CN106749559A - 一种基于细胞穿膜肽Tat(49‑57)的抗菌肽及其合成方法 - Google Patents

一种基于细胞穿膜肽Tat(49‑57)的抗菌肽及其合成方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106749559A
CN106749559A CN201611036266.7A CN201611036266A CN106749559A CN 106749559 A CN106749559 A CN 106749559A CN 201611036266 A CN201611036266 A CN 201611036266A CN 106749559 A CN106749559 A CN 106749559A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tat
peptide
phase
antibacterial peptide
tfa
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201611036266.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106749559B (zh
Inventor
吕名秀
李林璐
卢奎
孙志杰
赵玉芬
段冰潮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhengzhou University
Henan Institute of Engineering
Original Assignee
Zhengzhou University
Henan Institute of Engineering
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhengzhou University, Henan Institute of Engineering filed Critical Zhengzhou University
Priority to CN201611036266.7A priority Critical patent/CN106749559B/zh
Publication of CN106749559A publication Critical patent/CN106749559A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106749559B publication Critical patent/CN106749559B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明属于抗菌肽领域，公开一种基于细胞穿膜肽Tat(49‑57)的抗菌肽及其合成方法。该抗菌肽为Tat(YG)、Tat(YY)、Tat(FG)或Tat(FF)，肽链序列依次如SEQ ID No.2‑5所示。以Wang树脂为载体，Fmoc为氨基酸侧链保护基，哌啶的DMF溶液为脱保护试剂，HBTU、HOBT、DIEA为氨基酸缩合剂，采用固相合成法合成。这四种衍生抗菌肽对大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌具有较好的抑制效率，部分菌的抑制率甚至显著高于细胞穿膜肽Tat(49‑57)；并且，这四种衍生抗菌肽的溶血性都很小，在发挥抑菌活性时的浓度均未达到最低溶血浓度。

Description

一种基于细胞穿膜肽Tat(49-57)的抗菌肽及其合成方法
技术领域
本发明属于抗菌肽领域，具体涉及一种基于细胞穿膜肽Tat(49-57)的抗菌肽及其合成方法。
背景技术
抗生素在预防和治疗微生物感染的疾病上发挥了重要的作用。然而不合理的使用抗生素导致随后出现的多重耐药菌以及耐药菌感染引发的死亡等问题已成为世界范围内公共卫生难题，为此迫切需要能够抵抗多重耐药菌的新的抗生素。抗菌肽独特的抑菌机制及不易产生耐药性、对正常细胞的无毒性等优点使得其有望成为新一代有效的抗菌药物，应用前景和使用价值得到广泛关注。研究抗菌肽的抑菌机制，通过改造设计进一步改善抗菌肽的活性，增强其抗菌效果，成为目前该领域的研究热点。细胞穿膜肽Tat(49-57)是Tat蛋白行使转导功能的最小结构单元，其可以携带各种外源物质透过细胞膜进入细胞内，定位在细胞内核染色体上。这些特点使细胞穿膜肽Tat(49-57)介导各种外源分子跨越生物膜屏障定位于细胞核，成为高效、安全的载体成为可能。如能基于细胞穿膜肽Tat(49-57)，设计并制备出一种抗菌肽，无疑具有显著的意义。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种基于细胞穿膜肽Tat(49-57)的抗菌肽及其合成方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种基于细胞穿膜肽Tat(49-57)的抗菌肽，该抗菌肽为Tat(YG)、Tat(YY)、Tat(FG)或Tat(FF)，Tat(YG)、Tat(YY)、Tat(FG)、Tat(FF)的肽链序列依次为YGRKKRRQRRR（如SEQ IDNo.2所示）、YYRKKRRQRRR（如SEQ ID No.3所示）、FGRKKRRQRRR（如SEQ ID No.4所示）、FFRKKRRQRRR（如SEQ ID No.5所示）。
