CN107586318A

CN107586318A - 一种降血压肽及其制备方法

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Publication number: CN107586318A
Application number: CN201710976766.7A
Authority: CN
Inventors: 魏玉西; 陈应运
Original assignee: Qingdao University
Current assignee: Qingdao Chenlan Health Industry Group Co.,Ltd.
Priority date: 2017-05-25
Filing date: 2017-10-19
Publication date: 2018-01-16
Anticipated expiration: 2037-10-19
Also published as: CN107586318B

Abstract

本发明涉及降血压肽及其制备方法，具体涉及从贝类中提取降血压肽。降血压肽包含如下的氨基酸序列Val‑Leu‑Asp‑Ser‑Gly‑Asp‑Gly‑Val‑Thr‑His；Leu‑Asp‑Ser‑Gly‑Asp‑Gly‑Val‑Thr‑His；Val‑Val‑Val‑Gly‑Asp‑Gly‑Ala‑Val‑Gly‑Lys；Phe‑Ala‑Gly‑Asp‑Asp‑Ala‑Pro‑Arg‑Ala。本发明制备的降血压肽的ACE抑制活性高，在低于100μM浓度范围内，对血管内皮细胞无毒副作用，安全性好；制备过程不使用外加的酶解剂，所得降血压肽氨基酸序列中不含半胱氨酸残基，无需使用保护肽活性的添加剂，制备过程简单，成本低，产品质量好；原料在沿海地区来源广泛，价格低廉，适合工业化生产。

Description

一种降血压肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及降血压肽及其制备方法，具体涉及从贝类中提取降血压肽。

背景技术

降血压肽，又称为血管紧张素转化酶(Angioensin I Converting Enzyme，简称ACE)抑制肽，是从食物蛋白中分离出的一类具有显著降低血压功效的多肽短链物质。从来源上，可分为乳蛋白(包括酪蛋白、乳清蛋白)、发酵食品、动物蛋白、植物蛋白以及天然ACE抑制肽。这些来源于食品的降血压肽通常由蛋白酶在温和条件下水解蛋白质而获得，食用安全性高，其共同突出优点是只对高血压患者起到降压作用，对血压正常者无降压作用，因而不会有降压过度现象发生。除降压功能，它们往往具有免疫促进、抗凝血、易消化吸收和抗肿瘤等功能。而化学合成的降压药物(如卡托普利等)，虽然治疗高血压的效果非常明显，但其对肾脏的毒副作用，以及服药后出现低血压、干咳等症状，使人们对其安全性产生忧虑。降血压肽的开发，以及关键的分离提纯过程，具有很大的现实意义。

由于海洋生物生长环境的特殊性，从海洋生物中寻找降血压活性物质已成为海洋药物、海洋功能性食品研究的重要方向。菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)，隶属于软体动物门(Mollusca)、双壳纲(Bivalvia)、帘蛤科(Veneridae)的海洋生物，俗称花蛤，是我国四大养殖贝类之一。花蛤肉组织蛋白含量高，脂肪含量低，并含有丰富的维生素和微量元素，具有良好的营养保健功能。中医认为，蛤肉有滋阴明目、软坚化痰之功效。近代研究证明，菲律宾蛤仔提取物具有提高免疫力、抑制细胞微核形成、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗菌等作用。

目前对蛤蜊ACE抑制肽多采用酶解法提取。申请号为201611021291.8的中国专利公开了一种菲律宾蛤仔降血压肽的制备方法，其具体步骤为1)预处理；2)活化；3)发酵；4)酶解；5)超滤；6)凝胶层析、冷冻干燥。存在的问题：(1)申请号为201611021291.8的中国专利核心技术是采用发酵和酶解，工艺复杂；而且蛋白质经发酵后分子已经变小，如再经酶解，则产物中多肽含量将会大大下降，而游离氨基酸含量将会大大提高；(2)该专利并未得到有降压活性的序列明确的多肽；(3)该专利的方法还要加多肽保护剂，以防止被氧化，也就是发明者认为降血压多肽序列中应有含巯基的半胱氨酸残基，而后者不稳定、极易氧化，因而需加保护剂，这在临床应用上是困难的；(4该专利超滤步骤保留的降血压肽分子量在1500-10000Da,而把分子量小于900-1300Da的多肽当做杂质去掉了。

