CN103739663B - 微波辅助蛋白酸水解快速制备小肽氨基酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微波辅助蛋白酸水解快速制备小肽氨基酸的方法，该方法是在微波环境中，变性蛋白质原料与盐酸和亚硫酸的混合液进行水解反应后，将反应液离心过滤，纳滤膜脱酸，超滤分离，得到不同分子量的小肽氨基酸；该制备方法反应条件温和，生产周期短，生产成本低，产品回收率高，生产过程实现“三废”零排放，适用于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种微波辅助蛋白酸水解快速制备小肽氨基酸的方法，属于蛋白质的加工技术领域。
背景技术
蛋白质水解产物为胨、肽等，最终产物为α-氨基酸。肽是由一定数量的氨基酸通过肽键相连而成的，一般把肽键中氨基酸数为2～20个的肽称为寡肽或小肽，而将肽链长度大于20个氨基酸称为多肽。近代研究表明，蛋白质吸收的主要形式不是以氨基酸而是以小肽的形式完整吸收，小肽转运系统具有速度快、耗能低和不易饱和等特点，以肽的形式吸收的氨基酸强度比以游离氨基酸混合物吸收的强度高出70%～80%，其可以直接通过小肠壁进入血液，进而影响动物体内蛋白质代谢。肽作为动物消化道蛋白质的主要酶解产物，是迅速吸收的氨基酸供体，同时释放的许多肽具有活性作用，能够调节机体的生命活动。小肽能完整地通过肠粘膜细胞进入体循环，直接参与组织蛋白质的合成。某些具有特殊生理活性的小肽能够参与机体生理活动和代谢调节，提高动物机体的免疫能力。由于小肽结构的被阐明，生物技术、化学合成和基因工程的发展，小肽的生产和工艺有了许多改进和创新。小肽与氨基酸运输体系相比，小肽转运速度快、耗能低、吸收机制本身不易饱和，且可避免氨基酸之间的吸收竞争。目前，国内外生产小肽的方法主要有化学合成法、酶解法、酸水解法和碱解法、微生物发酵法和DNA重组技术。化学合成法分为液相法和固相法。液相法不适合反应中间体溶解度较低的情况。固相法与液相法相比易于纯化，可以实现自动化，但由于成本高，极大地限制了其应用。化学合成法的局限性主要表现在肽键形成中存在消旋作用，保护和去保护操作繁琐，使用超过量的偶联剂和酰化试剂回收困难，溶剂及偶联剂的毒性会带来环保及健康方面的问题；酶解法生产小肽是以蛋白质原料为底物，运用蛋白酶的酶解内剪切作用生产小肽，肽含量和可溶物含量高，营养较好，价格低廉，与小肽酶解生产效果密切相关的因素主要包括温度、pH值、酶浓度、底物浓度、酶解时间等。在一系列的研究中。酶解的最适宜条件确定困难，即使针对相同的酶解底物，可能结果也不一致；缺点是生产周期长，“三废”多，水解度和酶解过程的重复性难以控制，特别是任何酶制剂和酶解条件都不可避免使产品带有严重苦味，影响动物采食量。酸水解法和碱解法指在仅酸或碱存在的条件下使蛋白质发生分解产生小肽的一种方法。由于碱水解时，丝氨酸和苏氨酸等大部分氨基酸被破坏，且会发生消旋作用，营养成分损失大；酸水解蛋白质不会引起氨基酸的消旋作用，水解速度快、反应完全彻底，但温度和时间对水解程度影响很大，且所得水解产物中含大量因中和反应而产生的盐。总的来说，酸水解法和碱解法多用于试验研究，而在生产实践中使用较少；微生物发酵法能较好地去除蛋白质原料中的抗营养因子，生产成本低，发展前景较好。此方法的关键是筛选出合适的菌种，分泌合适的蛋白酶，在体外将蛋白质切成长短合适的肽段。为了提高小肽的产量和品质，还应注意底物的组成、菌龄、接种量、发酵时间等因素的影响；DNA重组技术是指从动物或植物的基因组中分离出带有目的基因的DNA片段，然后将此DNA片段克隆至适当的载体，并采用特定方法将其导入受体细胞，通过细胞表达获得所需要的活性肽或将外源基因插入到噬菌体基因序列之中，使得多肽以融合蛋白形式表达在噬菌体颗粒表面，并经过加工、纯化获得所需要的小肽。DNA重组技术目前仅限于生产大分子活性多肽和蛋白质的生产，在小分子的基因片段操作困难、其表达效率较低、监测工作困难、难筛选到高效表达的菌株和产量较低，另外生产小肽的种类也受限制。
