Gly

145 150 155 160

tgg gtt gac ttc gtt aat ggt cgc tct tat ccg tat gac gac cat ggc 528

Trp Val Asp Phe Val Asn Gly Arg Ser Tyr Pro Tyr Asp Asp His Gly

165 170 175

cac ggt aca cac gta gca tct atc gca gct ggc act ggc gca gct tct 576

His Gly Thr His Val Ala Ser Ile Ala Ala Gly Thr Gly Ala Ala Ser

180 185 190

aac ggc aag tac aaa ggc atg gca cct ggt gcg aaa ctt gct ggt atc 624

Asn Gly Lys Tyr Lys Gly Met Ala Pro Gly Ala Lys Leu Ala Gly Ile

195 200 205

aaa gta ctt ggc gca gac ggc tct ggc tca atc agc aca atc atc aaa 672

Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Ser Ile Ser Thr Ile Ile Lys

210 215 220

ggc gtt gag tgg gct gtt gac aac aag gac aaa tac ggt atc aaa gtt 720

Gly Val Glu Trp Ala Val Asp Asn Lys Asp Lys Tyr Gly Ile Lys Val

225 230 235 240

atc aac ctt tct ctt ggc tct tct caa agc tct gac ggc aca gac gcg 768

Ile Asn Leu Ser Leu Gly Ser Ser Gln Ser Ser Asp Gly Thr Asp Ala

245 250 255

ctt tca caa gct gtt aac gct gct tgg gac gct ggt ctt gta gtt gtt 816

Leu Ser Gln Ala Val Asn Ala Ala Trp Asp Ala Gly Leu Val Val Val

260 265 270

gtt gct gct ggt aac agc ggt cca aac aaa tac act atc ggc tca ccg 864

Val Ala Ala Gly Asn Ser Gly Pro Asn Lys Tyr Thr Ile Gly Ser Pro

275 280 285

gca gct gcg tct aaa gta atc aca gtt gga gct gta gac aaa tac gac 912

Ala Ala Ala Ser Lys Val Ile Thr Val Gly Ala Val Asp Lys Tyr Asp

290 295 300

gtt atc act tct ttc tca tct cgt ggc cct act gca gat ggt cgc ctt 960

Val Ile Thr Ser Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly Arg Leu

305 310 315 320

aaa cca gag gtt gta gca cca ggc aac tgg atc atc gca gct cgc gct 1008

Lys Pro Glu Val Val Ala Pro Gly Asn Trp Ile Ile Ala Ala Arg Ala

325 330 335

tct ggc aca tca atg ggc caa cca atc aac gac tac tat act gct gcg 1056

Ser Gly Thr Ser Met Gly Gln Pro Ile Asn Asp Tyr Tyr Thr Ala Ala

340 345 350

cca gga act tct atg gct act cca cac gta gca ggt atc gct gca ctt 1104

Pro Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ile Ala Ala Leu

355 360 365

ctt ctt caa gct cac cct tct tgg acg cct gac aaa gta aag act gca 1152

Leu Leu Gln Ala His Pro Ser Trp Thr Pro Asp Lys Val Lys Thr Ala

370 375 380

ctt atc gag act gct gac atc gtt aaa cct gac gag atc gca gac atc 1200

Leu Ile Glu Thr Ala Asp Ile Val Lys Pro Asp Glu Ile Ala Asp Ile

385 390 395 400

gct tat ggt gct ggt cgc gtt aat gcg tac aag gct atc aac tat gac 1248

Ala Tyr Gly Ala Gly Arg Val Asn Ala Tyr Lys Ala Ile Asn Tyr Asp

405 410 415

aac tat gct aaa ctt gta ttc acg ggc tac gta gct aac aaa ggc tct 1296

Asn Tyr Ala Lys Leu Val Phe Thr Gly Tyr Val Ala Asn Lys Gly Ser

420 425 430

caa acg cac caa ttt gtt atc tct ggc gca agc ttc gtt act gct act 1344

Gln Thr His Gln Phe Val Ile Ser Gly Ala Ser Phe Val Thr Ala Thr

435 440 445

ctt tac tgg gac aac gct aac tct gac ctt gac ctt tac tta tac gac 1392

Leu Tyr Trp Asp Asn Ala Asn Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Leu Tyr Asp

