CN105219824B - 小麦面筋蛋白源呈味肽及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及小麦面筋蛋白源呈味肽及其制备方法与应用。本发明以小麦面筋蛋白为原料，通过酶法水解，得到小麦面筋蛋白酶解液，再通过脱酰胺处理得到脱酰胺小麦面筋蛋白酶解液。对脱酰胺小麦面筋蛋白酶解液进行分离纯化得到一种新的呈味肽产品，其氨基酸序列为pyroGlu‑Gln‑Pro‑Gly‑Gln‑Gly。该呈味肽具有较好的呈味强度，在200ppm的浓度下可显著提高食品的厚味和鲜味，因此可以广泛应用于食品及调味品等领域。
Description
技术领域
本发明涉及小麦面筋蛋白的利用技术领域，具体涉及小麦面筋蛋白源呈味肽及其制备方法与应用。
背景技术
1728年，意大利科学家Bailey首次从小麦粉中分离出小麦面筋，又名谷朊粉。“面筋”指的是用水冲洗生面团，去除淀粉和水溶性蛋白之后剩下的复杂粘性蛋白，一般占小麦蛋白的80%。小麦面筋，又称谷朊粉，其化学组成根据生产工艺条件的差异有所不同。根据GB/T 21924-2008谷朊粉国家标准要求，一级谷朊粉水分含量≤8%；粗蛋白含量（N×6.25，干基）≥85%；灰分含量（干基）≤1.0%；脂肪含量（干基）≤1.0%；粗细度：CB30号筛通过率≥99.5%，且 CB36 筛通过率≥95%；吸水率（干基）≥170%。小麦面筋的吸水率和蛋白质含量是衡量谷朊粉品质的主要指标。
从面筋蛋白的基本化学组成可见，小麦面筋是一种高蛋白含量、低脂肪含量、低热量的蛋白质资源。小麦面筋蛋白的氨基酸分析表明：面筋蛋白中含有大量的41.26%的谷氨酰胺和谷氨酸，12.13%的脯氨酸， 6.89%的亮氨酸，5.11%的苯丙氨酸，4.37%的丝氨酸，4.10%的缬氨酸，3.75%的酪氨酸，3.66%的异亮氨酸， 3.45%的精氨酸，3.35%的甘氨酸，3.16%的天冬酰胺和天冬氨酸，3.17%的半胱氨酸，其他氨基酸含量均小于3%（表3-1）。由小麦面筋蛋白的氨基酸组成分析可见，富含谷氨酰胺和脯氨酸是小麦面筋蛋白氨基酸组成的重要特点，也是小麦面筋蛋白的结构不同于其它蛋白的原因之一。此外，小麦面筋蛋白中所含的碱性氨基酸（精、组、赖氨酸）较少，但富含非极性氨基酸残基，如亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸。
小麦面筋蛋白的一级结构中富含谷氨酸和呈味肽序列，是生产呈味基料和调味品的重要原料。如华南理工大学崔春等人以面筋蛋白为原料，通过发酵法制备呈味基料，并从发酵液中鉴定出一种鲜味三肽（Asp-Cys-Gly）。Ishii 等研究发现500-1000Da的小麦面筋蛋白多肽具有明显鲜味增强作用。2002年，雀巢公司的Schlichtherle-Cerny和Amadò等人发现了小麦谷朊粉经盐酸脱酰胺后，添加风味蛋白酶水解后得到的水解物具有较强的鲜味。研究发现水解产物中除了谷氨酸和某些有机酸之外还有其他关键的鲜味成分。通过凝胶渗透色谱和RP-HPLC分析，得到了系列含有焦谷氨酸的短肽（Pyroglutamyl Peptides）：pGlu-Pro -Ser、pGlu-Pro、pGlu-Pro-Glu 以及pGlu-Pro-Gln。他们发现酶解前对小麦面筋蛋白进行脱酰胺处理有利于水解物鲜味的提高。
然而，迄今为止，尚未见具有氨基酸序列pyroGlu-Gln-Pro-Gly-Gln-Gly的呈味肽的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有较强呈味强度的小麦面筋蛋白源呈味肽(pyroGlu-Gln-Pro-Gly-Gln-Gly)的制备方法及其应用。
发明人研究得出具有pyroGlu-Gln-Pro-Gly-Gln-Gly一级结构的小麦面筋蛋白源呈味肽在200mg/kg的浓度下可显著提高食品的鲜味和厚味，具体技术方案如下。
小麦面筋蛋白源呈味肽的制备方法，该方法步骤如下：
（1）小麦面筋蛋白的酶解：将小麦面筋与水按质量比1:8～1:10混合，加入蛋白酶，在50～60 ℃酶解1-3d至水解度为50-60%，得小麦面筋蛋白酶解液；
（2）将小麦面筋蛋白酶解液进行脱酰胺处理，得脱酰胺小麦面筋蛋白酶解液；
（3）将脱酰胺小麦面筋蛋白酶解液灭酶，离心，取上清液，得到小麦面筋蛋白源呈味基料；
