CN102168124A - 复合酶结合碱法制备小麦胚芽活性多肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合酶结合碱法制备小麦胚芽活性多肽的方法，属于酶工程和农产品加工技术领域。该方法以脱脂小麦胚芽为原料，首先对其进行脱糖，脱糖后离心分离；得到的固形物用复合酶对其进行水解，然后调节溶液的pH8～9进行碱提，碱提后进行离心分离；离心分离后上清液通过膜进行分离，通过最小分子量膜的液体再进行透析脱盐；各级分离物采用双效浓缩后喷雾干燥得到不同分子量的生物活性肽粉。本发明通过低廉原材料制备出高纯度的生物活性肽，提高麦胚蛋白的利用率，对于缓解我国十分紧缺的蛋白和油脂资源，提高我国人民的膳食营养与健康水平，提高企业的经济效益，具有十分重要的意义。

Description

复合酶结合碱法制备小麦胚芽活性多肽的方法

技术领域

本发明涉及复合酶结合碱法制备小麦胚芽活性多肽的方法，属于酶工程和农产品加工技术领域。

背景技术

脱脂小麦胚芽蛋白质含量高达38％左右，是一种全价蛋白，它含有人体必需的8种氨基酸和2种半必需氨基酸，占总氨基酸34.74％。小麦胚芽蛋白质中必需氨基酸相互比值与FAO/WHO推荐模式值及大豆、牛肉、鸡蛋氨基酸构成比例基本接近，明显优于大米、面粉蛋白质中必需氨基酸构成比例，有很好氨基酸平衡，在营养学上具有重要意义。在科研文献报道中，小麦胚中谷胱甘肽的含量丰富，位于所有含谷胱甘肽的谷物原料之首。谷胱甘肽能够清除人体内的自由基，清洁和净化人体内的环境污染，从而增进人的身心健康。国内外研究发现：小麦胚芽蛋白生产制备的ACE抑制肽活性高、含量多、被认为是开发ACE抑制活性肽最具潜力的食物蛋白源；另外麦胚蛋白多肽中还含有阿片活性肽，其主要功能有镇静镇痛；保护心血管、保护心肌；增强免疫力；调节胃肠运动；增强记忆力；调节内分泌、调节精神情绪、调整睡眠等作用。

目前提取谷物蛋白的方法主要有碱提和酶解法。碱提主要是利用水作为蛋白质的提取剂，通过调节水的pH来提取蛋白质，通常将溶液的pH调到9以上对小麦胚芽进行浸提。但在高碱性pH值和加热的条件下，蛋白质分子间相互作用会生成赖氨酰丙氨酸，对动物呈毒性反应。酶法抽提小麦胚芽蛋白是利用蛋白酶对小麦胚芽蛋白的水解和修饰作用，使其变成可溶的肽类而被提取出来，酶法水解生产蛋白条件温和，提取率较高，部分蛋白质分解成多种氨基酸和许多小肽段，口感较好，可作为消化系统功能不健全特定人群(老年人、婴儿等)膳食蛋白来源。以往的研究中只选用单一酶，提取率不高且酶用量大。

我国小麦胚芽资源量在10万吨以上，但由于多种因素制约，至今仍未能得到充分合理利用，大部分被当作麸皮处理。同时，近年来小麦胚芽丰富的营养保健成分和具有突出生理功能的活性物质受到国内外研究者的重视，相关的研究日益深入。因此，加速这一资源的研究开发，提高麦胚蛋白的利用率，更加科学合理地利用麦胚，对于缓解我国十分紧缺的蛋白和油脂资源，丰富我国营养、保健食品的种类，提高我国人民的膳食营养与健康水平，提高企业的经济效益，具有十分重要的意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种复合酶结合碱法制备小麦胚芽活性多肽的方法。该方法以脱脂小麦胚芽为原料，首先对其进行脱糖，脱糖后离心分离；得到的固形物用复合酶对其进行水解，然后调节溶液的pH8～9进行碱提，碱提后进行离心分离；离心分离后上清液通过膜进行分离，通过最小分子量膜的液体再进行透析脱盐；各级分离物采用双效浓缩后喷雾干燥得到不同分子量的生物活性肽粉。

