CN106498015A - 一种菲律宾蛤仔降血压肽的制备方法及应用 - Google Patents

一种菲律宾蛤仔降血压肽的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种菲律宾蛤仔降血压肽的制备方法及应用，其具体步骤为1）预处理；2）活化；3）发酵；4）酶解；5）超滤；6）凝胶层析、冷冻干燥。本发明的有益效果为：配置了枯草芽孢杆菌的种子培养基，加快了菌种的活化速度，提高了产中性蛋白酶的能力；发酵过程中加入了调节剂，提高了枯草芽孢杆菌的产酶速度；酶解过程中加入了酶解剂和添加剂，加快了酶解速度，保护了降压肽的活性。上述制备方法菲律宾蛤仔降血压肽的提取率高，提取的降压肽纯度高，安全无毒，活性强，对ACE抑制效果显著，操作简单适合大规模生产。

Description

一种菲律宾蛤仔降血压肽的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及降压肽制备技术领域，具体是一种菲律宾蛤仔降血压肽的制备方法及应用。
背景技术
降血压肽，又称为血管紧张素转化酶( Angioensin I Converting Enzyme，简称ACE )抑制肽，是从食物蛋白中分离出的一类具有显著降低血压功效的多肽短链物质。从来源上，可分为乳蛋白(包括酪蛋白、乳清蛋白)、发酵食品、动物蛋白、植物蛋白以及天然ACE抑制肽。这些来源于食品的降血压肽通常由蛋白酶在温和条件下水解蛋白质而获得，食用安全性高，其共同突出优点是只对高血压患者起到降压作用，对血压正常者无降压作用，因而不会有降压过度现象发生。除降压功能，它们往往具有免疫促进、抗凝血、易消化吸收和抗肿瘤等功能。而化学合成的降压药物(如卡托普利等)，虽然治疗高血压的效果非常明显，但其对肾脏的毒副作用，以及服药后出现低血压、干咳等症状，使人们对其安全性产生忧虑。 降血压肽的开发，以及关键的分离提纯过程，具有很大的现实意义。
现有技术如授权公告号为CN101168762B的中国发明专利，公开了一种发酵法利用带鱼脊骨制备降血压肽的方法，包括如下步骤：(1) 将蔗糖、粉碎后的带鱼脊骨、蛋白胨、K2HPO4、MgSO4·7H2O 及水配制成发酵培养基，灭菌后接种地衣芽孢杆菌，经培养得到发酵液；(2) 将发酵液离心后取上清液，将上清液过滤，滤液灭酶；(3) 灭酶后的滤液离心，离心上清液用活性炭脱色除味，得到脱色除味后的滤液；(4) 将脱色除味后的滤液进行超滤，得到透过液，透过液真空浓缩后冷冻干燥，得到具有降血压功能的肽粉。本发明方法采用的原料来源丰富，价格低廉，操作简单，具有较强的工业化实施性。该方法制备的肽粉杂质多，纯度不理想且降压肽的提取率也有待提高。授权公告号为CN104031967B的中国发明专利，公开了一种沙丁鱼降血压肽及其制备方法与应用，该方法主要技术步骤如下：沙丁鱼预处理成均浆后，先加入木瓜蛋白酶进行酶解，再加入碱性蛋白酶进行酶解；酶解完成后灭酶，并对灭酶后的酶解液进行离心；取离心后的上清液，利用超滤、凝胶层析的方法，对粗制品进行分离纯化；对分离纯化后的高效组分进行冷冻干燥，得到沙丁鱼降血压肽。沙丁鱼产量高、价格低廉，因此以沙丁鱼作为原料制备降血压肽，能充分提高沙丁鱼的综合利用价值，并且通过酶解获得的沙丁鱼降血压肽，不存在安全性问题，没有化学降血压类药物的副作用，降压效果理想。该方法降压肽的提取率不理想，提取出来的降压肽有一部分已经失去活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取率高，提取的菲律宾蛤仔降血压肽纯度高，安全无毒，活性强，对ACE抑制效果显著的制备方法及应用。
