CN102864200A

CN102864200A - 复合酶水解大米分离蛋白制备ace抑制肽的方法

Info

Publication number: CN102864200A
Application number: CN2012103464899A
Authority: CN
Inventors: 陈季旺; 蔡广霞; 吴永宁
Original assignee: Wuhan Polytechnic University
Current assignee: Wuhan Polytechnic University
Priority date: 2012-09-17
Filing date: 2012-09-17
Publication date: 2013-01-09

Abstract

本发明公开了一种复合酶水解大米分离蛋白制备ACE抑制肽的方法，该方法包括如下步骤：1）调节质量体积比浓度为5~8%的大米分离蛋白水溶液的温度至45~55℃，pH值至 8.5~9.5，按加酶量48~60AU/kg加入碱性蛋白酶水解120~150min；然后，2）调节体系温度至36~38℃，pH值至7~8，按加酶量12.5~25USP/kg加入胰蛋白酶水解30~60min；再然后，3）调节pH值至5.0~5.5，酶解液依次经固液分离、超滤膜筛分、脱盐、浓缩和冷冻干燥后，制得ACE抑制肽产品。本发明采用两种酶复合分别作用不同酶切位点，制备的ACE抑制肽得率高、活性强，并且该方法工艺简单，反应条件温和，有利于工业化生产。

Description

复合酶水解大米分离蛋白制备ACE抑制肽的方法

技术领域

本发明属于食品加工技术领域，具体涉及功能食品加工技术，特别是复合酶水解大米分离蛋白制备ACE（即血管紧张素转化酶）抑制肽的方法。

背景技术

全世界每年因高血压死亡约1200万人，在发达国家及较发达国家，其患病率高达20%以上，在发展中国家，近年来高血压的患病率也在不断增长。目前，我国高血压患病率已上升到11.88%，患病人数估计1亿多人。在高血压人群中有95%以上的患者是原发性高血压，通过抑制ACE活性可有效地降低原发性高血压。临床上常用的ACE抑制剂有卡托普利（Captopril）、依那普利（Enalapril）、赖诺普利（Lisinopril）、福辛普利（Fosinopril）等，但是这些合成的ACE抑制剂具有不良反应，如引发蛋白尿和白细胞减少等，严重威胁患者的生命安全。

食物源ACE抑制肽通常是在温和条件下由蛋白酶水解蛋白质而获得，其食用安全性高，无毒副作用，对高血压患者具有降压效果，而对血压正常者无降压作用，不存在降压过度的现象。除降血压功能外，食物源ACE抑制肽同时具有减肥、免疫调节和易消化吸收等功能，有着人工合成的药用ACE抑制剂不可比拟的优越性，其良好的安全性能以及多方面的生理功能吸引了众多的研究者，开发天然ACE抑制肽产品已成为高血压等非药物治疗中的重要组成部分。

目前已从乳蛋白、卵蛋白、油料蛋白、谷物蛋白、肉蛋白、鱼蛋白等分离出多种ACE抑制肽，并通过反相高效液相色谱法（RP~HPLC）、紫外分光光度法等分析了有ACE抑制活性的组分。这些方法多采用单一蛋白酶水解蛋白质、超滤分离、活性炭脱色精制等，肽得率和ACE抑制活性较低，灰分含量较高等而影响其应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种复合酶水解大米分离蛋白制备ACE抑制肽的方法，该方法制备的ACE抑制肽可提高ACE抑制活性和肽得率。

为实现上述目的，本发明的复合酶水解大米分离蛋白制备ACE抑制肽的方法包括如下步骤：

1）调节质量体积比浓度为5~8%的大米分离蛋白水溶液的温度至45~55℃，pH值至 8.5~9.5，按加酶量48~60AU/kg加入碱性蛋白酶水解120~150min；然后，

