CN104745663B - 一种猪血红蛋白综合利用的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种综合利用猪血红蛋白的方法：先酶解完整的血红蛋白，加热并在碱性溶液中使用一定浓度盐处理酶解液，促使血红素和多肽解离，再使用超滤、纳滤方法分离血红素和多肽及小肽，最终达到综合利用猪血红蛋白目的，经济效益显著，社会、环保价值高。上述方法不使用有机溶剂，简化工艺，降低成本，不产生任何废弃物；血红素和多肽、小肽分离彻底，产品得率高、纯度高，工业化应用前景广阔。
Description
技术领域：
本发明属于食品加工技术领域，特别涉及一种猪血红蛋白综合利用的方法。
背景技术：
我国生猪产量在世界排名第一，集约化生猪屠宰产生的猪血除了少数被制作成猪血豆腐食用外，其它都是不经利用直接排放，既浪费资源又污染环境。猪血红蛋白占猪血总蛋白75％以上，对其高效利用意义重大，现在已有企业开始利用这一废弃资源，采用喷雾干燥的方法分别干燥血浆和红细胞，制备猪血浆粉和红细胞粉用做动物饲料功能蛋白添加剂。
猪血红蛋白是结合血红素辅基、具有四级结构的珠蛋白，由四个亚基组成。四个亚基包含2个相同的α链和2个相同的β链。α链由141个氨基酸组成，分子量15126Da；β链由146个氨基酸组成，分子量l5866Da，每条链以配位键结合一个血红素吡咯分子，血红蛋白总分子量为64450Da。血红素是由4个吡咯分子组成的卟啉环，环中心结合1个亚铁离子，分子量652。血红素是制备胆红素、人工牛磺的重要原料，是治疗缺铁性贫血和癌症药物的重要中间体，市场需求较大。
猪血红蛋白四聚体的分子结构致密，直接食用不易消化吸收，热喷雾干燥促使血红蛋白分子结构更加紧密，更加不利于消化和吸收。因此，体外酶切降解血红蛋白，即可除腥，增加适口性，又可提高生物利用度，增加营养价值。此外，很多文献报导降解后的血红蛋白肽具有血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、降血压、降血脂等活性，适宜制作成保健食品肽，用于消化道疾病患者、食物过敏性患者以及老年人群(郑炯,汪学荣.肉类研究,2007,(4):38)。
酶切降解法是目前生产血红蛋白活性肽唯一可行的方法。酶法水解的反应条件温和，副反应少，不破坏氨基酸，同时，酶水解程度可以控制。特别是利用不同酶的特异性，得到不同水解物和各种多肽产品。
但是在使用酶解法获得血红蛋白多肽产品的同时，兼顾血红素的收集效果并不理想。如《酶解猪血制备水解蛋白和血红素的工艺研究》(苗建银,朱雪梅,邵海艳等.食品科技,2011,36(7):125)中所公布的工艺路线：新鲜猪血→抗凝猪血→离心→血球→0.9％生理盐水洗涤两次→冷冻干燥→血粉→超声波溶血→酶解→灭酶→冷却至室温→调pH到4.5→离心-沉淀(血红素粗品)→上清(水解蛋白)。在此工艺条件下获得的水解蛋白得率(以冻干血粉计)为40.1％，血红素粗品得率(以冻干血粉计)为16.2％，血红素粗品中的血红素含量仅为19.3％，可见上述方法分离不彻底，血红素得率较低。
目前，血红素成熟的提取方法是：pH 2-3的丙酮-盐酸溶液变性血红蛋白，过滤后滤液加入冰醋酸、氯化钠结晶提取血红素。如专利号为ZL 03116353.X的中国发明专利《血红素的提取与纯化方法》公开了一种血红素的提取与纯化方法，其生产工艺是分离动物鲜血红细胞，在其中加入丙酮盐酸溶液，过滤，调整该滤液pH，加乙酸钠溶液沉淀析出血红素，经洗涤干燥后得血红素粗品；将该血红素粗品用有机溶剂溶解，加入阳离子表面活性剂的水溶液，加热后逐步加入盐酸，析出结晶，洗涤干燥后得到血红素精品。而经上述方法处理后，变性的血红蛋白单体如需要继续利用生产多肽产品，则必须除去丙酮和乙酸钠，工艺难度大、成本高。