本发明的技术方案是：复合酶结合碱法制备小麦胚芽活性多肽的方法，包括粉碎、脱糖、复合酶水解、碱提、膜分离、透析脱盐、双效浓缩和喷雾干燥。

具体步骤如下：

1)脱脂小麦胚芽粉碎，过80～100目筛；称取粉碎后的脱脂小麦胚芽加入容器中，加入其质量5～8倍的水，搅匀后于75～85℃水浴0.8～1.2小时进行脱糖；

2)离心分离弃上清，加入水使底物浓度为3～6％(g/l)，然后加入食品级的盐酸调节溶液的pH值为6～7；温度40～60℃下，将中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按酶活比例2∶1～1∶2添加到溶液中，加酶量为400～600U/g底物，酶解90～120min；

3)使用食品级氢氧化钠将酶解液的pH值调到8～9，在40～50℃浸提0.8～1.2小时；

4)4500～5500rap/min离心12～18min，得到混合肽酶解液；

5)将得到的混合肽酶解液分别经过MW2000、MW600和MW300的聚砜膜分离，得到不同分子量大小的多肽溶液；

6)将通过MW300聚砜膜的液体进行透析脱盐；

7)将步骤5)和6)得到的各级分离物(步骤5)未通过MW2000聚砜膜的液体、通过MW2000聚砜膜但未通过MW600聚砜膜的液体、通过MW600聚砜膜但未通过MW300聚砜膜的液体和步骤6)透析脱盐的通过MW300聚砜膜的液体)分别采用双效浓缩后喷雾干燥得到不同分子量的生物活性肽粉。喷雾干燥的条件为：料液浓度为30-35wt％，料液温度为55～65℃，流量为130～170ml/h，进口温度为180～200℃，出口温度为60～70℃。

上述制得的蛋白质含量测定方法为：利用Folin-酚试剂法。

本发明的有益效果：

1、脱脂小麦胚芽粕，原料易得，来源广泛；

2、利用复合酶水解蛋白时，酶的添加量为400U/g底物时，麦胚蛋白的提取率达到了94.56wt％，生产1吨麦胚蛋白多肽，加入酶的成本为130-150元。而现有报导的麦胚蛋白最高提取率为92.43wt％，其中只使用木瓜蛋白酶，且加酶量为3000U/g溶液，其生产1吨麦胚蛋白多肽，加入酶的成本为640-660元。因此，利用复合酶提高了麦胚蛋白的提取率，同时降低酶的用量，节省了成本，提高了经济效益。

3、结合碱提，使提取更彻底，使其提取率达到94.56wt％且防止了纯碱提取需要高的pH带来的负面影响；

4、通过膜分离的控制得到了不同分子量且纯度较高的肽。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的方法作进一步说明，但不限于此。实施例中使用的脱脂小麦胚芽由山东广明实业有限公司提供，蛋白含量为36.5wt％，脂肪含量为2.90-3.20wt％。各种蛋白酶均由山东省发酵设计院提供。

实施例1

1)蛋白酶的选择

本实验从木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶四种蛋白酶中选出两种酶对脱脂后的小麦胚芽蛋白进行水解。按照每种蛋白酶的最适反应条件水解蛋白，用Folin-酚法测水解液中蛋白质的含量。四种蛋白酶水解麦胚蛋白的提取率分别为83.56wt％，76.84wt％，76.55wt％，87.64wt％但是，由于碱性蛋白酶水解得到的水解液略有苦味，不适宜食用。而且，菠萝蛋白酶和中性蛋白酶比较来看，其提取率相差不大。从经济角度考虑，中性蛋白酶的添加量较菠萝蛋白酶少，且价格较便宜，最终选择木瓜蛋白酶和中性蛋白酶作为制备麦胚生物活性肽的酶。

