CN104480171A - 一种从猫豆渣中提取多肽的方法 - Google Patents

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梁尚文
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Abstract

本发明公开一种从猫豆渣中提取多肽的方法，其步骤包括原料预处理、微波辅助萃取蛋白质、沉析蛋白质、稀解分离蛋白、酶解、灭活、沉析除杂、蒸发浓缩、微波干燥和粉碎均质。本方法具有效率高，收益好，节约资源的优点，本方法为猫豆资源的综合利用提供了新的途径。

Description

一种从猫豆渣中提取多肽的方法
技术领域
本发明属于农产品加工技术领域，特别是涉及一种从猫豆渣中提取多肽的方法。
背景技术
猫豆又叫狗爪豆、白藜豆、龙爪豆等，是豆科藜豆属草质藤本一年生植物，广泛分布于亚热带地区，在我国的海南、广东、广西等省及贵州和云南的南部地区广有分布，产量最多的是广西。猫豆有野生、半野生和人工栽植，在基岩为石灰岩山区多有半野生猫豆，即于春天播种岩石裂隙或风化岩边，不施肥、不搭架让枝蔓攀爬在岩石上，待到秋末冬初豆荚成熟后采收。
猫豆营养丰富，由于不同地区、不同栽培方法，其营养成分也略有差异。粗蛋白含量为22-27％，粗脂肪含量为3-6％，粗纤维含量为10-15％，无氮浸出物含量为41-52％，所含氨基酸种类比较齐全，游离氨基酸有17种，水解氨基酸有18种，其中以谷氨酸和天冬氨酸最高，其次是亮氨酸、赖氨酸，最低是色氨酸和蛋氨酸，药用成分左旋多巴的含量3-7％。据研究报道，野生或半野生猫豆中左旋多巴含量比栽培的高2-3％，猫豆豆仁外皮呈紫花色或黑色的左旋多巴含量比白色的高2-3％，特别是豆仁外皮呈黑色，内部呈淡黑色的猫豆中左旋多巴含量高达7.3％。
左旋多巴的分子式为：C9H11NO4，相对分子量为197.19，其结构式为：
左旋多巴易溶于水、稀盐酸和甲酸，微溶于醇，不溶于醚、苯、氯仿和醋酸乙酯，在水中(室温下)的溶解度为1.5mg/mL。左旋多巴为体内合成去甲肾上腺素、多巴胺等的前体物质之一，可提高脑组织中多巴胺水平，是生物体内一种重要的生物活性物质，是从L-酪氨酸到儿茶酚胺货黑色素的生化代谢途径过程中的重要中间产物。左旋多巴制剂、临床用于治疗帕金森病和帕金森氏综合症、震颤性麻痹、急性肝功能衰竭所致的肝昏迷、精神病、溃疡病、心力衰竭、腿多动综合症、脱毛症、调节性功能、抗衰老和锰、钴、一氧化碳中毒等。左旋多巴可以人工合成，但人工合成的左旋多巴是D型和L型的混合物，两者难以分离，应用有副作用。而从猫豆提取的天然左旋多巴是L型的，没有副作用。
目前，以猫豆为原料生产左旋多巴的企业，通常只有左旋多巴和饲料两个产品。生产左旋多巴之后的废渣仅作饲料利用，未能挖掘其综合利用的潜力，当以废渣为原料制备猫豆多肽时，还产出猫豆分离蛋白，让企业增加两个市场紧缺的产品，从而提高企业的经济效益。据研究报道，提取左旋多巴后的猫豆废渣，其粗蛋白的含量与原豆相比没有降低反而升高0.3-0.7％，因此，利用猫豆渣来提取多肽既可以充分利用猫豆资源，又提高猫豆的经济附加值。
发明内容
本发明的目的是提供从猫豆渣中提取多肽的方法，要解决的问题是充分利用提取左旋多巴后的猫豆渣资源来提取多肽，提高猫豆资源的附加值。本发明所提供的技术方案是：
一种从猫豆渣中提取多肽的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)原料预处理：将猫豆渣与水按照固液比1:20加入容器，浸泡4h后取出，脱水，再取少量猫豆渣与0.2mol/L HCL水溶液按照质量比1:4加入到容器中，加热至温度达到50℃，保温10min，检测溶液中无左旋多巴后，方可进入下一步骤；
(2)微波辅助萃取蛋白质：将脱去左旋多巴的猫豆渣按固液比1:10加入软水，调pH＝8.5，将其投入有搅拌装置和冷却水循环、微波频率为2450MHz，功率为20kw的立式微波罐中，控制料液温度55-60℃，微波萃取反应30min，保温20min，然后用离心机两次过滤脱溶，两次过滤的滤布的细度分别为20和200目，将所得滤渣合并；
