CN104311640A

CN104311640A - 一种免疫修复15肽、其制备方法及其应用

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Publication number: CN104311640A
Application number: CN201410568457.2A
Authority: CN
Inventors: 曹珉; 杨赛; 陈五岭; 张英起; 王越
Original assignee: SHANGHAI MIYANG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI MIYANG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2014-11-27
Filing date: 2014-11-27
Publication date: 2015-01-28
Anticipated expiration: 2034-11-27
Also published as: CN104311640B

Abstract

本发明涉及一种免疫修复15肽、其制备方法及其应用。本发明提供的免疫修复15肽，具有免疫调节活性和机体保护作用。本发明提供的化学合成法简便易行，能够满足药学、临床前和临床研究的需要。同时满足了大规模工业化生产的需要。

Description

一种免疫修复15肽、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种免疫修复15肽、其制备方法及其应用。具体而言，本发明提供了具有免疫调节活性和/或机体保护作用的免疫修复15肽、其制备方法及其在制备药物或保健品中的应用。

背景技术

现代营养学研究发现，人类摄食蛋白质经消化道的酶作用后，大多以低肽形式被吸收，以游离氨基酸形式吸收的比例很小。进一步的试验证实了肽比游离氨基酸消化更快、吸收更多，表明肽的生物效价和营养价值比游离氨基酸更高。目前已经确认在多肽中以大豆多肽的吸收率最高。

大豆多肽于70年代在美国研究出，之后Deltowm Species公司建成了年产5000T的食用蛋白肽工厂，日本也于80年代开始将大豆多肽应用于食品工业。如今，仅日本运动员食用的大豆多肽食品年销售额就高达30亿日元，且仍呈上升趋势，我国近年才开始大豆多肽应用的研究，并取得了一定进展。

大豆多肽是营养价值很高的植物高级蛋白质，有极佳的生理功能和加工特性，是一种非常有前途的功能性食品原料。大豆多肽的氨基酸组成几乎与大豆蛋白质完全一样。必需氨基酸平衡良好，含量也丰富。但是，目前生产的大豆多肽多为混合物，活性成分不明，不利于大豆多肽的进一步研究和开发。

另外，目前大豆多肽的生产主要是以大豆或豆粕作为原料，利用化学方法或酶法将大豆蛋白质水解而成。化学方法是采用酸水解，但氨基酸会受到损害降低其营养价值，已很少采用。酶水解法能很好的保有氨基酸的营养价值，工艺成熟，已被广泛采用。

但是，酶法生产大豆多肽尚存在以下问题：大豆中的脂肪氧化酶氧化大豆不饱和脂肪酸后可生成多种低分子醇、醛和酮等挥发性成份，从而产生令人难以接受的豆腥味；大豆蛋白质被酶解成肽后，往往产生不同程度的苦涩味，苦味成分主要是亮氨酸、蛋氨酸等疏水性氨基酸及其衍生物和低分子苦味肽。这些疏水氨基酸，平常被掩蔽在蛋白质中，在酶解过程中，蛋白质被水解而使这类氨基酸暴露出来，并随水解程度而苦味加重。

鉴于此，本发明鉴别出一种有免疫调节活性和机体保护作用的多肽(下文中称为免疫修复15肽)，并摒弃了传统的酶法生产，采用化学合成法，具体而言Fmoc-固相多肽合成法来合成该免疫修复15肽，并进一步对传统的仅适用于实验室生产的Fmoc-固相多肽合成法进行了改进，从而提供了一种可用于大规模工业化生产的制备方法。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种免疫修复15肽，所述肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的另一目的在于提供上述免疫修复15肽的制备方法，所述方法包括根据Fmoc-固相多肽合成法合成粗品多肽，优选的是，所述方法还包括使用反相高效液相色谱对所述粗品多肽进行纯化。

优选的是，所述Fmoc-固相多肽合成法中，以Rink-Amide-MBHA树脂为固相载体，HOBt(1-羟基-苯并-三氮唑)/TBTU(苯并三唑四甲基四氟硼酸)/DIEA(N,N'-二异丙基乙胺))为催化剂，二甲基甲酰胺DMF为溶剂和清洗剂，三氟乙酸TFA/H₂O为切割剂，进行所述粗品多肽的合成，其中所述TFA/H₂O中TFA与H₂O的体积比优选为95:5。

在所述Fmoc-固相多肽合成法中使用Fmoc-Asp(Otbu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH和Fmoc-Glu(Otbu)-OH作为合成氨基酸来分别将Asp、Lys和Glu偶联到肽链上。

具体而言，所述Fmoc-固相多肽合成的步骤包括：

a.用二甲基甲酰胺DMF浸泡所述Rink-Amide-MBHA树脂以将其活化；

b.根据Fmoc-固相多肽合成法，以Rink-Amide-MBHA树脂为固相载体，用哌啶脱去树脂上的Fmoc-基团，使树脂上的氨基游离出来，恢复反应活性；

c.可选地对树脂进行茚三酮显色检测，以鉴别Fmoc-基团是否脱除

d.洗涤后用以HOBT\TBTU\DIEA为催化剂，DMF为溶剂及清洗剂，连接第一个氨基酸；

e 用哌啶脱去Fmoc-基团，使第一个氨基酸的氨基游离出来，恢复反应活性；

f.可选地对树脂进行茚三酮显色检测，以鉴别Fmoc-基团是否脱除以及氨基酸的连接是否完全；

g.洗涤后用以HOBT\TBTU\DIEA为催化剂，DMF为溶剂及清洗剂，连接第二个氨基酸；

h.以同样方法连接其他的氨基酸；可选的是连接完每个氨基酸后都进行茚三酮显色检测，并且结果呈阴性时才可进行下步反应；

i.连接完所有氨基酸后洗涤；

j.对免疫修复15肽进行乙酰化修饰；

k.用切割试剂将肽从树脂上切割下来；

l.将切下的肽再在冷乙醚中沉淀、洗涤、离心；

m.冻干机中冻干获得粗品。

其中，所述反相高效液相色谱条件为：

以水-乙腈为二元梯度洗脱流动相，流动相A为0.1体积％三氟乙酸的水溶液，流动相B为0.1体积％三氟乙酸的乙腈溶液，色谱柱为C18反相色谱柱，50*250mm，紫外检测波长215nm，流速10ml/min，进样量20ml；

