CN114181292B - 一种高溶解性酪蛋白改善睡眠肽及其制备工艺与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高溶解性酪蛋白改善睡眠肽及其制备工艺与应用，涉及乳制品及食源性活性肽开发技术领域。其制备工艺步骤：(1)在恒温搅拌的水中加入酪蛋白，经预处理后，制得酪蛋白分散液；(2)在步骤(1)所述酪蛋白分散液中加入可食用碱液，调节pH值，加入胰酶、菠萝蛋白酶及风味蛋白酶其中一种复合其它蛋白酶进行控制酶解，酶解后升温灭酶；(3)冷却后，过筛，取上清液，浓缩，喷雾干燥，得到高溶解性酪蛋白改善睡眠肽。该制备工艺可实现工厂大规模生产，解决在口服液中添加应用中出现大量沉淀絮凝的问题，还可以显著提高戊巴比妥钠诱导小鼠的入睡率和睡眠时间，广泛适用于普通食品、保健食品或功能食品。
Description
技术领域
本发明涉及乳制品及食源性活性肽开发技术领域，具体涉及一种高溶解性的酪蛋白改善睡眠肽及其制备工艺与应用。
背景技术
目前，对于牛乳酪蛋白的深加工处理，一般是发酵法、酸法、碱法或酶法等方法，酪蛋白作为一种富含各种生物活性肽的大分子优质蛋白，其中应用最为广泛的要属酶法。近年来国内外陆续公开了很多酪蛋白酶解工艺的相关专利技术，其中大部分集中在新的活性肽制备技术，比如公开号CN201810373234.9的中国发明专利——一种水牛乳酪蛋白抗氧化活性肽的制备和公开号US8685933B2的美国发明专利——具有抗焦虑活性的酪蛋白肽α-CZP，但是它们均没有提出对于酪蛋白改善睡眠活性肽的相关研究。现有已公开的中国发明专利CN112056453A——一种富含芳香族氨基酸的改善睡眠酶解物及其制备方法，虽然提出具有改善睡眠活性的潜能，但是该酪蛋白改善睡眠肽的溶解性较差，没有考虑其加工性能，也没有在体内证明其改善睡眠活性，因此有待进一步改进。
现有技术中含α-CZP的酪蛋白酶解物已在动物实验及临床研究中证明，结果表明该酶解物具有显著延长大鼠戊巴比妥钠诱导睡眠以及缩短人的入睡潜伏期及延长人的深度睡眠时间的效果。主要作用机制在于α-CZP中两个特殊的酪氨酸中苯环的距离与具安定活性的苯二氮卓结构类似，并且能够在大脑中与“睡眠开关”GABA受体结合，从而发挥改善睡眠作用。但已有公开技术报道的改善睡眠酪蛋白酶解物，存在入睡率低，溶解性差，亚基蛋白原料难分离，生产成本高等一系列问题，因此目前市场上还没有许多相关产品应用。
在现有生产技术中，酪蛋白的溶解性很差，尤其在等电点附近(pH值为4.3～4.8)，容易析出大量沉淀。虽然酪蛋白经酶解后能够一定程度缓解这种现象，但轻度酶解的酪蛋白水解物中仍然含有许多疏水性大分子，在pH3～5高温高压条件下，十分容易浑浊、产生絮凝漂浮，甚至沉淀。因此，存在的这种技术弊端极大程度的限制了酪蛋白肽在口服液等功能食品中的应用，现有技术中常采用透析、超滤、盐析等方法去除大分子，提高溶解度，但是这样很容易造成酶解产物中的有效成分损失，降低产品的活性多肽含量。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述不足，本发明在于提供一种高溶解性酪蛋白改善睡眠肽，具有显著提高戊巴比妥钠诱导小鼠入睡率，延长睡眠时间的效果，应用在普通食品、功能性食品或保健食品中。
本发明提供一种高溶解性酪蛋白改善睡眠肽的制备工艺。在保证溶解性的同时，又能保证酶解产物的肽含量，同时还兼顾改善睡眠活性，整个过程经济环保，操作简单，适合工厂大规模生产。
本发明提供的一种高溶解性酪蛋白改善睡眠肽在口服液、粉剂、冲剂以及压片糖果等普通食品、食品添加剂、功能食品或保健食品中的应用。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提出一种高溶解性酪蛋白改善睡眠肽的制备工艺，具体步骤包括以下：
(1)在恒温搅拌的水中加入酪蛋白，经预处理后，制得酪蛋白分散液；