(3)沉析蛋白质：将1.5％壳聚糖醋酸溶液缓慢加入步骤(2)所得滤渣中并不断搅拌，当溶液pH＝5时停止搅拌，静置4h，分层，取下层沉淀离心、过滤，所得滤渣即为分离蛋白；
(4)稀解分离蛋白：加入软水使底物质浓度达7％，搅拌，使分离蛋白溶解，然后调pH＝8.5；
(5)酶解I：把稀解分离蛋白溶液投入立式微波罐中，添加碱性蛋白酶占底物质量的2.5％，微波反应20min，控制料液温度<60℃，微波反应结束后，55-60℃保温20min，在微波反应20min中，前15min每隔5min测pH值1次：第一次若测得pH<8时，则调pH值＝8.2-8.3；第二次若测得pH值<7.5时，则调pH值＝7.8-8.0；第三次若测得pH值<7.5时，则调料液的pH值＝7.5；
(6)酶解Ⅱ：当酶解Ⅰ结束后，控制料液pH值＝7.5，添加木瓜蛋白酶占底物质量的2.5％，控制料液温度<55℃，微波反应20min，保温20min，微波反应的前15min每隔5min测定1次pH值：第一次若测得pH值<7.0时，则调pH值＝7.2-7.3；第二次若测得pH值<6.8时，则调pH值＝7.0；第三次若测得pH值<6.8时，则调pH值＝7.0；
(7)灭活：待步骤(6)结束后，关闭微波罐的冷却循环，开启升温，使料液温度达到80-90℃，保温10min；
(8)沉析除杂：将酶解液排出，待温度冷却至40℃以下时，加入壳聚糖酸溶液，调节酶解液pH＝5，静置3-4h、分层、过滤下层浓液、将其干燥，温度≤70℃，上清液和滤液为多肽液；
(9)蒸发浓缩：将多肽液投入真空浓缩器中，减压浓缩使其浓度>60％；
(10)微波干燥：将步骤(9)中所得多肽浓浆投入微波干燥器中，控制温度<65℃，得多肽干粉；
(11)粉碎均质：将步骤(10)中所得多肽干粉粉碎、混合均匀，即得多肽成品。
其中，步骤(1)中检测溶液中无左旋多巴的方法为，取溶液加入10％三氯化铁试液检验，若溶液不显示蓝色表示无左旋多巴。
其中，步骤(3)中壳聚糖的脱乙酰度≥87％。
其中，步骤(3)中1.5％壳聚糖醋酸溶液，是将壳聚糖溶解于10％醋酸溶液中所得。
其中，步骤(3)中过滤，使用的滤布细度为300目。
其中，步骤(5)中碱性蛋白酶的酶活力为20万u/g。
其中，步骤(6)中木瓜蛋白酶的酶活力为20万u/g。
其中，步骤(8)中过滤所用滤布细度为10μm。
其中，步骤(8)中真空浓缩器的工作参数为：压强≤0.08MPa，温度为50-60℃。
其中，步骤(11)中多肽干粉粉碎后的细度<80目。
附图说明
附图1为从猫豆渣中提取多肽的生产工艺流程图。
本发明的有益效果
1、本发明充分利用了资源，相比以猫豆为原料生产左旋多巴的企业，利用猫豆渣制备猫豆多肽同时产出猫豆分离蛋白，可增加企业总产值一倍多。
2、本发明提高了生产效率，采用微波辅助萃取蛋白质和酶解、壳聚糖沉析蛋白质的新工艺与常规方法萃取蛋白质和酶解以及用酸沉析蛋白质的工艺，从投料到生产出多肽液全过程所需时间相比，新工艺所需的时间只占常规工艺所需的37％。
具体实施方式
参考下列实施例将更容易理解本发明，给出的实施例不是限制本发明的范围。
实施例1：
根据原料含左旋多巴量计算用水量，以每毫升水可溶出1.5毫克左旋多巴为基准，浸泡4小时后取出少量原料用4倍于原料的0.2mol/L HCL溶液并加热至50℃，保温10min，取溶液用10％三氯化铁试液检验，不显示蓝色表示左旋多巴基本脱除，显蓝色则再按上述浸泡操作，直至未检出蓝色为止。然后用120目滤布于离心机脱去溶液。若原料含左旋多巴低于1‰，可不进行脱左旋多巴工序，直接进入碱提工序。
将脱去残留左旋多巴的渣，按固液比1:10加入软水，用NaOH水溶液调ph＝8.5，投入有搅拌装置和冷却水循环、微波频率为2450MHZ，功率为0-20kw的立式微波罐中，控制料液温度55-60℃，微波萃取反应30min，保温20min，然后用离心机两次脱溶，第一次20目滤布出去较粗颗粒，第二次用200目滤布，两次滤渣合并，脱水或不脱水干燥作饲料。