线性洗脱梯度及柱处理：

B:5％-55％ 60分钟(制备纯化)

B:55％-90％ 10分钟(柱冲洗)

B:90％ 10分钟(柱冲洗)

B:5％ 10分钟(柱平衡)。

本发明的制备方法获得的粗品多肽的纯度为85％以上，优选87％以上。经过所述反相高效液相色谱纯化后的产品的纯度为98％以上。

本发明的又一目的在于提供上述免疫修复15肽在制备具有免疫调节活性和/或机体保护作用的药物或保健品、特别是运动营养保健品中的应用。

本发明提供的免疫修复15肽，具有免疫调节活性和机体保护作用。对各种条件引起的消化道粘膜、肝脏和胰腺损伤具有明显的保护作用；可促创伤伤口的愈合；促进骨折愈合；同时具有抑制炎性反应等作用。免疫修复15肽具有良好的稳定性，抗胃酶消化、抗酸，注射和口服具有同样的效果；对胃酸和胃酶分泌无抑制作用；在极低剂量(10μg和10ng/kg)、单次用药就具有明显的保护作用。其毒性剂量明显高于有效剂量，具有广泛的药理作用和高度的安全范围，同时具有优良的药代动力学特性。

此外，本发明提供的化学合成法独具优势。该工艺简便易行，能够满足药学、临床前和临床研究的需要。同时满足了大规模工业化生产的需要。

附图说明

图1：聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂载带多肽图。

图2：Boc-和Fmoc-结构图

图3：小试粗品液相图

图4：小试粗品质谱图

图5：小试主峰质谱图

图6：小试纯品液相图

图7：优化切割粗品液相图

图8：优化切割主峰质谱图

图9：HPLC分析免疫修复15肽保留时间(t_R)图

图10：HPLC分析免疫修复15肽提高分离效果图

图11：HPLC分析免疫修复15肽优化程序图

图12：合成工艺流程图

图13：纯化工艺流程图

图14：Fmoc-Val-OH中Fmoc脱除原理

图15：茚三酮氧化性向还原性转化方程式

图16：茚三酮显色原理方程式

图17：免疫修复15肽合成工艺线路

图18：实验室小试免疫修复15肽制备工艺流程

具体实施方式

以下通过实施例更为详细地说明本发明，但这并不意味着本发明的保护范围受这些实施例限制。

实施例1

该实施例为说明免疫修复15肽的制备方法的实施例。在建立了免疫修复15肽实验室固相化学合成工艺的基础上，优化并建立了中试规模的合成和制备工艺。

第一部分免疫修复15肽合成工艺的实验室研究

一、合成工艺整体思路和合成原理

1.合成工艺整体思路

结合免疫修复15肽的特点及一般肽合成的原则，设计了免疫修复15肽合成工艺线路，如图17所示：

2.合成工艺选择依据

多肽固相方法以快速简便的操作和高产率显示了无可比拟的优越性。其基本原理是按照要求序列顺序将氨基酸的C末端固定在不溶性聚合物载体上，然后依次缩合氨基酸，延长肽链的过程。在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的。完成合成后，将肽链从固相载体上切割，进行纯化等后处理过程，即可获得多肽目标产品。常用的多肽合成方法包括Boc法(叔丁氧羰基)和Fmoc固相法(9-芴甲氧羰基)。

2.1 合成用树脂的选择依据

固相多肽合成的高分子载体多采用聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂，它能起到支撑和载带多肽的作用(图1)。但它并不能直接连上(第一个)氨基酸，必须要在苯环上导入反应基团(接头)。由于苯环对位上碳原子相对活跃，可进行多种反应，从而可连接上各类活性集团(Linker)。可与多肽的第一个氨基酸的羧基相连接使其锚定在载体上，启动肽链在载体上的延伸。使用不同的Linker，可以用来合成肽氨、肽酸、肽醇、肽酯等不同多肽。

免疫修复15肽为羧酸型多肽，其碳末端要进行酰胺化修饰，故应采用Rink-Amide-MBHA树脂，Rink-Amide-MBHA树脂和第一个氨基酸的羧基形成的结构对酸不稳定，可以用三氟乙酸将其重新打断，在合成完成时可用三氟乙酸将肽链从树脂上切割下来，达到肽链和树脂的分离。

2.2 氨基酸连接工艺的选择依据

在多肽合成时，首先将氨基酸的α-氨基用适当的基团进行保护，以封闭其活性，使羧基处于游离状态，第一个氨基酸的羧基与树脂的Linker连接，以锚定肽链，脱去α-氨基的保护基团，使氨基酸重新游离出来，以后形成肽键的反应只能在前一个氨基酸的氨基和后一个氨基酸的羧基之间进行。每次偶联—脱保护可使肽链延伸一个氨基酸，不断重复偶联—脱保护过程，即可完成一个多肽的合成。三功能团氨基酸的侧链也要进行保护，以免副反应的发生。

固相多肽合成中的氨基酸保护策略分Boc-和Fmoc-两种(图2)