合成方法：以Wang树脂为载体，Fmoc为氨基酸侧链保护基，哌啶的DMF溶液为脱保护试剂，HBTU、HOBT、DIEA为氨基酸缩合剂，根据目标抗菌肽的序列，从C-端到N-端将相应的氨基酸进行缩合偶联；所有的氨基酸均偶联结束后，将最后一个氨基酸的Fmoc保护基脱除掉，洗涤，吹干；然后加入由三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇、水和苯酚配制而成的切割试剂，切割后，过滤，收集滤液于冰乙醚中，置于冰箱中静止直至有沉淀出现，离心，弃去上清液，再重复加入冰乙醚--离心数次，最后一次将上清液弃掉，剩下的沉淀经干燥，所得固体粉末进一步用二次蒸馏水溶解后，送去RP-HPLC（反相高效液相色谱）分离纯化，收集主峰流出液，并冷冻干燥后获得相应的目标抗菌肽。
各目标抗菌肽的RP-HPLC分离纯化条件优选如下：
Tat(YG)的RP-HPLC分离条件：液相色谱柱：Agilent Zorbax 300SB-C18（9.4 mm×250mm, 5 μm）；柱温：25 ℃；检测波长：220 nm；流速：1.0 mL/min；流动相：A相：0.1% TFA的水；B相：0.1% TFA的乙腈（色谱纯）；流动相梯度：11%~31%B相/0~20min（即0~20min，B相由11%上升到31%； 20min~结束，B相一直都是31%）；
Tat(YY)的RP-HPLC分离条件：液相色谱柱：Agilent Zorbax 300SB-C18（9.4 mm×250mm, 5 μm）；柱温：25 ℃；检测波长：220 nm；流速：1.0 mL/min；流动相：A相：0.1% TFA的水；B相：0.1% TFA的乙腈（色谱纯）；流动相梯度：21%~41%B相/0~20min（即0~20min，B相由21%上升到41%； 20min~结束，B相一直都是41%）；
Tat(FG)的RP-HPLC分离条件：液相色谱柱：Agilent Zorbax 300SB-C18（9.4 mm×250mm, 5 μm）；柱温：25 ℃；检测波长：220 nm；流速：1.0 mL/min；流动相：A相：0.1% TFA的水；B相：0.1% TFA的乙腈（色谱纯）；流动相梯度：30%~50%B相/0~20min（即0~20min，B相由30%上升到50%； 20min~结束，B相一直都是50%）；
Tat(FF)的RP-HPLC分离条件：液相色谱柱：Agilent Zorbax 300SB-C18（9.4 mm×250mm, 5 μm）；柱温：25 ℃；检测波长：220 nm；流速：1.0 mL/min；流动相：A相：0.1% TFA的水；B相：0.1% TFA的乙腈（色谱纯）；流动相梯度：32%~52%B相/0~20min（即0~20min，B相由32%上升到52%； 20min~结束，B相一直都是52%）；
本发明四种抗菌肽可以用于抑制大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、枯草杆菌和/或金黄色葡萄球菌。
有益效果：本发明采用Fmoc多肽固相法，对细胞穿膜肽Tat(49-57)衍生改变后分别制备了抗菌肽Tat(YG)、Tat(YY)、Tat(FG)、Tat(FF)，这四种衍生抗菌肽对大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌具有较好的抑制效率，部分菌的抑制率甚至显著高于细胞穿膜肽Tat(49-57)；并且，这四种衍生抗菌肽的溶血性都很小，在发挥抑菌活性时的浓度均未达到最低溶血浓度。
附图说明
图1：Tat(49-57)的RP-HPLC图。
图2：Tat(49-57)的质谱图。
图3：Tat(YG)的RP-HPLC图。
图4：Tat(YG)的质谱图。
图5：Tat(YY)的RP-HPLC图。
图6：Tat(YY)的质谱图。
图7：Tat(FG)的RP-HPLC图。
图8：Tat(FG)的质谱图。
图9：Tat(FF)的RP-HPLC图。
图10：Tat(FF)的质谱图。
图11：Tat(49-57)及其衍生肽对红细胞的溶血作用。
具体实施方式
实施例1--抗菌肽的合成
1实验部分
1.1.实验试剂
茚三酮检测液的配制：称量1 g茚三酮充分溶于20 mL无水乙醇中，形成的黄色溶液即为茚三酮检测液。
脱保护试剂的配制：取20 mL哌啶混于80 mL的DMF中，制成体积分数20%的哌啶DMF溶液即为脱保护试剂。