2)最佳复合酶配比的选择

将木瓜蛋白酶与中性蛋白酶以2∶1、1∶1、1∶2和1∶3的酶活比例配比混合，加酶量为500U/g，在55℃，pH为6，底物浓度为8％(g/l)的条件下水解2小时，测其水解中多肽的含量，得出粗提率。蛋白质的提取率随着木瓜蛋白酶与中性蛋白酶配比的不同而不同，其提取率分别为87.04wt％，90.23wt％，84.16wt％和81.78wt％。实验结果表明，木瓜蛋白酶与中性蛋白酶的配比为1∶1时提取率最高。

3)最佳胚芽颗粒度的选择

原料粒度的大小直接决定原料的比表面积，进而影响酶与底物的接触和作用过程，原料直径愈小，直径方向上的尺寸对酶的作用阻碍愈小，酶分子的流动阻碍愈小，酶与原料接触愈充分，酶解速度就愈快。

实验结果表明随着粒度的减小提取率逐渐增加，但当粒度减小到80目以上时，提取率增加趋于平缓。由于粒度越小，粉碎的强度越大，由于局部过热导致蛋白质变性的可能性也越大，同时耗能也越大，而且100目筛下物较少。

4)最佳提取温度的选择

每种酶都有各自的最适水解温度，木瓜蛋白酶为60℃，中性蛋白酶为55℃。为了探索混合酶的最适反应温度，取20g过80目的脱脂麦胚5份于烧杯中，在加酶量为500U/g底物，木瓜蛋白酶：中性蛋白酶酶活比例为1∶1，pH为6，底物浓度为8％(g/l)，分别在40℃，45℃，50℃，55℃，60℃条件下水解2小时，多肽的提取率分别为83.66wt％，86.94wt％，91.04wt％，88.01wt％和85.04wt％。实验结果表明随着温度的升高提取率逐渐增大，但当温度升高至50℃以后，随着温度的继续升高提取率逐渐下降，因此将实验的最适反应温度定为50℃。

5)最佳提取pH的选择

取20g脱脂麦胚(过80目)于烧杯中，在50℃，pH分别为4、5、6、7、8的条件下水解2h，加酶量和底物浓度同上。通过Folin-酚法测得的水解液中多肽含量及提取率分别为67.85wt％，76.31wt％，89.56wt％，91.74wt％和83.37wt％。结果表明随着pH的升高，提取率也逐渐升高，当pH为6和7时提取率较高，且相差并不大。随着pH的继续增大，提取率却随之减小，因此，将实验的最佳pH确定为6-7之间。

6)最佳提取时间的选择

分别取20g脱脂麦胚(过80目)于烧杯中，在50℃，pH为6，底物浓度为8％(g/l)，加酶量同上的条件下水解45min、60min、90min、120min和180min，得到蛋白提取率分别为65.64wt％，84.90wt％，90.63wt％，9099wt％和91.23wt％。实验结果表明提取的蛋白质含量从开始的30min起呈明显的上升趋势，但到90min基本达到稳定，过分长的提取时间是无效的。这是因为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶是内切酶，在反应初期，大量的肽键可同时被其水解，但随着水解时间的推移，水解液中可被蛋白酶水解的肽键的浓度逐渐减少，同时酶活性也会随水解进程而逐渐减弱，加之酶本身也是蛋白质，也有被水解的可能。因此，将实验的最佳提取时间定为90min。

7)最佳底物浓度的选择

分别取20g脱脂麦胚(过80目)于烧杯中，在50℃，pH为6，底物浓度分别为10％(g/l)、8％(g/l)、5％(g/l)和3％(g/l)，加酶量同上的条件下水解90min，蛋白质的提取率分别为73.84wt％，86.49wt％，91.21wt％和91.59wt％。实验结果表明随着底物浓度的降低，提取率逐渐升高，且当低于5％(g/l)后提取率升高更加缓慢，但这一条件不仅影响到蛋白质的得率，同时也考虑生产成本的合理性，从经济角度考虑，将最佳的底物浓度定为5％(g/l)。