450 455 460

cca aac ggc aac cag gtt gac tat tct tat act gca tac tac gac ttt 1440

Pro Asn Gly Asn Gln Val Asp Tyr Ser Tyr Thr Ala Tyr Tyr Asp Phe

465 470 475 480

gag aag gtt ggc tat tac aac cct act gac ggc aca tgg aca atc aaa 1488

Glu Lys Val Gly Tyr Tyr Asn Pro Thr Asp Gly Thr Trp Thr Ile Lys

485 490 495

gta gta agc tat tca gga tca gct aac tac caa gta gac gta gtt tct 1536

Val Val Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Gln Val Asp Val Val Ser

500 505 510

gac ggt tct ctt agc cag cct ggc tca tca cca taa 1572

Asp Gly Ser Leu Ser Gln Pro Gly Ser Ser Pro

515 520

<210> 2

<211> 523

<212> PRT

<213> 强烈火球菌

<400> 2

Met Ala Pro Glu Lys Lys Val Glu Gln Val Arg Asn Val Glu Lys Asn

1 5 10 15

Tyr Gly Leu Leu Thr Pro Gly Leu Phe Arg Lys Ile Gln Lys Leu Asn

20 25 30

Pro Asn Glu Glu Ile Ser Thr Val Ile Val Phe Glu Asn His Arg Glu

35 40 45

Lys Glu Ile Ala Val Arg Val Leu Glu Leu Met Gly Ala Lys Val Arg

50 55 60

Tyr Val Tyr His Ile Ile Pro Ala Ile Ala Ala Asp Leu Lys Val Arg

65 70 75 80

Asp Leu Leu Val Ile Ser Gly Leu Thr Gly Gly Lys Ala Lys Leu Ser

85 90 95

Gly Val Arg Phe Ile Gln Glu Asp Tyr Lys Val Thr Val Ser Ala Glu

100 105 110

Leu Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gln Val Met Ala Thr Tyr Val

115 120 125

Trp Asn Leu Gly Tyr Asp Gly Ser Gly Ile Thr Ile Gly Ile Ile Asp

130 135 140

Thr Gly Ile Asp Ala Ser His Pro Asp Leu Gln Gly Lys Val Ile Gly

145 150 155 160

Trp Val Asp Phe Val Asn Gly Arg Ser Tyr Pro Tyr Asp Asp His Gly

165 170 175

His Gly Thr His Val Ala Ser Ile Ala Ala Gly Thr Gly Ala Ala Ser

180 185 190

Asn Gly Lys Tyr Lys Gly Met Ala Pro Gly Ala Lys Leu Ala Gly Ile

195 200 205

Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Ser Ile Ser Thr Ile Ile Lys

210 215 220

Gly Val Glu Trp Ala Val Asp Asn Lys Asp Lys Tyr Gly Ile Lys Val

225 230 235 240

Ile Asn Leu Ser Leu Gly Ser Ser Gln Ser Ser Asp Gly Thr Asp Ala

245 250 255

Leu Ser Gln Ala Val Asn Ala Ala Trp Asp Ala Gly Leu Val Val Val

260 265 270

Val Ala Ala Gly Asn Ser Gly Pro Asn Lys Tyr Thr Ile Gly Ser Pro

275 280 285

Ala Ala Ala Ser Lys Val Ile Thr Val Gly Ala Val Asp Lys Tyr Asp

290 295 300

Val Ile Thr Ser Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly Arg Leu

305 310 315 320

Lys Pro Glu Val Val Ala Pro Gly Asn Trp Ile Ile Ala Ala Arg Ala

325 330 335

Ser Gly Thr Ser Met Gly Gln Pro Ile Asn Asp Tyr Tyr Thr Ala Ala

340 345 350

Pro Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ile Ala Ala Leu

355 360 365

Leu Leu Gln Ala His Pro Ser Trp Thr Pro Asp Lys Val Lys Thr Ala

370 375 380

Leu Ile Glu Thr Ala Asp Ile Val Lys Pro Asp Glu Ile Ala Asp Ile

385 390 395 400

Ala Tyr Gly Ala Gly Arg Val Asn Ala Tyr Lys Ala Ile Asn Tyr Asp

405 410 415

Asn Tyr Ala Lys Leu Val Phe Thr Gly Tyr Val Ala Asn Lys Gly Ser

420 425 430

Gln Thr His Gln Phe Val Ile Ser Gly Ala Ser Phe Val Thr Ala Thr

435 440 445

Leu Tyr Trp Asp Asn Ala Asn Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Leu Tyr Asp