发明内容

针对上述问题，本发明旨在提供一种制备具有很强的ACE抑制活性的降血压肽及其制备方法。

一种降血压肽，包含下列四种肽段中的至少一种：

(1)Val-Leu-Asp-Ser-Gly-Asp-Gly-Val-Thr-His(SEQ ID NO.1))

(2)Leu-Asp-Ser-Gly-Asp-Gly-Val-Thr-His(SEQ ID NO.2)

(3)Val-Val-Val-Gly-Asp-Gly-Ala-Val-Gly-Lys(SEQ ID NO.3)

(4)Phe-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-Pro-Arg-Ala(SEQ ID NO.4)。

一种降血压肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理：将鲜贝清洗、蒸煮取肉、切碎、冷冻干燥、粉碎；

(2)培养基配制与灭菌：将鲜贝肉干粉、蔗糖和蒸馏水配制培养基并灭菌；

(3)纳豆菌菌悬液的制备：将适量活化后的纳豆菌种转入装有种子培养基的三角瓶中，在35-40℃、140-180r·min^-1的条件下，摇床振荡培养12-48小时，制成纳豆菌种子菌悬液；

(4)液体发酵与后熟：在灭菌后的培养基中接入占培养基体积分数为3-8％的纳豆菌种子菌悬液，于40-50℃摇瓶液体发酵18-36小时，接着于3-5℃后熟16-32小时；

(5)发酵液经10000r/min,离心15min，取上清液冷冻干燥，过80目筛，制成冷冻干燥粉；

(6)超滤：将冷冻干燥粉用超纯水配制成一定浓度的发酵液抽滤后，通过分子量截留值为5KDa的超滤膜，选取20-30psi的超滤压力、33-38℃的多肽液温度、1.2-1.8％的多肽液浓度的超滤条件，检测各组分的ACE抑制活性，收集ACE抑制活性最高的组分；

(7)葡聚糖凝胶过滤层析及RP-HPLC纯化：以Sephadex G-10为层析介质，以超纯水为洗脱剂，以1.0mL/min的洗脱流速，以80mg/mL的上样浓度进行层析；检测得到的各组分的ACE抑制活性，收集ACE抑制活性最高的组分，进一步利用RP-HPLC进行多肽纯化，检测各组分的ACE抑制活性，收集ACE抑制活性最高的组分，即得降血压肽。

上述技术方案，进一步地，包括以下步骤：

(1)预处理：将新鲜菲律宾蛤仔清洗、蒸煮取肉、切碎、冷冻干燥、粉碎；

(3)纳豆菌菌悬液的制备：将适量活化后的纳豆菌种转入装有种子培养基的三角瓶中，在37℃、160r·min^-1的条件下，摇床振荡培养24小时，制成纳豆菌种子菌悬液；

(4)液体发酵与后熟：在灭菌后的培养基中接入占培养基体积分数为3-8％的纳豆菌种子菌悬液，于45℃摇瓶液体发酵24小时，接着于4℃后熟24小时；

(6)超滤：将冷冻干燥粉用超纯水配制成一定浓度的发酵液抽滤后，通过分子量截留值为5KDa的超滤膜，选取25psi的超滤压力、35℃的多肽液温度、1.5％的多肽液浓度的超滤条件，检测各组分的ACE抑制活性，收集ACE抑制活性最高的组分；

(7)葡聚糖凝胶过滤层析及RP-HPLC纯化：以Sephadex G-10为层析介质，以超纯水为洗脱剂，以1.0mL/min的洗脱流速，以80mg/mL的上样浓度进行层析；检测得到的各组分的ACE抑制活性，收集ACE抑制活性最高的组分，进一步利用RP-HPLC进行多肽纯化，检测各组分的ACE抑制活性，收集ACE抑制活性最高的组分。