切割试剂的配制：取三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇、水和苯酚按体积比为82.5:5:5:5:2.5的比例混合，混合液即为切割试剂。
1.2实验仪器
2.实验步骤及方法
2.1 抗菌肽固相合成
Tat(49-57)及其衍生肽Tat(YG)、Tat(YY)、Tat(FG)、Tat(FF)的肽链序列依次为RKKRRQRRR（如SEQ ID No.1所示）、YGRKKRRQRRR（如SEQ ID No.2所示）、YYRKKRRQRRR（如SEQID No.3所示）、FGRKKRRQRRR（如SEQ ID No.4所示）、FFRKKRRQRRR（如SEQ ID No.5所示）。根据目标肽段的序列，从C-端到N-端将相应的氨基酸进行缩合偶联。本发明以Wang树脂为载体，Fmoc为氨基酸侧链保护基，HBTU、HOBT、DIEA为氨基酸缩合剂，用三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇、水和苯酚配置切割剂，合成肽链Tat(49-57)以及Tat(YG)、Tat(YY)、Tat(FG)、Tat(FF)，使用反相高效液相色谱分离纯化，质谱进行表征。
具体地，合成步骤如下：
1. 溶胀树脂：称量Fmoc-Arg(pbf)-Wang resin (Sub=0.31 mmol/g) 1.50 g于干燥的固相合成管中，加入10 mL DMF，避光条件下通入氮气搅拌，使树脂充分溶胀，通氮气搅拌30min后减压抽滤除去DMF。
2. Fmoc保护基的脱除：向固相合成管中加入10 mL已经配制好的脱保护试剂，避光条件下通氮气搅拌，20 min后减压抽滤，再加入10 mL脱保护试剂，避光条件下通氮气搅拌，20 min后减压抽滤，然后按照DMF、甲醇、DMF、甲醇、DMF、DMF的顺序依次洗涤树脂，每次加入10 mL，洗涤时间2 min；洗涤结束后，用茚三酮检测液检测脱保护是否完成，具体检测操作是：洗涤完成后减压抽滤除去洗涤液，用玻璃棒粘取少量树脂，放入小试管中，滴加少许茚三酮检测液，然后将试管放在沸水浴中加热3 min，加热结束后观察树脂的颜色，若树脂变为深紫色或黑色，说明Fmoc保护基被去除完全，若树脂颜色较浅或呈无色，表明Fmoc保护基未充分脱除或未脱除，还需重复上述脱保护操作。
3. 氨基酸的偶联：称取1.30 g Fmoc-Arg(pbf)-OH，0.25 g HOBT，0.71 g HBTU于50 mL干燥洁净的小烧杯中，加入10 mL DMF进行溶解，溶解后再加入308 µL DIEA，混匀活化3 min后转移至固相合成管中，避光条件下通氮气搅拌反应3 h；反应结束后，按照DMF、甲醇、DMF、甲醇、DMF、DMF的顺序依次洗涤树脂，每次加入10 mL，洗涤时间2 min；洗涤结束后，用茚三酮检测液检测氨基酸偶联是否完全，若树脂为浅蓝色或是紫色，表明氨基酸偶联不完全，需重复上述偶联操作，若树脂呈无色，则表明氨基酸缩合偶联完全。
若氨基酸偶联完全，减压抽去洗涤液，重复步骤2的Fmoc保护基的脱除，保护基脱除完全后重复步骤3，偶联相应的氨基酸。重复进行步骤2、步骤3的操作，直至所有氨基酸都偶联上为止。
4. 树脂的切割：所有的氨基酸均偶联结束后，将最后一个氨基酸的Fmoc保护基脱除掉，洗涤，用氮气将树脂吹干。将吹干的树脂转移到50 mL的圆底烧瓶中，加入配制好的切割试剂20 mL，室温下用磁力搅拌器搅拌3 h；反应结束后，用砂芯漏斗过滤，收集滤液于冰乙醚中，置于冰箱中3-4 h，有白色沉淀生成，为肽链粗品；将其转移至离心管中离心，离心后弃去上清液，再加入适量冰乙醚，充分震荡使沉淀与乙醚充分接触，再次离心，重复3-4次，最后一次将上清液弃掉，剩下的沉淀自然晾干或者用吹风机吹干，得到固体粉末用于下一步的质谱检测和高效液相色谱分离纯化。
2.2 多肽的分离纯化和鉴定
所有合成肽的极性均比较大，取适量用二次蒸馏水溶解，用反相高效液相色谱仪（RP-HPLC）进行分离纯化。
Tat(49-57)的RP-HPLC分离条件：液相色谱柱：Agilent Zorbax 300SB-C18（9.4mm×250 mm, 5 μm）；柱温：25 ℃；检测波长：220 nm；流速：1.0 mL/min流动相：A相：0.1%TFA的水；B相：0.1% TFA的乙腈（色谱纯）；流动相梯度：30%~50%B相/0~20min（即0~20min，B相由30%上升到50%；20min~结束，B相一直都是50%）；
Tat(YG)的RP-HPLC分离条件：液相色谱柱：Agilent Zorbax 300SB-C18（9.4 mm×250mm, 5 μm）；柱温：25 ℃；检测波长：220 nm；流速：1.0 mL/min；流动相：A相：0.1% TFA的水；B相：0.1% TFA的乙腈（色谱纯）；流动相梯度：11%~31%B相/0~20min（即0~20min，B相由11%上升到31%；20min~结束，B相一直都是31%）；