滤液用10％醋酸溶液溶解脱乙酰度87％以上的壳聚糖，使酸液含壳聚糖1.5％，缓慢加入并搅拌，当溶液ph值＝5时可停止搅拌，静置4小时，溶液分层，上层为清液占大部分，下层为蛋白质沉淀。将上清液用虹吸移出，然后用300目滤布离心过滤沉淀。先将上清液虹吸移出再离心过滤可缩短工序时间。所得滤渣即为分离蛋白，上清液和滤液含少量乳清蛋白，可返回用于配碱液，如此循环数次后乳清蛋白浓度提高，此时再用壳聚糖作沉淀剂，能将大部分乳清蛋白收回。
过滤所得分离蛋白，由于凝集成凝胶状，酶解时会阻碍反应，必须将其碎解，用少量软水加到分离蛋白中，用碎解机或胶体磨将凝胶体打散均匀，然后再添用软水调ph＝8.5，使溶液中底物浓度为7％。
把碎解并调ph＝8.5的溶液投入立式微波罐中，添加按底物量2.5％溶解好碱性蛋白酶(20万u/g)，微波反应20min，控制料液温度<60℃。微波反应结束后，55-60℃保温20min，微波反应中、前15min，每隔5min测ph值1次。第一个5min测得PH值<8时，可适量补碱，使料液ph值达到8.2-8.3；第二个5min测得PH值<7.5时，补碱，使料液PH值达到7.8-8.0；第三个5min测得PH值<7.5时，补碱，使料液PH值达到7.5。
酶解Ⅰ结束后，测定料液的PH值若高于7.5时，用HCL溶液回调，使料液PH值下降至7.5。添加底物量2.5％的木瓜蛋白酶(20万u/g)，控制料液温度<55℃，微波反应20min，保温20min，微波反应的前15min每隔5min测定1次PH值。第一个5min测得PH值<7.0时，补碱，使料液ph值达到7.2-7.3；第二个5min测得PH值<6.8时，补碱，使料液PH值达到7.0；第三个5min测得PH值<6.8时，补碱，使料液PH值达到7.0。
酶解Ⅱ结束后，微波罐停止冷却循环，启动微波升温，使料液温度达到80-90℃，保温10min，灭酶活。
灭酶活后，将酶解液排出，待冷却至40℃以下时，加入壳聚糖酸溶液，使酶解液PH值达到5，沉析未酶解的蛋白质和大分子杂质。静置溶液3-4小时，溶液分层后虹吸上清液，用10μm滤布离心过滤下层浓液。滤渣为分离蛋白，送微波干燥，温度控制在70℃以内，上清液和滤液为多肽液，此时的多肽液PH值低于6，当直接使用时，可按配兑产品的要求进行回调至要求的PH值。
把多肽液投入真空浓缩器中，在≤0.08MPa，50-60℃条件下，减压浓缩至浓度>60％。
把减压蒸发得到的多肽浓浆投入微波干燥器中，控制温度<65℃,得多肽干粉。
把微波干燥得的干粉，再粉碎至细度<80目，然后混合均匀，即得多肽成品。
实施例2：以年处理1000吨猫豆为例，计算并比较其年产值。
利用猫豆只生产左旋多巴和饲料的年总产值：左旋多巴平均回收率设定为3％，年产左旋多巴30吨，得含水率50％的湿渣1900吨，左旋多巴的价格为50万元/吨，湿饲料价格以400元/吨计，年总产值为：30吨×50万元/吨+1900吨×400元/吨＝1576万元。
利用猫豆渣提取猫豆多肽时的年总产值：得猫豆多肽粉103.04吨，猫豆分离蛋白112.67吨，湿饲料1468吨。多肽粉参照大豆多肽粉出厂价75％计，分离蛋白粉参照大豆分离蛋白粉出厂价60％计，湿饲料按每吨300元计，年总产值为103.04吨×17万/吨+112.67吨×1.2万/吨+1468吨×300元/吨＝1751.68万元+135.216万元+44.04万元＝1930.936万元。
利用猫豆生产多巴和多肽时年总产值为1930.936万+1576万＝3506.936万元，比只生产多巴和饲料时产值增加3506.936万-1576万＝1930.936万元。
表1 不同方案处理猫豆的年产值
注：方案1为利用猫豆只生产左旋多巴和饲料；方案2为利用猫豆渣提取猫豆多肽。
假设方案1的总产值为100％，则方案2的总产值相比方案1提高了1930.936万/1576万＝1.2252×100％＝122.52％。
实施例3：
表2 本发明提取多肽的新工艺与常规工艺耗时对照表(处理量为50kg原料)
注：表中所计耗时包括上下工序衔接耗时。