发明内容
本发明针对现有技术中蛋白水解存在的各种弊端，目的在于提供一种在温和条件下用微波辅助蛋白酸水解快速制备小肽氨基酸的方法，该方法成本低，周期短，可以工业化生产。
本发明提供了微波辅助蛋白酸水解快速制备小肽氨基酸的方法，该方法是在功率为150～800W的微波环境中，将变性蛋白原料加入到盐酸和亚硫酸混合液中，在80～120℃进行水解反应4～8h；水解反应完成后，将反应液离心过滤，纳滤膜脱酸，超滤分离，得到不同分子量的小肽氨基酸；其中，变性蛋白原料与盐酸和亚硫酸混合液的质量比为1:4～5；所述的盐酸和亚硫酸混合液由质量百分比浓度为10～25%的盐酸溶液和质量百分比浓度为5.5～6.5%的亚硫酸溶液按体积比1:1～1.5混合得到。
所述的盐酸和亚硫酸混合液由盐酸溶液和亚硫酸溶液按优选的体积比1:1～1.2混合得到。
所述的水解反应由TCA法跟踪测定水解率来确定反应时间；水解率和时间成正比，
所述的超滤分离超滤膜切割分子量为1000D，分子量低于1000D的小肽和氨基酸分离出来形成超滤液，分子量大于1000D的多肽和部分水解蛋白形成浓缩液。
所述的离心过滤是将反应液离心后趁热过双尼龙布层，再过孔径不大于0.5μm的滤膜。
所述的纳滤膜脱酸是将离心过滤后的滤液在一级纳滤膜分离系统回收盐酸，再进一步在二级纳滤膜分离系统回收盐酸，水解反应产物被膜截留。
所述的变性蛋白质原料是将新鲜蛋白原料先行进行脱脂处理，再在85～90℃下加热处理10～20min。
所述的蛋白原料包括植物蛋白原料或动物蛋白原料；优选为血粉、蚕蛹或豆粉。
本发明的微波辅助蛋白酸水解快速制备小肽氨基酸的方法，包括以下步骤：
1）采用混酸在微波辅助下水解：将纯度至少是食品级的盐酸用去离子水稀释成质量百分比浓度为10～25%的盐酸溶液，和质量百分比浓度为5.5～6.5%的亚硫酸溶液以体积比1:1～1.5混合，变性蛋白质原料与所述混酸溶液的质量比为1:4～5，在功率为150～800W的微波环境中，水解温度为80～120℃，水解时间为4～8h，用TCA法测定水解率；
2）离心过滤：水解完毕后得到的料液经离心并趁热过滤，先用耐酸板框压滤机过滤，滤膜是由两层尼龙布，再进行微滤，微滤膜的过滤孔径不大于0.5μm；
3）纳滤膜脱酸：经预处理后的滤液进入一级纳滤膜分离系统进行分离，纳滤膜分离孔径允许分子量小于100D的物质通过，小于膜分离孔径的盐酸和水在压力作用下穿透膜表面进行浓度较高盐酸的回收，一级纳滤膜分离系统出来的滤液进入到二级纳滤膜分离系统，二级透析液进行稀盐酸回收；在上述分离系统中，小肽、多肽和部分水解蛋白无法穿透膜表面的截留液，可返回到上一级装置中继续进行分离，以保证原料的充分利用；
4）膜法提纯超滤分离：上述滤液送入超滤分离系统进行分离提纯，超滤膜切割分子量为1000D，分子量低于1000D的小肽和氨基酸分离出来形成超滤液，分子量大于1000D的多肽和部分水解蛋白以浓缩液形式返回循环装置中，这样料液被分成超滤液和浓缩液。
本发明的有益效果：现有技术中的小肽的制备方法主要采用酶水解法，反应条件要求苛刻，酶易失活，反应速率低，水解效率也不高，水解产物以多肽为主，同时，任何酶制剂和酶解条件都避免不了使产品带来严重苦味，影响的产品品质，并且生产成本较高；而本发明首次采用微波辅助，在一定配比的盐酸与亚硫酸的混合酸条件下能将变性后的蛋白原料在温和条件下快速水解成小肽分子，该方法使蛋白原料的水解时间短、水解效率高，且水解液的色值低，有效减轻了后续脱色工艺的难度；得到的小肽分子含量高，品质好，大大降低了小肽分子生产的能耗和生产成本。
附图说明
【图1】为本发明的工艺流程图。