450 455 460

Pro Asn Gly Asn Gln Val Asp Tyr Ser Tyr Thr Ala Tyr Tyr Asp Phe

465 470 475 480

Glu Lys Val Gly Tyr Tyr Asn Pro Thr Asp Gly Thr Trp Thr Ile Lys

485 490 495

Val Val Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Gln Val Asp Val Val Ser

500 505 510

Asp Gly Ser Leu Ser Gln Pro Gly Ser Ser Pro

515 520

<210> 3

<211> 413

<212> PRT

<213> 强烈火球菌

<400> 3

Ala Glu Leu Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gln Val Met Ala Thr

1 5 10 15

Tyr Val Trp Asn Leu Gly Tyr Asp Gly Ser Gly Ile Thr Ile Gly Ile

20 25 30

Ile Asp Thr Gly Ile Asp Ala Ser His Pro Asp Leu Gln Gly Lys Val

35 40 45

Ile Gly Trp Val Asp Phe Val Asn Gly Arg Ser Tyr Pro Tyr Asp Asp

50 55 60

His Gly His Gly Thr His Val Ala Ser Ile Ala Ala Gly Thr Gly Ala

65 70 75 80

Ala Ser Asn Gly Lys Tyr Lys Gly Met Ala Pro Gly Ala Lys Leu Ala

85 90 95

Gly Ile Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Ser Ile Ser Thr Ile

100 105 110

Ile Lys Gly Val Glu Trp Ala Val Asp Asn Lys Asp Lys Tyr Gly Ile

115 120 125

Lys Val Ile Asn Leu Ser Leu Gly Ser Ser Gln Ser Ser Asp Gly Thr

130 135 140

Asp Ala Leu Ser Gln Ala Val Asn Ala Ala Trp Asp Ala Gly Leu Val

145 150 155 160

Val Val Val Ala Ala Gly Asn Ser Gly Pro Asn Lys Tyr Thr Ile Gly

165 170 175

Ser Pro Ala Ala Ala Ser Lys Val Ile Thr Val Gly Ala Val Asp Lys

180 185 190

Tyr Asp Val Ile Thr Ser Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly

195 200 205

Arg Leu Lys Pro Glu Val Val Ala Pro Gly Asn Trp Ile Ile Ala Ala

210 215 220

Arg Ala Ser Gly Thr Ser Met Gly Gln Pro Ile Asn Asp Tyr Tyr Thr

225 230 235 240

Ala Ala Pro Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ile Ala

245 250 255

Ala Leu Leu Leu Gln Ala His Pro Ser Trp Thr Pro Asp Lys Val Lys

260 265 270

Thr Ala Leu Ile Glu Thr Ala Asp Ile Val Lys Pro Asp Glu Ile Ala

275 280 285

Asp Ile Ala Tyr Gly Ala Gly Arg Val Asn Ala Tyr Lys Ala Ile Asn

290 295 300

Tyr Asp Asn Tyr Ala Lys Leu Val Phe Thr Gly Tyr Val Ala Asn Lys

305 310 315 320

Gly Ser Gln Thr His Gln Phe Val Ile Ser Gly Ala Ser Phe Val Thr

325 330 335

Ala Thr Leu Tyr Trp Asp Asn Ala Asn Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Leu

340 345 350

Tyr Asp Pro Asn Gly Asn Gln Val Asp Tyr Ser Tyr Thr Ala Tyr Tyr

355 360 365

Asp Phe Glu Lys Val Gly Tyr Tyr Asn Pro Thr Asp Gly Thr Trp Thr

370 375 380

Ile Lys Val Val Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Gln Val Asp Val