Boc合成法是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用HF(氢氟酸)可脱除的苄醇类。合成时将一个Boc-氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过Dcc(二环己基碳二亚胺)活化、偶联下一个氨基酸，最终采用HF或TFMSA(三氟甲磺酸)将多肽从树脂上切割下来。

Fmoc合成法采用了碱可脱除的Fmoc为α-氨基的保护基，侧链的保护采用TFA 可脱除的叔丁氧基等，合成时将一个Fmoc-氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用哌啶脱除Fmoc，然后通过HOBt(1-羟基-苯并-三氮唑)/TBTU(苯并三唑四甲基四氟硼酸)/DIEA(N,N'-二异丙基乙胺)/催化、偶联下一个氨基酸，最终采用TFA将多肽从树脂上切割下来，避免了强酸处理所起侧链的一些副反应，故近年来各种多肽的合成大多数采用Fmoc-法。

我们采用Fmoc法合成免疫修复15肽的固相，所选氨基酸的α-氨基均采用对弱酸敏感的Fmoc-基团保护，用弱碱性物质—哌啶脱保护，侧链活性基团用对弱酸敏感的(Trt、tBu、Boc、OtBu、Pbf)基团保护，其特点是再合成过程中，肽链只经受弱碱处理，而侧链保护基团一直处于稳定状态，在合成结束时用TFA一次将侧链保护基团和第一个氨基酸与树脂之间的连接键打断。

二、Fmoc-法固相免疫修复15肽合成工艺研究

1.试验材料

2.试验仪器

3.工艺研究

3.1 免疫修复15肽小样试合成

采用Fmoc-固相合成策略，根据以往经验，采用MBHA树脂为载体合成免疫修复15肽。

3.1.1 拟合成的工艺流程

3.1.2 实验操作

1.用DMF浸泡树脂2h以活化树脂。

2.依据Fmoc-固相多肽合成原理，以MBHA树脂为固相载体，DMAP、DIC为催化剂，DMF为溶剂，在固相多肽合成器中连接第一个氨基酸到树脂。选择Rink-Amide-MBHA树脂对免疫修复15肽进行酰胺化修饰。根据Fmoc-固相多肽合成法，用哌啶脱去树脂上的Fmoc-基团，使树脂上的氨基游离出来，恢复反应活性；可选地对树脂进行茚三酮显色检测，以鉴别Fmoc-基团是否脱除。洗涤后用以HOBT\TBTU\DIEA为催化剂，DMF为溶剂及清洗剂，连接第一个氨基酸；

3.洗涤后加入20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc-基团，使第一个氨基酸的氨基游离出来，恢复反应活性。

4.从反应器中取少量树脂于干燥洁净的试管中，加入5％茚三酮的无水乙醇溶液 (W/V)，在沸水浴中加热5分钟，颜色反应呈阳性

5.洗涤后用以HOBT\TBTU\DIEA为催化剂，DMF为溶剂及清洗剂，在固相多肽合成器中连接第二个氨基酸。

6.同样方法连接其他的氨基酸。连接完每个氨基酸后都需用5％茚三酮的无水乙醇溶液进行检测，结果呈阴性时才可进行下步反应。

7.连接完所有氨基酸后洗涤.

8.加入乙酸酐/DIE/ADCM反应，对免疫修复15肽进行乙酰化修饰。反应充分后用氮气将树脂吹干。

8.用切割试剂将肽从树脂上切割下来。

9.将切下的肽再在冷乙醚中沉淀、洗涤、离心。

10.在冻干机中冻干获得粗品。

按以上的合成工艺流程步骤，合成了小样(1克)，经HPLC和质谱分析(图3、4、5、6)，结果如下。

小试结果表明：粗肽主峰明显，粗品的纯度为79.2007％，粗品主峰的分子量(1419.51Dr.)与免疫修复15肽理论分子量(1419.76Dr.)一致，故所设计的工艺流程基本可行。以下将对所选工艺进行优化组合，以提高粗品纯度。

3.2 氨基酸的选择

氨基酸的选择是取决于合成策略、树脂载体及合成工艺，合成工艺和氨基酸的选择对产品的纯度、质量以及合成效率都有关键性的影响。基于Fmoc策略及MBHA树脂为载体的免疫修复15肽合成，可选用的保护氨基酸包括：

Gly:Fmoc-Gly-OH

Val:Fmoc-Val-OH

Asp:Fmoc-Asp(otBu)-OH或Fmoc-Asp(Pbf)-OH

Lys:Fmoc-Lys(Boc)-OH或Fmoc-Lys(Trt)-OH

Leu:Fmoc-Leu-OH

Glu:Fmoc-Glu(Trt)-OH或Fmoc-Glu(OtBu)-OH

Ala：Fmoc-Ala-OH

Pro：Fmoc-Pro-OH

这几种Fmoc-氨基酸均可用于免疫修复15肽的合成，出于降低成本考虑我们选用以下Fomc-氨基酸进行免疫修复15肽的合成(见下表)

表：Fmoc-氨基酸的分子式和结构式

在合成策略、树脂载体、合成工艺既定的情况下，合成氨基酸的选择应基于高反应选择性和高反应效率，经济和有利于规模化，以使合成效率高、成本低，容易经过改进以实现大量的、经济的规模化生产。

3.3 切割试剂的选择

根据肽序列及选用氨基酸原材料的不同，设计配制合理的切割试剂及工艺，减少切割试剂的损耗，提高收率，减小纯化负担。如传统的切割试剂中的保护基吸收剂对于有些序列无意义或效果重复，这样就可根据具体序列详加分析，选用适合的切割工艺。