Tat(YY)的RP-HPLC分离条件：液相色谱柱：Agilent Zorbax 300SB-C18（9.4 mm×250mm, 5 μm）；柱温：25 ℃；检测波长：220 nm；流速：1.0 mL/min；流动相：A相：0.1% TFA的水；B相：0.1% TFA的乙腈（色谱纯）；流动相梯度：21%~41%B相/0~20min（即0~20min，B相由21%上升到41%；20min~结束，B相一直都是41%）；
Tat(FG)的RP-HPLC分离条件：液相色谱柱：Agilent Zorbax 300SB-C18（9.4 mm×250mm, 5 μm）；柱温：25 ℃；检测波长：220 nm；流速：1.0 mL/min；流动相：A相：0.1% TFA的水；B相：0.1% TFA的乙腈（色谱纯）；流动相梯度：30%~50%B相/0~20min（即0~20min，B相由30%上升到50%；20min~结束，B相一直都是50%）；
Tat(FF)的RP-HPLC分离条件：液相色谱柱：Agilent Zorbax 300SB-C18（9.4 mm×250mm, 5 μm）；柱温：25 ℃；检测波长：220 nm；流速：1.0 mL/min；流动相：A相：0.1% TFA的水；B相：0.1% TFA的乙腈（色谱纯）；流动相梯度：32%~52%B相/0~20min（即0~20min，B相由32%上升到52%；20min~结束，B相一直都是52%）；
Tat(49-57)及各衍生肽的质谱检测条件：经RP-HPLC分离后，收集主峰流出液，使用Thermo-LCQ Fleet Advantage质谱仪进行表征，质谱条件：离子源：ESI；检测模式：正离子；鞘气流速：20 psi；辅气流速：8 psi；扫气流速：5 psi；喷雾电压：4.5 KV；毛细管电压：35V；套管透镜电压：110 V；毛细管温度：275 ℃；毛细管电压：35 V；套管透镜电压：110 V；在m/z为150-2000进行全扫描。
2.3结果与讨论
2.3.1 Tat(49-57)的RP-HPLC分析及质谱表征
Tat(49-57)的RP-HPLC及质谱图如图1、图2所示。
产物粗品经RP-HPLC分离纯化（如图1），主峰的表留时间为21.119 min，纯度97.27%。Tat(49-57)肽的理论分子量为1339.62，质谱图谱（图2）显示主峰产物离子峰质荷比值670.50、485.08、447.50、359.83、336.00、269.08分别对应Tat(49-57)肽的离子峰[M+2H]2+、[M+3K]3+、[M+3H]3+、[M+4Na]4+、[M+4H]4+、[M+5H]5+，说明图1中主峰为目标肽产物。经RP-HPLC分离，收集保留时间为21.119 min时的流出液，并冷冻干燥后得到Tat(49-57)肽为白色粉末。
2.3.2 Tat(YG)的RP-HPLC分析及质谱表征
Tat(YG)的RP-HPLC及质谱图如图3、图4所示。
产物粗品经RP-HPLC分离纯化（如图3），主峰的表留时间为16.859 min，纯度98.86%。Tat(YG) 肽（序列YGRKKRRQRRR）的理论分子量为1559.85，质谱图谱（图4）显示离子峰质荷比值558.42、520.75、414.67、390.83、312.92分别对应YGRKKRRQRRR肽的离子峰[M+3K]3、[M+3H]3+、[M+4Na]4+、[M+4H]4+、[M+5H]5+，说明图3中主峰为目标肽产物。经RP-HPLC分离，收集保留时间为16.859 min时的流出液，并冷冻干燥后得到Tat(YG)肽为白色粉末。
2.3.3 Tat(YY)的RP-HPLC分析及质谱表征
Tat(YY)的RP-HPLC及质谱图如下面图5、图6所示。
产物粗品经RP-HPLC分离纯化（如图5），主峰的表留时间为13.697 min，纯度99.86%。Tat(YY) 肽（序列YYRKKRRQRRR）的理论分子量为1665.97，质谱图谱（6）显示离子峰质荷比值593.92、556.42、445.67、417.58、334.33分别对应YYRKKRRQRRR肽的离子峰[M+3K]3+、[M+3H]3+、[M+4Na]4+、[M+4H]4+、[M+5H]5+，说明图5中主峰为目标肽产物。经RP-HPLC分离，收集保留时间为13.697 min时的流出液，并冷冻干燥后得到Tat(YY)肽为白色粉末。
2.3.4 Tat(FG)的RP-HPLC分析及质谱表征
Tat(FG)的RP-HPLC及质谱图如下面图7、图8所示。
产物粗品经RP-HPLC分离纯化（如图7），主峰的表留时间为13.754 min，纯度92.74%。Tat(FG) 肽（序列FGRKKRRQRRR）的理论分子量为1543.86，质谱图谱（图8）显示离子峰质荷比值772.50、515.33、442.17、386.92、309.67分别对应FGRKKRRQRRR肽的离子峰[M+2H]2+、[M+3H]3+、[M+4K]4+、[M+4H]4+、[M+5H]5+，说明图7中主峰为目标肽产物。经RP-HPLC分离，收集保留时间为13.754 min时的流出液，并冷冻干燥后得到Tat(FG)肽为白色粉末。
