CN105177096A - 一种抗凝血肽的酶解制备方法 - Google Patents

Abstract

一种抗凝血肽的酶解制备方法，本发明属于食源性蛋白深加工技术领域，它为了解决现有以植物蛋白为来源制备得到的凝血酶抑制肽的抑制率较低的问题。制备方法：一、将大豆分离蛋白溶于蒸馏水中，制备得到大豆蛋白溶液；二、大豆蛋白溶液在60～90℃下加热处理，根据所用蛋白酶种类的不同，调节体系的pH，加入蛋白酶进行水解反应，灭酶处理后得到酶解溶液，所述的蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶或复合蛋白酶等；三、过滤酶解溶液；四、进行均质处理；五、对均质后的酶解溶液进行杀菌处理；六、杀菌后的酶解溶液进行干燥处理得到大豆抗凝血肽。本发明以大豆蛋白为原料，得到的大豆抗凝血肽的凝血酶抑制率最高可达40％。

Description

一种抗凝血肽的酶解制备方法

技术领域

本发明属于食源性蛋白深加工技术领域，具体涉及一种以大豆或大豆蛋白为原料制备具有抗凝血活性多肽的工艺方法。

背景技术

由于现代人们过度饮食、嗜烟和酗酒等不良的生活习惯，这种动态平衡被打破，触发了血液中的凝血系统，使得血液在血管中凝固形成了血栓。心脑血管血栓性疾病现已成为人类的头号杀手，目前，心血管疾病在欧洲每年造成180万人过早死亡，在我国心血管疾病流行趋势也不容乐观。据调查，我国心血管疾病患病率男性为1.78％，女性1.10％，且患病率随年龄升高而增加。

目前用来治疗血栓的药物主要有肝素、华法林等，但这些药物都存在一定的副作用，如血小板减少和引起出血等。认识到到这些抗血栓药物的缺点，人们开始研究开发更安全健康的抗凝血、抗血栓药物。在这种背景下，生物活性肽凭借吸收性好、安全性高的特性开始进入众多研究者的视野。目前，一些肽类化合物已被发现具有显著的抗凝血活性，按抗凝血活性肽的来源不同可将其分为非食源性肽和食源性肽两大类，其中非食源性抗凝肽已有较长的研究历史，而食源性抗凝肽的研究近年来才引起广泛的关注。

目前，研究热点主要集中在前两个方面。而且从预防的角度来说，抑制凝血因子或者抑制凝血酶活性是公认较为理想的选择。

水蛭素与凝血酶分子表面上碱性氨基酸组成的纤维蛋白原识别位点结合，使凝血酶构型发生轻微改变，进而水蛭素与凝血酶的酶活性中心结合，从而抑制凝血酶的催化活性，阻止凝血酶和纤维蛋白原相互作用。采采蝇凝血酶抑制剂TTI是从采采蝇的唾液腺提取物中分离得到的，比较N–端氨基酸顺序发现其与己经鉴定的丝氨酸蛋白酶抑制剂及其他天然抗凝剂无同源性。壁虱抗凝肽TAP是由60个氨基酸组成的单链酸性肽，可以与凝血酶的催化位点结合，分子结构与水蛭素类似，其通过与Xa因子结合，从而阻止凝血激酶复合物的形成，以抑制凝血酶原的激活。线虫抗凝肽是一系列小分子多肽，通过与凝血因子活性位点结合，来抑制凝血原酶或凝血酶合成。比伐卢定是一种合成的凝血酶抑制剂，属于水蛭素衍生出的小分子多肽。比伐卢定同凝血酶结合形成1:1复合物，直接抑制凝血酶活性，从而起到抗凝作用，但其抑制凝血酶活性的持续时间较短。美拉加群是一种纤维蛋白二肽类似物，其抗凝机制是与凝血酶活性位点结合，可以竞争性直接抑制凝血酶。