此外，现有技术中关于血红素提取与纯化、血红蛋白酶解两方面各有很多文献报导，但将两方面以上下游方式串在一起综合考虑、对血红蛋白进行效益最大化综合利用鲜见报道。
因此，本发明将针对上述问题提出一种新型血红蛋白综合利用方法，不使用有机溶剂，简化工艺，降低成本，不产生任何废弃物；血红素和多肽分离彻底，产品得率高、纯度高，工业化应用前景广阔。
发明内容：
为了解决上述问题，本发明提供一种综合利用猪血红蛋白的方法：先酶解完整的血红蛋白，加热并在碱性溶液中使用一定浓度的盐处理酶解液，促使血红素和多肽解离，再使用超滤、纳滤方法分离血红素和多肽及小肽，最终达到综合利用猪血红蛋白目的。
所述酶解血红蛋白的酶为食品级蛋白酶；
所述食品级蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶以及木瓜蛋白酶中的至少一种；
所述碱性溶液为浓氨水或NaOH；
所述处理酶解液的盐为NaCl；
所述NaCl添加的终浓度为反应体系总体积的0.5-20％。
所述技术方案具体如下：
1、新鲜猪血加入0.8％柠檬酸三钠抗凝，4000g离心20min分离血红细胞，血红细胞使用0.9％NaCl生理盐水洗涤2次；
2、将所得的血红细胞加入1-3倍体积蒸馏水，不断搅拌溶血30min，4000g离心30min，取上清用作血红蛋白液；
3、血红蛋白液加入食品级蛋白酶酶解，酶添加量、温度、时间、pH均根据不同的酶选择其最优值；
所述食品级蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶以及木瓜蛋白酶中的至少一种；
4、酶解液用浓氨水或NaOH调pH值至8-10，加热至60-90℃，并加入总体积0.5-20％的NaCl充分搅拌30min，促使血红素与多肽、小肽彻底分离并灭酶活；冷却至室温后4000g离心，使用截留分子量1KDa超滤系统处理上清液分离血红素、小肽和多肽。
5、血红蛋白酶解多肽存在超滤截留液中，用盐酸调pH至4-6，使用截留分子量200Da纳滤系统脱盐并浓缩至适当体积，冷冻干燥既得多肽产品；
6、超滤滤出液中含有血红素、小肽、氨基酸、其它小分子有机物、无机物等。浓缩超滤滤出液至血红素开始析出，用2-5倍体积的0.1mol.L-1NaOH溶液溶解，过滤除去不溶性杂质，再以盐酸调pH值4-5，血红素重新沉淀析出。过滤收集沉淀，再使用相同的加碱调酸方法2-3次处理沉淀以纯化血红素，分别用双蒸水和无水乙醇洗涤血红素沉淀，50℃干燥即得血红素纯品；
7、收集、合并步骤6过滤后的酸化滤液，调pH至4-6，纳滤脱盐并浓缩至适当体积，冷冻干燥即得小肽产品。
有益效果：
1、本发明使用NaCl破坏珠蛋白和吡咯分子间的配位键，促使血红素与多肽、小肽彻底分离，未引入丙酮等有机溶剂，避免了后续多肽类物质收集过程中去除有机溶剂的步骤，简化了工艺；
2、整个工艺过程不使用有机溶剂，产品无有机溶剂残留；此外，工艺中虽有反复加碱调酸步骤，但通过血红素结晶即可实现血红素与酸、盐的分离，酸化废液用NaOH中和成NaCl后可回收再利用，对环境无排放；
3、采用本发明所述工艺综合利用猪血红蛋白，经济效益显著，社会、环保价值高，产品得率高，纯度高，收集得到的血红素纯度达到90％以上，小肽、多肽纯度达到80％。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1：
新鲜猪血1000mL加入终浓度0.8％柠檬酸三钠抗凝，4000g离心20min分离血红细胞，使用0.9％NaCl生理盐水洗涤2次，最后一次离心后记录体积为413mL，计434g。