2.3.5 Tat(FF)的RP-HPLC分析及质谱表征
Tat(FF)的RP-HPLC及质谱图如下面图9、图10所示。
产物粗品经RP-HPLC分离纯化（如图9），主峰的表留时间为13.226 min，纯度94.62%。Tat(FF) 肽（序列FFRKKRRQRRR）的理论分子量为1633.97，质谱图谱（10）显示离子峰质荷比值817.50、583.17、545.58、437.67、409.58、327.92分别对应FFRKKRRQRRR肽的离子峰[M+2H]2+、[M+3K]3+、[M+3H]3+、[M+4Na]4+、[M+4H]4+、[M+5H]5+，说明图9中主峰为目标肽产物。经RP-HPLC分离，收集保留时间为13.226 min时的流出液，并冷冻干燥后得到Tat(FF)肽为白色粉末。
综上，本发明采用多肽固相合成的方法，合成了母肽Tat(49-57)（序列为RKKRRQRRR）和Tat(YG)（序列为YGRKKRRQRRR），Tat(YY)（序列为YYRKKRRQRRR），Tat(FG)（序列为FGRKKRRQRRR），Tat(FF)（序列为FFRKKRRQRRR）4条衍生肽。利用反相高效液相色谱法将合成的各种肽进行分离纯化，使用质谱对目标肽进行表征，结果表明所合成的产物均为相应的目标肽，纯度均在90%以上。
实施例2--多肽的抗菌活性检测
1.实验材料和仪器
1.1 实验用的细菌
金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、鼠伤沙门氏菌均为市购获得。
1.2 主要试剂
1.3 主要仪器
2 实验方法
2.1 主要溶液配制
LB液体培养基：取蛋白胨10 g，氯化钠10 g，酵母粉5 g于大烧杯中，加入蒸馏水1000mL，待溶解后用浓氢氧化钠溶液调节pH至7.2-7.4。将配好的培养基置于121 ℃下湿热灭菌20 min，然后分装于250 mL的锥形瓶中，常温保存待使用。
MTT试液：称取100 mg MTT 溶解于20 mL 磷酸钠缓冲液中(pH=7.0)，无菌滤膜过滤后分装-20 ℃避光保存待使用。
2.2 多肽抗菌活性测定
MTT法是用于细胞存活率检测的方法。其原理是外源性MTT 可以氧化活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶，将本身还原为不溶于水的甲瓒，并沉积在细胞内，而已经死亡的细胞则无此功能。DMSO可以溶解细胞中的甲瓒结晶，通过测定在570 nm处吸光度，可以间接反映活细胞的数量。在一定范围内，570 nm处的吸光度与活细胞数量成正比。
采用美国临床实验室标准研究所(CLSI)推荐的M27-A方案中的微量稀释法进行各肽体外抗菌活性测试。
1、用无菌20 mmol /L PBS(pH=6.0)溶液溶解抗菌肽，配制 8 mg/mL 的肽储存液。
2、分别在无菌96孔板的第一列至第十列各孔加入100 μL 20 mmol/L的PBS(pH=6.0)，用于稀释肽，吸取 100 μL肽储存液至96孔板中的第一列各孔，然后用移液枪小心吹吸4-5次。
3、从96孔板中的第一列中吸取100 μL溶液加入到第二列，吹吸4-5次，再从第二列中吸取100 μL至第三列，依次重复至第十列，吸取第十列100 μL丢弃。
4、无菌环境下挑取待测菌种单菌落到LB液体培养基中，28℃、180rpm 培养 30h，用LB液体培养基稀释菌悬液，采用血小球计数板计数法计算菌悬液浓度。吸取100 μL含菌体悬浮液(浓度在1×104-5×104 CFU/mL)的培养基加入到96孔板的第一列至第十列各孔，充分混匀。第十一列为阴性对照孔，各孔加入100 μL PBS溶液和100 μL菌体悬浮液；第十二列为培养基为空白对照，各孔加入100 μL PBS溶液和100 μL LB液体培养基，每组实验设三个重复组。
5、在37 ℃静置孵育96孔板18 h，结束后每个孔中加入10 μL 5 mg/mL MTT，混匀后继续孵育，4 h后向96孔板中每孔加入100 μL DMSO，混匀。酶标仪扫描，测在570 nm处吸光度。抑菌率由如下公式计算得到：
抑菌率（%）＝{[OD570(样品)–OD570(空白)]/[OD570(阴性)–OD570(空白)]}×100
2.3 多肽溶血性的测定
2.3.1 人红细胞的制备
静脉抽取健康志愿者血液10 mL，置于干净的含有抗凝血当量的肝素钠的三角瓶中，充分搅拌后加入50 mL生理盐水，摇匀后在2000 rpm转速下离心10 min，除去上清液，将底部的沉淀再用生理盐水洗2-3次。吸取1 mL红细胞沉淀，加入50 mL生理盐水，得到2%人红血细胞悬浮液。
2.3.2 分光光度法测定溶血性