由表2可知，本发明采用微波辅助萃取蛋白质和酶解，蛋白质用壳聚糖沉析的新工艺与常规方法萃取蛋白质和酶解以及用酸沉析蛋白质的工艺，从投料到生产出多肽液全过程所需时间相比，新工艺所需的时间只要常规工艺所需的37％。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种从猫豆渣中提取多肽的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)原料预处理：将猫豆渣与水按照固液比1:20加入容器，浸泡4h后取出，脱水，再取少量猫豆渣与0.2mol/L HCL水溶液按照质量比1:4加入到容器中，加热至温度达到50℃，保温10min，检测溶液中无左旋多巴后，方可进入下一步骤；
(2)微波辅助萃取蛋白质：将脱去左旋多巴的猫豆渣按固液比1:10加入软水，调pH＝8.5，将其投入有搅拌装置和冷却水循环、微波频率为2450MHz，功率为20kw的立式微波罐中，控制料液温度55-60℃，微波萃取反应30min，保温20min，然后用离心机两次过滤脱溶，两次过滤的滤布的细度分别为20和200目，将所得滤渣合并；
(3)沉析蛋白质：将1.5％壳聚糖醋酸溶液缓慢加入步骤(2)所得滤渣中并不断搅拌，当溶液pH＝5时停止搅拌，静置4h，分层，取下层沉淀离心、过滤，所得滤渣即为分离蛋白；
(4)稀解分离蛋白：加入软水使底物质浓度达7％，搅拌，使分离蛋白溶解，然后调pH＝8.5；
(5)酶解I：把稀解分离蛋白溶液投入立式微波罐中，添加碱性蛋白酶占底物质量的2.5％，微波反应20min，控制料液温度<60℃，微波反应结束后，55-60℃保温20min，在微波反应20min中，前15min每隔5min测pH值1次：第1次若测得pH<8时，则调pH值＝8.2-8.3；第2次若测得pH值<7.5时，则调pH值＝7.8-8.0；第3次若测得pH值<7.5时，则调pH值＝7.5；
(6)酶解Ⅱ：当酶解Ⅰ结束后，控制料液pH值＝7.5，添加木瓜蛋白酶占底物质量的2.5％，控制料液温度<55℃，微波反应20min，保温20min，微波反应的前15min每隔5min测定1次pH值：第1次若测得pH值<7.0时，则调pH值＝7.2-7.3；第2次若测得pH值<6.8时，则调pH值＝7.0；第3次若测得pH值<6.8时，则调pH值＝7.0；
(7)灭活：待步骤(6)结束后，关闭微波罐的冷却循环，开启升温，使料液温度达到80-90℃，保温10min；
(8)沉析除杂：将酶解液排出，待温度冷却至40℃以下时，加入壳聚糖酸溶液，调节酶解液pH＝5，静置3-4h、分层、过滤下层浓液、将其干燥，温度≤70℃，上清液和滤液为多肽液；
(9)蒸发浓缩：将多肽液投入真空浓缩器中，减压浓缩使其浓度>60％；
(10)微波干燥：将步骤(9)中所得多肽浓浆投入微波干燥器中，控制温度<65℃，得多肽干粉；
(11)粉碎均质：将步骤(10)中所得多肽干粉粉碎、混合均匀，即得多肽成品。
2.如权利要求1所述的从猫豆渣中提取多肽的方法，其特征在于，步骤(1)中检测溶液中无左旋多巴的方法为，取溶液加入10％三氯化铁试液检验，若溶液不显示蓝色表示无左旋多巴。
3.如权利要求1所述的从猫豆渣中提取多肽的方法，其特征在于，步骤(3)中壳聚糖的脱乙酰度≥87％。
4.如权利要求1所述的从猫豆渣中提取多肽的方法，其特征在于，步骤(3)中1.5％壳聚糖醋酸溶液，是将壳聚糖溶解于10％醋酸溶液中所得。
5.如权利要求1所述的从猫豆渣中提取多肽的方法，其特征在于，步骤(3)中过滤，使用的滤布细度为300目。
6.如权利要求1所述的从猫豆渣中提取多肽的方法，其特征在于，步骤(5)中碱性蛋白酶的酶活力为20万u/g。
7.如权利要求1所述的从猫豆渣中提取多肽的方法，其特征在于，步骤(6)中木瓜蛋白酶的酶活力为20万u/g。
8.如权利要求1所述的从猫豆渣中提取多肽的方法，其特征在于，步骤(8)中过滤所用滤布细度为10μm。
9.如权利要求1所述的从猫豆渣中提取多肽的方法，其特征在于，步骤(8)中真空浓缩器的工作参数为：压强≤0.08MPa，温度为50-60℃。
10.如权利要求1所述的从猫豆渣中提取多肽的方法，其特征在于，步骤(11)中多肽干粉粉碎后的细度<80目。
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