血红细胞加入1倍体积蒸馏水，不断搅拌溶血30min。4000g离心30min后取上清用作血红蛋白液。血红蛋白液加入碱性蛋白酶(20万U.g-1，广西南宁庞博生物工程有限公司)进行酶解。
酶解工艺为：酶添加量4000U.mL-1，温度50℃，pH 9.0，时间5h，酶解过程中每隔半小时使用2mol.L-1NaOH调节一次pH至9.0。酶解结束后将酶解液加热至90℃，调节pH至9.0，加入总体积5％的NaCl，充分搅拌30min，促使血红素与多肽、小肽彻底分离并灭酶活。
冷却至室温后4000g离心20min，取上清液使用截留分子量1KDa超滤系统(聚砜膜，压差20psi)分离多肽和血红素及小肽，中间分3次补加2000mL蒸馏水入截留液中。
血红蛋白酶解多肽存在超滤截留液中，用2mol.L-1盐酸调pH至6，使用截留分子量200Da纳滤系统(磺化聚醚砜膜，压差45psi)脱盐并浓缩至适当体积，冷冻干燥既得多肽产品93.2g，得率21.47％。
超滤滤出液使用旋转蒸发浓缩至血红素开始析出，加入3倍体积的0.1mol.L-1NaOH溶液溶解，过滤除去不溶性杂质，再以2mol.L-1盐酸调pH值4，血红素重新沉淀析出。过滤收集沉淀，再使用相同的加碱调酸方法2次处理沉淀以纯化血红素。分别用双蒸水和无水乙醇洗涤，50℃干燥即得血红素纯品3.6g，得率0.83％。
收集、合并酸化滤液，调pH值至6，使用截留分子量200Da纳滤系统(磺化聚醚砜膜，压差45psi)脱盐并浓缩至适当体积，冷冻干燥即得小肽产品12.9g，得率2.97％。
血红素含量测定采用紫外-可见光分光光度法，特征吸收波长385nm，血红素对照品为Sigma产品，测得血红素纯度为91.6％。小肽和多肽纯度测定采用Lowry法，标准品为结晶牛血清蛋白，测得小肽和多肽纯度分别是68.3％和83.2％。
实施例2：
新鲜猪血1000mL加入终浓度0.8％柠檬酸三钠抗凝，4000g离心20min分离血红细胞，使用0.9％NaCl生理盐水洗涤2次，最后一次离心后记录体积为396mL，计415g。
血红细胞加入2倍体积蒸馏水，不断搅拌溶血30min。4000g离心30min后取上清用作血红蛋白液。血红蛋白液加入胰蛋白酶(国药集团化学试剂有限公司，酪蛋白转化力>25)进行酶解。
酶解工艺为：酶添加量15g，温度40℃，pH 8.5，时间6h，每隔半小时使用2mol.L- 1NaOH调节一次pH为8.5。酶解结束后将酶解液加热至80℃，调节pH至9.0，加入总体积10％的NaCl，充分搅拌30min，促使血红素与多肽、小肽彻底分离并灭酶活。
冷却至室温后4000g离心20min，取上清液使用截留分子量1K Da超滤系统(聚砜膜，压差20psi)分离多肽和血红素及小肽，中间分3次补加2000mL蒸馏水入截留液中。
血红蛋白酶解多肽存在超滤截留液中，用2mol.L-1盐酸调pH至5，使用截留分子量200Da纳滤系统(磺化聚醚砜膜，压差45psi)脱盐并浓缩至适当体积，冷冻干燥既得多肽产品78.5g，得率18.92％。
超滤滤出液使用旋转蒸发浓缩至血红素开始析出，加入2倍体积的0.1mol.L-1NaOH溶液溶解，过滤除去不溶性杂质，再以2mol.L-1盐酸调pH值5，血红素重新沉淀析出。过滤收集沉淀，再使用相同的加碱调酸方法2次处理沉淀以纯化血红素。分别用双蒸水和无水乙醇洗涤，50℃干燥即得血红素纯品4.2g，得率0.97％。
收集、合并酸化滤液，调pH值至5，使用截留分子量200Da纳滤系统(磺化聚醚砜膜，压差45psi)脱盐并浓缩至适当体积，冷冻干燥即得小肽产品18.7g，得率4.51％。
血红素含量测定采用紫外-可见光分光光度法，特征吸收波长385nm，血红素对照品为Sigma产品，测得血红素纯度为88.4％。小肽和多肽纯度测定采用Lowry法，标准品为结晶牛血清蛋白，测得小肽和多肽纯度分别是77.6％和89.3％。