Fmoc-策略中传统的切割试剂多采用TFA、Thioanisole、EDT、phenol、H₂O(传统切割配方)进行配制，其中TFA为切割剂，可打断第一个氨基酸的羧基与树脂之间的连接键，以及各个氨基酸侧链保护基团与相应侧链之间的连接键。其他四种为清除剂，用于淬灭已经切割下来的各种保护集团的反应活性，以防止其重新与侧链反应。由于免疫修复15肽所选Fmoc-氨基酸的侧链保护基团只有OtBu、Boc两种，因而设计切割液配方(优化)如下：

TFA:H₂O＝95:5

3.3.1 Boc基团的切割及清除原理

切割原理：

清除原理：

Boc+HS-CH₂CH₂-SH→HS-CH₂CH₂-S-Boc+H(+)

3.3.2 OtBu基团的切割及清除原理

切割原理：

清除原理：

TFA-OtBu+HS-CH₂CH₂-SH→HS-CH₂CH₂-S-OtBu+H(TFA)

TFA-OtBu+H₂O→HO-OtBu+H(TFA)

在整体切割方案下，对传统切割配方和优化切割配方进行了实验比较。传统切割配方切割后的分析结果见图7、8；优化切割配方切割后的分析结果如下：

HPLC分析表明，两种切割工艺对免疫修复15肽粗品的影响不大，两者纯度较为接近。而质谱结果也表明经两种切割工艺获得的粗品均为目标产品。因而我们选用更加简单、副产物少的TFA:H₂O＝95:5的切割试剂配方工艺。

3.4 纯化工艺研究

采用Waters 600 HPLC，以水和乙腈为二元梯度洗脱流动相，研究纯化工艺。

3.4.1 探索主峰出峰时间

色谱条件：C18反相色谱柱，4.6*250mm，紫外检测波长215nm，流动相A为0.1％三氟乙酸的水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，流速1ml/min。B相5％-90％30min。结果如图9所示。免疫修复15肽的保留时间为15.023分。

3.4.2 提高分离效果

以第一次主峰出峰时间B相浓度为基点，前降20％，后加20％得程序B.相15％-55％

色谱条件：C18反相色谱柱，4.6*250mm，紫外检测波长215nm，流动相A为0.1％三氟乙酸的水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，流速1ml/min，洗脱时间30min。梯度洗脱(B.相15％-55％)，结果如图10所示。免疫修复15肽的保留时间(t_R)为14.023分，保留时间前移。

3.4.3 优化程序

提高A相起始浓度，可使主峰前的杂肽较易与主峰分离，降低A相终浓度可使主峰后的杂峰出峰拖后，提高分离度。B相5％-55％

色谱条件：C18反相色谱柱，4.6*250mm，紫外检测波长215nm，流动相A为0.1％三氟乙酸的水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，流速1ml/min，洗脱时间30min。结果如图11所示。免疫修复15肽的保留时间(t_R)为14.998分，与以上分离的结果相比，保留时间后移。主峰与其前后的杂峰明显分离。可初步选择此条件为纯化条件。

实验室研究小结

1.采用Fmoc-固相合成策略的经典方法，小样合成免疫修复15肽，经HPLC分析,主峰明显，杂质含量较少，质谱分析主峰物质分子量与免疫修复15肽理论分子量一致。结果表明以Rink-Amide-MBHA为载体的Fmoc-固相合成方法适用于免疫修复15肽的合成。

2.通过选择合成载体、氨基酸，细化合成步骤、优选切割试剂，封闭树脂等手段优化合成工艺，确定以Rink-Amide-MBHA树脂为固相载体，以HOBt/TBTU/DIEA/为催化剂，以DMF为溶剂和清洗剂，以TFA/H₂O为切割剂的合成工艺。结果显示免疫修复15肽粗品纯度达到87％。

3.初步研究了免疫修复15肽的分析纯化工艺，确定了以水-乙腈为二元梯度洗脱流动相，以0.1％三氟乙酸为离子对的HPLC分析方法。粗品纯化色谱条件为：C18反相色谱柱，20*250mm，紫外检测波长215nm，流动相A为0.1％三氟乙酸的水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，流速10ml/min，

线性梯度洗脱及柱处理条件：

B:5％-55％ 60分钟(制备纯化)

B:55％-90％ 10分钟(柱冲洗)

B:90％ 10分钟(柱冲洗)

B:5％ 10分钟(柱平衡)

4.用以上工艺纯化的免疫修复15肽纯度为98％，收率为75％。

5.实验室小试免疫修复15肽制备工艺流程如图18所示：

总之，经过理化分析，实验室优化组合的免疫修复15肽小批量生产制备工艺，简单可行，收率为70％，产品纯度达到98％，达到新药申报样品纯度的要求。此工艺是否可以直接进行中试规模生产，尚需进行实验验证。

第二部分免疫修复15肽合成中试工艺

一、试剂材料及仪器

1.试验材料

试剂名称	生产厂家	试剂级别
			Rink-Amide-MBHA树脂	吉尔生化(上海)有限公司	分析纯
异丙醇	天津市福晨化学试剂厂	分析纯
			二氯甲烷	天津市福晨化学试剂厂	分析纯
甲醇	西安富力化学厂	分析纯
			茚三酮	上海山浦化工有限公司	分析纯
乙醚	西安化学试剂厂	分析纯
			三氟乙酸	上海诚心化工有限公司	化学纯
乙基二硫醇	吉尔生化(上海)有限公司	分析纯
			哌啶	上海诚心化工有限公司	分析纯
乙腈	Fisher	色谱纯
			DMF	天津市福晨化学试剂厂	分析纯
DIEA	吉尔生化(上海)有限公司	分析纯
			Fmoc-AA	吉尔生化(上海)有限公司	分析纯
TBTU	吉尔生化(上海)有限公司	分析纯