8)最佳添酶量的选择

分别取20g脱脂麦胚(过80目)于烧杯中，在50℃，pH为6，底物浓度为5％(g/l)，加酶量分别为250U/g底物、350U/g底物、400U/g底物、450U/g底物、500U/g底物和600U/g底物，水解90min，蛋白的提取率分别为66.85wt％，78.49wt％，91.10wt％，90.5wt 5％，89.86wt％和90.14wt％。实验结果表明加酶量的增加使提取率趋于直线增加，但当加酶量增加到400U/g底物后，提取率基本趋于平稳，因此最佳添酶量为400U/g底物，其用量均比各单一酶的添加量少。原因可能是当酶增加到一定量时酶分子已被底物充分结合达到饱和状态，此时再增加酶用量也是无用的。

9)多肽粉的制备

以上的实验得到了酶解脱脂麦胚的最佳配方，在该配方的条件下酶解麦胚后，将酶解液的pH调到8-9之间，45℃碱提1h，5000rap/min离心15min后得到水解液。用Folin-酚法测水解液中蛋白质的含量。蛋白质的提取率为94.56wt％，然后将得到的混合肽酶解液分别经过MW2000、MW600和MW300的聚砜膜分离，得到不同分子量大小的多肽溶液；将通过MW300膜的液体进行分级透析脱盐；得到的各级分离物。未通过MW2000聚砜膜的液体、通过MW2000聚砜膜但未通过MW600聚砜膜的液体、通过MW600聚砜膜但未通过MW300聚砜膜的液体和透析脱盐的通过MW300聚砜膜的液体分别采用双效浓缩后喷雾干燥得到不同分子量的生物活性肽粉，测得分子量从大到小的分离物的蛋白质的纯度分别为96.74wt％、95.1wt％、95.8wt％、89.64wt％。

实施例2

1)脱脂小麦胚芽粉碎成粉状，过80目筛。称取粉碎后的20g脱脂小麦胚芽于烧杯中，加入120ml的水，搅匀后于80℃水浴1小时进行脱糖。

2)离心分离弃上清，加入水使底物浓度为6％(g/l)，使用食品级盐酸调节水解液的pH值为6-7，温度50℃，将中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按酶活比例1∶1，添加到浸泡液中，加酶量为400U/g底物，酶解120min；

3)使用食品级氢氧化钠将酶解液的pH值调到8-9，在45℃浸提1小时；

4)5000rap/min离心15min，得到混合肽酶解液；

5)将得到的混合肽酶解液分别经过MW2000、MW600和MW300的聚砜膜，得到不同分子量大小的多肽溶液；

6)将通过MW300膜的液体进行分级透析脱盐；

7)将由5)和6)得到的各级分离物采用双效浓缩后喷雾干燥得到不同分子量的肽粉，喷雾干燥的条件为：料液浓度为30-35wt％，料液温度为60℃，流量为150ml/h，进口温度为190℃，出口温度为70℃；测得分子量从大到小的分离物的蛋白质的纯度分别为94.96wt％、95.0wt％、93.5wt％、90.5wt％。蛋白质的提取率达到94.45wt％。

实施例3：

1)脱脂小麦胚芽粉碎成粉状，过80目筛。称取粉碎后的20g脱脂小麦胚芽蛋白于烧杯中，加入130ml的水，搅匀后于80℃水浴1小时进行脱糖。

2)离心分离弃上清，加入水使底物浓度6％(g/l)，使用食品级盐酸调节水解液液的pH值为6-7之间，温度60℃，将中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按酶活比例1∶1，添加到浸泡液中，加酶量为450U/g底物，酶解120min；