2）调节体系温度至36~38℃，pH值至7~8，按加酶量12.5~25USP/kg加入胰蛋白酶水解30~60min；再然后，

3）调节pH值至5.0~5.5，酶解液依次经固液分离、超滤膜筛分、脱盐、浓缩和冷冻干燥后，制得ACE抑制肽产品。

进一步地，所述步骤3）中，超滤膜是截留相对分子质量为3000的超滤膜。

进一步地，所述步骤3）中，脱盐步骤采用大孔树脂吸附方法或采用离子交换树脂吸附方法。

进一步地，所述步骤1）中，大米分离蛋白水溶液质量体积比浓度为7.5%，pH值为9.0，水解温度为50℃，酶与底物比为54 AU/kg，水解时间为120min。

进一步地，所述步骤2）中，pH值为8，水解温度为37℃，酶与底物比为20USP/kg，水解时间为30min。

本发明具有如下的优点：

1.工艺简单，反应条件温和，利于工业化生产。

大米蛋白主要为谷蛋白，在碱性溶液中溶解度较高。碱性蛋白酶最适pH值为8~10，先采用碱性蛋白酶水解能使大米分离蛋白在水中具有较高的溶解度，酶分子和蛋白质分子可以充分接触，缩短水解时间，提高生产效率。后续膜分离、树脂洗脱均在常温下操作，能耗小，产品中灰分低，利于工业化生产。

2.ACE抑制肽得率高、活性强。

碱性蛋白酶主要水解羧基末端为疏水性氨基酸的肽键，胰蛋白酶主要水解羧基末端为碱性氨基酸的肽键。采用碱性蛋白酶、胰蛋白酶分步水解大米分离蛋白，不仅反应条件温和，而且由于二种蛋白酶作用不同酶切位点，ACE抑制肽的相对分子质量低，主要集中在1000以下，因此ACE抑制肽的得率大于40%，其IC₅₀值（ACE抑制活性为最大值一半时的ACE抑制肽的浓度）为0.15-0.20mg/ml。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

采用丹麦Novozymes公司提供的碱性蛋白酶（Alcalase 2.4L FG，2.4AU/g，枯草杆菌生产，其活力采用动力学二甲醛酪蛋白法测定。）及胰蛋白酶（Trypsin Novo 6.0，1250USP/mg，由猪胰腺中提取，其活力采用紫外分光光度法测定。）制备工艺条件为：大米分离蛋白水溶液质量体积比浓度为7.5%，pH值为9，反应温度为50℃，加酶量为54AU/kg，水解反应120min后，迅速调节反应温度为37℃，pH值为8，按加酶量20USP/kg加入胰蛋白酶水解反应30 min。然后调节pH值至5.0，灭酶并去除大分子多肽。酶解液在4000 r/min条件下离心分离20 min，取上清液通过截留相对分子质量为3000的超滤膜分离，收集透过液经聚苯乙烯型大孔吸附树脂脱盐，用75%的乙醇洗脱。乙醇洗脱液经真空浓缩、冷冻干燥，制得ACE抑制肽产品，外官呈白色粉末状，得率为46%。测定其抑制ACE的抑制率和浓度，计算IC₅₀值，以及灰分等其他指标见表1。

表1 大米ACE抑制肽主要理化指标

实施例2

采用丹麦Novozymes公司提供的碱性蛋白酶（Alcalase 2.4L FG，2.4AU/g，枯草杆菌生产，其活力采用动力学二甲醛酪蛋白法测定。）及胰蛋白酶（Trypsin Novo 6.0，1250 USP/mg，由猪胰腺中提取，其活力采用紫外分光光度法测定。）制备工艺条件为：大米分离蛋白水溶液质量体积比浓度为7.5%，pH值为9，反应温度为50℃，加酶量为60 AU/kg，水解反应120 min后，迅速调节反应温度为37℃，pH值为7.5，按加酶量25USP/kg加入胰蛋白酶水解反应30 min。反应结束调节pH值至5.0，灭酶并去除大分子多肽。酶解液在4000 r/min条件下离心分离20 min，取上清液通过截留相对分子质量为3000的超滤膜分离，收集透过液经聚苯乙烯型大孔吸附树脂脱盐，用75%的乙醇洗脱。乙醇洗脱液经真空浓缩、冷冻干燥，制得ACE抑制肽产品，外官呈白色粉末状，得率为45%。测定其抑制ACE的抑制率和浓度，计算IC₅₀值，以及灰分等其他指标见表2。