（4）在呈味基料中用浓度为80%的乙醇沉淀大分子蛋白和多肽，取上清液；用Sephadex G-50层析柱进行分离层析，收集第三个峰的组分。
进一步优化实施地，步骤（1）中所述的蛋白酶为来源于米曲霉或酱油曲霉的蛋白酶。
进一步优化实施地，步骤（2）中所述的脱酰胺方法为采用盐酸进行脱酰胺处理。
进一步优化实施地，步骤（2）中所述的脱酰胺条件为在pH1-2，50-70℃脱酰胺处理12-24h。
进一步优化实施地，步骤（3）中所述的灭酶条件90～100ºC灭酶10～15min。
进一步优化实施地，步骤（4）中层析的条件为：洗脱液洗脱速度为0.70ml/min，上样浓度为30mg/ml，洗脱液采用pH值为7.1，浓度为0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐水溶液。
上述述制备方法制得的小麦面筋蛋白源呈味肽，其一级结构为pyroGlu-Gln-Pro-Gly-Gln-Gly。
上述小麦面筋蛋白源呈味肽及其盐可在调味品、冷冻食品、方便食品中应用，以提高食品鲜味和厚味。所述小麦面筋蛋白源呈味肽在食品中浓度为200mg/kg以上。
进一步优化实施地，小麦面筋蛋白源呈味肽的制备方法的步骤如下：
（1）小麦面筋蛋白的酶解：将小麦面筋与水按质量比1:8～1:10混合，加入来源于米曲霉和酱油曲霉的蛋白酶，在50～60 ℃酶解1-3d至水解度为50-60%，得小麦面筋蛋白酶解液；
（2）将小麦面筋蛋白酶解液用盐酸调pH值至1-2，在50-70℃脱酰胺处理12-24h，得脱酰胺小麦面筋蛋白酶解液；
（3）将脱酰胺小麦面筋蛋白酶解液90～100ºC灭酶10～15min灭酶，离心，取上清液，得到小麦面筋蛋白源呈味基料；
（4）在呈味基料中用浓度为80%的乙醇沉淀大分子蛋白和多肽，取上清液；用Sephadex G-50层析柱进行分离层析，收集第三个峰；层析条件为：洗脱液洗脱速度为0.70ml/min，上样浓度为30mg/ml。洗脱液采用pH值为7.1，浓度为0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和技术效果：
（1）本发明提供的小麦面筋蛋白源呈味肽的呈味强度较高，在200mg/kg的浓度可显著提高食品的鲜味和厚味，用于调味品、膨化食品及冷冻食品中；
（2）本发明提供的小麦面筋蛋白源呈味肽稳定性较好，在小麦面筋蛋白液态呈味基料中室温存放1年，含量基本不变。
具体实施方式
以下再结合实例对本发明的实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此，以下若有未特别详细说明之过程和参数，均是本领域技术人员可参照现有技术实现的。
实施例1
（1）小麦面筋蛋白的酶解：将小麦面筋与水按质量比1:8混合，加入面筋重量2%风味蛋白酶（Favourzyme 500MG），在50 ℃酶解3d至水解度为50%，得小麦面筋蛋白酶解液；
（2）将小麦面筋蛋白酶解液用盐酸调pH值至1，在50℃脱酰胺处理12h，得脱酰胺小麦面筋蛋白酶解液；
（3）将脱酰胺小麦面筋蛋白酶解液灭酶，离心，取上清液，得到小麦面筋蛋白源呈味基料；
（4）在呈味基料中用体积浓度为80%的乙醇沉淀大分子蛋白和多肽，取上清液；用Sephadex G-50层析柱进行分离层析，收集第三个峰；层析条件为：洗脱液洗脱速度为0.70ml/min，上样浓度为30mg/ml。洗脱液采用pH值为7.1，浓度为0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液。
（4）将步骤（4）得到的组分，用电喷雾串联质谱法进行序列分析，经二级质谱分析，得到其一级结构为pyroGlu-Gln-Pro-Gly-Gln-Gly。
实施例2
（1）小麦面筋蛋白的酶解：将小麦面筋与水按质量比1:10混合，添加面筋重量1.5%Protease M（日本天野公司），在55℃酶解2d至水解度为56%，得小麦面筋蛋白酶解液；
（2）将小麦面筋蛋白酶解液用盐酸调pH值至2，在70℃脱酰胺处理24h，得脱酰胺小麦面筋蛋白酶解液；
（3）将脱酰胺小麦面筋蛋白酶解液100ºC灭酶10灭酶，离心，取上清液，得到小麦面筋蛋白源呈味基料；
