CN101701242A - 一种牛乳铁蛋白素的分离方法 - Google Patents

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安美忱
张铁男
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Abstract

一种牛乳铁蛋白素的分离方法，它涉及一种乳铁蛋白素的分离方法。它解决了现有分离乳铁蛋白素的方法存在分离后得到的乳铁蛋白素纯度低、成本高及安全性差的问题。分离方法：一、制备上清液；二、采用离子交换层析方法分离上清液；三、采用反相层析方法分离，即可分离出牛乳铁蛋白素。本发明分离出的牛乳铁蛋白素经测得纯度高达90％～92％。本发明分离出的牛乳铁蛋白素相对分子量为3124.89Da。本发明工艺简单、设备简单且成本低廉，本发明安全性好。

Description

一种牛乳铁蛋白素的分离方法
技术领域
本发明涉及一种乳铁蛋白素的分离方法。
背景技术
近年来，抗生素作为治疗细菌感染性疾病的主要药物，它不仅能杀灭细菌，而且对霉菌、支原体、衣原体等其它致病微生物也有良好的抑制和杀灭作用。但是，当前抗生素滥用的情况越来越严重，导致大量耐药细菌产生，难治性感染越来越多，因此，必须寻找安全的新型抗生素替代物以解决该问题。
乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)是富含在初乳中的一种功能因子，是转铁蛋白家族中一种天然的铁离子结合糖蛋白，参与铁的转运，并具有抗菌、抗病毒、抗癌、调节免疫系统、抗氧化和促进骨骼生长等功能。酶解后LF可获得活性更高抗菌肽段。其中，牛乳铁蛋白素(LfcinB)抗菌活性最强。LfcinB来源于牛乳铁蛋白的第17～41位氨基酸，由25个氨基酸残基组成，氨基酸顺序为：Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-ThrCys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe，包括5个Arg、2个Trp和多个芳香族氨基酸残基，具有强碱性，pI＞8.5，分子量为3124Da，其中的2个Cys通过形成分子内二硫键使LfcinB分子呈环状结构。因乳铁蛋白素具有抗病毒活性、不易产生耐药性，此外它在抑制病毒和真菌增殖、抑杀肿瘤细胞的同时，对真核细胞几乎没有毒性。目前，乳铁蛋白素的分离方法有多种，分离效果最好的为利用超滤的方法分离乳铁蛋白素，但仍存在分离后得到的乳铁蛋白素纯度低(纯度仅为40％和80％)、成本高、安全性差的问题。
发明内容
本发明目的是为了解决现有分离乳铁蛋白素的方法存在分离后得到的乳铁蛋白素纯度低、成本高及安全性差的问题，而提供一种牛乳铁蛋白素的分离方法。
牛乳铁蛋白素的分离按以下步骤实现：一、称取4～6g的乳铁蛋白溶于100mL水中，用浓度为1mol/L的HCl调节pH至2.0～3.0，然后加入0.0013～0.002g的胃蛋白酶，而后在温度为37℃的条件下酶解3.5～4.5h，再在温度为75～85℃条件下加热处理10～20min，然后冷却至20℃，滴加NaOH调节pH至7.0，然后在温度为4℃、离心转速为17000g的条件下离心10～20min，收集上清液；二、在温度为25℃条件下，将上清液进行离子交换层析，首先进行淋洗，再进行梯度洗脱，进样量为500μL，在检测波长为215nm条件下收集梯度洗脱第二步的洗脱峰，得牛乳铁蛋白素的粗分离组分，然后放置于截流量为1000Da的半透膜中，在pH值为8.0的超纯水中透析20～30h，脱盐后冻干，得冻干后牛乳铁蛋白素的粗分离组分；三、在温度为25℃条件下，将冻干后牛乳铁蛋白素的粗分离组分再次进行反相层析分离，进样量为500μL，在检测波长为215nm的条件下收集第二个洗脱峰并冻干，即分离出牛乳铁蛋白素；其中步骤二中梯度洗脱洗脱的方式为先采用第一步洗脱再进行第二步洗脱；其中第一步洗脱为用体积浓度为50％的50mmol的Na3PO4进行洗脱18min；第二步洗脱为用体积浓度为100％的50mmol的Na3PO4进行洗脱15min；第一步洗脱与第二步洗脱的洗脱流速为1mL/min；第一步洗脱中体积浓度为50％的50mmol的Na3PO4中含1mol的NaCl和体积浓度为10％的乙腈，第二步洗脱中体积浓度为100％的50mmol的Na3PO4中含1mol的NaCl和体积浓度为10％的乙腈；步骤三中进行反相层析分离的方式是先用体积百分比为20％、体积浓度为90％的乙腈和体积百分比为80％、体积浓度为0.1％的TFA溶液平衡5min后进样，进样后进行线性洗脱，体积浓度为90％的乙腈的体积百分比在40min内由20％均匀升到50％，其中体积百分比为20％、体积浓度为90％的乙腈含体积浓度为0.9％的TFA，洗脱流速为1mL/min。
本发明以牛乳铁蛋白为原料，运用胃蛋白酶酶解牛乳铁蛋白，酶解离心后再经过离子交换层析、反相层析即可分离出牛乳铁蛋白素；本发明分离出的牛乳铁蛋白素经测得纯度高达90％～92％。
本发明离出的牛乳铁蛋白素相对分子量为3124.89Da。
本发明工艺简单、设备简单且成本低廉，本发明安全性好。
附图说明
图1为具体实施方式十四步骤二中经过离子交换层析分离得到的牛乳铁蛋白素的粗分离组分，图2为具体实施方式十四步骤三中经过反相层析分离得到的牛乳铁蛋白素，图3为具体实施方式十四步骤三中反相层析分离得到五种不同组分F1～F5对金黄色葡萄球菌的抗菌活性试验结果图，图4为具体实施方式十四步骤三中反相层析分离得到五种不同组分F1～F5对大肠杆菌的抗菌活性试验结果图，图5为具体实施方式十四得到的牛乳铁蛋白素即F2组分的分子量质谱图，图6为具体实施方式十四得到的牛乳铁蛋白素即F2组分质量指纹质谱图，图7为具体实施方式十四得到的牛乳铁蛋白素的m/z831.46的二级质谱图，图8为具体实施方式十四得到的牛乳铁蛋白素的m/z1073.60的二级质谱图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式牛乳铁蛋白素的分离按以下步骤实现：一、称取4～6g的乳铁蛋白溶于100mL水中，用浓度为1mol/L的HCl调节pH至2.0～3.0，然后加入0.0013～0.002g的胃蛋白酶，而后在温度为37℃的条件下酶解3.5～4.5h，再在温度为75～85℃条件下加热处理10～20min，然后冷却至20℃，滴加NaOH调节pH至7.0，然后在温度为4℃、离心转速为17000g的条件下离心10～20min，收集上清液；二、在温度为25℃条件下，将上清液进行离子交换层析，首先进行淋洗，再进行梯度洗脱，进样量为500μL，在检测波长为215nm条件下收集梯度洗脱第二步的洗脱峰，得牛乳铁蛋白素的粗分离组分，然后放置于截流量为1000Da的半透膜中，在pH值为8.0的超纯水中透析20～30h，脱盐后冻干，得冻干后牛乳铁蛋白素的粗分离组分；三、在温度为25℃条件下，将冻干后牛乳铁蛋白素的粗分离组分再次进行反相层析分离，进样量为500μL，在检测波长为215nm的条件下收集第二个洗脱峰并冻干，即分离出牛乳铁蛋白素；其中步骤二中梯度洗脱洗脱的方式为先采用第一步洗脱再进行第二步洗脱；其中第一步洗脱为用体积浓度为50％的50mmol的Na3PO4进行洗脱18min；第二步洗脱为用体积浓度为100％的50mmol的Na3PO4进行洗脱15min；第一步洗脱与第二步洗脱的洗脱流速为1mL/min；第一步洗脱中体积浓度为50％的50mmol的Na3PO4中含1mol的NaCl和体积浓度为10％的乙腈，第二步洗脱中体积浓度为100％的50mmol的Na3PO4中含1mol的NaCl和体积浓度为10％的乙腈；步骤三中进行反相层析分离的方式是先用体积百分比为20％、体积浓度为90％的乙腈和体积百分比为80％、体积浓度为0.1％的TFA溶液平衡5min后进样，进样后进行线性洗脱，体积浓度为90％的乙腈的体积百分比在40min内由20％均匀升到50％，其中体积百分比为20％、体积浓度为90％的乙腈含体积浓度为0.9％的TFA，洗脱流速为1mL/min。
本实施方式步骤一中经过加热处理后使胃蛋白酶完全失活。
本实施方式步骤一中得到的上清液在温度为4℃的条件下保存。
本实施方式步骤二中淋洗的目的是除去溶液中的杂蛋白。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中称取5g的乳铁蛋白。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤一中用浓度为1mol/L的HCl调节pH至2.5。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三不同的是步骤一中胃蛋白酶的加入量为0.0015g。其它步骤及参数与具体实施方式一至三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四不同的是步骤一中酶解时间为4h。其它步骤及参数与具体实施方式一至四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五不同的是步骤一中在温度为78～82℃条件下加热处理12～18min。其它步骤及参数与具体实施方式一至五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至五不同的是步骤一中在温度为80℃条件下加热处理15min。其它步骤及参数与具体实施方式一至五相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七不同的是步骤一中离心时间为12～18min。其它步骤及参数与具体实施方式一至七相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至七不同的是步骤一中离心时间为15min。其它步骤及参数与具体实施方式一至七相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九不同的是步骤二中层析分离所使用的仪器为自动紫外液相色谱层析分离仪，将自动紫外液相色谱层析分离仪平衡15min后进样。其它步骤及参数与具体实施方式一至九相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一至十不同的是步骤二中淋洗的方式为用50mmol的Na3PO4溶液淋洗12min，Na3PO4溶液中含有体积浓度为10％的乙腈。其它步骤及参数与具体实施方式一至十相同。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一至十一不同的是步骤二中透析时间为22～28h。其它步骤及参数与具体实施方式一至十一相同。
具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式一至十一不同的是步骤二中透析时间为25h。其它步骤及参数与具体实施方式一至十一相同。
具体实施方式十四：本实施方式牛乳铁蛋白素的分离按以下步骤实现：一、称取5g的乳铁蛋白溶于100mL水中，用浓度为1mol/L的HCl调节pH至2.5，然后加入0.0015g的胃蛋白酶，而后在温度为37℃的条件下酶解4h，再在温度为80℃条件下加热处理15min，然后冷却至20℃，滴加浓度为1mol/L的NaOH调节pH至7.0，然后在温度为4℃、离心转速为17000g的条件下离心15min，收集上清液；二、在温度为25℃条件下，将上清液进行离子交换层析，首先进行淋洗，再进行梯度洗脱，进样量为500μL，在检测波长为215nm条件下收集梯度洗脱第二步的洗脱峰，得牛乳铁蛋白素的粗分离组分，然后放置于截流量为1000Da的半透膜中，在pH值为8.0的超纯水中透析24h，脱盐后冻干，得冻干后牛乳铁蛋白素的粗分离组分；三、在温度为25℃条件下，将冻干后牛乳铁蛋白素的粗分离组分再次进行反相层析分离，进样量为500μL，在检测波长为215nm的条件下收集第二个洗脱峰并冻干，即分离出牛乳铁蛋白素；其中步骤二中梯度洗脱洗脱的方式为先采用第一步洗脱再进行第二步洗脱；其中第一步洗脱为用体积浓度为50％的50mmol的Na3PO4进行洗脱18min；第二步洗脱为用体积浓度为100％的50mmol的Na3PO4进行洗脱15min；第一步洗脱与第二步洗脱的洗脱流速为1mL/min；第一步洗脱中体积浓度为50％的50mmol的Na3PO4中含1mol的NaCl和体积浓度为10％的乙腈，第二步洗脱中体积浓度为100％的50mmol的Na3PO4中含1mol的NaCl和体积浓度为10％的乙腈；步骤三中进行反相层析分离的方式是先用体积百分比为20％、体积浓度为90％的乙腈和体积百分比为80％、体积浓度为0.1％的TFA溶液平衡5min后进样，进样后进行线性洗脱，体积浓度为90％的乙腈的体积百分比在40min内由20％均匀升到50％，其中体积百分比为20％、体积浓度为90％的乙腈含体积浓度为0.9％的TFA，洗脱流速为1mL/min。
本实施方式分离出牛乳铁蛋白素经测得纯度为91.37％。
本实施方式分离出牛乳铁蛋白素即图2、图3和图4中的F2。
以牛血清白蛋白(BSA)为标准样品，使用碧云天公司BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)，标准品加入96孔板，用酶标仪在570nm测量光吸收值，根据已知的标准品BSA浓度，用直线回归法拟合标准曲线，本实施方式分离出牛乳铁蛋白素牛乳铁蛋白素的蛋白质浓度为90～92mg/mL。
本实施方式步骤二中采用的是离子交换层析分离，得到两个洗脱峰如图1所示，图中A1为第一步洗脱产生的洗脱峰，图中A2为第二步洗脱产生的洗脱峰。
本实施方式步骤三中采用的是反相层析分离，得到洗脱峰如图2所示，图中F1～F5均为分离得到的洗脱峰。
选择金黄色葡萄球菌做指示菌对本实施方式三步骤中反相层析分离得到五种不同组分F1～F5分别进行抗菌活性测定采用琼脂扩散法，测试结果如图3所示。1.2％的素琼脂，按每平皿10mL倾倒在无菌平皿中晾干；制备含0.7％琼脂适宜指示菌生长的软琼脂培养基，冷至50℃，每100mL接入0.6mL过夜培养的指示菌菌液，在底层有琼脂的平皿上倾倒8mL含有指示菌的软琼脂培养基晾干；用打孔器在涂有指示菌的培养基上打孔，孔直径8mm；分别在孔中加入200霯浓度为1mg/mL的各个洗脱峰溶液，超净工作台上放置3h；置于37℃下培养16h，用游标卡尺测量抑菌圈直径为8.64～11.56mm。
选择大肠杆菌做指示菌，抗菌活性测定采用琼脂扩散法。1.2％的素琼脂，按每平皿10mL倾倒在无菌平皿中晾干；制备含0.7％琼脂适宜指示菌生长的软琼脂培养基，冷至50℃，每100mL接入0.6mL过夜培养的指示菌菌液，在底层有琼脂的平皿上倾倒8mL含有指示菌的软琼脂培养基晾干；用打孔器在涂有指示菌的培养基上打孔，孔直径8mm；分别在孔中加入200霯浓度为1mg/mL的各个洗脱峰溶液，超净工作台上放置3h；置于37℃下培养16h，用游标卡尺测量抗菌圈直径为8.64～11.56mm，图4为不同组分对大肠杆菌的抗菌活性，图中F1～F5为分离得到的洗脱峰所对应收集的大肠杆菌菌斑。
肽段分子量分析：称取本实施方式步骤三(反相分离)具有抗菌活性的冻干样品1礸，溶解于100μL、50％乙腈且含0.1％TFA溶液，取0.8μL点于质谱仪靶上，自然干燥后再点0.5磕基质(α-氰基-4-羟基肉桂酸)，再次自然干燥后，将靶装入质谱仪进行分析。仪器相应参数为反射模式，扫描范围1000～3500Da，激光能量MS 4500，质谱信号的单次扫描累加200次，正离子谱测定可知F2组分的分子量质谱图如图5所示，从图5可知本实施方式得到的牛乳铁蛋白素的相对分子量为3124.89Da，F2组分质量指纹质谱图如图6所示。
肽段质量指纹谱分析及肽段二级质谱鉴定：称取本实施方式步骤三(反相分离)具有抗菌活性的冻干样品1μg，溶解于100μL、50％乙腈含0.1％TFA溶液，取0.8磕点于质谱仪靶上，等样品干燥后再点0.5磕基质(α-氰基-4-羟基肉桂酸)，自然干燥后，将靶装入质谱仪进行分析。仪器相应参数为反射模式，扫描范围800～1500Da，激光能量MS4500，MS/MS5500，质谱信号的单次扫描累加150次，正离子谱测定可知m/z831.46的二级质谱图如图7所示，m/z1073.60的二级质谱图如图8所示，从图7与图8中可知分离出牛乳铁蛋白素的氨基酸序列Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-CysVal-Arg-Arg-Ala-Phe。

Claims (8)

1.一种牛乳铁蛋白素的分离方法，其特征在于牛乳铁蛋白素的分离按以下步骤实现：一、称取4～6g的乳铁蛋白溶于100mL水中，用浓度为1mol/L的HCl调节pH至2.0～3.0，然后加入0.0013～0.002g的胃蛋白酶，而后在温度为37℃的条件下酶解3.5～4.5h，再在温度为75～85℃条件下加热处理10～20min，然后冷却至20℃，滴加NaOH调节pH至7.0，然后在温度为4℃、离心转速为17000g的条件下离心10～20min，收集上清液；二、在温度为25℃条件下，将上清液进行离子交换层析，首先进行淋洗，再进行梯度洗脱，进样量为500μL，在检测波长为215nm条件下收集梯度洗脱第二步的洗脱峰，得牛乳铁蛋白素的粗分离组分，然后放置于截流量为1000Da的半透膜中，在pH值为8.0的超纯水中透析20～30h，脱盐后冻干，得冻干后牛乳铁蛋白素的粗分离组分；三、在温度为25℃条件下，将冻干后牛乳铁蛋白素的粗分离组分再次进行反相层析分离，进样量为500μL，在检测波长为215nm的条件下收集第二个洗脱峰并冻干，即分离出牛乳铁蛋白素；其中步骤二中梯度洗脱洗脱的方式为先采用第一步洗脱再进行第二步洗脱；其中第一步洗脱为用体积浓度为50％的50mmol的Na3PO4进行洗脱18min；第二步洗脱为用体积浓度为100％的50mmol的Na3PO4进行洗脱15min；第一步洗脱与第二步洗脱的洗脱流速为1mL/min；第一步洗脱中体积浓度为50％的50mmol的Na3PO4中含1mol的NaCl和体积浓度为10％的乙腈，第二步洗脱中体积浓度为100％的50mmol的Na3PO4中含1mol的NaCl和体积浓度为10％的乙腈；步骤三中进行反相层析分离的方式是先用体积百分比为20％、体积浓度为90％的乙腈和体积百分比为80％、体积浓度为0.1％的TFA溶液平衡5min后进样，进样后进行线性洗脱，体积浓度为90％的乙腈的体积百分比在40min内由20％均匀升到50％，其中体积百分比为20％、体积浓度为90％的乙腈含体积浓度为0.9％的TFA，洗脱流速为1mL/min。
2.根据权利要求1所述的一种牛乳铁蛋白素的分离方法，其特征在于步骤一中用浓度为1mol/L的HCl调节pH至2.5。
3.根据权利要求1或2所述的一种牛乳铁蛋白素的分离方法，其特征在于步骤一中酶解时间为4h。
4.根据权利要求3所述的一种牛乳铁蛋白素的分离方法，其特征在于步骤一中在温度为80℃条件下加热处理15min。
5.根据权利要求1、2或4所述的一种牛乳铁蛋白素的分离方法，其特征在于步骤一中离心时间为15min。
6.根据权利要求5所述的一种牛乳铁蛋白素的分离方法，其特征在于步骤二中层析分离所使用的仪器为自动紫外液相色谱层析分离仪，将自动紫外液相色谱层析分离仪平衡15min后进样。
7.根据权利要求1、2、4或6所述的一种牛乳铁蛋白素的分离方法，其特征在于步骤二中淋洗的方式为用50mmol的Na3PO4溶液淋洗12min，Na3PO4溶液中含有体积浓度为10％的乙腈。
8.根据权利要求7所述的一种牛乳铁蛋白素的分离方法，其特征在于步骤二中透析时间为22～28h。
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