CN111808904B - 一种从乳清废液中提取水解蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从乳清废液中提取水解蛋白的制备方法，利用絮凝剂聚合氯化铝和聚丙烯酰胺将蛋白富集后，采用高温高压技术使絮凝剂对蛋白的结合力减弱，后采用复合酶解技术直接对絮凝蛋白进行酶解产生小分子肽及氨基酸，解决了传统方法中蛋白提取率低问题，降低了乳清废液提取水解蛋白的生产成本，提高了产品的附加值，提升产业经济效益；此外，本发明选用具有高度定向性的复合酶制剂，不受絮凝剂影响，可以直接将絮凝剂结合的蛋白进行分解成为小分子肽及氨基酸，产品可直接应用于动物饲料及有机化肥，增加动物或植物的氮源摄入及吸收，解决了蛋白的应用问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种从乳清废液中提取水解蛋白的制备方法，尤其是一种利用蛋白质絮凝和复合酶解工艺从乳清废液中提取水解蛋白的方法，属于蛋白质提取技术领域。
背景技术
大豆乳清废水是生产大豆蛋白(大豆浓缩蛋白或分离蛋白)时所排出的工艺废水。大豆浓缩蛋白和分离蛋白生产都是以低温脱脂豆柏为原料，大豆浓缩蛋白的生产一般经过酸沉、醇沉、热处理等工艺过程实现蛋白沉淀分离，因此在大豆蛋白生产过程中会产生大量的乳清废水。乳清废液pH约为4.5，总固形物含量一般为1.0 %～2.1 %，其中糖类占一半以上，大豆乳清蛋白占0.1-0.5%，其BOD高达5000～8000mg/L，COD高达18000～20000mg/L，远远超过了要求排放的标准（我国对废水的排放标准BOD≦25mg/L、COD≦80mg/L）。如对乳清废水直接进行无害化治理（如专利CN105439397A）不仅增加生产成本，而且会导致乳清废水中蛋白质、低聚糖等资源的浪费，因此对乳清废水的资源化利用成为大豆蛋白产业亟需解决的技术难题。
豆清水蛋白含量较低，前期豆清水在预处理较难实现，要在车间连续化生产条件下提取其中的蛋白较为困难，且设备投资较高。乳清废液中蛋白提取最有效方法是膜提取，但提取率较低，仅为5%左右，且容易造成膜污染，生产成本高昂。如直接添加絮凝剂将蛋白沉淀出来，此时蛋白因与絮凝剂高度结合无法被利用，且生产出来的蛋白无法直接应用，应用方向不明朗。现有技术中，专利CN110577565A公开了一种从豌豆乳清废水回收PA2及psaLA的方法，以豌豆蛋白加工过程中产生的含蛋白质的豌豆乳清废水为原料，选择天然阳离子多糖壳聚糖作为凝聚剂，通过调节复凝聚条件，分步实现豌豆两种乳清蛋白PA2和psa LA的提取与分离纯化；专利CN108191950A公开了一种从大豆乳清废水中回收蛋白的方法，包括如下步骤：(1)将大豆乳清废水的pH调节为碱性后浓缩；(2)将步骤(1)浓缩后的豆清浓缩液调节蛋白浓度为12～16％，经喷雾干燥得到所述大豆蛋白粉。比较发现，现有技术并未解决絮凝后蛋白直接利用、蛋白质提取率低、生产成本高等技术问题。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，针对絮凝后的蛋白无法直接被利用的问题，本发明提供一种从乳清废液中提取水解蛋白的制备方法，利用絮凝剂聚合氯化铝和聚丙烯酰胺将蛋白富集后，采用高温高压技术使絮凝剂对蛋白的结合力减弱，后采用复合酶解技术直接对絮凝蛋白进行酶解产生小分子肽及氨基酸，解决了传统方法中蛋白提取率低问题，降低了乳清废液提取水解蛋白的生产成本，提高了产品的附加值，提升产业经济效益；此外，本发明选用具有高度定向性的复合酶制剂，不受絮凝剂影响，可以直接将絮凝剂结合的蛋白进行分解成为小分子肽及氨基酸，产品可直接应用于动物饲料及有机化肥，增加动物或植物的氮源摄入及吸收，解决了蛋白的应用问题。
本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：
一种从乳清废液中提取水解蛋白的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）絮凝沉淀：向乳清废液中添加絮凝剂，搅拌均匀，调节乳清废液的pH至5.0～6.0，使蛋白质不断沉淀；
（2）离心分离：将絮凝沉淀后的乳清废液离心分离，在25℃条件下，4000～6000rpm离心20min；
（3）剪切乳化：离心后的重相加入3倍纯净水水洗，利用高速剪切乳化机进行剪切乳化，然后离心分离，分离出重相和轻相；
（4）加热解离：向步骤（3）离心后的重相加入2倍的纯净水，调整pH至6.5，进入压力罐中加热，加热温度120℃，加热时间30min，使得絮凝蛋白变性解离；
（5）降温酶解：加热完成后，压力罐夹层通冷却水，使料液温度降低至50～55℃，并加入复合酶制剂，保温酶解15h；
（6）灭菌灭酶：酶解完成后，压力罐中120℃，10min灭菌灭酶；
（7）离心干燥：料液冷却后离心，轻相进行喷雾干燥，得到最终产品。
进一步的，步骤（1）中所述絮凝剂为聚合氯化铝、聚丙烯酰胺中的一种或两者的混合。
优选的，步骤（1）中所述絮凝剂为聚合氯化铝、聚丙烯酰胺的混合物，其质量比为5:1。
进一步的，步骤（1）中絮凝剂的添加量为3～5g/L乳清废液。
最优的，步骤（1）中絮凝剂的添加量为3g/L乳清废液。
进一步的，步骤（5）中复合酶制剂的添加量为料液质量比的6～8%。
进一步的，所述复合酶制剂为碱性蛋白酶、复合蛋白酶和植酸酶的混合物，其质量比为10:2:1。
优选的，所述碱性蛋白酶和复合蛋白酶为安琪酵母生产制备的酶制剂。
优选的，步骤（3）中离心后轻相回用于低聚糖生产工序用于生产低聚糖。
本发明提供一种乳清废液中提取水解蛋白的制备工艺，与现有技术相比，具有以下显著优势：
（1）本发明利用蛋白絮凝后复合酶解的工艺从乳清废液中提取水解蛋白，解决了传统方法中蛋白提取率低问题。实验结果表明，本发明利用蛋白絮凝剂将乳清废水中的蛋白沉淀出来，蛋白去除率可达90%以上，最终蛋白的利用率（水解蛋白/乳清废水中总蛋白）可达80%以上；所得产品氨基酸含量可达90%以上，适于动植物对氮源的吸收利用；
（2）本发明显著降低了从乳清废液中提取水解蛋白的生产成本。经测算，利用本发明生产水解蛋白，产品成本大幅降低至9元/Kg以下，而水解蛋白平均价格在18元/Kg左右，大幅提高蛋白厂副产品的产品附加值，为企业增加经济效益；
（3）本发明工艺简单，蛋白厂现有设备即可满足生产要求，不用额外购置昂贵的膜设备，适合工厂连续化生产；
（4）本发明利用絮凝和酶解工艺从乳清废液中提取水解蛋白，蛋白利用后实现了废液的零排放，可有效减轻乳清废水对环境的污染，具有显著的环保效益。
具体实施方式
实施例1
一种从乳清废液中提取水解蛋白的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）絮凝沉淀：向乳清废液中添加絮凝剂聚合氯化铝和聚丙烯酰胺，添加量为聚合氯化铝为2.5g/L乳清废液、聚丙烯酰胺为0.5g/L乳清废液，搅拌均匀，调节乳清废液的pH至5.0～6.0，使蛋白质不断沉淀；
（2）离心分离：将絮凝沉淀后的乳清废液离心分离，在25℃条件下，4000～6000rpm离心20min；
（3）剪切乳化：离心后的重相加入3倍纯净水水洗，利用高速剪切乳化机进行剪切乳化，然后离心分离，分离出重相和轻相；
（4）加热解离：向步骤（3）离心后的重相加入2倍的纯净水，调整pH至6.5，进入压力罐中加热，加热温度120℃，加热时间30min，使得絮凝蛋白变性解离；
（5）降温酶解：加热完成后，压力罐夹层通冷却水，使料液温度降低至50～55℃，并加入料液质量比6.5%的复合酶制剂，保温酶解15h；所述复合酶制剂为碱性蛋白酶、复合蛋白酶和植酸酶的混合物，其质量比为10:2:1；
（6）灭菌灭酶：酶解完成后，压力罐中120℃，10min灭菌灭酶；
（7）离心干燥：料液冷却后离心，轻相进行喷雾干燥，得到最终产品。
测定絮凝后蛋白去除率及酶解后水解蛋白得率，实验结果如表1所示：
表1 实施例1实验结果
上述实验结果表明，在实施例1工艺技术条件下，可以显著去除乳清废液的蛋白，去除率达到92.20%，通过复合酶解工艺制备水解蛋白氨基酸，水解蛋白得率达到83.95%，氨基酸含量达到97.39%。在此工艺条件下，水解蛋白的生产成本仅为9.18元/Kg,目前该工艺已在临沂山松生物制品有限公司实现产业化转化应用，显著提升了企业的经济效益。
实施例2
一种从乳清废液中提取水解蛋白的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）絮凝沉淀：向乳清废液中添加絮凝剂聚合氯化铝，添加量为3.0g/L乳清废液，搅拌均匀，调节乳清废液的pH至5.0～6.0，使蛋白质不断沉淀；
（2）离心分离：将絮凝沉淀后的乳清废液离心分离，在25℃条件下，4000～6000rpm离心20min；
（3）剪切乳化：离心后的重相加入3倍纯净水水洗，利用高速剪切乳化机进行剪切乳化，然后离心分离，分离出重相和轻相；
（4）加热解离：向步骤（3）离心后的重相加入2倍的纯净水，调整pH至6.5，进入压力罐中加热，加热温度120℃，加热时间30min，使得絮凝蛋白变性解离；
（5）降温酶解：加热完成后，压力罐夹层通冷却水，使料液温度降低至50～55℃，并加入料液质量比6.5%的复合酶制剂，保温酶解15h；所述复合酶制剂为碱性蛋白酶、复合蛋白酶和植酸酶的混合物，其质量比为10:2:1；
（6）灭菌灭酶：酶解完成后，压力罐中120℃，10min灭菌灭酶；
（7）离心干燥：料液冷却后离心，轻相进行喷雾干燥，得到最终产品。
测定絮凝后蛋白去除率及酶解后水解蛋白得率，实验结果如表2所示：
表2 实施例2实验结果
上述实验结果表明，当絮凝剂采用单一的聚合氯化铝时，蛋白去除率和水解蛋白的得率均下降，水解蛋白的生产成本上升。
实施例3
一种从乳清废液中提取水解蛋白的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）絮凝沉淀：向乳清废液中添加絮凝剂聚丙烯酰胺，添加量为3.0g/L乳清废液，搅拌均匀，调节乳清废液的pH至5.0～6.0，使蛋白质不断沉淀；
（2）离心分离：将絮凝沉淀后的乳清废液离心分离，在25℃条件下，4000～6000rpm离心20min；
（3）剪切乳化：离心后的重相加入3倍纯净水水洗，利用高速剪切乳化机进行剪切乳化，然后离心分离，分离出重相和轻相；
（4）加热解离：向步骤（3）离心后的重相加入2倍的纯净水，调整pH至6.5，进入压力罐中加热，加热温度120℃，加热时间30min，使得絮凝蛋白变性解离；
（5）降温酶解：加热完成后，压力罐夹层通冷却水，使料液温度降低至50～55℃，并加入料液质量比6.5%的复合酶制剂，保温酶解15h；所述复合酶制剂为碱性蛋白酶、复合蛋白酶和植酸酶的混合物，其质量比为10:2:1；
（6）灭菌灭酶：酶解完成后，压力罐中120℃，10min灭菌灭酶；
（7）离心干燥：料液冷却后离心，轻相进行喷雾干燥，得到最终产品。
测定絮凝后蛋白去除率及酶解后水解蛋白得率，实验结果如表3所示：
表3 实施例3实验结果
上述实验结果表明，当絮凝剂采用单一的聚丙烯酰胺时，蛋白去除率较实施例1上升，表明采用聚丙烯酰胺为絮凝剂时提升了乳清废液中蛋白的去除率，这对乳清废液的无害化治理是有利的；但絮凝剂采用单一的聚丙烯酰胺时，水解蛋白得率显著降低，这表明聚丙烯酰胺为絮凝剂时不利于酶解反应及水解氨基酸的析出，此时水解氨基酸的生产成本显著上升。
对比实施例1
一种从乳清废液中提取水解蛋白的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）絮凝沉淀：向乳清废液中添加絮凝剂聚合氯化铝和聚丙烯酰胺，添加量为聚合氯化铝为2.5g/L乳清废液、聚丙烯酰胺为0.5g/L乳清废液，搅拌均匀，调节乳清废液的pH至5.0～6.0，使蛋白质不断沉淀；
（2）离心分离：将絮凝沉淀后的乳清废液离心分离，在25℃条件下，4000～6000rpm离心20min；
（3）剪切乳化：离心后的重相加入3倍纯净水水洗，利用高速剪切乳化机进行剪切乳化，然后离心分离，分离出重相和轻相；
（4）加热解离：向步骤（3）离心后的重相加入2倍的纯净水，调整pH至6.5，进入压力罐中加热，加热温度120℃，加热时间30min，使得絮凝蛋白变性解离；
（5）降温酶解：加热完成后，压力罐夹层通冷却水，使料液温度降低至50～55℃，并加入料液质量比6.0%的复合酶制剂，保温酶解15h；所述复合酶制剂为碱性蛋白酶、复合蛋白酶的混合物，其质量比为5:1；
（6）灭菌灭酶：酶解完成后，压力罐中120℃，10min灭菌灭酶；
（7）离心干燥：料液冷却后离心，轻相进行喷雾干燥，得到最终产品。
对比实施例2
一种从乳清废液中提取水解蛋白的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）絮凝沉淀：向乳清废液中添加絮凝剂聚合氯化铝和聚丙烯酰胺，添加量为聚合氯化铝为2.5g/L乳清废液、聚丙烯酰胺为0.5g/L乳清废液，搅拌均匀，调节乳清废液的pH至5.0～6.0，使蛋白质不断沉淀；
（2）离心分离：将絮凝沉淀后的乳清废液离心分离，在25℃条件下，4000～6000rpm离心20min；
（3）剪切乳化：离心后的重相加入3倍纯净水水洗，利用高速剪切乳化机进行剪切乳化，然后离心分离，分离出重相和轻相；
（4）加热解离：向步骤（3）离心后的重相加入2倍的纯净水，调整pH至6.5，进入压力罐中加热，加热温度120℃，加热时间30min，使得絮凝蛋白变性解离；
（5）降温酶解：加热完成后，压力罐夹层通冷却水，使料液温度降低至50～55℃，并加入料液质量比0.5%的植酸酶；
（6）灭菌灭酶：酶解完成后，压力罐中120℃，10min灭菌灭酶；
（7）离心干燥：料液冷却后离心，轻相进行喷雾干燥，得到最终产品。
对比实施例3
一种从乳清废液中提取水解蛋白的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）絮凝沉淀：向乳清废液中添加絮凝剂聚合氯化铝和聚丙烯酰胺，添加量为聚合氯化铝为2.5g/L乳清废液、聚丙烯酰胺为0.5g/L乳清废液，搅拌均匀，调节乳清废液的pH至5.0～6.0，使蛋白质不断沉淀；
（2）离心分离：将絮凝沉淀后的乳清废液离心分离，在25℃条件下，4000～6000rpm离心20min；
（3）剪切乳化：离心后的重相加入3倍纯净水水洗，利用高速剪切乳化机进行剪切乳化，然后离心分离，分离出重相和轻相；
（4）加热解离：向步骤（3）离心后的重相加入2倍的纯净水，调整pH至6.5，进入压力罐中加热，加热温度120℃，加热时间30min，使得絮凝蛋白变性解离；
（5）降温酶解：加热完成后，压力罐夹层通冷却水，使料液温度降低至50～55℃，并加入料液质量比6.5%的纯净水，保温降解15h；
（6）灭菌灭酶：酶解完成后，压力罐中120℃，10min灭菌灭酶；
（7）离心干燥：料液冷却后离心，轻相进行喷雾干燥，得到最终产品。
比较实施例1和对比实施例1-3的水解蛋白得率，实验结果如表4所示：
表4 对比实施例水解蛋白得率
| 组别 | 酶解方案 | 水解蛋白得率（%） |
| 实施例1 | 碱性蛋白酶+复合蛋白酶+植酸酶 | 83.95 |
| 对比实施例1组 | 碱性蛋白酶+复合蛋白酶 | 67.83 |
| 对比实施例2组 | 植酸酶 | 27.76 |
| 对比实施例3组 | 无 | 29.18 |
上述实验结果表明，在本申请中碱性蛋白酶和复合蛋白酶对水解蛋白的得率起到主要作用，能够将絮凝后的蛋白降解为水解氨基酸，植酸酶与空白对照组相比，差异极不显著，这表明植酸酶对水解蛋白得率的影响不显著；同时，实验结果表明碱性蛋白酶、复合蛋白酶与植酸酶之间具有显著的协同增效作用。
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (2)
1.一种从乳清废液中提取水解蛋白的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤：
（1）絮凝沉淀：向乳清废液中添加絮凝剂，搅拌均匀，调节乳清废液的pH至5.0～6.0，使蛋白质不断沉淀；所述絮凝剂为聚合氯化铝、聚丙烯酰胺的混合物，其质量比为5:1；添加量为聚合氯化铝为2.5g/L乳清废液、聚丙烯酰胺为0.5g/L乳清废液；
（2）离心分离：将絮凝沉淀后的乳清废液离心分离，在25℃条件下，4000～6000rpm离心20min；
（3）剪切乳化：离心后的重相加入3倍纯净水水洗，利用高速剪切乳化机进行剪切乳化，然后离心分离，分离出重相和轻相；
（4）加热解离：向步骤（3）离心后的重相加入2倍的纯净水，调整pH至6.5，进入压力罐中加热，加热温度120℃，加热时间30min，使得絮凝蛋白变性解离；
（5）降温酶解：加热完成后，压力罐夹层通冷却水，使料液温度降低至50～55℃，并加入复合酶制剂，保温酶解15h；所述复合酶制剂的添加量为料液质量比的6～8%；所述复合酶制剂为碱性蛋白酶、复合蛋白酶和植酸酶的混合物，其质量比为10:2:1
（6）灭菌灭酶：酶解完成后，压力罐中120℃，10min灭菌灭酶；
（7）离心干燥：料液冷却后离心，轻相进行喷雾干燥，得到最终产品。
2.根据权利要求1所述一种从乳清废液中提取水解蛋白的制备方法，其特征在于所述步骤（3）中离心后轻相回用于低聚糖生产工序用于生产低聚糖。
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