用生理盐水代替PBS，采用2.2中的方法配置梯度浓度的肽溶液。第十一列不加入肽作为阴性对照组，各孔加入100 μL生理盐水；第十二列作为阳性对照组，各孔加入100μL 1v%Triton X-100的生理盐水溶液；第一列至第十二列各孔加入100μL 2%人红血细胞悬浮液。将96孔板置于37 ℃下孵育30 min后吸取各孔上清150 μL于另外一个96孔板中，然后酶标仪测定570 nm处的吸光度A。实验组设三组重复，计算溶血率的平均值，计算公式如下：
溶血率(%)=[(样品A570–阴性对照A570)/(阳性对照A570–阴性对照A570)]×100%
3 结果与讨论
本实验选取的菌种有革兰氏阳性菌枯草杆菌和金黄色葡萄球菌，革兰氏阴性菌大肠杆菌和鼠伤寒沙门菌。
Tat(49-57)肽和衍生肽Tat(YG)、Tat(YY)、Tat(FG)、Tat(FF)的抗菌活性如表5所示。
从表5中可以看出，对大肠杆菌的抑制效果最好的是Tat(YY)，鼠伤寒沙门菌抑制效果最好的是Tat(FF)，枯草杆菌和金黄色葡萄球菌抑制效果最好的是Tat(YY)和Tat(FF)。说明Tat(49-57)肽经过衍生改变后抑菌活性变的更好。
Tat(49-57)肽和衍生肽对大肠杆菌的抑制效果最好；Tat(49-57)肽经过改变后对鼠伤寒沙门菌的抑制明显改善，抑制活性均明显增强，Tat(FF)的抑菌能力增强基本到达Tat(49-57)肽7倍；对枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果也明显增加。但是Tat(YG)对大肠杆菌和枯草杆菌的抑制能力较Tat(49-57)肽则是下降，Tat(FG)对枯草杆菌的抑制能力与Tat(49-57)肽基本一致，这可能是由于不同菌的细胞膜结构有差异，对于不同的肽的摄取不同，导致肽在菌胞内的含量不同，产生不同的抑制效果。
总体来看，对Tat(49-57)进行衍生改变后，抑菌效果增加，不同的衍生肽对不同的菌的抑制效果各有不同，其中Tat(FF)和Tat(YY)相比于其他肽的抑菌效果有明显优势。
Tat(49-57)及其衍生物的溶血性在一定程度上反应了它们对红细胞的毒性。图11为Tat(49-57)及其衍生物对人红细胞的溶血性影响。如图11显示，Tat(YG)和Tat(YY)在浓度为62.5 µg/mL时，溶血率基本达到5%；Tat(49-57)的浓度在250 µg/mL时溶血率达到5%，在浓度大于500 µg/mL时，溶血率急剧增加；Tat(FG)的测试的溶血率小于5%的最大浓度为250 µg/mL；Tat(FF)测试的溶血率小于5%的最大浓度为500 µg/mL。结合各肽的IC50，Tat(49-57)及其衍生物在发挥抑菌活性时的浓度均未达到最低溶血浓度，说明Tat(49-57)及其衍生物安全性都比较高，具有进一步改善设计成为优异抗菌药物的价值。
结论
本发明选取革兰氏阳性菌枯草杆菌和金黄色葡萄球菌，革兰氏阴性菌大肠杆菌和鼠伤寒沙门菌。采用标准微量稀释法测定Tat(49-57)肽和衍生肽Tat(YG)、Tat(YY)、Tat(FG)、Tat(FF)的抗菌活性及溶血性。对大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制效率最高的分别是肽Tat(YY)、Tat(FF)、Tat(FF)和Tat(YG)、Tat(FF)。Tat(49-57)肽经过衍生改变后抑菌活性有所增强。Tat(49-57)肽和衍生肽的溶血性都很小，在发挥抑菌活性时的浓度均未达到最低溶血浓度。
SEQUENCE LISTING
<110> 郑州大学
河南工程学院
<120> 一种基于细胞穿膜肽Tat(49-57)的抗菌肽及其合成方法
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Tyr Tyr Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Phe Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Phe Phe Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10

Claims (3)

1.一种基于细胞穿膜肽Tat(49-57)的抗菌肽，其特征在于：该抗菌肽为Tat(YG)、Tat(YY)、Tat(FG)或Tat(FF)，Tat(YG)、Tat(YY)、Tat(FG)、Tat(FF)的肽链序列依次如SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示。