【图2】为实施例1水解反应液的HPLC色谱图：1-His，2-Ser-His，3-Gly-His,，4-His–Pro，5-Ala-Trp，6-Gly-Leu-Tyr。
具体实施方式
以下实施例旨在进一步说明本发明，而不是限制本发明的保护范围。
原料要求：蛋白质原料为新鲜、干燥、无霉变、无杂质；可以是植物蛋白和动物蛋白，包括血粉、蚕蛹、豆粉等，先行进行脱脂处理，后将蛋白粉溶液在85～90℃温度下加热处理10～20min，可使蛋白质适度变性，使其致密的立体结构变得松散；盐酸和亚硫酸为化学纯或分析纯；水为去离子水。
用TCA法测定水解率：
产品检测：HPLC法测定小肽和氨基酸的含量：色谱柱为MicrosorbODS柱(4.6×250mm，5μm)；检测波长为210nm；流动相为乙腈-水(含0.5％甲酸)溶液(体积比约为33:67)；流速0.8mL/min，测定小肽氨基酸的含量。
产品的回收率的测定：准确量取水解液总体积（V0），取体积V1水解液于烘干至恒重的培养皿中（记下皿重），加热干燥至恒重，称量培养皿与干物质的总质量，计算回收率。
平均肽链长度的测定：测定平均肽链长度需要测定α-氨基酸(α-NH2-N)的含量和总氮(TN)含量。用甲醛双电位滴定法测定α-NH2-N含量，总氮用凯式定氮法测定。然后计算平均肽链长度，公式如下：
实施例1
(1)水解：将新鲜干燥、无霉变、无杂质的脱脂后大豆蛋白粉溶液在90℃温度下加热处理10min，可使蛋白质适度变性，使其致密的立体结构变得松散；加入质量百分比浓度为20%的盐酸和质量百分比浓度为5.5%亚硫酸溶液按体积比1:1混合，变性蛋白质原料与所述混酸溶液的质量比为1:4，水解温度90℃，功率为600W的微波辅助水解时间4h。
(2)过滤：蛋白粉微波辅助酸水解完毕后，离心并趁热过滤。先用耐酸板框压滤机粗滤，过双层尼龙布，滤液再通过微滤压缩机微滤，过0.5μm微滤膜，微滤后的料液用输料泵输入料液桶，滤渣用KOH溶液中和后作有机肥。
(3)脱酸：经预处理后的料液进入一级纳滤膜分离系统进行分离，纳滤膜分离孔径允许分子量小于100D的物质通过，小于膜分离孔径的盐酸和水在压力作用下穿透膜表面进行盐酸回收，一级纳滤膜分离系统出来的滤液进入到二级纳滤膜分离系统，二级透析液进行稀盐酸回收；在上述分离过程中，小肽、多肽和部分水解蛋白无法穿透膜表面的截留液，以1:1(V/V)65℃的水冲洗2次，以保证物料充分利用；
(4)分离提纯：滤液加去离子水稀释后，进入膜法提纯超滤系统进行分离提纯。分子量低于1000D的小肽氨基酸在压力下通过中空纤维柱壁孔径形成超滤液，余下浓缩液制作多肽蛋白饲料。
(5)HPLC检测：色谱柱为MicrosorbODS柱(4.6×250mm，5μm)；检测波长为210nm；流动相为乙腈-水(含0.5％甲酸)溶液(体积比约为33：67)；流速0.6mL/min，测定小肽氨基酸的含量如图2所示。
大豆肽的平均肽链长度PCL为4.50，平均分子量为497.83Da，产品的回收率约为70%左右。
(6)喷雾干燥：经分离提纯的小肽溶液由超高温瞬时杀菌装置迅速加热至135℃，进行48S强力热杀菌处理，再用双效降膜浓缩蒸发器进行双鼓真空浓缩，浓缩后经压力喷雾干燥塔进行喷雾干燥，设定设备进口热风温度和出口热风温度，最后制成小肽精粉。
实施例2
(1)水解：将新鲜干燥、无霉变、无杂质的脱脂后油茶籽蛋白粉溶液在90℃温度下加热处理20min，可使蛋白质适度变性，使其致密的立体结构变得松散；加入质量百分比浓度为25%的盐酸和质量百分比浓度为6%亚硫酸溶液按体积比为1：1混合，变性蛋白质原料与所述混酸溶液的质量比为1:5，水解温度100℃，功率为300W的微波辅助水解时间6h，每半小时抽样一次，用TCA法进行中间检测，并作好记录；
(2)过滤：蛋白粉微波辅助酸水解完毕后，离心并趁热过滤。先用耐酸板框压滤机粗滤，过双层尼龙布，滤液再通过微滤压缩机微滤，过0.5μm微滤膜，微滤后的料液用输料泵输入料液桶，滤渣用KOH溶液中和后作有机肥。
