CN103074404B - 一种用复合酶水解乳清蛋白及制备蛋白胨的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用复合酶水解乳清蛋白的方法，该方法利用复合酶水解乳清蛋白，并随后用水解产物生产蛋白胨产品。所述方法包括以下步骤：配制一定浓度的乳清蛋白水溶液，离心脱脂，热水浴加热保温一段时间后，调节料液pH值及温度，加入一定量的内切与外切蛋白酶复合水解一段时间后，将水解液升温至约90℃，保温约10分钟灭酶活，再经过超滤过滤与反渗透浓缩，最后冻干制得乳清蛋白胨粉剂。按照本发明生产的蛋白胨产品水解度在60％以上，产品易溶于水，蛋白胨得率在50％以上，且质量好，其中寡肽含量在90％以上，易于消化吸收。

Description

一种用复合酶水解乳清蛋白及制备蛋白胨的方法

技术领域

本发明涉及一种蛋白胨生产方法，具体地涉及一种用复合酶水解乳清蛋白、并利用超滤技术制备蛋白胨的方法。

背景技术

蛋白胨作为培养基的主要成分之一，正广泛应用于食品、医药、微生物培养、生物发酵等很多领域。一种好的蛋白胨产品不仅价格要低廉，营养价值也要很高。目前，生产蛋白胨的主要原料多为大豆、及动物产品生产加工过程中的边角料，如骨头、血液、内脏等，由于原材料及生产工艺的不同，蛋白胨产品的内在质量各异，营养价值也有所区别。

目前，生产蛋白胨常用的工艺方法有：酸水解法、碱水解法和蛋白酶水解法。酸、碱水解工艺生产蛋白胨过程中虽然得率较高，但水解时严重破坏了产品中的氨基酸，使蛋白胨产品的营养价值降低，另外该方法生产过程中还会带入大量盐分，必要时还要做脱盐处理。相比之下，酶法生产蛋白胨的工艺条件较为缓和，生产过程中不会造成氨基酸的破坏，同时在生产过程中还会产生一定量的多肽，所以酶法制得的蛋白胨产品营养价值更高。

CN 1418562A和CN 1393148A公开了两种以大豆为原料生产蛋白胨的工艺方法，两种方法制得的试剂级蛋白胨的得率最高只有30％，且两种方法并没有对大豆原料的水解程度进行详细描述。

CN 101548709A和CN 101538601A分别公布了以动物血液和骨头为原料生产蛋白胨的生产工艺，两种工艺的蛋白胨得率最高为15％左右，且加工过程中需要高温高压蒸煮，工艺较为复杂。

US 6372452 B1公布了一种复合酶水解和膜滤分离技术生产蛋白胨类产品的工艺，但此工艺所用的原料为葵花籽、油菜籽和葡萄废料等植物性原料，且蛋白胨产品主要应用于临床治疗中使用的保健品。US 6787168 B1公布了一种利用酶解技术水解乳清浓缩蛋白(WPC)为生产蛋白胨的工艺，此工艺的主要目的是为了水解乳清蛋白中的过敏性蛋白，产品主要作为乳制品生产中的配料进行使用。

可以看出，目前蛋白胨的工艺生产，主要是以大豆、植物种子、骨头、血液、内脏等为生产原料，虽然价格低廉，但是蛋白质含量较低，且氨基酸组成搭配也不是很合理，蛋白胨产品的营养价值不高，同时，蛋白胨的得率也都不是很高。

因此，本发明旨在提供一种营养价值更高、蛋白胨得率更高的乳清蛋白胨粉剂及其制备方法。在该制备方法中，本发明采用了现有技术中尚无报道的碱性蛋白酶和风味蛋白酶的复合酶在碱性起始pH值下对乳清蛋白进行组合水解，发明人发现按本发明的水解方法得到的乳清蛋白水解产物的水解度要明显高于现有技术中用单一酶或复合酶得到的乳清蛋白水解产物的水解度，并且寡肽含量更高。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种酶法制备乳清蛋白水解产物的方法，以使乳清蛋白的水解程度较高，水解产物寡肽的含量较多，并获得较高的产品得率。

本发明的另一个目的在于提供一种由乳清蛋白水解产物制成的蛋白胨类产品，其中寡肽含量较高，氨基酸搭配合理，且营养丰富。

一方面，本发明提供了一种酶法制备乳清蛋白水解产物的方法，该方法主要利用碱性蛋白酶与风味蛋白酶复合使用，在碱性起始pH值下对乳清蛋白进行深度水解，并进行超滤，所得到的水解产品中的寡肽含量在90％以上，水解产物的水解度在60％以上，最终制得的蛋白胨产品得率在50％以上。

另一方面，本发明还提供了一种蛋白胨产品，其是按照本发明所述酶法水解乳清蛋白的方法得到的水解产物浓缩液经冻干制得的。

具体实施方式

本发明中所用乳清蛋白可以是通过本领域已知的方法生产得到的乳清蛋白，如乳清分离蛋白(WPI)或乳清浓缩蛋白(WPC)等。在本发明优选的实施方案中，可利用纯水将乳清蛋白溶解为2％～10％(重量/重量，按总固形物的含量计算)的蛋白溶液进行酶解，优选的乳清蛋白溶液的浓度为8％～10％。

除特别注明外，本发明中所述含量与比例均为重量含量与比例。

根据本发明的具体实施方案，本发明中将配制好的乳清蛋白溶液离心脱脂，脱脂后溶液中脂肪含量小于0.09％，蛋白胨粉剂产品中脂肪含量小于1％。具体可以采用本领域中常用的脱脂操作方法和参数。

根据本发明的具体实施方案，本发明中将离心脱脂后的乳清蛋白溶液在60℃～90℃的条件下保温5分钟～20分钟，以使乳清蛋白充分变性。

本发明所提供的酶法水解乳清蛋白的方法，主要包括以下步骤：将欲进行酶解的乳清蛋白溶解成乳清蛋白水溶液，将两种酶同时加入到所述水溶液中进行水解。

根据本发明的具体实施方案，本发明是采用微生物蛋白酶对乳清蛋白进行水解，更具体地，所述微生物蛋白酶为：碱性蛋白酶和风味蛋白酶。这些蛋白酶均可商购获得，例如诺维信(中国)有限公司的

根据本发明的具体实施方案，复合酶的总添加量为配制乳清蛋白水溶液时加入的乳清蛋白重量的2％～5％，优选的实施方案中，添加的复合酶的量为4％～5％。

根据本发明的具体实施方案，本发明中，在使乳清蛋白热变性后、在添加复合酶进行水解前，将乳清蛋白溶液的pH值调为8.0～10.0，该pH在本申请中称为“起始pH值”。调节pH值的调节剂可以采用所属领域中常用的调节剂，如1M NaOH溶液、1M HCl溶液等。发明人在研究中发现，作为内切酶的碱性蛋白酶优先作用于底物，随着底物中多肽含量的增加，风味蛋白酶，即外切酶开始发挥作用；而随着水解反应的进行，溶液pH值也逐渐降低，开始适合于风味蛋白酶的最佳作用条件。因此本发明选定的起始pH值同时考虑了碱性蛋白酶和风味蛋白酶各自的最适pH，从而使得可以将最适pH不一致的两种酶组合起来进行水解。

将乳清蛋白溶液调节至适合于酶解的温度，即可加入蛋白酶进行酶解。本发明中优选的酶解温度为50℃～60℃。

根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中是采用碱性蛋白酶与风味蛋白酶同时添加进行水解。发明人在研究中发现，在本发明的水解条件下，本发明中两种酶同时加入可以在更短的时间内达到较高的水解度，并且终止水解时水解产物的水解程度更高。

根据本发明的具体实施方案，本发明中，碱性蛋白酶与风味蛋白酶的添加比例为0.4～1∶1，优选为0.6～1∶1。本发明在实施时，将乳清蛋白溶液温度调节为50℃～60℃，再将碱性蛋白酶与风味蛋白酶同时加入，水解2小时～5小时。

根据本发明的具体实施方案，复合蛋白酶优选控制水解度达到60％以上时，热灭活蛋白酶，从而终止酶解的进行。本发明中具体的热灭活温度可控制为75℃～95℃，优选为85℃～95℃；热灭活时间为5分钟～20分钟，优选为5分钟～15分钟。

根据本发明的具体实施方案，本发明将灭酶活后的溶液冷却至室温，再进行超滤处理，超滤膜的膜分子量孔径为5万Da～20万Da，超滤膜的进膜工作压力为0.20MPa～0.50MPa，出膜工作压力为0.05MPa～0.20MPa，超滤膜的工作温度为30℃～50℃。将超滤后的透过液利用反渗透膜进行浓缩处理，最后利用冻干技术制得蛋白胨粉剂的形式。

本发明中，采用高效液相色谱法对水解产物的分子量分布进行了测定。本发明的乳清蛋白水解产物，其中分子量为180～2000Da的寡肽含量为在90％以上，分子量小于180Da的游离氨基酸含量＜5％。

综上所述，按照本发明生产的蛋白胨产品水解度在60％以上，产品易溶于水，蛋白胨得率在50％以上，且质量好，其中寡肽含量在90％以上，易于消化吸收，氨基酸搭配合理，营养价值高。

以下通过具体实施例详细说明本发明的技术及特点，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的技术实质和所能产生的有益效果，但不能将以下实施例理解为对本发明实施范围的限定。

实施例

参数测定方法

1、水解度测定方法：

本方法是通过测定水解前后乳中游离氨基氮的含量，来计算蛋白水解度的一种方法。在水解牛乳样中加入三氯乙酸(TCA)溶液使蛋白沉淀，然后过滤掉沉淀的蛋白，通过水解后在三氯乙酸(TCA)溶液中增加的游离氨基酸与三硝基苯磺酸钠(TNBS)反应的颜色变化来测定蛋白水解度。

蛋白质水解度按下式计算

$\mathrm{DH}=\frac{(C_2-C_1)\×0.1}{\mathrm{Pro}\×h_{\mathrm{tot}}}\×100$

其中：DH为水解度％

C₁-水解前样品中游离氨基氮的含量，单位为mmol/L；

C₂-水解后样品中游离氨基氮的含量，单位为mmol/L；

Pro-样品中蛋白质的浓度，单位g/100ml，通过凯氏定氮法测得；

h_tot-每克蛋白质的肽键的毫摩尔数，h_tot对于某一特定蛋白质来讲是一个常数(乳清蛋白的h_tot＝8.8mmol/g)。

2、分子量分布测定方法

采用高效凝胶过滤色谱法测定乳蛋白肽分子量分布，通过峰面积归一化法得到不同分子量范围肽的相对百分比；并用GPC软件处理数据得到不同分子量范围肽的数均分子量(Mn)和重均分子量(Mw)。

3、得率计算方法

得率＝反应后冻干粉的质量(w)/反应前原料的质量(w)×100％

实施例1

将乳清蛋白用水配制成8重量％的溶液，并将该溶液离心脱脂(5000r/min，55℃，处理能力为20t/h)，将脱脂后的溶液在80℃热水浴中保温15分钟，用1mol/L的氢氧化钠水溶液将该脱脂后的溶液的pH值调至9.0；然后，加入碱性蛋白酶与风味蛋白酶的复合酶，复合酶的总的添加量为配制乳清蛋白水溶液时加入的乳清蛋白的重量的5％，其中碱性蛋白酶与风味蛋白酶的添加比例为0.6∶1；将此溶液在55℃的条件下水解4.0小时，在85℃的条件下水浴灭活10分钟，再利用超滤膜将此溶液膜滤处理，超滤膜的膜分子量孔径为20万Da，超滤膜的进膜工作压力为0.40MPa，出膜工作压力为0.05MPa，超滤膜的工作温度为42℃；再将透过液利用反渗透膜进行浓缩处理，冻干浓缩液制得本实施例的蛋白胨粉剂样品。

本实施例酶解后水解产物的水解度为67.24％，其中分子量为180～2000Da的寡肽含量为95.1％，分子量小于180Da的游离氨基酸含量为4.98％；制得的蛋白胨回收率为58.5％。

实施例2

将乳清蛋白用水配制成2重量％的溶液，并将该溶液离心脱脂(5000r/min，55℃，处理能力为20t/h)，将脱脂后的溶液在60℃热水浴中保温10分钟，用1mol/L的氢氧化钠水溶液将该脱脂后的溶液的pH值调至8.0；然后，向上述乳清蛋白溶液中加入碱性蛋白酶与风味蛋白酶的复合酶，复合酶的总的添加量为配制乳清蛋白水溶液时加入的乳清蛋白的重量的2％，其中碱性蛋白酶与风味蛋白酶的添加比例为0.4∶1；将此溶液在50℃的条件下水解3.0小时，在80℃的条件下水浴灭活10分钟，再利用超滤膜将此溶液膜滤处理，超滤膜的膜分子量孔径为5万Da，超滤膜的进膜工作压力为0.30MPa，出膜工作压力为0.20MPa，超滤膜的工作温度为30℃；再将透过液利用反渗透膜进行浓缩处理，冻干浓缩液制得本实施例的蛋白胨粉剂样品。

本实施例酶解后水解产物的水解度为60.57％，其中分子量为180～2000Da的寡肽含量为90.6％，分子量小于180Da的游离氨基酸含量为3.59％；制得的蛋白胨回收率为51.1％。

实施例3

将乳清蛋白用水配制成10重量％的溶液，并将该溶液离心脱脂(5000r/min，55℃，处理能力为20t/h)，将脱脂后的溶液在90℃热水浴中保温20分钟，用1mol/L的氢氧化钠水溶液将该脱脂后的溶液的pH值调至10.0；然后，向上述乳清蛋白溶液中加入碱性蛋白酶与风味蛋白酶的复合酶，复合酶的总的添加量为配制乳清蛋白水溶液时加入的乳清蛋白的重量的4％，其中碱性蛋白酶与风味蛋白酶的添加比例为0.7∶1；将此溶液在60℃的条件下水解5.0小时，在90℃的条件下水浴灭活10分钟，再利用超滤膜将此溶液膜滤处理，超滤膜的膜分子量孔径为20万Da，超滤膜的进膜工作压力为0.40MPa，出膜工作压力为0.10MPa，超滤膜的工作温度为50℃；再将透过液利用反渗透膜进行浓缩处理，冻干浓缩液制得本实施例的蛋白胨粉剂样品。

本实施例酶解后水解产物的水解度为66.31％，其中分子量为180～2000Da的寡肽含量为93.2％，分子量小于180Da的游离氨基酸含量为4.75％；制得的蛋白胨回收率为57.3％。

实施例4

将乳清蛋白用水配制成5重量％的溶液，并将该溶液离心脱脂(5000r/min，55℃，处理能力为20t/h)，将脱脂后的溶液在70℃热水浴中保温5分钟，用1mol/L的氢氧化钠水溶液将该脱脂后的溶液的pH值调至8.0；然后，向上述乳清蛋白溶液中加入碱性蛋白酶与风味蛋白酶的复合酶，复合酶的总的添加量为配制乳清蛋白水溶液时加入的乳清蛋白的重量的3％，其中碱性蛋白酶与风味蛋白酶的添加比例为1∶1；将此溶液在50℃的条件下水解2.0小时，在75℃的条件下水浴灭活15分钟，再利用超滤膜将此溶液膜滤处理，超滤膜的膜分子量孔径为10万Da，超滤膜的进膜工作压力为0.50MPa，出膜工作压力为0.20MPa，超滤膜的工作温度为35℃；再将透过液利用反渗透膜进行浓缩处理，冻干浓缩液制得本实施例的蛋白胨粉剂样品。

本实施例酶解后水解产物的水解度为65.12％，其中分子量为180～2000Da的寡肽含量为92.1％，分子量小于180Da的游离氨基酸含量为4.56％；制得的蛋白胨回收率为55.3％。

实施例5

将乳清蛋白用水配制成5重量％的溶液，并将该溶液离心脱脂(5000r/min，55℃，处理能力为20t/h)，将脱脂后的溶液在70℃热水浴中保温10分钟，用1mol/L的氢氧化钠水溶液将该脱脂后的溶液的pH值调至8.0；然后，向上述乳清蛋白溶液中加入碱性蛋白酶与风味蛋白酶的复合酶，复合酶的总的添加量为配制乳清蛋白水溶液时加入的乳清蛋白的重量的3％，其中碱性蛋白酶与风味蛋白酶的添加比例为0.5∶1；将此溶液在55℃的条件下水解4.0小时，在95℃的条件下水浴灭活5分钟，再利用超滤膜将此溶液膜滤处理，超滤膜的膜分子量孔径为5万Da，超滤膜的进膜工作压力为0.40MPa，出膜工作压力为0.10MPa，超滤膜的工作温度为45℃；再将透过液利用反渗透膜进行浓缩处理，冻干浓缩液制得本实施例的蛋白胨粉剂样品。

本实施例酶解后水解产物的水解度为63.12％，其中分子量为180～2000Da的寡肽含量为91.5％，分子量小于180Da的游离氨基酸含量为4.32％；制得的蛋白胨回收率为53.87％。

对比例1

将乳清蛋白用水配制成1重量％的溶液，并将该溶液离心脱脂(5000r/min，55℃，处理能力为20t/h)，将脱脂后的溶液在50℃热水浴中保温10分钟，用1mol/L的盐酸溶液将该脱脂后的溶液的pH值调至6.0；然后，向上述乳清蛋白溶液中加入碱性蛋白酶与风味蛋白酶的复合酶，复合酶的总的添加量为配制乳清蛋白水溶液时加入的乳清蛋白的重量的1％，其中碱性蛋白酶与风味蛋白酶的添加比例为1.5∶1；将此溶液在55℃的条件下水解4.0小时，在95℃的条件下水浴灭活5分钟，再利用超滤膜将此溶液膜滤处理，超滤膜的膜分子量孔径为1万Da，超滤膜的进膜工作压力为0.40MPa，出膜工作压力为0.10MPa，超滤膜的工作温度为20℃；再将透过液利用反渗透膜进行浓缩处理，冻干浓缩液制得本实施例的蛋白胨粉剂样品。

本实施例酶解后水解产物的水解度为42.75％，其中分子量为180～2000Da的寡肽含量为70.2％，分子量小于180Da的游离氨基酸含量为3.25％；制得的蛋白胨回收率为40.87％。

对比例2

将乳清蛋白用水配制成12重量％的溶液，并将该溶液离心脱脂(5000r/min，55℃，处理能力为20t/h)，将脱脂后的溶液在55℃热水浴中保温5分钟，用1mol/L的氢氧化钠水溶液将该脱脂后的溶液的pH值调至7.0；然后，向上述乳清蛋白溶液中加入碱性蛋白酶与风味蛋白酶的复合酶，复合酶的总的添加量为配制乳清蛋白水溶液时加入的乳清蛋白的重量的1％，其中碱性蛋白酶与风味蛋白酶的添加比例为0.2∶1；将此溶液在40℃的条件下水解4.0小时，在90℃的条件下水浴灭活5分钟，再利用超滤膜将此溶液膜滤处理，超滤膜的膜分子量孔径为6kDa，超滤膜的进膜工作压力为0.30MPa，出膜工作压力为0.050MPa，超滤膜的工作温度为25℃；再将透过液利用反渗透膜进行浓缩处理，冻干浓缩液制得本实施例的蛋白胨粉剂样品。

本实施例酶解后水解产物的水解度为45.75％，其中分子量为180～2000Da的寡肽含量为73.6％，分子量小于180Da的游离氨基酸含量为3.53％；制得的蛋白胨回收率为43.69％。

Claims (10)

1.一种制备乳清蛋白水解产物的蛋白胨粉剂的方法，，该方法包括以下步骤：

A配制乳清蛋白水溶液，并离心脱脂；

B将A中得到的溶液置于热水浴中进行温育；

C调节温育后的溶液的pH值至8.0～10.0，随后加入由碱性蛋白酶与风味蛋白酶组成的复合酶进行水解，其中，所述复合酶的总添加量为配制乳清蛋白水溶液时加入的乳清蛋白的重量的2％～5％，所述碱性蛋白酶与所述风味蛋白酶的添加重量比为0.4～1：1，所述水解的温度为50℃～60℃，所述水解的持续时间为2小时～5小时，而后进行热灭活处理终止水解；

D将C中制得的溶液用超滤膜进行超滤过滤并进行反渗透浓缩处理，从而得到水解产物的浓缩液；

E将D中获得的水解产物冻干制成蛋白胨粉剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述乳清蛋白水溶液含2重量％～10重量％的乳清蛋白。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述离心脱脂后，A中得到的溶液中的脂肪含量小于0.09重量％。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，B中所述的热水浴的温度为60℃～90℃，B中所述的温育的持续时间为5分钟～20分钟。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述复合酶的总添加量为配制乳清蛋白水溶液时加入的乳清蛋白的重量的4％～5％；所述碱性蛋白酶与所述风味蛋白酶的添加重量比为0.6～1：1。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述热灭活处理的温度为75℃～95℃，持续时间为5分钟～20分钟。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述热灭活处理的温度为85℃～95℃，持续时间为5分钟～15分钟。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述超滤膜的膜分子量孔径为5万Da～20万Da；所述超滤膜的进膜工作压力为0.20MPa～0.50MPa，出膜工作压力为0.05MPa～0.20MPa；所述超滤膜的工作温度为30℃～50℃。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述乳清蛋白为乳清分离蛋白或乳清浓缩蛋白。

10.一种乳清蛋白水解产物的蛋白胨粉剂，所述蛋白胨粉剂是按照权利要求1～9中任一项所述的方法制得的。