2.一种合成如权利要求1所述抗菌肽的方法，其特征在于：以Wang树脂为载体，Fmoc为氨基酸侧链保护基，哌啶的DMF溶液为脱保护试剂，HBTU、HOBT、DIEA为氨基酸缩合剂，根据目标抗菌肽的序列，从C-端到N-端将相应的氨基酸进行缩合偶联；所有的氨基酸均偶联结束后，将最后一个氨基酸的Fmoc保护基脱除掉，洗涤，吹干；然后加入由三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇、水和苯酚配制而成的切割试剂，切割后，过滤，收集滤液于冰乙醚中，置于冰箱中静止直至有沉淀出现，离心，弃去上清液，再重复加入冰乙醚--离心数次，最后一次将上清液弃掉，剩下的沉淀经干燥，所得固体粉末进一步用二次蒸馏水溶解后，送去RP-HPLC分离纯化，收集主峰流出液，并冷冻干燥后获得相应的目标抗菌肽。
3.如权利要求2所述抗菌肽的合成方法，其特征在于各目标抗菌肽的RP-HPLC分离纯化条件如下：
Tat(YG)的RP-HPLC分离条件：液相色谱柱：Agilent Zorbax 300SB-C18；柱温：25 ℃；检测波长：220 nm；流速：1.0 mL/min；流动相：A相：0.1% TFA的水；B相：0.1% TFA的乙腈；流动相梯度：11%~31%B相/0~20min；
Tat(YY)的RP-HPLC分离条件：液相色谱柱：Agilent Zorbax 300SB-C18；柱温：25 ℃；检测波长：220 nm；流速：1.0 mL/min；流动相：A相 0.1% TFA的水、B相 0.1% TFA的乙腈；流动相梯度：21%~41%B相/0~20min；
Tat(FG)的RP-HPLC分离条件：液相色谱柱：Agilent Zorbax 300SB-C18；柱温：25 ℃；检测波长：220 nm；流速：1.0 mL/min；流动相：A相：0.1% TFA的水、B相：0.1% TFA的乙腈；流动相梯度：30%~50%B相/0~20min；
Tat(FF)的RP-HPLC分离条件：液相色谱柱：Agilent Zorbax 300SB-C18；柱温：25 ℃；检测波长：220 nm；流速：1.0 mL/min；流动相：A相：0.1% TFA的水、B相：0.1% TFA的乙腈；流动相梯度：32%~52%B相/0~20min。
CN201611036266.7A 2016-11-23 2016-11-23 一种基于细胞穿膜肽Tat(49-57)的抗菌肽及其合成方法 Expired - Fee Related CN106749559B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611036266.7A CN106749559B (zh) 2016-11-23 2016-11-23 一种基于细胞穿膜肽Tat(49-57)的抗菌肽及其合成方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611036266.7A CN106749559B (zh) 2016-11-23 2016-11-23 一种基于细胞穿膜肽Tat(49-57)的抗菌肽及其合成方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106749559A true CN106749559A (zh) 2017-05-31
CN106749559B CN106749559B (zh) 2020-09-04

Family

ID=58971900

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611036266.7A Expired - Fee Related CN106749559B (zh) 2016-11-23 2016-11-23 一种基于细胞穿膜肽Tat(49-57)的抗菌肽及其合成方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106749559B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108610428A (zh) * 2018-05-17 2018-10-02 河南工程学院 一种抗菌融合肽及其制备方法和应用
CN113754784A (zh) * 2021-09-27 2021-12-07 中国农业大学 一种细胞穿透抗菌肽及其应用
CN116375877A (zh) * 2022-12-01 2023-07-04 东北农业大学 一种细胞穿透抗菌肽pw2及其制备方法和应用
CN117567590A (zh) * 2023-04-23 2024-02-20 山东第一医科大学(山东省医学科学院) 一种提高抗耐药菌活性的订书肽及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103648518A (zh) * 2011-06-24 2014-03-19 诺诺公司 局部缺血的组合治疗

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103648518A (zh) * 2011-06-24 2014-03-19 诺诺公司 局部缺血的组合治疗