实施例3：
新鲜猪血1000mL加入终浓度0.8％柠檬酸三钠抗凝，4000g离心20min分离血红细胞，使用0.9％NaCl生理盐水洗涤2次，最后一次离心后记录体积为425mL，计446g。
血红细胞加入3倍体积蒸馏水，不断搅拌溶血30min。4000g离心30min后取上清用作血红蛋白液。血红蛋白液加入中性蛋白酶(20万U.g-1，广西南宁庞博生物工程有限公司)进行酶解。
酶解工艺为：酶添加量4000U.mL-1，温度30℃，pH 7.5，时间5h，每隔半小时使用2mol.L-1NaOH调节一次pH为7.5。酶解结束后将酶解液加热至70℃，用浓氨水调pH值至9，加入总体积15％的NaCl，充分搅拌30min，促使血红素与多肽、小肽彻底分离并灭酶活。冷却至室温后4000g离心20min，取上清液使用截留分子量1K Da超滤系统(聚砜膜，压差20psi)分离多肽和血红素及小肽，中间分3次补加2000mL蒸馏水入截留液中。
血红蛋白酶解多肽存在超滤截留液中，用2mol.L-1盐酸调pH至4，使用截留分子量200Da纳滤系统(磺化聚醚砜膜，压差45psi)脱盐并浓缩至适当体积，冷冻干燥既得多肽产品101.3g，得率22.71％。
超滤滤出液使用旋转蒸发浓缩至血红素开始析出，加入4倍体积的0.1mol.L-1NaOH溶液溶解，过滤除去不溶性杂质，再以2mol.L-1盐酸调pH值4，血红素重新沉淀析出。过滤收集沉淀，再使用相同的加碱调酸方法3次处理沉淀以纯化血红素。分别用双蒸水和无水乙醇洗涤，50℃干燥即得血红素纯品2.8g，得率0.63％。
收集、合并酸化滤液，调pH值至4，使用截留分子量200Da纳滤系统(磺化聚醚砜膜，压差45psi)脱盐并浓缩至适当体积，冷冻干燥即得小肽产品10.9g，得率2.44％。
血红素含量测定采用紫外-可见光分光光度法，特征吸收波长385nm，血红素对照品为Sigma产品，测得血红素纯度为90.5％。小肽和多肽纯度测定采用Lowry法，标准品为结晶牛血清蛋白，测得小肽和多肽纯度分别是81.7％和76.3％。
Claims (1)
1.一种猪血红蛋白综合利用的方法，其特征在于，所述方法具体如下：
(1)新鲜猪血进行处理后得到血红蛋白液；
(2)血红蛋白液加入食品级蛋白酶酶解，所述食品级蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶以及木瓜蛋白酶中的至少一种；
(3)酶解结束后，酶解液加热至60-90℃，并用浓氨水或NaOH调pH值至8-10，加入总体积5-15％的NaCl充分搅拌30min，促使血红素与多肽、小肽彻底分离并灭酶活；
(4)冷却至室温后4000g离心，使用截留分子量1KDa超滤系统处理上清液分离血红素、小肽和多肽，多肽存在超滤截留液中，超滤滤出液中含有血红素、小肽、氨基酸、其它小分子有机物、无机物等；
(5)将超滤截留液用盐酸调pH至4-6，使用截留分子量200Da纳滤系统脱盐并浓缩至适当体积，冷冻干燥即得多肽产品；
(6)将超滤滤出液浓缩至血红素开始析出，用2-5倍体积的0.1mol ·L-1NaOH溶液溶解，过滤除去不溶性杂质，再以盐酸调pH值4-5，血红素重新沉淀析出；过滤收集沉淀，再使用相同的加碱调酸方法2-3次处理沉淀以纯化血红素，分别用双蒸水和无水乙醇洗涤血红素沉淀，50℃干燥即得血红素纯品；
(7)收集、合并步骤(6)过滤后的酸化滤液，调pH至4-6，纳滤脱盐并浓缩至适当体积，冷冻干燥即得小肽产品。
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