(3)脱酸：经预处理后的料液进入一级纳滤膜分离系统进行分离，纳滤膜分离孔径允许分子量小于100D的物质通过，小于膜分离孔径的盐酸和水在压力作用下穿透膜表面进行盐酸回收，一级纳滤膜分离系统出来的滤液进入到二级纳滤膜分离系统，二级透析液进行稀盐酸回收；在上述分离过程中，小肽、多肽和部分水解蛋白无法穿透膜表面的截留液，以1:1(V/V)70℃的水冲洗2次，以保证物料充分利用；
(4)分离提纯：滤液加去离子水稀释后，进入膜法提纯超滤系统进行分离提纯。分子量低于1000D的小肽氨基酸在压力下通过中空纤维柱壁孔径形成超滤液，余下浓缩液制作多肽蛋白饲料。
(5)HPLC检测：色谱柱为MicrosorbODS柱(4.6×250mm，5μm)；检测波长为210nm；流动相为乙腈-水(含0.5％甲酸)溶液(体积比约为33：67)；流速0.6mL/min，测定小肽氨基酸的含量，结果如下：His含量约为0.83%，Ser-His含量约为1.57%，Gly-His含量约为2.04%，His-Glu含量约为6.25%，Glu-Leu含量约为3.26%，Glu-Arg-Asp含量约为4.23%。
油茶小肽的平均肽链长度PCL为7.95，平均分子量为907.6Da，产品的回收率约为68%左右。
(6)喷雾干燥：经分离提纯的小肽溶液由超高温瞬时杀菌装置迅速加热至135℃，进行48S强力热杀菌处理，再用双效降膜浓缩蒸发器进行双鼓真空浓缩，浓缩后经压力喷雾干燥塔进行喷雾干燥，设定设备进口热风温度和出口热风温度，最后制成小肽精粉。
Claims (8)
1.微波辅助蛋白酸水解快速制备小肽氨基酸的方法，其特征在于，在功率为150～800W的微波环境中，将变性蛋白原料加入到盐酸和亚硫酸混合液中，在80～120℃进行水解反应4～8h；水解反应完成后，将反应液离心过滤，纳滤膜脱酸，超滤分离，得到不同分子量的小肽氨基酸；其中，变性蛋白原料与盐酸和亚硫酸混合液的质量比为1:4～5；所述的盐酸和亚硫酸混合液由质量百分比浓度为10～25%的盐酸溶液和质量百分比浓度为5.5～6.5%的亚硫酸溶液按体积比1:1～1.5混合得到。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的盐酸和亚硫酸混合液由盐酸溶液和亚硫酸溶液按体积比1:1～1.2混合得到。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的水解反应由TCA法跟踪测定水解率来确定反应时间。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的超滤分离超滤膜切割分子量为1000D，分子量低于1000D的小肽和氨基酸分离出来形成超滤液，分子量大于1000D的多肽和部分水解蛋白形成浓缩液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的离心过滤是将反应液离心后趁热过双尼龙布层，再过孔径不大于0.5μm的滤膜。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的纳滤膜脱酸是将离心过滤后的滤液在一级纳滤膜分离系统回收盐酸，再进一步在二级纳滤膜分离系统回收盐酸，水解反应产物被膜截留。
7.如权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，所述的变性蛋白质原料是将新鲜蛋白原料先行进行脱脂处理，再在85～90℃下加热处理10～20min。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的蛋白原料包括植物蛋白原料或动物蛋白原料。
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