3)利用食品级氢氧化钠将酶解液的pH值调到8-9之间，再45℃浸提1小时；

4)5000rap/min离心15min，得到混合肽酶解液溶液；

5)将得到的混合肽酶解液分别经过MW2000、MW600和MW300的聚砜膜，得到不同分子量大小的多肽溶液；

6)将通过MW300膜的液体进行分级透析脱盐；

7)将由5)和6)得到的各级分离物采用双效浓缩后喷雾干燥得到不同分子量的肽粉，喷雾干燥的条件为：料液浓度为30％-35wt％之间，料液温度为60℃，流量为150ml/h，进口温度为190℃，出口温度为70℃；测得分子量从大到小的分离物的蛋白质的纯度分别为95.34wt％、95.4wt％、96.3wt％、90.12wt％。蛋白质的提取率达到94.38wt％。

Claims (6)

1.一种复合酶结合碱法制备小麦胚芽活性多肽的方法，其特征是，以脱脂小麦胚芽为原料，首先对其进行脱糖，脱糖后离心分离；得到的固形物用复合酶对其进行水解，然后调节溶液的pH8～9进行碱提，碱提后进行离心分离；离心分离后上清液通过膜进行分离，通过最小分子量膜的液体再进行透析脱盐；各级分离物采用双效浓缩后喷雾干燥得到不同分子量的生物活性肽粉。

2.如权利要求1所述的复合酶结合碱法制备小麦胚芽活性多肽的方法，其特征是，包括以下步骤：

1)脱脂小麦胚芽粉碎，过80～100目筛；称取粉碎后的脱脂小麦胚芽加入容器中，加入其质量5～8倍的水，搅匀后于75～85℃水浴0.8～1.2小时进行脱糖；

2)离心分离弃上清，加入水使底物浓度为3～6％，然后加入食品级的盐酸调节溶液的pH值为6～7；温度40～60℃下，将中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按酶活比例2∶1～1∶2添加到溶液中，加酶量为400～600U/g底物，酶解90～120min；所述底物浓度百分数为质量体积比；

3)使用食品级氢氧化钠将酶解液的pH值调到8～9，在40～50℃浸提0.8～1.2小时；

4)4500～5500rap/min离心12～18min，得到混合肽酶解液；

5)将得到的混合肽酶解液分别经过MW2000、MW600和MW300的聚砜膜分离，得到不同分子量大小的多肽溶液；

6)将通过MW300聚砜膜的液体进行透析脱盐；

7)将步骤5)和6)得到的各级分离物分别采用双效浓缩后喷雾干燥得到不同分子量的生物活性肽粉；所述各级分离物为步骤5)未通过MW2000聚砜膜的液体、通过MW2000聚砜膜但未通过MW600聚砜膜的液体、通过MW600聚砜膜但未通过MW300聚砜膜的液体和步骤6)透析脱盐的通过MW300聚砜膜的液体；所述喷雾干燥的条件为：料液浓度为30-35wt％，料液温度为55～65℃，流量为130～170ml/h，进口温度为180～200℃，出口温度为60～70℃。

3.如权利要求2所述的复合酶结合碱法制备小麦胚芽活性多肽的方法，其特征是，所述步骤2)底物浓度为6％，酶解温度为50℃，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶活比例为1∶1，加酶量为400U/g底物，酶解时间为120min。

4.如权利要求2所述的复合酶结合碱法制备小麦胚芽活性多肽的方法，其特征是，所述步骤2)底物浓度为5％，酶解温度为50℃，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶活比例为1∶1，加酶量为400U/g底物，酶解时间为90min。

5.如权利要求2所述的复合酶结合碱法制备小麦胚芽活性多肽的方法，其特征是，所述步骤3)浸提温度为45℃，浸提时间为1小时。

6.如权利要求2-5中任意一项所述的复合酶结合碱法制备小麦胚芽活性多肽的方法，其特征是，所述步骤7)喷雾干燥的条件为：料液浓度为30-35wt％，料液温度为60℃，流量为150ml/h，进口温度为190℃，出口温度为70℃。