(2)在步骤(1)所述酪蛋白分散液中加入可食用碱液，调节pH值，搅拌分散，在恒定温度下，加入胰酶、菠萝蛋白酶及风味蛋白酶其中一种复合其它蛋白酶进行控制酶解，酶解后升温灭酶；
(3)冷却后，过筛，取上清液，浓缩，喷雾干燥，得到高溶解性酪蛋白改善睡眠肽。
进一步地，步骤(1)所述恒温范围包括37～50℃。
进一步地，步骤(1)所述加入酪蛋白与水的质量比为1:6～1:12。
进一步地，步骤(1)所述预处理方法包括在pH范围包括5～8，加热温度具体在37℃～50℃内，超声频率在40～80KHz范围内及剪切速率在8000～14000rpm其中一种或多种方法处理。
进一步地，步骤(2)所述胰酶、菠萝蛋白酶及风味蛋白酶其中一种和步骤(1)所述加入酪蛋白的质量百分比为0.01％～1.0％。
进一步地，步骤(2)所述其它蛋白酶为木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶及中性蛋白酶中的一种或多种。
进一步地，步骤(2)所述其它蛋白酶和步骤(1)所述加入酪蛋白的质量百分比为0.1％～2.0％。
进一步地，步骤(2)所述其它蛋白酶和步骤(1)所述加入酪蛋白的质量百分比为0.1％～1.0％。
进一步地，步骤(2)所述酶解温度为37℃～55℃，酶解pH为6.5～8.0。
进一步地，步骤(2)所述酶解的时间为1～6h。
进一步地，步骤(3)所述过筛的要求为80～200目。
进一步地，步骤(3)所述浓缩的固形物含量20％～40％。
进一步地，步骤(3)所述喷雾干燥的条件为：进口温度为160～210℃，出口温度为70～120℃。
本发明提供一种由上述制备工艺得到的高溶解性酪蛋白改善睡眠肽，溶解度高，无絮凝，肽含量损失小，入睡率高，睡眠时间延长。
本发明所述高溶解性酪蛋白改善睡眠肽能够广泛应用于口服液、粉剂、冲剂、普通食品(如压片糖果、饮料)、食品添加剂、功能食品或保健食品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明提供的制备工艺，无需离心，只需简单的过筛，可实现工厂的大规模生产，通过简单的预处理叠加使用比较特异的胰酶、菠萝蛋白酶或风味蛋白酶先对酪蛋白序列进行轻度酶切，释放出前体肽，而后精准、适度复合其他蛋白酶深度酶解，酶消耗量非常低，极显著提高溶解度、肽含量，但同时所得到的肽组分，还兼具提高入睡率及延长睡眠时间的效果。
(2)本发明提供的高溶解性酪蛋白改善睡眠肽可以应用在口服液中。在酸性条件下，也不会出现漂浮的絮凝以及大分子沉淀，同时产品中活性肽含量也得到最大的保留，显著提高经济效益。
附图说明
图1为实施例1-4及对比例1-4所得酪蛋白改善睡眠肽在戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠行为学实验中入睡率的结果图。
图2为实施例1-4及对比例1-4所得酪蛋白改善睡眠肽在戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠行为学实验中睡眠时间的结果图。
具体实施方式
以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
下列实施例中涉及的对于食品中溶解度的测定方法、肽含量和睡眠行为学指标的测定方法：
(1)食品中溶解度的测定方法，采用食品安全国家标准方法GB5413.29-2010婴幼儿食品和乳品中“第二法——溶解度法”进行溶解性的测定。
(2)食品中肽含量的测定方法，采用食品安全国家标准方法GB/T22492-2008大豆肽粉·附录B肽含量的测定方法。
(3)延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间和提高戊巴比妥钠诱导小鼠入睡率的实验方法，参考《保健食品检验与评价技术规范》进行测定。(其中空白对照组为口服灌胃相同剂量的超纯水，阳性对照组为腹腔注射1mg/kg的安定类药物地西泮，而其他样品组别均设置口服灌胃150mg/kg，0.1mL/10g)