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NICOLE BROOKS ET AL: "Comparative Immunogenicity of a Cytotoxic T Cell Epitope Delivered by Penetratin and TAT Cell Penetrating Peptides", 《MOLECULES》 *
任建丽 等: "穿膜肽TAT的固相合成及体外活性研究", 《第三军医大学学报》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108610428A (zh) * 2018-05-17 2018-10-02 河南工程学院 一种抗菌融合肽及其制备方法和应用
CN108610428B (zh) * 2018-05-17 2021-04-02 河南工程学院 一种抗菌融合肽及其制备方法和应用
CN113754784A (zh) * 2021-09-27 2021-12-07 中国农业大学 一种细胞穿透抗菌肽及其应用
CN113754784B (zh) * 2021-09-27 2023-08-15 中国农业大学 一种细胞穿透抗菌肽及其应用
CN116375877A (zh) * 2022-12-01 2023-07-04 东北农业大学 一种细胞穿透抗菌肽pw2及其制备方法和应用
CN116375877B (zh) * 2022-12-01 2023-10-27 东北农业大学 一种细胞穿透抗菌肽pw2及其制备方法和应用
CN117567590A (zh) * 2023-04-23 2024-02-20 山东第一医科大学(山东省医学科学院) 一种提高抗耐药菌活性的订书肽及其制备方法和应用
CN117567590B (zh) * 2023-04-23 2024-04-12 山东第一医科大学(山东省医学科学院) 一种提高抗耐药菌活性的订书肽及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN106749559B (zh) 2020-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106749559A (zh) 一种基于细胞穿膜肽Tat(49‑57)的抗菌肽及其合成方法
CN104961801B (zh) 一种具有多靶点的抗菌多肽偶联物及其二聚物的合成和应用
CN106232616B (zh) 两亲性合成抗菌肽、其药物组合物及其用途
CN102924574B (zh) 抗菌肽lz1和该抗菌肽在制备抗菌药物中的用途
CN110283253B (zh) 一种猪源衍生杂合抗菌肽mdp-2及其制备方法和应用
CN107344958B (zh) 抗菌五肽衍生物及其应用
CN112341522A (zh) 一种抗菌肽及其应用
CN106552257B (zh) 一种基于细胞穿膜肽Tat(49-57)的抗菌肽在抑制细菌方面的应用
CN110330553B (zh) 一种抗菌肽vl25-1的突变体及其制备方法与应用
CN116874614B (zh) 一种具有高活性低裂解效果的抗菌多肽aph171及其制备方法和应用
CN112625092B (zh) 一种基于polybia-MPI的抗菌多肽化合物及其合成与应用
CN106916205A (zh) 抗菌六肽及其衍生物和应用
CN107188944A (zh) 海蚯蚓抗菌肽nz17074衍生肽n6及其应用
JP2013523661A (ja) 低赤血球溶解性の抗微生物ペプチド、医薬組成物およびその使用
CN110066320B (zh) 抗多重耐药菌环肽及其制备方法和应用
CN105175525B (zh) 沼水蛙抗菌肽及其应用
CN110283245B (zh) 猪髓源pmap-23衍生抗菌肽及制备方法和应用
CN104672307B (zh) 一种提高阳离子短肽抗菌性和稳定性的方法
CN113045627B (zh) 一种抗菌多肽sa-2及其制备方法和应用
CN116284237A (zh) 一种高效的纳米抗菌肽及其制备方法和应用
CN100390194C (zh) 低溶血性的抗菌胜肽及其使用方法
CN115028685A (zh) 一种阳离子双环抗菌肽及其应用
CN112409457B (zh) 一类抗细菌多肽及其应用
CN112625106A (zh) 一种抗菌多肽化合物、合成方法及其应用
CN102796176B (zh) 一种昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin及其制备和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20200904

Termination date: 20201123

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee