CN113801193A

CN113801193A - 具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的麦胚蛋白多肽及其制备

Info

Publication number: CN113801193A
Application number: CN202111085938.4A
Authority: CN
Inventors: 李洪岩; 王静; 刘维维; 孙宝国; 温洋洋; 范浩然; 路士熠
Original assignee: Beijing Technology and Business University
Current assignee: Beijing Technology and Business University
Priority date: 2021-09-16
Filing date: 2021-09-16
Publication date: 2021-12-17

Abstract

本发明提供了一种具有α‑葡萄糖苷酶抑制活性的麦胚蛋白多肽及其制备和应用，属于生物医药领域。本发明提供的一种生物活性多肽具有α‑葡萄糖苷酶抑制活性，具有降血糖作用，且其分子量小，稳定性高，在医疗卫生、食品保健等领域具有广泛的应用前景。该生物活性多肽可用于制备糖尿病治疗和/或预防药物，或作为功能食品添加剂，供糖尿病患者长期治疗保健使用。且本发明所述的生物活性多肽来源于天然植物蛋白，具有稳定、安全、人体易吸收等特点，可进行大规模产业化生产。

Description

具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的麦胚蛋白多肽及其制备

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的麦胚蛋白多肽及其制备和应用。

背景技术

糖尿病是一组以高血糖为特征的慢性、多因素代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍，如足部溃疡、糖尿病视网膜病变、肾病、中风、心血管疾病、神经病变等等。糖尿病可分为1型或2型糖尿病，其中，1型或2型糖尿病均存在明显的遗传异质性。糖尿病存在家族发病倾向，1/4-1/2患者有糖尿病家族史，且临床上至少有60种以上的遗传综合征可伴有糖尿病。1型糖尿病中有多个DNA位点参与发病，其中以HLA抗原基因中DQ位点多态性关系最为密切。而在2型糖尿病中，已发现多种明确的基因突变，如胰岛素基因、胰岛素受体基因、葡萄糖激酶基因、线粒体基因等。近年来，糖尿病患病率迅速上升，且发病呈现低龄化趋势，其中由胰岛素抵抗/缺乏引起的II型糖尿病(T2D)为主要类型，占所有糖尿病发病率的90％以上，因此，开发新型预防/治疗糖尿病功能因子显得尤为迫切。

α-葡萄糖苷酶(GAA)作为一种重要的碳水化合物水解酶，在降低聚糖和二糖转化为葡萄糖的过程中起关键作用，产生的单糖可被小肠吸收，导致血糖水平升高。因此，GAA已被认为是T2D防治的主要靶标酶，而α-葡萄糖苷酶抑制剂(AGI)在控制糖尿病患者餐后血糖水平和维持血糖正常方面发挥重要作用。AGI可延缓碳水化合物的消化，减少单糖的吸收。研究人员一直致力于从有机化合物和天然产物中筛选AGIs，如阿卡波糖、米格列醇、伏格列波糖等。但这些药物存在一些明显的副作用，如腹痛、腹胀、胀气加重、腹泻、抽筋等。且这些药物的需求量大，但来源稀少，价格昂贵。因此，从天然产物中筛选出副作用小的天然活性化合物作为AGI越来越受到重视，美国临床内分泌学家协会(AACE)和国际糖尿病联合会(IDF)已将天然AGI视为一线疗法。

专利CN103468774B公开了一种从紫菜酶解产物中分离α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，通过复配可控酶解成本低廉的末水条斑紫菜，得到α-葡萄糖苷酶抑制剂粗品，经分离纯化后制备得到的α-葡萄糖苷酶的高抑制活性部分(LGI)分子量较小，稳定性好，成本低、应用安全，在医药和食品等领域有较广泛的应用前景。专利CN109721639A公开了一种生物活性多肽及其在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用，所述生物活性多肽AGI-1由十个氨基酸残基组成，其中含有两个半胱氨酸，形成一对分子内二硫键，其可以抑制α-葡萄糖苷酶活性，IC50值为1.54mM。

基于此，亟需提供一种新的具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的小分子化合物，用于制备降血糖药物。

发明内容

针对上述不足，本发明提供了一种生物活性多肽及其制备方法和应用。所述的活性多肽具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，具有降血糖作用，且其分子量小，稳定性高，在医疗卫生、食品保健等领域具有广泛的应用前景。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种生物活性多肽，所述的生物活性多肽包含如LDLQ*、#GGF*和/或LDNF*所示的氨基酸序列中的一种或多种，其中，*为碱性氨基酸K/R/H，#为A/M。

具体地，所述的生物活性多肽具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。

具体地，所述的生物活性多肽包含如SEQ ID NO:1-12所示的氨基酸序列中的一种或多种。

具体地，所述的生物活性多肽来自于小麦天然提取或人工合成。

另一方面，本发明提供了一种上述生物活性多肽的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：

(1)麦胚蛋白的提取：以麦胚粉为原料，采用碱溶酸沉法提取麦胚蛋白；

(2)麦胚蛋白定向酶解：采用生物信息学联合生物酶解技术得到虚拟定向酶解步骤(1)制备的麦胚蛋白的条件；

(3)具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的生物活性多肽制备：采用步骤(2)得到的虚拟酶解条件处理步骤(1)制备的麦胚蛋白，得到生物活性多肽；

(4)高活性生物活性多肽的筛选：采用液质联用对步骤(3)制备得到的生物活性多肽进行鉴定、筛选及分子对接，得到上述生物活性多肽。

具体地，步骤(1)中所述的麦胚粉为脱脂麦胚粉。

具体地，步骤(1)中所述的碱溶酸沉法提取步骤为：取脱脂麦胚粉按照料液比1:10的比例溶于蒸馏水中，1M NaOH调节pH至11.0，50℃搅拌浸提2h，4000rpm离心15min，取上清，1M HCl调pH至4.5，4000rpm离心15min，沉淀即为麦胚蛋白，冻干备用。

进一步具体地，步骤(1)麦胚蛋白的提取的作用是富集脱脂麦胚粉中的蛋白，去除其中多糖及多酚。

具体地，步骤(2)中所述的麦胚蛋白定向酶解的具体方法为：首先采用生物信息学方法对蛋白结构进行分析，在Biopep数据库“Enzymeaction”模块，进行计算机辅助酶解，将得到的多肽采用

Maestro软件，以α-葡萄糖苷酶为靶点蛋白进行虚拟筛选，利用对接模板筛选出得分较高的前配体，对获得的多肽进行活性预测并打分，取打分位于前列的多肽虚拟酶解条件作为实际酶解条件。

具体地，步骤(3)中所述的生物活性多肽的具体制备方法为：按照虚拟酶解条件，将所得麦胚蛋白溶于pH8.0的缓冲溶液，加入胰蛋白酶进行酶解，得到酶解液，酶解液经0.45μm滤膜过滤后再经不同截留分子量滤膜超滤分离纯化，得到不同分子量级分的生物活性多肽，收集不同级分并检测各级分抑制活性，得到高活性生物活性多肽级分。

进一步具体地，步骤(3)中生物活性多肽的分离纯化是以α-葡萄糖苷酶抑制活性为指标，利用超滤(10KDa，5KDa，3KDa，1KDa)对混合生物活性多肽组分进行分离纯化。

具体地，步骤(4)中所述的液质联用为LC-TOF-MS/MS。

又一方面，本发明提供了上述生物活性多肽在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。

又一方面，本发明提供了一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂包含上述生物活性多肽。

又一方面，本发明提供了上述生物活性多肽在制备降血糖药物中的应用。

又一方面，本发明提供了一种降血糖药物，所述的降血糖药物包含上述生物活性多肽。

具体地，所述的降血糖药物还包括药学上可接受的载体，所述的载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂中的任意一种或多种。