（4）在呈味基料中用浓度为80%的乙醇沉淀大分子蛋白和多肽，取上清液；用Sephadex G-50层析柱进行分离层析，收集第三个峰；层析条件为：洗脱液洗脱速度为0.70ml/min，上样浓度为30mg/ml。洗脱液采用pH值为7.1，浓度为0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐。
（5）将步骤（4）得到的组分，用电喷雾串联质谱法进行序列分析，经二级质谱分析，得到其一级结构为pyroGlu-Gln-Pro-Gly-Gln-Gly。
实施例3
呈味肽pyroGlu-Gln-Pro-Gly-Gln-Gly的呈味效果评价
利用固相合成法合成纯度为99%的pyroGlu-Gln-Pro-Gly-Gln-Gly用于感官评价。
将鸡胸肉搅碎，放入20倍重量清水中，煮沸后保温30min，过滤得鸡汤。加入鸡汤质量0.5%的食盐，分别在鸡汤中加入200mg/kg的pyroGlu-Gln-Pro-Gly-Gln-Gly，在室温进行品尝。感官评价实验由8位32-46岁有感官评价经验的男性和10位女性组成。感官评价结果表明：添加200mg/kg的pyroGlu-Gln-Pro-Gly-Gln-Gly的鸡汤的厚味和鲜味明显提高。
在0.7%（m/v）的食盐溶液中分别添加味精和合成的面筋蛋白源呈味肽，并采用滋味稀释分析法研究合成的pyroGlu-Gln-Pro-Gly-Gln-Gly的鲜味阈值，分析其呈味肽的呈味特性，其滋味稀释分析结果见表1。由表1可见合成的pyroGlu-Gln-Pro-Gly-Gln-Gly在其较低浓度时具有明显的鲜味，其鲜味阈值达到 200 mg/L，是味精阈值的 1/2，但其对MSG没有显著的鲜味增强作用；若采用浓度为200 mg/L 的 I+G为空白溶液，该肽在200 mg/L的浓度下具有显著的鲜味增强作用。
表1
实施例4
将合成的pyroGlu-Gln-Pro-Gly-Gln-Gly以0.2%（质量）的浓度溶于1%食盐、0.3%的味精、0.02%I+G构成的鲜味溶液，分别于1、3、6、12个月后，测定溶液中的pyroGlu-Gln-Pro-Gly-Gln-Gly的含量，结果见表2。
表2
| 含量 | |
| 0 | 0.20% |
| 1 | 0.20% |
| 3 | 0.20% |
| 6 | 0.19% |
| 12 | 0.18% |
由表2可见，鲜味溶液中pyroGlu-Gln-Pro-Gly-Gln-Gly的含量在半年内仅降解5%，一年内降解10%，较为稳定。
Claims (4)
1.小麦面筋蛋白源呈味肽的制备方法，其特征在于该方法步骤如下：
（1）小麦面筋蛋白的酶解：将小麦面筋与水按质量比1:8～1:10混合，加入蛋白酶，在50～60 ℃酶解1-3d至水解度为50-60%，得小麦面筋蛋白酶解液；所述的蛋白酶为来源于米曲霉或酱油曲霉的蛋白酶；
（2）将小麦面筋蛋白酶解液进行脱酰胺处理，得脱酰胺小麦面筋蛋白酶解液；所述的脱酰胺方法为采用盐酸进行脱酰胺处理；所述的脱酰胺条件为在pH1-2，50-70℃脱酰胺处理12-24h；
（3）将脱酰胺小麦面筋蛋白酶解液灭酶，离心，取上清液，得到小麦面筋蛋白源呈味基料；所述的灭酶条件90～100ºC灭酶10～15min；
（4）在呈味基料中用浓度为80%的乙醇沉淀大分子蛋白和多肽，取上清液；用SephadexG-50层析柱进行分离层析，层析的条件为：洗脱液洗脱速度为0.70mL /min，上样浓度为30mg/mL ，洗脱液采用pH值为7.1，浓度为0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐水溶液；收集第三个峰的组分，得到小麦面筋蛋白源呈味肽，其一级结构为pyroGlu-Gln-Pro-Gly-Gln-Gly。
2.由权利要求1所述制备方法制得的小麦面筋蛋白源呈味肽，其一级结构为pyroGlu-Gln-Pro-Gly-Gln-Gly。
3.权利要求2所述小麦面筋蛋白源呈味肽及其盐在调味品、冷冻食品、方便食品中的应用，以提高食品鲜味和厚味。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述小麦面筋蛋白源呈味肽在食品中浓度为200mg/kg以上。
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