实施例1
(1)按照质量份数1:6比例分别称量加入酪蛋白和蒸馏水，并且注意先加入水，再加入酪蛋白，37℃恒温搅拌溶解，调pH至8，在80KHz下超声处理5min，制得酪蛋白分散液。
(2)在上述酪蛋白分散液中加入可食用碱调节pH值至7.0，控制温度为50℃，搅拌分散液至基本无大颗粒，加入0.1％的胰酶(按加入酪蛋白的质量计)复合1％的木瓜蛋白酶和1％的碱性蛋白酶(按加入酪蛋白的质量计)，开始酶解4h，得到酶解液，迅速升温至95℃，加热15min灭酶。
(3)灭酶后将酶解液冷却至65℃，80目过筛，取上清液，浓缩至固形物含量35％，高压瞬时加热灭菌后，以进口温度为200℃，出风温度为85℃喷雾干燥后得到酪蛋白改善睡眠肽。
实施例2
(1)按照质量份数1:6比例分别称量加入酪蛋白和蒸馏水，并且注意先加入水，再加入酪蛋白，37℃恒温搅拌溶解，调pH至6.3，40KHz下超声处理10min，制得酪蛋白分散液。
(2)在上述酪蛋白分散液中加入可食用碱调节pH值至8.0，控制温度为45℃，搅拌分散液至基本无大颗粒，加入0.01％的胰酶(按加入酪蛋白的质量计)复合0.1％的碱性蛋白酶(按加入酪蛋白的质量计)，开始酶解6h，得到酶解液，迅速升温至95℃，加热15min灭酶。
(3)灭酶后将酶解液冷却至70℃，100目过筛，取上清液，浓缩至固形物含量20％，高压瞬时加热灭菌后，以进口温度为160℃，出口温度为70℃，喷雾干燥得到酪蛋白改善睡眠肽。
实施例3
(1)按照质量份数1:8比例分别称量加入酪蛋白和蒸馏水，并且注意先加入水，再加入酪蛋白，50℃恒温搅拌溶解，调pH至7.5，14000rpm高速剪切处理5min，制得酪蛋白分散液。
(2)在上述酪蛋白分散液中加入可食用碱，调节pH值至7.5，控制温度为55℃，搅拌分散液至基本无大颗粒，加入1％的菠萝蛋白酶(按加入酪蛋白的质量计)复合1％的中性蛋白酶(按加入酪蛋白的质量计)，开始酶解2h，得到酶解液，迅速升温至95℃，加热15min灭酶。
(3)灭酶后将酶解液冷却至60℃，200目过筛，取上清液，浓缩至固形物含量40％，高压瞬时加热灭菌后，以进口温度为210℃，出口温度为120℃喷雾干燥得到酪蛋白改善睡眠肽。
实施例4
(1)按照质量份数1:12比例分别称量加入酪蛋白和蒸馏水，并且注意先加入水，再加入酪蛋白，45℃恒温搅拌溶解，调pH至5，8000rpm高速剪切处理5min，制得酪蛋白分散液。
(2)在上述酪蛋白分散液中加入可食用碱，调节pH值至7.5，控制温度为37℃，搅拌分散液至基本无大颗粒，加入0.5％的风味蛋白酶(按加入酪蛋白的质量计)复合0.5％的木瓜蛋白酶(按加入酪蛋白的质量计)，开始酶解1h，得到酶解液，迅速升温至95℃，加热15min灭酶。
(3)灭酶后将酶解液冷却至70℃，80目过筛，取上清液，浓缩至固形物含量35％，高压瞬时加热灭菌后以进口温度为180℃，出风温度为100℃，喷雾干燥得到酪蛋白改善睡眠肽。
对比例1(基于实施例1减少加酶工艺)
(1)按照质量份数1:6比例分别称量加入酪蛋白和蒸馏水，并且注意先加入水，再加入酪蛋白，37℃恒温搅拌溶解，调pH至8，在80KHz下超声处理5min，制得酪蛋白分散液。
(2)在上述酪蛋白分散液中加入可食用碱调节pH值至7.0，控制温度为50℃，搅拌分散液至基本无大颗粒，加入0.1％的胰酶(按加入酪蛋白的质量计)，开始酶解4h，得到酶解液，迅速升温至95℃，加热15min灭酶。
(3)灭酶后将酶解液冷却至65℃，80目过筛，取上清液，浓缩至固形物含量35％，高压瞬时加热灭菌后，以进口温度为200℃，出风温度为85℃喷雾干燥得到酪蛋白改善睡眠肽。
对比例2(基于实施例2减少预处理)