本发明为解决背景技术中提出的问题采取的技术方案为：
1）预处理：将菲律宾蛤仔去壳取肉用冰水清洗3~5次，在鼓风干燥机中干燥，温度为60~70℃，干燥时间为1~2h，再用超声波粉碎仪进行粉碎，过200~400目筛。将菲律宾蛤仔粉碎成粉末增大了比表面积，可以使发酵和酶解反应更充分，也可缩短反应时间；
2）活化：将枯草芽孢杆菌置于种子培养基上活化，活化温度为30~40℃，活化时间为12~24h，培养基中的物质刺激枯草芽孢杆菌生长繁殖，将活性不大的枯草芽孢杆菌菌粉活化为活力旺盛，数量足够的菌群，为下一步的发酵做准备；
3）发酵：按照固液比1:3~1:5的比例在蛤仔粉中加入蒸馏水，搅拌均匀后接入活化后的枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌占原料质量的3~7%，加入调节剂，发酵温度为50~70℃，发酵时间为20~30h，发酵期间不断通入氧气，使发酵液中溶解氧浓度为0.2~0.4%，发酵结束后过滤。枯草芽孢杆菌是需氧型细菌，液体中溶解氧浓度过低会限制其生长繁殖，发酵速度降低，所以需要通入氧气。枯草芽孢杆菌生长过程中会产生α-淀粉酶和中性蛋白酶，蛋白酶会将蛤仔蛋白水解使其溶于水溶液中，将其从固体粉末中提取出来；
4）酶解：在发酵液中加入酶解剂和添加剂，酶解剂占发酵液的0.4~0.7%，添加剂占酶解液的0.01~0.03%，酶解温度为38~50℃，pH为6.1~6.9，酶解时间为2.5~3.5h，酶解结束后，沸水浴灭酶10~15min，过滤。酶解剂将蛤仔蛋白进一步水解成多肽，酶解效率高。添加剂能保护水解得到的降压肽的活性，避免重金属离子和具氧化性的物质对降压肽结构的破坏；
5）超滤：用活性炭对滤液进行脱色去味，根据菲律宾蛤仔降血压肽的分子量大小选择超滤膜超滤，将滤液先用12000~15000Da的膜超滤，压力为0.12~0.16MPa，其透过液再用900~1300Da 的膜超滤，压力为0.1~0.2MPa，取滞留液得到多肽粗液。降压肽的分子量在1500~10000Da，超滤后降压肽没有损失并除去了分子量大于10000~15000 Da和分子量小于900~1300Da的杂质；
6）凝胶层析、冷冻干燥：将多肽粗液进行凝胶层析，得到菲律宾蛤仔降血压肽浓缩液，冷冻干燥得到菲律宾蛤仔降血压肽粉末。菲律宾蛤仔降血压肽粉末纯度高，活性强，对ACE抑制效果显著且安全无毒。
种子培养基成份及其重量份为：20~30份琼脂，10~15份酵母提取物，5~10份葡萄糖，4~8份牛肉汁，1~4份氯化钠，2~5份维生素A，1~3份柠檬酸，4~9份大豆蛋白，2~5份硅藻多糖和0.5~1.5份硫代甜菜碱。上述培养基活化枯草芽孢杆菌的速度快，活化的菌种活力旺盛，产中性蛋白酶的能力高。
调节剂成份及其重量比为：12~25份酵母提取液，2~5份氯化钠，5~10份牛肉汁，1~4份松香聚氧乙烯酯，2~4份椰子油提取物和1~3份乙二醇。上述调节剂可加快枯草芽孢杆菌的生长繁殖速度，且产中性蛋白酶能力增强。