具体地，所述的降血糖药物为外用制剂、口服制剂或注射制剂中的任意一种。

进一步具体地，所述的外用制剂为喷雾剂或气雾剂。

进一步具体地，所述的口服制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂或囊泡剂中的任意一种。

进一步具体地，所述的注射制剂采用皮内、皮下、肌内、局部或静脉内注射作为给药方式。

又一方面，本发明还提供了上述生物活性多肽在制备降血糖保健品中的应用。

又一方面，本发明还提供了一种降血糖保健品，所述的降血糖保健品包含上述生物活性多肽。

与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：

(1)本发明提供了一种生物活性多肽，具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，具有降血糖作用，且其分子量小，稳定性高，在医疗卫生、食品保健等领域具有广泛的应用前景。该生物活性多肽可用于制备糖尿病治疗和/或预防药物，或作为功能食品添加剂，供糖尿病患者长期治疗保健使用。

(2)本发明所述的生物活性多肽来源于天然植物蛋白，具有稳定、安全、人体易吸收等特点，其制备原料为小麦胚芽油加工副产物-脱脂麦胚粉，价格低廉且来源广泛，可进行大规模产业化生产。

附图说明

图1为粗麦胚肽对α-葡萄糖苷酶的抑制活性曲线图。

图2为不同分子量级分麦胚肽对α-葡萄糖苷酶的抑制活性曲线图及IC₅₀值检测结果图。

图3为麦胚肽(<1KDa)在大鼠肠内的降血糖效果评价图。

图4为阿卡波糖与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。

图5为本发明高活性肽段LDLQK与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。

图6为本发明高活性肽段LDLQR与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。

图7为本发明高活性肽段LDLQH与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。

图8为本发明高活性肽段AGGFK与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。

图9为本发明高活性肽段AGGFR与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。

图10为本发明高活性肽段AGGFH与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。

图11为本发明高活性肽段MGGFK与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。

图12为本发明高活性肽段MGGFR与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。

图13为本发明高活性肽段MGGFH与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。

图14为本发明高活性肽段LDNFK与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。

图15为本发明高活性肽段LDNFR与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。

图16为本发明高活性肽段LDNFH与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例中未注明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件(如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。

实施例1.α-葡萄糖苷酶活性抑制多肽的制备

(1)麦胚蛋白提取：10g脱脂麦胚粉溶于100mL蒸馏水中，1M NaOH调节pH至11.0，50℃搅拌浸提2h，4000rpm离心15min，取上清，1M HCl调pH至4.5，4000rpm离心15min，沉淀即为麦胚蛋白，冻干备用。

(2)定向酶解制肽：采用生物信息学联合生物酶解技术定向酶解麦胚蛋白。首先采用生物信息学方法对蛋白结构进行分析，从UniProtKB蛋白质数据/NCBI基因库中下载麦胚蛋白氨基酸/基因序列，利用Biopep数据库中“Profiles of potential biologicalactivity”模块对氨基酸序列进行分析，评估其作为降血糖活性肽来源的潜力。在Biopep数据库“Enzymeaction”模块，单独或联合使用胃蛋白、胰蛋白酶、糜蛋白酶进行计算机辅助酶解，将得到的多肽采用

Maestro软件中的Glide模块进行虚拟筛选，利用Protein Preparation Wizard模块处理靶点蛋白(PDB ID:2QMJ，Resolution:

)，去除结晶水，补加缺失的氢原子，并修复缺失键信息，修补缺失肽段，最后对蛋白进行能量最小化、以及几何结构的优化。利用OPLS3e力场对受体进行约束最小化，所有多肽分子均按LigPre模块的默认设置制备。在Glide模块中进行筛选时，导入制备好的受体，以在受体网格生成中指定合适的位置。首先将原配体进行再对接，确认对接方法的选择的可行性。然后进行对接数据集的筛选。最后，利用对接模板筛选出得分较高的肽段，对获得的肽段进行活性预测并打分，取打分位于前列的肽段酶解条件作为实际酶解条件。