目前已报道的各类具有抗凝血功能的活性肽，有些本身是动物唾液或毒液的有效成分，尽管抗凝效果良好，但同时也可能具有强烈的副作用，存在安全隐患；有些抗凝血肽在天然生物体内含量极少，分离和纯化成本高，所以大多数多肽难以规模化生产；还有的抗凝血肽活性周期短、有的不能口服等。这些弊端促使研究者们极力开发食源性的抗凝血肽，而且这些抗凝血物质的开发都是从临床药物的角度进行的。对于血栓的早期预防，从功能性食品组分的角度入手是较为理想的手段。

多数食物蛋白质中都存在生物活性肽序列，通过酶解作用可将食物蛋白序列中的肽释放出来，得到多种具有生物功能或生理效应的活性肽。食源性抗凝血活性肽是指以天然动植物蛋白为前体物质，直接提取或进行再加工获得的具有抗凝活性的肽。

近年来，从不同食物蛋白中寻找具有抗凝血功能蛋白水解物的研究逐渐受到关注。Shimizu等利用木瓜蛋白酶(Papain)水解猪肉，分离得到的肽组分对老鼠给药后显示较好的抗血栓活性。杨万根等利用Alcalase2.4L和ProteaseN水解蛋清蛋白，得到了具有抗凝血活性的水解产物。Rajapakse等从鱼肉蛋白酶解物中获得了具有抗凝血和抑制血小板聚集的单链单体蛋白。Rojas–Ronquillo等利用乳酸菌发酵牛乳酪蛋白，研究表明发酵产物具有抗凝血活性，且在发酵27h时对凝血酶抑制性最强，发酵产物经HPLC纯化后得到多个活性肽。还有研究发现来源自k–酪蛋白的抗血栓活性肽能够减少凝血酶引起的血小板聚合，并呈显著的量效关系。聂毅磊等使用胰蛋白酶水解明胶，发现明胶水解物的抗凝效果显著。

酶解法制备活性多肽是利用蛋白酶水解蛋白的特定氨基酸位点，从而得到具有生物活性的多肽。该方法操作相对简单、生产条件温和、产品安全性高，是获得食品级生物活性肽的常用方法。我国目前对植物蛋白的开发利用率非常低，许多制油工艺得到的饼粕(含有丰富的蛋白)仅作为饲料或肥料，资源浪费严重。以植物蛋白为来源采用酶法制备凝血酶抑制肽正日益受到国内外学者的重视，尽管其活性不一定能够满足临床治疗的要求，但如果将其进一步开发作为功能性食品配料用于预防血栓性疾病，则会具有广阔的市场前景。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有以植物蛋白为来源制备得到的凝血酶抑制肽的抑制率较低的问题，而提供一种抗凝血肽的酶解制备方法。

本发明抗凝血肽的酶解制备方法按下列步骤实现：

一、将大豆分离蛋白溶于蒸馏水中，制备得到大豆蛋白溶液；

二、将步骤一得到的大豆蛋白溶液加热至60～90℃处理5～10min，冷却至室温后调节体系的pH，然后加入蛋白酶进行水解反应，灭酶处理后得到酶解溶液；

三、对酶解溶液进行离心处理，收集上清液，然后采用截留分子量小于500的过滤膜进行过滤，得到过滤后的酶解溶液；

四、将过滤后的酶解溶液在60～65℃、15～30MPa的条件下进行均质处理，得到均质后的酶解溶液；

五、对均质后的酶解溶液进行杀菌处理，得到杀菌后的酶解溶液；

六、将杀菌后的酶解溶液进行干燥处理，得到大豆抗凝血肽；

其中当步骤二所述的蛋白酶为胃蛋白酶时，水解反应过程是用酸性调节剂调节体系的pH至1.2～2.5，在30～40℃恒温水浴条件下加入E/S2.0％～5.0％的胃蛋白酶进行水解反应0.5～4h；

当步骤二所述的蛋白酶为胰蛋白酶时，水解反应过程是用碱性调节剂调节体系的pH至7.0～8.0，在30～40℃恒温水浴条件下加入E/S2.0％～5.0％胰蛋白酶进行水解反应0.5～4h；

当步骤二所述的蛋白酶为碱性蛋白酶时，水解反应过程是用碱性调节剂调节体系的pH至7.5～9.0，在50～65℃恒温水浴条件下加入E/S2.0％～5.0％碱性蛋白酶进行水解反应0.5～4h，并在水解反应过程中加入碱性调节剂维持体系pH值恒定；

当步骤二所述的蛋白酶为胃蛋白酶与胰蛋白酶的复合蛋白酶时，水解反应过程是先用酸性调节剂调节体系的pH至1.2～2.5，在30～40℃恒温水浴条件下加入E/S2.0％～5.0％胃蛋白酶进行水解0.5～2h，然后用碱性调节剂调节体系的pH至7.0～8.0，再加入E/S2.0％～5.0％胰蛋白酶水解1～3h；

当步骤二所述的蛋白酶为中性蛋白酶和风味蛋白酶的复合蛋白酶时，水解反应过程是先滴加酸性调节剂或碱性调节剂调节体系的pH至5.0～9.0，在30～60℃的温度下加入E/S2％～5％作为内肽酶的中性蛋白酶酶解1～3h，然后再加入E/S2％～5％作为外肽酶的风味蛋白酶酶解1～3h。

本发明所述的具有抗凝血活性的大豆肽的制备方法，以大豆蛋白为原料，选取合适的蛋白酶，在一定条件下酶解制备大豆抗凝血肽粗产品，然后采用膜技术进行浓缩，并采用真空冷冻干燥技术或者低温喷雾干燥技术，最终制备得到大豆抗凝血肽。

与现有技术相比，本发明抗凝血肽的酶解制备方法包含以下有益效果：

1、以大豆为原料开发抗凝血肽的技术，目前并未见相关专利文献，本发明所述的酶解制备方法有效填补该领域空白。

2、采用大豆蛋白为原料开发蛋白肽，原料非常丰富，价格低廉，可满足大规模工业化生产。对于大豆蛋白产品多样化、大豆生物活性肽在功能性食品、保健食品或者药品中的开发利用具有重要的意义。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式抗凝血肽的酶解制备方法按下列步骤实施：

一、将大豆分离蛋白溶于蒸馏水中，制备得到大豆蛋白溶液；

二、将步骤一得到的大豆蛋白溶液加热至60～90℃处理5～10min，冷却至室温后调节体系的pH，然后加入蛋白酶进行水解反应，灭酶处理后得到酶解溶液；

三、对酶解溶液进行离心处理，收集上清液，然后采用截留分子量小于500的过滤膜进行过滤，得到过滤后的酶解溶液；

四、将过滤后的酶解溶液在60～65℃、15～30MPa的条件下进行均质处理，得到均质后的酶解溶液；

五、对均质后的酶解溶液进行杀菌处理，得到杀菌后的酶解溶液；

六、将杀菌后的酶解溶液进行干燥处理，得到大豆抗凝血肽；

其中当步骤二所述的蛋白酶为胃蛋白酶时，水解反应过程是用酸性调节剂调节体系的pH至1.2～2.5，在30～40℃恒温水浴条件下加入E/S2.0％～5.0％的胃蛋白酶进行水解反应0.5～4h；

当步骤二所述的蛋白酶为胰蛋白酶时，水解反应过程是用碱性调节剂调节体系的pH至7.0～8.0，在30～40℃恒温水浴条件下加入E/S2.0％～5.0％胰蛋白酶进行水解反应0.5～4h；

当步骤二所述的蛋白酶为碱性蛋白酶时，水解反应过程是用碱性调节剂调节体系的pH至7.5～9.0，在50～65℃恒温水浴条件下加入E/S2.0％～5.0％碱性蛋白酶进行水解反应0.5～4h，并在水解反应过程中加入碱性调节剂维持体系pH值恒定；

当步骤二所述的蛋白酶为胃蛋白酶与胰蛋白酶的复合蛋白酶时，水解反应过程是先用酸性调节剂调节体系的pH至1.2～2.5，在30～40℃恒温水浴条件下加入E/S2.0％～5.0％胃蛋白酶进行水解0.5～2h，然后用碱性调节剂调节体系的pH至7.0～8.0，再加入E/S2.0％～5.0％胰蛋白酶水解1～3h；

当步骤二所述的蛋白酶为中性蛋白酶和风味蛋白酶的复合蛋白酶时，水解反应过程是先滴加酸性调节剂或碱性调节剂调节体系的pH至5.0～9.0，在30～60℃的温度下加入E/S2％～5％作为内肽酶的中性蛋白酶酶解1～3h，然后再加入E/S2％～5％作为外肽酶的风味蛋白酶酶解1～3h。

本实施方式步骤一中的大豆分离蛋白可以用大豆为原料通过碱溶酸沉的方法进行制备。步骤二所述的E/S是指酶与大豆蛋白添加量的比值。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一所述的大豆蛋白溶液的浓度为4wt％～12wt％。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤二中所述的碱性调节剂为NaOH溶液、KOH溶液、碳酸氢钠溶液或碳酸氢钾溶液。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是步骤二中所述的酸性调节剂为磷酸溶液、盐酸溶液、硫酸溶液、柠檬酸溶液或醋酸溶液。其它步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是步骤二中所述的碱性蛋白酶为碱性丝氨酸蛋白酶、碱性天冬氨酸蛋白酶或碱性金属蛋白酶。其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤二中所述的中性蛋白酶为霉菌中性蛋白酶或细菌中性蛋白酶。其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是当步骤二所述的蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶与胰蛋白酶的复合蛋白酶时，灭酶处理是在80～100℃下灭酶5～20min。其它步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是当步骤二所述的蛋白酶为中性蛋白酶和风味蛋白酶的复合蛋白酶时，灭酶处理是滴加酸性调节剂或碱性调节剂调节酶解液的pH至4.0～5.0。其它步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是步骤五所述的杀菌处理是在管式热交换器中以130～142℃的温度进行超高温瞬时杀菌2～8s。其它步骤及参数与具体实施方式一至八之一相同。

本实施方式步骤五也可以通过膜过滤除菌结合巴氏杀菌的方式。采用0.2～1.2μm孔径的无机陶瓷膜进行过滤除菌，然后进行62～65℃的巴氏杀菌，处理时间为20～30min。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是步骤六所述的干燥处理是通过真空冷冻干燥法，控制冷阱温度-73～-40℃，真空度为0.01～0.5mbar，干燥时间为3～24h。其它步骤及参数与具体实施方式一至九之一相同。

具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是步骤六所述的干燥处理是先加入占杀菌后的酶解溶液重量2％～3％的麦芽糊精和0.5％～2％的β-环状糊精，再通过喷雾干燥方法进行干燥处理，喷雾干燥时的进风温度为145～200℃，排风温度为70～95℃。其它步骤及参数与具体实施方式一至九之一相同。

具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是步骤六所述的干燥处理是通过低温喷雾干燥法进行的。其它步骤及参数与具体实施方式一至九之一相同。

实施例一：本实施例抗凝血肽的酶解制备方法按下列步骤实施：

一、将大豆分离蛋白溶于蒸馏水中，制备得到5wt％大豆蛋白溶液；

二、将步骤一得到的大豆蛋白溶液加热至90℃处理10min，冷却至室温后使用1mol/L的盐酸调节体系的pH＝2.0，在35℃恒温水浴条件下加入4.0％(E/S)胃蛋白酶进行水解反应3h，100℃灭酶10min后得到酶解溶液；

三、采用3000rpm的速度对酶解溶液进行离心处理30min，收集上清液，然后采用截留分子量小于500的过滤膜进行过滤，得到过滤后的酶解溶液；

四、将过滤后的酶解溶液在65℃、15MPa的条件下进行均质处理，得到均质后的酶解溶液；

五、对均质后的酶解溶液进行杀菌处理，采用0.2μm孔径的无机陶瓷膜进行过滤除菌，然后进行65℃的巴氏杀菌，处理时间为30min，得到杀菌后的酶解溶液；

六、通过喷雾干燥方法进行干燥，在杀菌后的酶解溶液加入其重量2％的麦芽糊精和2％的β-环状糊精后进行干燥，干燥时的进风温度为165℃，排风温度为70℃，得到大豆抗凝血肽。

相关测试按以下方式进行：

1、多肽(蛋白质)含量测定：

采用凯氏定氮法测定各样品中多肽(蛋白质)含量。

2、水解度测定方法

采用pH-stat法测定大豆蛋白的水解度，加入蛋白酶后开始计时，在水解过程中加入0.5mol/L的NaOH维持pH恒定，每20min记录一次耗碱量，直到水解结束。通过下式计算水解度。

DH＝(CV/αMh)×100％

V：耗碱量，ml。

C：NaOH摩尔浓度。

M：蛋白质质量。

α：蛋白氨基酸的平均离解度，α＝10^pH-pK/(l+10^pH-pK)。

h：蛋白质具有的肽键毫摩尔数，对于大豆分离蛋白，h＝7.75。

3、凝血酶抑制率测定

采用酶标仪法，将酶标仪的温度设定为37℃，测定波长设定为405nm。纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液均以Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，pH＝7.2)配制。向酶标板的小孔中加入140μL2mg/ml(W/V)纤维蛋白原溶液和40μL样品溶液，混匀后读数(A_SB)。再加入10μL凝血酶溶液(12U/mL)开始反应，10min后读数(A_S)。取40μLTris-HCl缓冲液代替样品溶液，其他操作同样品管，测得吸光值(A_CB和A_C)。

抑制率＝[(A_C-A_CB)-(A_S-A_SB)]/(A_C-A_CB)×100％

本实施例的大豆抗凝血肽的蛋白质含量(纯度)大于91％、水解度为35％，干燥后产品即为大豆抗凝血肽产品，经检测本实施例得到的2mg干粉的凝血酶抑制率为8.1％。

实施例二：本实施例抗凝血肽的酶解制备方法按下列步骤实施：

一、将大豆分离蛋白溶于蒸馏水中，制备得到6wt％大豆蛋白溶液；

二、将步骤一得到的大豆蛋白溶液加热至80℃处理5min，冷却至室温后使用1mol/L的NaOH调节体系的pH＝7.5，在37℃恒温水浴条件下加入4.0％(E/S)胰蛋白酶进行水解反应4h，100℃灭酶10min后得到酶解溶液；

三、采用4000rpm的速度对酶解溶液进行离心处理20min，收集上清液，然后采用截留分子量小于500的过滤膜进行过滤，得到过滤后的酶解溶液；

四、将过滤后的酶解溶液在65℃、30MPa的条件下进行均质处理，得到均质后的酶解溶液；

五、对均质后的酶解溶液进行杀菌处理，在管式热交换器中进行超高温瞬时杀菌，温度控制在135℃，时间为4s，得到杀菌后的酶解溶液；

六、通过低温喷雾进行干燥，活性多肽溶液的固形物含量调整为30％，真空度控制在-0.05MPa，进风温度为105℃，物料温度控制在50℃，得到大豆抗凝血肽。

干燥后产品即为大豆抗凝血肽产品，经检测本实施例得到的2.4mg干粉的凝血酶抑制率为40.1％。

实施例三：本实施例抗凝血肽的酶解制备方法按下列步骤实施：

一、将大豆分离蛋白溶于蒸馏水中，制备得到8wt％大豆蛋白溶液；

二、将步骤一得到的大豆蛋白溶液加热至90℃处理5min，冷却至室温后使用1mol/L的NaOH调节体系的pH＝8.0，在60℃恒温水浴条件下加入4.0％(E/S)枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶进行水解反应2h，水解过程中加入0.5mol/L的NaOH维持pH值恒定，每20min记录一次耗碱量，100℃灭酶10min后得到酶解溶液；

三、采用4000rpm的速度对酶解溶液进行离心处理20min，收集上清液，然后采用截留分子量小于500的过滤膜进行过滤，得到过滤后的酶解溶液；

四、将过滤后的酶解溶液在60℃、30MPa的条件下进行均质处理，得到均质后的酶解溶液；

五、对均质后的酶解溶液进行杀菌处理，在管式热交换器中进行超高温瞬时杀菌，温度控制在142℃，时间为4s，得到杀菌后的酶解溶液；

六、通过喷雾干燥方法进行干燥，在杀菌后的酶解溶液加入其重量3％的麦芽糊精和1％的β-环状糊精后进行干燥，干燥时的进风温度为200℃，排风温度为90℃，得到大豆抗凝血肽。

干燥后产品即为大豆抗凝血肽产品，经检测本实施例得到的3.2mg干粉的凝血酶抑制率为31.4％，大豆蛋白的水解度为17.8％。

实施例四：本实施例抗凝血肽的酶解制备方法按下列步骤实施：

一、将大豆分离蛋白溶于蒸馏水中，制备得到5wt％大豆蛋白溶液；

二、将步骤一得到的大豆蛋白溶液加热至90℃处理10min，冷却至室温后使用1mol/L的HCl溶液调节体系的pH＝2.0，在37℃恒温水浴条件下加入4.0％(E/S)胃蛋白酶进行水解反应1h(或2h)，然后用1mol/L的NaOH溶液调节pH＝7.5，加入4.0％(E/S)胰蛋白酶，再水解3h(或2h)，100℃灭酶10min后得到酶解溶液；

三、采用4000rpm的速度对酶解溶液进行离心处理20min，收集上清液，然后采用截留分子量小于500的过滤膜进行过滤，得到过滤后的酶解溶液；

四、将过滤后的酶解溶液在60℃、15MPa的条件下进行均质处理，得到均质后的酶解溶液；

五、对均质后的酶解溶液进行杀菌处理，通过膜过滤除菌结合巴氏杀菌，采用0.5μm孔径的无机陶瓷膜进行过滤除菌，然后进行65℃的巴氏杀菌，处理时间为30min，得到杀菌后的酶解溶液；

六、通过真空冷冻干燥法进行干燥处理，控制冷阱温度为-60℃，真空度0.1mbar，时间为10h，得到大豆抗凝血肽。

干燥后产品即为大豆抗凝血肽产品，经检测，胃蛋白酶水解1h+胰蛋白酶水解3h，2mg干粉的凝血酶抑制率为27.1％；胃蛋白酶水解2h+胰蛋白酶水解2h，2mg干粉的凝血酶抑制率为19.4％。

实施例五：本实施例抗凝血肽的酶解制备方法按下列步骤实施：

一、将大豆分离蛋白溶于蒸馏水中，制备得到12wt％大豆蛋白溶液；

二、将步骤一得到的大豆蛋白溶液加热至80℃处理5min，冷却至室温后调节体系的pH＝7.0，在55℃恒温水浴条件下加入3％(E/S)中性蛋白酶进行水解反应2h，再加入2％(E/S)风味蛋白酶，再水解2h，滴加HCl调节pH至4.0，将酶灭活得到酶解溶液；

三、采用4000rpm的速度对酶解溶液进行离心处理20min，收集上清液，然后采用截留分子量小于500的过滤膜进行过滤，得到过滤后的酶解溶液；

四、将过滤后的酶解溶液在65℃、20MPa的条件下进行均质处理，得到均质后的酶解溶液；

五、对均质后的酶解溶液进行杀菌处理，在管式热交换器中进行超高温瞬时杀菌，温度控制在137℃，时间为5s；

六、通过低温喷雾进行干燥，活性多肽溶液的固形物含量调整为30％，真空度控制在-0.05MPa，进风温度为105℃，物料温度控制在60℃，得到大豆抗凝血肽。

干燥后产品即为大豆抗凝血肽产品，经检测，4.8mg干粉的凝血酶抑制率为22.8％。

Claims (10)

1.一种抗凝血肽的酶解制备方法，其特征在于是按下列步骤实现：

一、将大豆分离蛋白溶于蒸馏水中，制备得到大豆蛋白溶液；

二、将步骤一得到的大豆蛋白溶液加热至60～90℃处理5～10min，冷却至室温后调节体系的pH，然后加入蛋白酶进行水解反应，灭酶处理后得到酶解溶液；

三、对酶解溶液进行离心处理，收集上清液，然后采用截留分子量小于500的过滤膜进行过滤，得到过滤后的酶解溶液；

四、将过滤后的酶解溶液在60～65℃、15～30MPa的条件下进行均质处理，得到均质后的酶解溶液；

五、对均质后的酶解溶液进行杀菌处理，得到杀菌后的酶解溶液；

六、将杀菌后的酶解溶液进行干燥处理，得到大豆抗凝血肽；

其中当步骤二所述的蛋白酶为胃蛋白酶时，水解反应过程是用酸性调节剂调节体系的pH至1.2～2.5，在30～40℃恒温水浴条件下加入E/S2.0％～5.0％的胃蛋白酶进行水解反应0.5～4h；

当步骤二所述的蛋白酶为胰蛋白酶时，水解反应过程是用碱性调节剂调节体系的pH至7.0～8.0，在30～40℃恒温水浴条件下加入E/S2.0％～5.0％胰蛋白酶进行水解反应0.5～4h；

当步骤二所述的蛋白酶为碱性蛋白酶时，水解反应过程是用碱性调节剂调节体系的pH至7.5～9.0，在50～65℃恒温水浴条件下加入E/S2.0％～5.0％碱性蛋白酶进行水解反应0.5～4h，并在水解反应过程中加入碱性调节剂维持体系pH值恒定；

当步骤二所述的蛋白酶为胃蛋白酶与胰蛋白酶的复合蛋白酶时，水解反应过程是先用酸性调节剂调节体系的pH至1.2～2.5，在30～40℃恒温水浴条件下加入E/S2.0％～5.0％胃蛋白酶进行水解0.5～2h，然后用碱性调节剂调节体系的pH至7.0～8.0，再加入E/S2.0％～5.0％胰蛋白酶水解1～3h；

当步骤二所述的蛋白酶为中性蛋白酶和风味蛋白酶的复合蛋白酶时，水解反应过程是先滴加酸性调节剂或碱性调节剂调节体系的pH至5.0～9.0，在30～60℃的温度下加入E/S2％～5％作为内肽酶的中性蛋白酶酶解1～3h，然后再加入E/S2％～5％作为外肽酶的风味蛋白酶酶解1～3h。

2.根据权利要求1所述的一种抗凝血肽的酶解制备方法，其特征在于步骤一所述的大豆蛋白溶液的浓度为4wt％～12wt％。

3.根据权利要求1所述的一种抗凝血肽的酶解制备方法，其特征在于步骤二中所述的碱性调节剂为NaOH溶液、KOH溶液、碳酸氢钠溶液或碳酸氢钾溶液。

4.根据权利要求1所述的一种抗凝血肽的酶解制备方法，其特征在于步骤二中所述的酸性调节剂为磷酸溶液、盐酸溶液、硫酸溶液、柠檬酸溶液或醋酸溶液。

5.根据权利要求1所述的一种抗凝血肽的酶解制备方法，其特征在于步骤二中所述的碱性蛋白酶为碱性丝氨酸蛋白酶、碱性天冬氨酸蛋白酶或碱性金属蛋白酶。

6.根据权利要求1所述的一种抗凝血肽的酶解制备方法，其特征在于步骤二中所述的中性蛋白酶为霉菌中性蛋白酶或细菌中性蛋白酶。

7.根据权利要求1所述的一种抗凝血肽的酶解制备方法，其特征在于当步骤二所述的蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶与胰蛋白酶的复合蛋白酶时，灭酶处理是在80～100℃下灭酶5～20min。

8.根据权利要求1所述的一种抗凝血肽的酶解制备方法，其特征在于当步骤二所述的蛋白酶为中性蛋白酶和风味蛋白酶的复合蛋白酶时，灭酶处理是滴加酸性调节剂或碱性调节剂调节酶解液的pH至4.0～5.0。

9.根据权利要求1所述的一种抗凝血肽的酶解制备方法，其特征在于步骤五所述的杀菌处理是在管式热交换器中以130～142℃的温度进行超高温瞬时杀菌2～8s。

10.根据权利要求1所述的一种抗凝血肽的酶解制备方法，其特征在于步骤六所述的干燥处理是通过真空冷冻干燥法，控制冷阱温度-73～-40℃，真空度为0.01～0.5mbar，干燥时间为3～24h。