酶解剂成份及其重量份为：10~20份风味蛋白酶，1~5份半胱氨酸，2~5份N-酰基谷氨酸，1~3份十八烷基三甲基氯化铵和0.2~0.6份硫酸钠。上述酶解剂水解蛤仔蛋白效率高，缩短了降压肽制备的时间。
添加剂成份及其重量份为：3~8份牛血清白蛋白外源蛋白，2~5份乙二醇，3~6份还原型谷胱甘肽，3~9份磷酸盐缓冲液，2~5份花青素和0.7~1.4份维生素C。上述添加剂能保护水解得到的降压肽的活性，避免重金属离子和具氧化性的物质对降压肽结构的破坏。
具体实施例
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种菲律宾蛤仔降血压肽的制备方法及应用，具体步骤如下：
1）预处理：将菲律宾蛤仔去壳取肉用冰水清洗3~5次，在鼓风干燥机中干燥，温度为60~70℃，干燥时间为1~2h，再用超声波粉碎仪进行粉碎，过200~400目筛.。将菲律宾蛤仔粉碎成粉末增大了比表面积，可以使发酵和酶解反应更充分，也可缩短反应时间；
2）活化：将枯草芽孢杆菌置于种子培养基上活化，活化温度为30~40℃，活化时间为12~24h，培养基中的物质刺激枯草芽孢杆菌生长繁殖，将活性不大的枯草芽孢杆菌菌粉活化为活力旺盛，数量足够的菌群，为下一步的发酵做准备；
3）发酵：按照固液比1:3~1:5的比例在蛤仔粉中加入蒸馏水，搅拌均匀后接入活化后的枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌占原料质量的3~7%，加入调节剂，发酵温度为50~70℃，发酵时间为20~30h，发酵期间不断通入氧气，使发酵液中溶解氧浓度为0.2~0.4%，发酵结束后过滤。枯草芽孢杆菌是需氧型细菌，液体中溶解氧浓度过低会限制其生长繁殖，发酵速度降低，所以需要通入氧气。枯草芽孢杆菌生长过程中会产生α-淀粉酶和中性蛋白酶，蛋白酶会将蛤仔蛋白水解使其溶于水溶液中，将其从固体粉末中提取出来；
4）酶解：在发酵液中加入酶解剂和添加剂，酶解剂占发酵液的0.4~0.7%，添加剂占酶解液的0.01~0.03%，酶解温度为38~50℃，pH为6.1~6.9，酶解时间为2.5~3.5h，酶解结束后，沸水浴灭酶10~15min，过滤。酶解剂将蛤仔蛋白进一步水解成多肽，酶解效率高。添加剂能保护水解得到的降压肽的活性，避免重金属离子和具氧化性的物质对降压肽结构的破坏；
5）超滤：用活性炭对滤液进行脱色去味，根据菲律宾蛤仔降血压肽的分子量大小选择超滤膜超滤，将滤液先用12000~15000Da的膜超滤，压力为0.12~0.16MPa，其透过液再用900~1300Da 的膜超滤，压力为0.1~0.2MPa，取滞留液得到多肽粗液。降压肽的分子量在1500~10000Da，超滤后降压肽没有损失并除去了分子量大于10000~15000 Da和分子量小于900~1300Da的杂质；
6）凝胶层析、冷冻干燥：将多肽粗液进行凝胶层析，得到菲律宾蛤仔降血压肽浓缩液，冷冻干燥得到菲律宾蛤仔降血压肽粉末。菲律宾蛤仔降血压肽粉末纯度高，活性强，对ACE抑制效果显著且安全无毒。
种子培养基成份及其重量份为：20~30份琼脂，10~15份酵母提取物，5~10份葡萄糖，4~8份牛肉汁，1~4份氯化钠，2~5份维生素A，1~3份柠檬酸，4~9份大豆蛋白，2~5份硅藻多糖和0.5~1.5份硫代甜菜碱。上述培养基活化枯草芽孢杆菌的速度快，活化的菌种活力旺盛，产中性蛋白酶的能力高。