HOBT

吉尔生化(上海)有限公司

分析纯

2.试验仪器

仪器名称	型号	生产厂家
			多肽合成反应器	中号	自制
超纯水净水器	SA67120	美国Millipore公司
			磁力搅拌器	78HW-1	杭州仪表电机有点公司
台式低速自动平衡离心机	TDZ5-WS	湖南湘仪实验仪器开发有限公司
			液相色谱纯化系统	Delta600	美国Waters公司
电子天平	TP-220	湘仪天平仪器设备有限公司
			冻干机	CJ300B	浦东冷冻干燥设备厂
一次性使用吸管(3ml)		江苏康健医疗用品有限公司
			循环水式多用真空泵	SHB-Ⅲ	郑州长城科工贸有限公司

二、技术路线及工艺流程图

1.技术路线

活化Rink-Amide-MBHA树脂→脱保护→洗涤→检测→连接第一个氨基酸→检测→洗涤→脱保护→洗涤→检测→连接第二个氨基酸→洗涤→检测→脱保护→洗涤→检测…重复连接氨基酸、脱保护…连接到第十五个氨基酸→乙酰化→吹干树脂→切割→纯化→冻干→分析

2.合成和纯化工艺流程图，请参见图12和图13

免疫修复15肽纯化条件为：以水-乙腈为二元梯度洗脱流动相。流动相A为0.1％三氟乙酸的水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，色谱柱为C18反相色谱柱，50*250mm，紫外检测波长215nm，流速10ml/min。

线性洗脱梯度及柱处理条件：

B:5％-55％ 60分钟(制备纯化)

B:55％-90％ 10分钟(柱冲洗)

B:90％ 10分钟(柱冲洗)

B:5％ 10分钟(柱平衡)

3.制备工艺流程

3.1 脱去Rink MBHA resin上的Fmoc-基团

用20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc-基团,使树脂上的氨基游离出来，恢复反应活性。反应2次，第一次10分钟第二次30分钟。

反应式图14所示：

抽去反应混合物，并清洗树脂，为下一步反应做好准备。

从反应器中取少量树脂于干燥洁净的试管中，加入5％茚三酮的无水乙醇溶液(W/V)，在沸水浴中加热5分钟，颜色反应呈阳性。

茚三酮可与脱除Fmoc-基团氨基酸的裸露氨基发生颜色反应，用于鉴别Fmoc-基团是否脱除以及氨基酸的连接是否完全。其原理如下：

首先，氨基酸被转化成α—酮酸和氨，α—酮酸不稳定，脱羧成相应的醛和二氧化碳，可参见图15：

然后，茚三酮水合物、还原型茚三酮和氨形成紫红色化合物，可参见图16：

3.2 连接Fmoc-Val-OH到Rink-Amide-MBHA树脂上

称取Fmoc-Val-OH氨基酸，加入TBTU、HOBT、DIEA、DMF在反应柱反应2小时，反应液为浅黄色液体。

3.3 脱去Fmoc-Val-OH上的Fmoc-基团

用20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc-基团，使第一个氨基酸的氨基游离出来，恢复反应活性。反应2次，第一次10分钟第二次30分钟，洗涤后检测结果呈阳性。

3.4 连接Fmoc-Ala-OH到H₂N-Val-OH上

在上述Fmoc-Val-树脂中，加入用DMF溶解的Fmoc-Ala-OH、TBTU、HOBT、DIEA的混合物，充分反应2小时，用真空泵抽干。之后用N,N-二甲基甲酰胺、异丙醇清洗树脂2次。检测结果呈阴性。加入脱保护试剂哌啶、DMF溶液脱去Fmoc-基团。再次用N,N-二甲基甲酰胺、异丙醇清洗树脂2次。检测结果呈阳性。这样第二个氨基酸的氨基游离出来，恢复反应活性。此时获得Fmoc-Ala-Val-树脂。

3.5 连接Fmoc-Pro-OH到Fmoc-Ala-Val上

在上述Fmoc-Ala-Val-树脂中，加入用DMF溶解的Fmoc-Pro-OH、TBTU、HOBT、DIEA的混合物，充分反应2小时，用真空泵抽干。之后用N,N-二甲基甲酰胺、异丙醇清洗树脂2次。检测结果呈阴性。加入脱保护试剂哌啶、DMF溶液脱去Fmoc-基团。再次用N,N-二甲基甲酰胺、异丙醇清洗树脂2次。检测结果呈阳性。这样第二个氨基酸的氨基游离出来，恢复反应活性。此时获得Fmoc-Pro-Ala-Val-树脂。

3.6 连接Fmoc-Leu-OH到Fmoc-Pro-Ala-Val上

在上述Fmoc-Pro-Ala-Val树脂中，加入用DMF溶解的Fmoc-Leu-OH、TBTU、HOBT、DIEA的混合物，充分反应2小时，用真空泵抽干。之后用N,N-二甲基甲酰胺、异丙醇清洗树脂2次。检测结果呈阴性。加入脱保护试剂哌啶、DMF溶液脱去Fmoc-基团。再次用N,N-二甲基甲酰胺、异丙醇清洗树脂2次。检测结果呈阳性。这样第二个氨基酸的氨基游离出来，恢复反应活性。此时获得Fmoc-Leu-Pro-Ala-Val-树脂。