(1)按照质量份数1:6比例分别称量加入酪蛋白和蒸馏水，并且注意先加入水，再加入酪蛋白，37℃恒温搅拌溶解，制得酪蛋白分散液。
(2)在上述酪蛋白分散液中加入可食用碱调节pH值至8.0，控制温度为45℃，搅拌分散液至基本无大颗粒，加入0.01％的胰酶(按加入酪蛋白的质量计)复合0.1％的碱性蛋白酶(按加入酪蛋白的质量计)，开始酶解6h，得到酶解液，迅速升温至95℃，加热15min灭酶。
(3)灭酶后将酶解液冷却至70℃，100目过筛，取上清液，浓缩至固形物含量20％，高压瞬时加热灭菌后，以进口温度为160℃，出口温度为70℃，喷雾干燥得到酪蛋白改善睡眠肽。
对比例3(基于实施例3减少加酶工艺)
(1)按照质量份数1:8比例分别称量加入酪蛋白和蒸馏水，并且注意先加入水，再加入酪蛋白，50℃恒温搅拌溶解，调pH至7.5，14000rpm高速剪切处理5min，制得酪蛋白分散液。
(2)在上述酪蛋白分散液中加入可食用碱，调节pH值至7.5，控制温度为55℃，搅拌分散液至基本无大颗粒，加入1％的菠萝蛋白酶(按加入酪蛋白的质量计)，开始酶解2h，得到酶解液，迅速升温至95℃，加热15min灭酶。
(3)灭酶后将酶解液冷却至60℃，200目过筛，取上清液，浓缩至固形物含量40％，高压瞬时加热灭菌后，以进口温度为210℃，出口温度为120℃喷雾干燥得到酪蛋白改善睡眠肽。
对比例4(基于实施例4减少加酶工艺)
(1)按照质量份数1:12比例分别称量加入酪蛋白和蒸馏水，并且注意先加入水，再加入酪蛋白，45℃恒温搅拌溶解，调pH至5，8000rpm高速剪切处理5min，制得酪蛋白分散液。
(2)在上述酪蛋白分散液中加入可食用碱，调节pH值至7.5，控制温度为37℃，搅拌分散液至基本无大颗粒，加入0.5％的风味蛋白酶(按加入酪蛋白的质量计)，开始酶解1h，得到酶解液，迅速升温至95℃，加热15min灭酶。
(3)灭酶后将酶解液冷却至70℃，80目过筛，取上清液，浓缩至固形物含量35％，高压瞬时加热灭菌后以进口温度为180℃，出风温度为100℃，喷雾干燥得到酪蛋白改善睡眠肽。
对比例5(基于实施例1减少预处理)
(1)按照质量份数1:6比例分别称量加入酪蛋白和蒸馏水，并且注意先加入水，再加入酪蛋白，37℃恒温搅拌溶解，制得酪蛋白分散液。
(2)在上述酪蛋白分散液中加入可食用碱调节pH值至7.0，控制温度为50℃，搅拌分散液至基本无大颗粒，加入0.1％的胰酶(按加入酪蛋白的质量计)复合1％的木瓜蛋白酶(按加入酪蛋白的质量计)和1％的碱性蛋白酶(按加入酪蛋白的质量计)，开始酶解4h，得到酶解液，迅速升温至95℃，加热15min灭酶。
(3)灭酶后将酶解液冷却至65℃，80目过筛，取上清液，浓缩至固形物含量35％，高压瞬时加热灭菌后，以进口温度为200℃，出风温度为85℃喷雾干燥后得到酪蛋白改善睡眠肽。
对比例6(基于实施例1，加入的蛋白酶为1％的碱性蛋白酶(按加入酪蛋白的质量计))
(1)按照质量份数1:6比例分别称量加入酪蛋白和蒸馏水，并且注意先加入水，再加入酪蛋白，37℃恒温搅拌溶解，调pH至8，在80KHz下超声处理5min，制得酪蛋白分散液。
(2)在上述酪蛋白分散液中加入可食用碱调节pH值至7.0，控制温度为50℃，搅拌分散液至基本无大颗粒，加入1％的碱性蛋白酶(按加入酪蛋白的质量计)，开始酶解4h，得到酶解液，迅速升温至95℃，加热15min灭酶。
(3)灭酶后将酶解液冷却至65℃，80目过筛，取上清液，浓缩至固形物含量35％，高压瞬时加热灭菌后，以进口温度为200℃，出风温度为85℃喷雾干燥得到酪蛋白改善睡眠肽。
对实施例1-4及对比例1-6所得酪蛋白酶解产物在不同pH值条件下观察表观溶解程度，本发明实施例1-4所得酪蛋白改善睡眠肽在酸性及中性条件下的表观溶解度与对比例1-6相比，仅实施例3存在少量絮凝，而其他组别均无明显不溶物，几乎澄清透亮；但是对比例1-6静置后，均存在较严重的絮凝，尤其是对比例1，几乎出现一半以上的不溶物。