调节剂成份及其重量比为：12~25份酵母提取液，2~5份氯化钠，5~10份牛肉汁，1~4份松香聚氧乙烯酯，2~4份椰子油提取物和1~3份乙二醇。上述调节剂可加快枯草芽孢杆菌的生长繁殖速度，且产中性蛋白酶能力增强。
酶解剂成份及其重量份为：10~20份风味蛋白酶，1~5份半胱氨酸，2~5份N-酰基谷氨酸，1~3份十八烷基三甲基氯化铵和0.2~0.6份硫酸钠。上述酶解剂水解蛤仔蛋白效率高，缩短了降压肽制备的时间。
添加剂成份及其重量份为：3~8份牛血清白蛋白外源蛋白，2~5份乙二醇，3~6份还原型谷胱甘肽，3~9份磷酸盐缓冲液，2~5份花青素和0.7~1.4份维生素C。上述添加剂能保护水解得到的降压肽的活性，避免重金属离子和具氧化性的物质对降压肽结构的破坏。
实施例2：
一种菲律宾蛤仔降血压肽的制备方法及应用，最优选步骤如下：
1）预处理：将菲律宾蛤仔去壳取肉用冰水清洗4次，在鼓风干燥机中干燥，温度为60℃，干燥时间为2h，再用超声波粉碎仪进行粉碎，过300目筛.。将菲律宾蛤仔粉碎成粉末增大了比表面积，可以使发酵和酶解反应更充分，也可缩短反应时间；
2）活化：将枯草芽孢杆菌置于种子培养基上活化，活化温度为35℃，活化时间为18h，培养基中的物质刺激枯草芽孢杆菌生长繁殖，将活性不大的枯草芽孢杆菌菌粉活化为活力旺盛，数量足够的菌群，为下一步的发酵做准备；
3）发酵：按照固液比1:3的比例在蛤仔粉中加入蒸馏水，搅拌均匀后接入活化后的枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌占原料质量的4%，加入调节剂，发酵温度为60℃，发酵时间为24h，发酵期间不断通入氧气，使发酵液中溶解氧浓度为0.3%，发酵结束后过滤。枯草芽孢杆菌是需氧型细菌，液体中溶解氧浓度过低会限制其生长繁殖，发酵速度降低，所以需要通入氧气。枯草芽孢杆菌生长过程中会产生α-淀粉酶和中性蛋白酶，蛋白酶会将蛤仔蛋白水解使其溶于水溶液中，将其从固体粉末中提取出来；
4）酶解：在发酵液中加入酶解剂和添加剂，酶解剂占发酵液的0.6%，添加剂占酶解液的0.015%，酶解温度为45℃，pH为6.5，酶解时间为2.8h，酶解结束后，沸水浴灭酶12min，过滤。酶解剂将蛤仔蛋白进一步水解成多肽，酶解效率高。添加剂能保护水解得到的降压肽的活性，避免重金属离子和具氧化性的物质对降压肽结构的破坏；
5）超滤：用活性炭对滤液进行脱色去味，根据菲律宾蛤仔降血压肽的分子量大小选择超滤膜超滤，将滤液先用13000Da的膜超滤，压力为0.14MPa，其透过液再用1100Da 的膜超滤，压力为0.16MPa，取滞留液得到多肽粗液。降压肽的分子量在1500~10000Da，超滤后降压肽没有损失并除去了分子量大于13000 Da和分子量小于1100Da的杂质；
6）凝胶层析、冷冻干燥：将多肽粗液进行凝胶层析，得到菲律宾蛤仔降血压肽浓缩液，冷冻干燥得到菲律宾蛤仔降血压肽粉末。菲律宾蛤仔降血压肽粉末纯度高，活性强，对ACE抑制效果显著且安全无毒。
种子培养基成份及其重量份为： 30份琼脂，12份酵母提取物，7份葡萄糖，6份牛肉汁，3份氯化钠，5份维生素A，2份柠檬酸，8份大豆蛋白，3份硅藻多糖和1.2份硫代甜菜碱。上述培养基活化枯草芽孢杆菌的速度快，活化的菌种活力旺盛，产中性蛋白酶的能力高。