3.7 连接Fmoc-Asp-OH到Fmoc-Leu-Pro-Ala-Val上

在上述Fmoc-Leu-Pro-Ala-Val树脂中，加入用DMF溶解的Fmoc-Asp-OH、TBTU、HOBT、DIEA的混合物，充分反应2小时，用真空泵抽干。之后用N,N-二甲基甲酰胺、异丙醇清洗树脂2次。检测结果呈阴性。加入脱保护试剂哌啶、DMF溶液脱去Fmoc-基团。再次用N,N-二甲基甲酰胺、异丙醇清洗树脂2次。检测结果呈阳性。这样第二个氨基酸的氨基游离出来，恢复反应活性。此时获得Fmoc-Asp-Leu-Pro-Ala-Val-树脂。

3.8 连接Fmoc-Lys-OH到Fmoc-Leu-Pro-Ala-Val上

在上述Fmoc-Asp-Leu-Pro-Ala-Val-树脂中，加入用DMF溶解的Fmoc-Lys-OH、TBTU、HOBT、DIEA的混合物，充分反应2小时，用真空泵抽干。之后用N,N-二甲基甲酰胺、异丙醇清洗树脂2次。检测结果呈阴性。加入脱保护试剂哌啶、DMF溶液脱去Fmoc-基团。再次用N,N-二甲基甲酰胺、异丙醇清洗树脂2次。检测结果呈阳性。这样第二个氨基酸的氨基游离出来，恢复反应活性。此时获得Fmoc-Lys-Asp-Leu-Pro-Ala-Val-树脂。

3.9 重复上述步骤，直至连接完最后一个氨基酸Fmoc-Gly-OH,此时获得NH₂-Gly-Ala-Pro-Pro-Glu-Pro-Gly-Gly-Asp-Lys-Asp--Leu-Pro-Ala-Val-NH₂完整序列。

3.10 乙酰化向上述反应液中加入乙酸酐、DIEA、DCM反应1小时，对免疫修复15肽进行乙酰化修饰。

3.11 肽链的切割及侧链脱保护

切割试剂配方：TFA:H₂O＝95:5。每1克树脂使用的切割试剂的量在10～15ml 之间。

将肽树脂置于圆底烧瓶中，加入切割液磁力搅拌2小时，用200目砂芯过滤器除去树脂，滤液直接抽入冷冻乙醚中，3000r/min离心使粗肽沉淀，弃去上清液，再向离心管中加入乙醚摇匀使沉淀物悬浮、离心，重复三次，洗去切割液残留物，加入蒸馏水溶解沉淀物，弃去上层乙醚层，于冻干机中冷冻干燥，得粗肽粉末。

3.12 免疫修复15肽粗品的纯化

取冻干的免疫修复15肽粗品4.0g溶于20ml去离子水中，充分溶解后过滤，取滤液备用。

免疫修复15肽纯化条件为：以水-乙腈为二元梯度洗脱流动相。流动相A为0.1％三氟乙酸的水溶液，流动相B为0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，色谱柱为C18反相色谱柱，50*250mm，紫外检测波长215nm，流速10ml/min，进样量20ml。

线性洗脱梯度及柱处理：

B:5％-55％ 60分钟(制备纯化)

B:55％-90％ 10分钟(柱冲洗)

B:90％ 10分钟(柱冲洗)

B:5％ 10分钟(柱平衡)

第三部分免疫修复15肽中试试验操作及记录

以实验室合成工艺为基础，按照中试放大合成工艺制备免疫修复15肽，以验证工艺是否可行。每批次采用10g MBHA树脂为载体，合成免疫修复15肽，然后进行切割和纯化。共连续合成3批，分别为20140201、20140301、20140401批。其分析结果如下：

表：三批机体保护多肽中试试验结果

表：三批机体保护多肽中试氨基酸投料表

批号	Gly(g)	Leu(g)	Val(g)	Glu(g)	Asp(g)	Pro(g)	Lys(g)	Ala(g)
									20140201	52	28	136	44	68	136	44	56
20140301	52	28	136	44	68	136	44	56
									20140401	52	28	136	44	68	136	44	56

表；三批中试试验回收率及纯度结果

批号	纯化前重(g)	纯化后重(g)	回收率(％)	纯化前纯度(％)	纯化后纯度(％)	纯化倍数
							20140201	60.7	30.3	49.918	87.9758	98.2115	1.116
20140301	60.6	30.3	50	87.3618	98.1134	1.123
							20140401	60.9	30.1	49.425	87.7671	98.1412	1.118
平均值	60.7	30.23	49.78	87.70	98.16	1.19
							标准差	0.15	0.11	0.31	0.31	0.05	0.003

从上表中看出，三批中试试验回收率为49.78％±0.31％，纯化前纯度为87.70％±0.31％，纯化后为98.16％±0.05％，纯化倍数为1.19±0.003。

实施例2

该实施例测试了免疫修复15肽的各种生理活性。

免疫修复15肽是一个由15个氨基酸组成的多肽，具有免疫调节活性和机体保护作用。对各种条件引起的消化道粘膜、肝脏和胰腺损伤具有明显的保护作用；可促创伤伤口的愈合；促进骨折愈合；同时具有抑制炎性反应等作用。免疫修复15肽具有良好的稳定性，抗胃酶消化、抗酸，注射和口服具有同样的效果；对胃酸和胃酶分泌无抑制作用；在极低剂量(10μg和10ng/kg)、单次用药就具有明显的保护作用。其毒性剂量明显高于有效剂量，具有广泛的药理作用和高度的安全范围，同时具有优良的药代动力学特性。