(3)麦胚蛋白酶解：参考上述步骤(2)虚拟酶解得到的酶解条件，10％NaOH调节0.8％麦胚蛋白溶液至pH8.0，蛋白充分溶解后沸水浴中煮沸10min，80W超声30min，冷却至37℃后加入蛋白质量1％的胰蛋白酶酶解1.5h，期间保持温度恒定，1M NaOH维持pH在8.0。酶解结束后，煮沸10min灭酶，得到酶解液。

(4)α-葡萄糖苷酶活性抑制多肽的分离纯化：所得酶解液首先经0.45μm滤膜过滤，将滤液依次经过10KDa、5KDa、3KDa、1KDa超滤膜，收集滤出液得到>10KDa、5-10KDa、3-5KDa、1-3KDa、<1KDa共5个不同分子量范围的肽级分，检测不同级分对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

(5)α-葡萄糖苷酶活性抑制肽的结构鉴定：液质联用对高活性麦胚肽组分进行鉴定，并对所得肽段再次进行虚拟筛选及分子对接，得到高活性肽段为LDLQ*/#GGF*/LDNF*，其中，*为碱性氨基酸K/R/H，#为A/M。

实施例2.生物活性多肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性检测

检测方法：在96孔酶标板孔中依次加入50μL 0.1mol/L PBS(0.01M,pH6.8)、50μL0.5U/mLα-葡萄糖苷酶以及50μL多肽溶液(用PBS配制不同浓度的多肽溶液)，混匀后于37℃恒温反应15min后加入100μL 1.5mmol/L 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)，混匀后于酶标仪内37℃孵育15min后检测其在405nm波长下的吸光度值，重复实验3次，取平均值。

酶活性抑制率的公式：I％＝[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100％；式中：A1为样液组的吸光度值，A2为以PBS代替酶溶液测得的样液组背景吸光度值，A3为以PBS溶液代替样液测得的空白对照组吸光度值，A4为以PBS溶液代替样液与以PBS溶液代替酶溶液测得的空白对照组背景吸光度值。

不同组分的多肽组分冷冻干燥的冻干粉，配制不同浓度溶液后检测α-葡萄糖苷酶抑制活性，检测结果如图1和图2所示。结果显示：粗麦胚肽对α-葡萄糖苷酶抑制活性IC₅₀为6.874mg/mL，将粗肽按照分子量大小进行分级后，发现分子量<1KDa的麦胚肽组分活性最高，IC₅₀值为2.097mg/mL，高活性多肽级分得到有效富集。

实施例3.大鼠肠囊翻转实验

雄性SD大鼠实验前禁食过夜，取空肠部分，生理盐水冲洗除去内容物，切成3cm长片段，采用灌胃针将空肠片段翻转，刷状缘毛朝外，两端打结封口，放入5mL含5M蔗糖，37℃的Ringer’s溶液中，加入或不加上述实施例1制备的生物活性多肽，孵育90min，每隔15min检测溶液中葡萄糖含量，计算葡萄糖生成速率，评价生物活性多肽的降血糖效果。图3结果表明，与不加生物活性多肽相比，1mg/mL的麦胚肽(<1KDa)即可显著降低葡萄糖生成速率，发挥优异降血糖效果。

实施例4.分子对接分析

α-葡萄糖苷酶(2QMJ)蛋白的晶体结构精度高，无关键残基缺失，通过原配体进行多次测试，确定了原配体与活性位点的结合模式(图4)。活性位点残基ASP-203，ARG-526，THR-205，ASP-542，HIS-600，ASP-327等在稳定配体发挥着重要的作用(图4)。这些活性位点氨基酸与原配体能够形成多个氢键，对稳定在蛋白口袋中的小分子有着较大的贡献。为了确定合适的对接方案用于筛选潜在的活性多肽分子，将对接后的原配体再次对接到2QMJ结合位点上，结合位置与先前的复合物中一致，表明该筛选方法的有效性，后期抑制剂的筛选均在此方法下进行。