385 390 395 400

Val Ser Asp Gly Ser Leu Ser Gln Pro Gly Ser Ser Pro

405 410

<210> 4

<211> 188

<212> PRT

<213> 拟诺卡菌属

<400> 4

Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser

1 5 10 15

Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr

20 25 30

Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly

35 40 45

Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe

50 55 60

Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr

65 70 75 80

Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile

85 90 95

Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly

100 105 110

Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val

115 120 125

Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly

130 135 140

Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly

145 150 155 160

Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr

165 170 175

Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr

180 185

<210> 5

<211> 1107

<212> DNA

<213> 嗜热裂孢菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1107)

<400> 5

gtg aac cat tcc tcc cga aga acc acc tcc ctc ctt ttc act gcc gcg 48

Val Asn His Ser Ser Arg Arg Thr Thr Ser Leu Leu Phe Thr Ala Ala

1 5 10 15

ctg gcc gcc act gca ctg gtc gcc gcc acc acc ccc gcc tcc gcc caa 96

Leu Ala Ala Thr Ala Leu Val Ala Ala Thr Thr Pro Ala Ser Ala Gln

20 25 30

gag ctc gcc ctc aaa cgc gac ctc ggg ttg agc gac gct gaa gtc gcg 144

Glu Leu Ala Leu Lys Arg Asp Leu Gly Leu Ser Asp Ala Glu Val Ala

35 40 45

gaa ctg cgc gcc gcc gaa gcc gaa gca gtc gag ctg gaa gag gag ctg 192

Glu Leu Arg Ala Ala Glu Ala Glu Ala Val Glu Leu Glu Glu Glu Leu

50 55 60

cgc gac tcc ctc ggc tcc gat ttc ggc ggc gtc tac ttg gac gcg gac 240

Arg Asp Ser Leu Gly Ser Asp Phe Gly Gly Val Tyr Leu Asp Ala Asp

65 70 75 80

acc aca gag atc acg gtc gcc gtc acc gac ccc gcc gcc gtg tcc cgt 288

Thr Thr Glu Ile Thr Val Ala Val Thr Asp Pro Ala Ala Val Ser Arg

85 90 95

gtc gac gcg gac gac gtc acc gtg gac gtt gtt gat ttc ggg gaa acc 336

Val Asp Ala Asp Asp Val Thr Val Asp Val Val Asp Phe Gly Glu Thr

100 105 110

gcc ctc aac gac ttc gtg gcg tcc ctc aac gcg atc gct gac acc gct 384

Ala Leu Asn Asp Phe Val Ala Ser Leu Asn Ala Ile Ala Asp Thr Ala

115 120 125

gac cca aag gtc acc ggc tgg tac acc gac ctg gag tcc gat gcg gta 432

Asp Pro Lys Val Thr Gly Trp Tyr Thr Asp Leu Glu Ser Asp Ala Val

130 135 140

gtc atc acc acg ctc cgg ggc ggc act ccg gca gcc gaa gag ctc gcc 480

Val Ile Thr Thr Leu Arg Gly Gly Thr Pro Ala Ala Glu Glu Leu Ala

145 150 155 160

gag cgg gct ggt ctg gac gag cgg gcc gtg cgc att gtc gaa gag gac 528

Glu Arg Ala Gly Leu Asp Glu Arg Ala Val Arg Ile Val Glu Glu Asp

165 170 175

gaa gag ccg cag tcc ctt gcc gcc atc atc ggc ggc aac ccc tac tat 576

Glu Glu Pro Gln Ser Leu Ala Ala Ile Ile Gly Gly Asn Pro Tyr Tyr

180 185 190

ttc ggg aac tac cgc tgc tct atc gga ttc tcg gtc cgc cag ggc agc 624

Phe Gly Asn Tyr Arg Cys Ser Ile Gly Phe Ser Val Arg Gln Gly Ser

195 200 205

cag acc ggc ttc gcc acc gcg ggc cac tgc ggt tcg aca ggc acg cga 672

Gln Thr Gly Phe Ala Thr Ala Gly His Cys Gly Ser Thr Gly Thr Arg

210 215 220

gtc agc tcc ccc tca ggc act gtc gcc gga tcg tac ttc ccc ggc cgt 720

Val Ser Ser Pro Ser Gly Thr Val Ala Gly Ser Tyr Phe Pro Gly Arg

225 230 235 240

gac atg ggc tgg gtg cgt atc acc agc gct gac acc gtc acc ccg ctc 768

Asp Met Gly Trp Val Arg Ile Thr Ser Ala Asp Thr Val Thr Pro Leu

245 250 255

gtc aac cgc tac aac ggc gga acg gtg acc gtc acc ggt tcg cag gag 816

Val Asn Arg Tyr Asn Gly Gly Thr Val Thr Val Thr Gly Ser Gln Glu

260 265 270

gcc gcc acc ggc tct tcg gtg tgc cgc tcc gga gcg acc acc ggg tgg 864

Ala Ala Thr Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ala Thr Thr Gly Trp

275 280 285

cgc tgc ggc acc atc cag tcg aag aac cag acc gtc cgc tac gcg gaa 912

Arg Cys Gly Thr Ile Gln Ser Lys Asn Gln Thr Val Arg Tyr Ala Glu

290 295 300

gga acc gtc acc ggc ctg acc cgc acc act gcc tgc gct gaa ggc ggc 960

Gly Thr Val Thr Gly Leu Thr Arg Thr Thr Ala Cys Ala Glu Gly Gly

305 310 315 320

gac tcc ggc ggc ccg tgg ctc acc ggt tcc caa gcc caa ggg gtg acc 1008

Asp Ser Gly Gly Pro Trp Leu Thr Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr

325 330 335

tcg ggc ggc acc ggt gac tgc cgg tcc ggc ggc atc acg ttc ttc cag 1056

Ser Gly Gly Thr Gly Asp Cys Arg Ser Gly Gly Ile Thr Phe Phe Gln

340 345 350

ccc atc aac ccg ctg ctg tcc tac ttc gga ctg caa ctg gtc acc ggc 1104

Pro Ile Asn Pro Leu Leu Ser Tyr Phe Gly Leu Gln Leu Val Thr Gly

355 360 365

tga 1107

<210> 6

<211> 368

<212> PRT

<213> 嗜热裂孢菌

<400> 6

Met Asn His Ser Ser Arg Arg Thr Thr Ser Leu Leu Phe Thr Ala Ala

1 5 10 15

Leu Ala Ala Thr Ala Leu Val Ala Ala Thr Thr Pro Ala Ser Ala Gln

20 25 30

Glu Leu Ala Leu Lys Arg Asp Leu Gly Leu Ser Asp Ala Glu Val Ala

35 40 45

Glu Leu Arg Ala Ala Glu Ala Glu Ala Val Glu Leu Glu Glu Glu Leu

50 55 60

Arg Asp Ser Leu Gly Ser Asp Phe Gly Gly Val Tyr Leu Asp Ala Asp

65 70 75 80

Thr Thr Glu Ile Thr Val Ala Val Thr Asp Pro Ala Ala Val Ser Arg

85 90 95

Val Asp Ala Asp Asp Val Thr Val Asp Val Val Asp Phe Gly Glu Thr

100 105 110

Ala Leu Asn Asp Phe Val Ala Ser Leu Asn Ala Ile Ala Asp Thr Ala

115 120 125

Asp Pro Lys Val Thr Gly Trp Tyr Thr Asp Leu Glu Ser Asp Ala Val

130 135 140

Val Ile Thr Thr Leu Arg Gly Gly Thr Pro Ala Ala Glu Glu Leu Ala

145 150 155 160

Glu Arg Ala Gly Leu Asp Glu Arg Ala Val Arg Ile Val Glu Glu Asp

165 170 175

Glu Glu Pro Gln Ser Leu Ala Ala Ile Ile Gly Gly Asn Pro Tyr Tyr

180 185 190

Phe Gly Asn Tyr Arg Cys Ser Ile Gly Phe Ser Val Arg Gln Gly Ser

195 200 205

Gln Thr Gly Phe Ala Thr Ala Gly His Cys Gly Ser Thr Gly Thr Arg

210 215 220

Val Ser Ser Pro Ser Gly Thr Val Ala Gly Ser Tyr Phe Pro Gly Arg

225 230 235 240

Asp Met Gly Trp Val Arg Ile Thr Ser Ala Asp Thr Val Thr Pro Leu

245 250 255

Val Asn Arg Tyr Asn Gly Gly Thr Val Thr Val Thr Gly Ser Gln Glu

260 265 270

Ala Ala Thr Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ala Thr Thr Gly Trp

275 280 285

Arg Cys Gly Thr Ile Gln Ser Lys Asn Gln Thr Val Arg Tyr Ala Glu

290 295 300

Gly Thr Val Thr Gly Leu Thr Arg Thr Thr Ala Cys Ala Glu Gly Gly

305 310 315 320

Asp Ser Gly Gly Pro Trp Leu Thr Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr

325 330 335

Ser Gly Gly Thr Gly Asp Cys Arg Ser Gly Gly Ile Thr Phe Phe Gln

340 345 350

Pro Ile Asn Pro Leu Leu Ser Tyr Phe Gly Leu Gln Leu Val Thr Gly

355 360 365

<210> 7

<211> 371

<212> PRT

<213> 嗜热裂孢菌

<400> 7

Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile

1 5 10 15

Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Gln Glu Leu Ala Leu

20 25 30

Lys Arg Asp Leu Gly Leu Ser Asp Ala Glu Val Ala Glu Leu Arg Ala

35 40 45

Ala Glu Ala Glu Ala Val Glu Leu Glu Glu Glu Leu Arg Asp Ser Leu

50 55 60

Gly Ser Asp Phe Gly Gly Val Tyr Leu Asp Ala Asp Thr Thr Glu Ile

65 70 75 80

Thr Val Ala Val Thr Asp Pro Ala Ala Val Ser Arg Val Asp Ala Asp

85 90 95

Asp Val Thr Val Asp Val Val Asp Phe Gly Glu Thr Ala Leu Asn Asp

100 105 110

Phe Val Ala Ser Leu Asn Ala Ile Ala Asp Thr Ala Asp Pro Lys Val

115 120 125

Thr Gly Trp Tyr Thr Asp Leu Glu Ser Asp Ala Val Val Ile Thr Thr

130 135 140

Leu Arg Gly Gly Thr Pro Ala Ala Glu Glu Leu Ala Glu Arg Ala Gly

145 150 155 160

Leu Asp Glu Arg Ala Val Arg Ile Val Glu Glu Asp Glu Glu Pro Gln

165 170 175

Ser Leu Ala Ala Ile Ile Gly Gly Asn Pro Tyr Tyr Phe Gly Asn Tyr

180 185 190

Arg Cys Ser Ile Gly Phe Ser Val Arg Gln Gly Ser Gln Thr Gly Phe

195 200 205

Ala Thr Ala Gly His Cys Gly Ser Thr Gly Thr Arg Val Ser Ser Pro

210 215 220

Ser Gly Thr Val Ala Gly Ser Tyr Phe Pro Gly Arg Asp Met Gly Trp

225 230 235 240

Val Arg Ile Thr Ser Ala Asp Thr Val Thr Pro Leu Val Asn Arg Tyr

245 250 255

Asn Gly Gly Thr Val Thr Val Thr Gly Ser Gln Glu Ala Ala Thr Gly

260 265 270

Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ala Thr Thr Gly Trp Arg Cys Gly Thr

275 280 285

Ile Gln Ser Lys Asn Gln Thr Val Arg Tyr Ala Glu Gly Thr Val Thr

290 295 300

Gly Leu Thr Arg Thr Thr Ala Cys Ala Glu Gly Gly Asp Ser Gly Gly

305 310 315 320

Pro Trp Leu Thr Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Thr

325 330 335

Gly Asp Cys Arg Ser Gly Gly Ile Thr Phe Phe Gln Pro Ile Asn Pro

340 345 350

Leu Leu Ser Tyr Phe Gly Leu Gln Leu Val Thr Gly His Gln His Gln

355 360 365

His Gln His

370

<210> 8

<211> 186

<212> PRT

<213> 嗜热裂孢菌

<400> 8

Ala Ala Ile Ile Gly Gly Asn Pro Tyr Tyr Phe Gly Asn Tyr Arg Cys

1 5 10 15

Ser Ile Gly Phe Ser Val Arg Gln Gly Ser Gln Thr Gly Phe Ala Thr

20 25 30

Ala Gly His Cys Gly Ser Thr Gly Thr Arg Val Ser Ser Pro Ser Gly

35 40 45

Thr Val Ala Gly Ser Tyr Phe Pro Gly Arg Asp Met Gly Trp Val Arg

50 55 60

Ile Thr Ser Ala Asp Thr Val Thr Pro Leu Val Asn Arg Tyr Asn Gly

65 70 75 80

Gly Thr Val Thr Val Thr Gly Ser Gln Glu Ala Ala Thr Gly Ser Ser

85 90 95

Val Cys Arg Ser Gly Ala Thr Thr Gly Trp Arg Cys Gly Thr Ile Gln

100 105 110

Ser Lys Asn Gln Thr Val Arg Tyr Ala Glu Gly Thr Val Thr Gly Leu

115 120 125

Thr Arg Thr Thr Ala Cys Ala Glu Gly Gly Asp Ser Gly Gly Pro Trp

130 135 140

Leu Thr Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Thr Gly Asp

145 150 155 160

Cys Arg Ser Gly Gly Ile Thr Phe Phe Gln Pro Ile Asn Pro Leu Leu

165 170 175

Ser Tyr Phe Gly Leu Gln Leu Val Thr Gly

180 185

Claims

1.一种用于生产蛋白质水解产物的方法，该方法包括：

a)向包括底物蛋白质的组合物中添加热稳定性内肽酶；

2.如权利要求1所述的方法，其中该热稳定性内肽酶是非特异性内肽酶。

3.如权利要求2所述的方法，其中该非特异性内肽酶特征在于，在该内肽酶表现出其最大活性的至少40％的温度和pH下，将0.5％(w/w)BSA与该内肽酶孵育4小时导致至少10％的水解度。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该热稳定性内肽酶是一种内肽酶，在80℃和pH 9下孵育15分钟后，相对于其在37℃下孵育后的活性，该内肽酶具有至少80％的残留活性。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该热稳定性内肽酶(i)与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％序列一致性，(ii)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性的多核苷酸编码，或(iii)是在一个或多个位置处包括取代、缺失和/或插入的SEQ ID NO:3的多肽的变体。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该热稳定性内肽酶(i)与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％序列一致性，(ii)由与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性的多核苷酸编码，或(iii)是在一个或多个位置处包括取代、缺失和/或插入的SEQ ID NO:8的多肽的变体。

7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该热稳定性内肽酶(i)与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％的序列一致性，或(ii)是在一个或多个位置处包括取代、缺失和/或插入的SEQ ID NO:4的多肽的变体。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤c)中添加的蛋白酶制剂是来自曲霉属，优选米曲霉的蛋白酶制剂。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤c)中添加的蛋白酶制剂包括至少五种蛋白质水解组分，每种蛋白质水解组分分别具有选自23kD、27kD、31kD、32kD、35kD、38kD、42kD、47kD、53kD和100kD的近似分子量。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤d)中，将该组合物在30℃-65℃的温度下孵育。

11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤c)的同时或之后添加能够将Gln转化为Glu的酶。

12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤d)中获得的蛋白质水解产物具有至少10％的水解度。

13.一种用于生产蛋白质水解产物的方法，该方法包括：

a)向包括底物蛋白质的组合物中添加热稳定性内肽酶，该内肽酶(i)与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％序列一致性，(ii)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％序列一致性的多核苷酸编码，或(iii)是在一个或多个位置处包括取代、缺失和/或插入的SEQ ID NO:3的多肽的变体；并且

b)在至少75℃的温度下将步骤a)的组合物孵育至少10分钟。

14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该底物蛋白质选自大豆蛋白质、小麦谷蛋白蛋白质或乳清蛋白质。

15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该包括底物蛋白质的组合物具有至少1％(w/w)的干物质含量。