调节剂成份及其重量比为：19份酵母提取液，3份氯化钠，7份牛肉汁，3份松香聚氧乙烯酯，3份椰子油提取物、2份乙二醇、0.01~0.2份环戊硅氧烷。上述调节剂可加快枯草芽孢杆菌的生长繁殖速度，且产中性蛋白酶能力增强，且最终产物具有较高的活性，其机理尚不明确。酶解剂成份及其重量份为：20份风味蛋白酶，4份半胱氨酸，3份N-酰基谷氨酸，2份十八烷基三甲基氯化铵和0.4份硫酸钠。上述酶解剂水解蛤仔蛋白效率高，缩短了降压肽制备的时间。
添加剂成份及其重量份为：6份牛血清白蛋白外源蛋白，4份乙二醇，4份还原型谷胱甘肽，8份磷酸盐缓冲液，3份花青素和1份维生素C。上述添加剂能保护水解得到的降压肽的活性，避免重金属离子和具氧化性的物质对降压肽结构的破坏。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (9)

1.一种菲律宾蛤仔降血压肽的制备方法及应用，其特征在于以下步骤：
1）预处理：将菲律宾蛤仔去壳取肉进行清洗，干燥，粉碎；
2）活化：将枯草芽孢杆菌置于种子培养基上活化；
3）发酵：在蛤仔粉中加入蒸馏水，再接入活化后的枯草芽孢杆菌，加入调节剂，发酵一段时间后过滤；
4）酶解：在发酵液中加入酶解剂和添加剂，酶解一段时间，灭酶，过滤；
5）超滤：将滤液脱色去味后根据菲律宾蛤仔降血压肽的分子量大小选择超滤膜超滤，得到多肽粗液；
6）凝胶层析、冷冻干燥：将多肽粗液进行凝胶层析，得到菲律宾蛤仔降血压肽浓缩液，冷冻干燥得到菲律宾蛤仔降血压肽粉末。
2.根据权利要求1所述的一种菲律宾蛤仔降血压肽的制备方法及应用，其特征在于：所述的步骤2中种子培养基成份及其重量份为：20~30份琼脂，10~15份酵母提取物，5~10份葡萄糖，4~8份牛肉汁，1~4份氯化钠，2~5份维生素A，1~3份柠檬酸，4~9份大豆蛋白，2~5份硅藻多糖和0.5~1.5份硫代甜菜碱。
3.根据权利要求1所述的一种菲律宾蛤仔降血压肽的制备方法及应用，其特征在于：所述的步骤3发酵过程中通入氧气。
4.根据权利要求1所述的一种菲律宾蛤仔降血压肽的制备方法及应用，其特征在于：所述的步骤3中调节剂成份及其重量比为：12~25份酵母提取液，2~5份氯化钠，5~10份牛肉汁，1~4份松香聚氧乙烯酯，2~4份椰子油提取物和1~3份乙二醇。
5.根据权利要求1所述的一种菲律宾蛤仔降血压肽的制备方法及应用，其特征在于：所述的步骤4中酶解剂成份及其重量份为：10~20份风味蛋白酶，1~5份半胱氨酸，2~5份N-酰基谷氨酸，1~3份十八烷基三甲基氯化铵和0.2~0.6份硫酸钠、0.01~0.2份环戊硅氧烷。
6.根据权利要求1所述的一种菲律宾蛤仔降血压肽的制备方法及应用，其特征在于：所述的步骤4中添加剂成份及其重量份为：3~8份牛血清白蛋白外源蛋白，2~5份乙二醇，3~6份还原型谷胱甘肽，3~9份磷酸盐缓冲液，2~5份花青素和维生素C。
7.根据权利要求1所述的一种菲律宾蛤仔降血压肽的制备方法及应用，其特征在于：所述的步骤5中采用活性炭对滤液进行脱色除味。
8.根据权利要求1所述的一种菲律宾蛤仔降血压肽的制备方法及应用，其特征在于：所述的步骤5中超滤膜选用12000~15000Da和900~1300Da两种规格。
9.根据权利要求1所述的一种菲律宾蛤仔降血压肽的制备方法及应用，其特征在于：所述的步骤4中酶解温度为38~50℃，pH为6.1~6.9，酶解时间为2.5~3.5h。
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