麦胚多肽高活性组分鉴定所得肽段以同一方法将其与2QMJ进行对接(详见图5-图16)，发现其与α-葡萄糖苷酶活性中心的ASP-327，ARG-526，GLN-603，ASP-203，ASP-542等基团形成的较强的氢键相互作用，平均距离为

远小于传统氢键的

这些氢键的存在对稳定蛋白活性位点中的多肽小分子有着重要意义。因此，本申请所述的多肽与2QMJ蛋白匹配较好，结合能力强，而且所述多肽分子相互作用模式与阿卡波糖接近，说明所述多肽分子是一个潜在的α-葡萄糖苷酶抑制剂。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 北京工商大学

<120> 具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的麦胚蛋白多肽及其制备

<130> 20210826

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Leu Asp Leu Gln Lys

1 5

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Leu Asp Leu Gln Arg

1 5

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

Leu Asp Leu Gln His

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

Ala Gly Gly Phe Lys

1 5

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

Ala Gly Gly Phe Arg

1 5

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

Ala Gly Gly Phe His

1 5

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

Met Gly Gly Phe Lys

1 5

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

Met Gly Gly Phe Arg

1 5

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

Met Gly Gly Phe His

1 5

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

Leu Asp Asn Phe Lys

1 5

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

Leu Asp Asn Phe Arg

1 5

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

Leu Asp Asn Phe His

1 5

Claims

1.一种生物活性多肽，其特征在于：所述的生物活性多肽具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，所述的生物活性多肽包含如LDLQ*、#GGF*和/或LDNF*所示的氨基酸序列中的一种或多种，其中，*为碱性氨基酸K/R/H，#为A/M。

2.根据权利要求1所述的生物活性多肽，其特征在于：所述的生物活性多肽包含如SEQID NO:1-12所示的氨基酸序列中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的生物活性多肽，其特征在于：所述的生物活性多肽来自于小麦天然提取或人工合成。

4.一种权利要求1-3任一项所述的生物活性多肽的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的碱溶酸沉法提取步骤为：取脱脂麦胚粉按照料液比1:10的比例溶于蒸馏水中，1M NaOH调节pH至11.0，50℃搅拌浸提2h，4000rpm离心15min，取上清，1M HCl调pH至4.5，4000rpm离心15min，沉淀即为麦胚蛋白，冻干备用；

Maestro软件，以α-葡萄糖苷酶为靶点蛋白进行虚拟筛选，利用对接模板筛选出得分较高的前配体，对获得的多肽进行活性预测并打分，取打分位于前列的多肽虚拟酶解条件作为实际酶解条件；

具体地，步骤(3)中所述的生物活性多肽的具体制备方法为：按照虚拟酶解条件，将所得麦胚蛋白溶于pH8.0的缓冲溶液，加入胰蛋白酶进行酶解，得到酶解液，酶解液经0.45μm滤膜过滤后再经不同截留分子量滤膜超滤分离纯化，得到不同分子量级分的生物活性多肽，收集不同级分并检测各级分抑制活性，得到高活性生物活性多肽级分；

步骤(4)中所述的液质联用为LC-TOF-MS/MS。

6.权利要求1-3任一项所述的生物活性多肽在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。

7.一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其特征在于：所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂包含权利要求1-3任一项所述的生物活性多肽。

8.权利要求1-3任一项所述的生物活性多肽在制备降血糖药物和/或降血糖保健品中的应用。

9.一种降血糖药物，其特征在于：所述的降血糖药物包含权利要求1-3任一项所述的生物活性多肽。

10.一种降血糖保健品，其特征在于：所述的降血糖保健品包含权利要求1-3任一项所述的生物活性多肽。