表2 大米ACE抑制肽主要理化指标

实施例3

采用丹麦Novozymes公司提供的碱性蛋白酶（Alcalase 2.4L FG，2.4AU/g，枯草杆菌生产，其活力采用动力学二甲醛酪蛋白法测定。）及胰蛋白酶（Trypsin Novo 6.0，1250USP/mg，由猪胰腺中提取，其活力采用紫外分光光度法测定。）制备工艺条件为：大米分离蛋白水溶液质量体积比浓度为7.5%，pH值为9，反应温度为50℃，加酶量为48 AU/kg，水解反应120 min后，迅速调节反应温度为37℃，pH值为7.5，按加酶量12.5USP/kg加入胰蛋白酶水解反应30 min。然后调节pH值至5.0，灭酶并去除大分子多肽。酶解液在4000 r/min条件下离心分离20 min，取上清液通过截留相对分子质量为3000的超滤膜分离，收集透过液经聚苯乙烯型混合床离子交换树脂脱盐，脱盐液经真空浓缩、冷冻干燥，制得ACE抑制肽产品，外官呈白色粉末状，得率为42%。测定其抑制ACE的抑制率和浓度，计算IC₅₀值，以及灰分等其他指标见表3。

表3 大米ACE抑制肽感官特性和主要理化指标

实施例4

采用丹麦Novozymes公司提供的碱性蛋白酶（Alcalase 2.4L FG，2.4AU/g，枯草杆菌生产，其活力采用动力学二甲醛酪蛋白法测定。）及胰蛋白酶（Trypsin Novo 6.0，1250USP/mg，由猪胰腺中提取，其活力采用紫外分光光度法测定。）制备工艺条件为：大米分离蛋白水溶液质量体积比浓度为7.5%，pH值为9，反应温度为50℃，加酶量为60AU/kg，水解反应60min后，迅速调节反应温度为37℃，pH值为7.5，按加酶量25USP/kg加入胰蛋白酶水解反应60 min。然后调节pH值至5.0，灭酶并去除大分子多肽。酶解液在4000 r/min条件下离心分离20 min，取上清液通过截留相对分子质量为3000的超滤膜分离，收集透过液经聚苯乙烯型混合床离子交换树脂脱盐，脱盐液经真空浓缩、冷冻干燥，制得ACE抑制肽产品，外官呈白色粉末状，得率为41%。测定其抑制ACE的抑制率和浓度，计算IC₅₀值，以及灰分等其他指标见表4。

表4 大米ACE抑制肽主要理化指标

Claims

1.一种复合酶水解大米分离蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的复合酶水解大米分离蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于：所述步骤3）中，超滤膜是截留相对分子质量为3000的超滤膜。

3.如权利要求1或2所述的复合酶水解大米分离蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于：所述步骤3）中，脱盐步骤采用大孔树脂吸附方法。

4.如权利要求3所述的复合酶水解大米分离蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于：所述步骤3）中，脱盐步骤采用大孔树脂吸附方法。

5.如权利要求1或2所述的复合酶水解大米分离蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于：所述步骤3）中，脱盐步骤采用离子交换树脂吸附方法。

6.如权利要求3所述的复合酶水解大米分离蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于：所述步骤3）中，脱盐步骤采用离子交换树脂吸附方法。

7.如权利要求1或2所述的复合酶水解大米分离蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于：所述步骤1）中，大米分离蛋白水溶液质量体积比浓度为7.5%，pH值为9.0，水解温度为50℃，加酶量为54AU/kg，水解时间为120min。

8.如权利要求3所述的复合酶水解大米分离蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于：所述步骤1）中，大米分离蛋白水溶液质量体积比浓度为7.5%，pH值为9.0，水解温度为50℃，加酶量为54AU/kg，水解时间为120min。

9.如权利要求1或2所述的复合酶水解大米分离蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于：所述步骤2）中，pH值为8，水解温度为37℃，加酶量为20USP/kg，水解时间为30min。

10.如权利要求3所述的复合酶水解大米分离蛋白制备ACE抑制肽的方法，其特征在于：所述步骤2）中，pH值为8，水解温度为37℃，加酶量为20USP/kg，水解时间为30min。