1、对胃肠道粘膜的保护作用：应用不同的动物模型，证明免疫修复15肽在很低剂量，单次用药或多次用药对急性和慢性食道、胃、十二指肠及结肠粘膜损伤具有明显的预防和治疗作用。应用三种大鼠试验性溃疡动物模型(48小时约束应激、皮下注射半胱胺、胃灌注96％酒精)观察免疫修复15肽(腹腔注射或灌胃10μg或10ng)和其他对照药物(应激试验中应用金刚胺、法莫替丁、甲氰咪瓜、溴麦角隐亭、生长激素抑制剂；半胱胺试验中应用腹腔注射CCK/26-30、胰高血糖素、促胰液素、NPY；酒精损伤试验中腹腔注射促胰液素、胰高血糖素和NPY)对胃粘膜保护作用，发现仅有免疫修复15肽在上述模型中均具有胃粘膜保护作用。免疫修复15肽还对多巴胺消耗剂和受体阻断剂、前列腺素合成抑制剂、糖尿病诱发剂四氧嘧啶及其它多种因素引起的胃粘膜损伤具有明显的保护作用。应用食管空肠吻合大鼠模型研究证实，免疫修复15肽对反流性食管炎所引起的食管粘膜损伤具有明显的预防和治疗作用。应用三硝基苯磺酸诱导大鼠结肠结肠损伤模型，观察腹腔和结肠内应用免疫修复15肽对结肠粘膜损伤的保护作用。结果表明，腹腔注射免疫修复15肽剂量依赖性的抑制TNBS诱导的结肠粘膜损伤，并降低结肠组织MPO(代表白细胞在损伤组织中的浸润程度)的活性。免疫修复15肽还对由半胱胺引起的结肠慢性损伤有明显的逆转作用。免疫修复15肽对大鼠胃酸分泌和胃肠道动力无明显影响。

具体的实验过程如下所述

一、大鼠慢性胃溃疡(醋酸型胃溃疡)的制备

(一)、模型制备与分组:

大鼠120只，体重170-250g，雄性，禁食24小时后，乙醚麻醉，无菌切开腹腔，暴露胃，在胃窦与胃体交界处浆膜下用微量注射器注入30％醋酸50μl，敷适量青霉素粉，缝合腹壁肌层与皮肤，术后立即随机分为以下各组(每组10只):

肌注给药组60只，随机分为以下6组:

第1组:空白对照组

第2组:赋形剂对照组

第3组:法莫替丁 50mg/kg

第4组:免疫修复15肽 200ng/kg

第5组:免疫修复15肽 500ng/kg

第6组:免疫修复15肽 800ng/kg

灌胃给药组60只，随机分为以下6组:

第1组:空白对照组

第2组:法莫替丁 50mg/kg

第3组:免疫修复15肽 100ng/kg

第4组:免疫修复15肽 200ng/kg

第5组:免疫修复15肽 500ng/kg

第6组:免疫修复15肽 800ng/kg

(二)、给药方法：术后分组后立即开始给药。肌注组按0.1ml/100g im免疫修复15肽或法莫替丁，赋形剂对照组im等体积赋形剂溶液，空白对照组im等体积生理盐水。灌胃给药组按1ml/100g ig免疫修复15肽(原料药)或法莫替丁，空白对照组ig等体积生理盐水。1日量分早、晚2次给予，连续12天。

(三)、指标检测：

1.溃疡面积：给药12天后停药禁食，于次日颈椎脱臼处死，开腹，胃内注入10ml 10％福马林溶液固定，取胃，在福马林溶液内继续固定12h,沿胃大弯纵行切开，用生理盐水冲净胃内容物，将溃疡标本平铺在平板上，用带近摄镜摄像机摄像，图象分析仪测量溃疡面积。

二、对大鼠醋酸型溃疡面积的影响

1、肌注给药：表1结果显示，肌注给药组免疫修复15肽200、500、800ng/kg均使大鼠醋酸型溃疡面积显著缩小，和对照组比，差别均有显著性意义，500ng/kg时作用即非常明显。赋形剂对醋酸型溃疡未显示出明显影响。对溃疡形成的抑制率肌注给药组(表1)强于灌胃给药组(表2)。肌注免疫修复15肽500-800ng/kg组大鼠醋酸型溃疡愈合率明显高于法莫替丁50mg/kg组，说明肌注给药时免疫修复15肽促溃疡愈合的作用明显强于法莫替丁。

2、灌胃给药：表2结果显示。和空白对照组比较，灌胃给药组法莫替丁、免疫修复15肽200、500、800ng/kg使大鼠醋酸型溃疡面积显著缩小，和对照组比，差别均有显著性(表2。免疫修复15肽500-800ng/kg灌胃组大鼠醋酸型溃疡愈合率低于法莫替丁50mg/kg组，说明灌胃给药时免疫修复15肽促溃疡愈合的作用弱于法莫替丁。

表1.免疫修复15肽肌注给药对大鼠醋酸型溃疡面积的影响

和赋形剂对照组比，*P<0.05,**P<0.01.

表2.免疫修复15肽灌胃给药对大鼠醋酸型溃疡面积的影响

和空白对照组比，*P<0.05,**P<0.01.