对实施例1-4及对比例1-6所得酪蛋白改善睡眠肽进行溶解度及可溶性肽含量的测定，均通过食品安全国家标准进行测定，结果如表1所示，本发明实施例1-4所得酪蛋白改善睡眠肽的溶解度及可溶性肽含量与对比例1-6相比均显著增加。同时，对比例1-6与实施例1-4相比较而言，单独改变预处理或加酶工艺，均无法达到对应实施例中的溶解程度以及肽释放含量。(由于基于实施例1改变条件的对比例1、5、6的溶解度和可溶性肽含量太低，仅挑选其中对比例1的组别进行动物实验的评价。)
实施例1-4及对比例1-4所得酪蛋白改善睡眠肽在戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠行为学实验中观察记录入睡率和睡眠时间，结果分别如图1和图2所示，与对照组相比(入睡率为50％)，实施例1-4的小鼠入睡率分别可达到83.57％(p＜0.05)，64.29％，78.57％(p＜0.05)，66.67％，但对比例1-4的小鼠入睡率仅分别为50％，58.33％，50％及50％。同时，与对照组(睡眠时间为559.00±272.24s)，实施例1-4的戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时长可达到2577.5±1355.07s(p＜0.001)，2144.25±1097.71s(p＜0.01)，2211.75±1031.58s(p＜0.01)，1976.00±1237.43s(p＜0.01)，但对比例1-4的小鼠睡眠时间仅为915.80±278.07s，1115.80±378.07s，999.30±232.07s，1032.55±333.27。综合以上数据，相比本发明所得酶解物与空白对照组相比极显著延长睡眠时间并且提高入睡率，与对比例相比也明显延长睡眠时间及提高入睡率。同时，对比例1-4分别与对应的实施例1-4相比较而言，单独改变预处理或加酶工艺，均无法达到相应实施例中的活性效果。
表1酪蛋白改善睡眠肽溶解度及可溶性肽含量测定
注：*表明各组实施例1-4分别与对应的对比例1-4相比较具有显著差异，p＜0.05。
以上实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种高溶解性酪蛋白改善睡眠肽的制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：
（1）在恒温37~50℃搅拌的水中以质量比1:6~1:12加入酪蛋白，经40~80 KHz下超声处理，制得酪蛋白分散液；
（2）在步骤（1）所述酪蛋白分散液中加入可食用碱液，调节pH值，搅拌分散，在恒定温度下，加入复合酶进行酶解，控制酶解温度为37 ℃~55 ℃，酶解pH为6.5~8.0进行复合酶解4~6 h，酶解后升温灭酶；所述复合酶为由酪蛋白质量0.1%的胰酶、1%的木瓜蛋白酶、1%的碱性蛋白酶组成的复合酶，或由酪蛋白质量0.01%的胰酶、0.1%的碱性蛋白酶组成的复合酶，或由酪蛋白质量0.5%的风味蛋白酶、0.5%的木瓜蛋白酶组成的复合酶；
（3）冷却后，过筛，取上清液，浓缩，喷雾干燥，得到高溶解性酪蛋白改善睡眠肽。
2.根据权利要求1所述的高溶解性酪蛋白改善睡眠肽的制备工艺，其特征在于，步骤（3）所述过筛的要求为80~200目。
3.根据权利要求1所述的高溶解性酪蛋白改善睡眠肽的制备工艺，其特征在于，步骤（3）所述浓缩的固形物含量20%~40%；步骤（3）所述喷雾干燥的条件为：进口温度为160~210℃，出口温度为70~120 ℃。
4.一种由权利要求1-3任一项所述制备工艺制得的高溶解性酪蛋白改善睡眠肽。
5.权利要求4所述的高溶解性酪蛋白改善睡眠肽在制备普通食品或保健食品中的应用，所述普通食品或保健食品的剂型包括口服液、粉剂、冲剂。
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