三、结论

对大鼠醋酸型溃疡模型进行治疗试验，结果肌注或灌胃给予免疫修复15肽200ng/kg(1日量分2次灌胃或肌注)即有明显的治疗作用，表现为溃疡面积较对照组明显为小；最佳有效剂量为500-800ng/kg。免疫修复15肽肌注给药疗效强于灌胃给药，肌注时促溃疡愈合作用强于法莫替丁，而灌胃给药时此作用弱于法莫替丁。

2、对肝脏和胰腺的保护作用：应用24小时胆管/肝动脉连接、48小时约束应激试验、CCl₄制备大鼠肝脏损伤模型，观察免疫修复15肽和对照药品(溴麦角溴隐亭，金刚烷胺和生长抑素)对肝脏的保护作用。发现BPC157灌胃和腹腔注射可明显抑制肝脏坏死和脂肪变化。可使胆红素、SGOT、SGPT等指标恢复正常。对照药品无明显的肝脏保护作用。用7.28g/kg/天酒精灌胃2-3个月后，大鼠门脉压明显增高，肝细胞和肝细胞核明显增大，肝脏严重脂肪化，肝脏重量明显增加。接受免疫修复15肽治疗或预防的大鼠门脉压降至正常水平，病理变化全部消失。说明，免疫修复15肽可预防和逆转肝脏急性或慢性损伤以及由肝脏损伤所引起的门脉高压。应用胆管连接胰腺炎模型观察免疫修复15肽对大鼠胰腺和胃、十二指肠损伤的保护作用，发现免疫修复15肽可减少胰腺水肿、坏死，减少中性粒细胞浸润，降低淀粉酶水平。免疫修复15肽还可以明显改善胰腺损伤所导致的胃、十二指肠粘膜损伤。

3、促进伤口和骨折愈合：应用大鼠皮肤切割伤、结肠吻合和合成海绵体移植物血管形成模型，观察免疫修复15肽对伤口愈合、肉芽组织形成、胶原形成和血管形成的作用。结果表明，免疫修复15肽灌胃和局部应用，对伤口愈合均具有明显的促进作用。观察免疫修复15肽软膏局部应用或腹膜内注射对小鼠烧伤创面和烧伤后胃粘膜损伤的保护作用，发现与对照组相比，免疫修复15肽软膏治疗组烧伤愈合指标均明显改善，水肿程度降低，炎性细胞减少，坏死明显减轻，真皮结缔组织和胶原纤维中毛细血管数目明显增加，2周后创面完全愈合，愈合后的皮肤张力明显增强，皮肤含水量降低。免疫修复15肽全身治疗的小鼠烧伤创面炎性细胞减少，愈合皮肤张力增加，含水量减少。此外，局部和全身应用免疫修复15肽可明显抑制烧伤小鼠的胃粘膜损伤。应用家兔部分骨缺损模型观察免疫修复15肽对骨缺损的修复作用。用药方式为：1)局部应用(10μg/kg)，2)在术后7、9、14、16天肌肉注射(10μg/kg)，3)术后7-21天每天注射(10μg或10ng/kg)，结果表明，无论采用何种用药方式，免疫修复15肽可明显促进骨缺损愈合。此外，免疫修复15肽可明显促进缺损组织中肉芽组织形成和毛细血管形成。

4、抑制炎性反应：用免疫修复15肽(10μg/kg，10ng/kg)预处理大鼠，然后用辣椒素鼻内应用制备鼻炎模型，在1、3、12h处死动物，分析鼻粘膜中肥大细胞浸润、脱粒和炎性细胞浸润情况。发现用免疫修复15肽预处理1h可明显减轻肥大细胞浸润。多型核白细胞在10μg/kg组明显减少。应用0.2ml制备关节炎模型，在制备模型前1h或应用佐剂后单剂量或每天(0-14天、14-30天、14天-1年)给予免疫修复15肽治疗，单剂量应用可明显减轻佐剂性关节炎的损伤，每天应用可使损伤进一步减轻。对于已建立的佐剂性关节炎，应用2周后可见明显的保护作用，用药1年后其保护作用更加明显。说明免疫修复15肽对大鼠佐剂性关节炎具有明显的保护作用。

Claims

1.一种免疫修复15肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的免疫修复15肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括根据Fmoc-固相多肽合成法合成粗品多肽，优选的是，所述方法还包括使用反相高效液相色谱对所述粗品多肽进行纯化。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Fmoc-固相多肽合成法中，以Rink-Amide-MBHA树脂为固相载体，HOBt(1-羟基-苯并-三氮唑)/TBTU(苯并三唑四甲基四氟硼酸)/DIEA(N,N'-二异丙基乙胺)为催化剂，二甲基甲酰胺DMF为溶剂和清洗剂，三氟乙酸TFA/H₂O为切割剂，进行所述粗品多肽的合成。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Fmoc-固相多肽合成法中使用Fmoc-Asp(Otbu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH和Fmoc-Glu(Otbu)-OH作为合成氨基酸来分别将Asp、Lys和Glu偶联到肽链上。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Fmoc-固相多肽合成的步骤包括：

a.用二甲基甲酰胺DMF浸泡所述Rink-Amide-MBHA树脂以将其活化；

c.可选地对树脂进行茚三酮显色检测，以鉴别Fmoc-基团是否脱除；

e.用哌啶脱去Fmoc-基团，使第一个氨基酸的氨基游离出来，恢复反应活性；

i.连接完所有氨基酸后洗涤；

j.对免疫修复15肽进行乙酰化修饰；

k.用切割试剂将肽从树脂上切割下来；

l.将切下的肽再在冷乙醚中沉淀、洗涤、离心；

m.冻干机中冻干获得粗品。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反相高效液相色谱条件为：

线性洗脱梯度及柱处理：

B:5％-55％ 60分钟(制备纯化)

B:55％-90％ 10分钟(柱冲洗)

B:90％ 10分钟(柱冲洗)

B:5％ 10分钟(柱平衡)。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述粗品多肽的纯度为85％以上，优选87％以上。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述反相高效液相色谱纯化后的产品的纯度为98％以上。

9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述TFA/H₂O中TFA与H₂O的体积比95:5。

10.权利要求1所述的免疫修复15肽在制备具有免疫调节活性和/或机体保护作用的药物或保健品、特别是运动营养保健品中的应用。