上述技术方案，进一步地，所述鲜贝为扇贝、牡蛎、贻贝或者鲍鱼。

上述技术方案，进一步地，利用质谱仪对RP-HPLC纯化收集到的ACE抑制活性最高的组分交替进行一级质谱和二级质谱，借助软件分析，获得肽段的氨基酸序列。

本发明还提供一种降血压肽在制备降血压产品方面的应用，包括制备降血压药物、保健品、食品。

上述技术方案，进一步地，所述降血压肽经过乙酰化、磷酸化、糖基化或氨基化修饰。

上述技术方案，进一步地，包括以贝类为原料制备，或根据权利要求1公布的氨基酸序列人工合成。

本发明还提供一种药物组合物，包含上述降血压肽及药学上可接受的赋形剂。

本发明还提供一种营养制品组合物，包含上述降血压肽，以及一种或者多种选自如下的营养组分：脂肪、蛋白质、碳水化合物、矿物质和维生素。

本发明的降血压肽及其制备方法具有以下有益效果：

1、降血压肽的ACE抑制活性高，在低于100μM浓度范围内，对血管内皮细胞无毒副作用，安全性好；

2、制备过程不使用外加的酶解剂，所得降血压肽氨基酸序列中不含半胱氨酸残基，无需使用保护肽活性的添加剂，制备过程简单，成本低，产品质量好；

3、原料在沿海地区来源广泛，价格低廉，适合工业化生产；

4、降血压肽序列明确且链短、氨基酸残基数目较少，可方便地进行规模化人工合成，具有医药应用前景；

5、由于纳豆菌发酵产物中降血压肽种类及其氨基酸序列明确，发酵产物可直接用于降血压功能性食品，或经过分离纯化步骤将降血压肽纯化出来用于降血压药物，或根据本发明公开的降血压肽序列全人工合成降血压药物。

附图说明

图1菲律宾蛤仔源ACE抑制肽凝胶过滤层析图；

图2GLFJ-3-D的反相高效液相色谱；

图3菲律宾蛤仔源ACE抑制肽对HUVECs细胞增殖的影响；

图4菲律宾蛤仔源ACE抑制肽对HUVECs细胞NO分泌的影响；

图5菲律宾蛤仔源ACE抑制肽对HUVECs细胞ET-1分泌的影响。

图6为实施例4各组大鼠平均血压变化趋势图；

图7为实施例4各组大鼠舒张压变化趋势图；

图8为实施例4各组大鼠收缩压变化趋势图。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。

下述实施例所采用的菲律宾蛤仔、牡蛎、鲍鱼均来自青岛海域，纳豆菌购自中山市纳豆微生物制品有限公司(活菌数：1.0×10⁹cfu/g)。

实施例1

1、菲律宾蛤仔源降血压肽的制备

(1)鲜贝预处理：将新鲜菲律宾蛤仔清洗后蒸煮取肉，将肉切碎后置于-20℃冰箱冷冻，6小时后转入真空冷冻干燥机中，冷冻干燥48小时，粉碎，过40目筛，得鲜贝肉干粉，于-20℃贮藏，备用；

(2)培养基配制与灭菌：按重量比1：0.1:25分别加入鲜贝肉干粉、蔗糖和蒸馏水配制培养基，在灭菌锅中121℃灭菌15分钟；

(3)纳豆菌菌悬液的制备：将适量活化后的纳豆菌种转入装有种子培养基的三角瓶中，在37℃、160r﹒min^-1的条件下，摇床振荡培养24小时，制成10⁸CFU﹒mL^-1的种子菌悬液，备用；

(4)液体发酵与后熟：在灭菌后的培养基中接入占培养基体积分数为5％的纳豆菌种子菌悬液，于45℃摇瓶液体发酵24小时，接着于4℃后熟24小时；

(5)发酵液经10000r/min,离心15min，取上清液冷冻干燥，同时去除纳豆制品令人不悦的氨味，过80目筛，制成冷冻干燥粉；

(6)超滤：将用超纯水配制成一定浓度的发酵液抽滤后，通过分子量截留值为5KDa的超滤膜，选取25psi的超滤压力、35℃的多肽液温度、1.5％的多肽液浓度的超滤条件，检测各组分的ACE抑制活性，收集ACE抑制活性最高的组分，ACE抑制活性最高的组分IC₅₀为1.273mg/mL；

IC₅₀检测条件方法：

采用改良的Cushman紫外比色法进行ACE抑制率的测定(Cushman D W,Cheung HS.Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-convertingenzyme of rabbit lung[J].Biochem Pharmacol,1971,20(7):1637-1648.)。将HHL(Hip-His-Leu)溶解在0.1M硼酸盐缓冲液中(pH值8.3,含0.3M氯化钠)配置成5.0mM HHL溶液；用去离子水配置0.1U·mL^-1ACE溶液。在10mL小试管中依次加入200μL HHL，80μL样品，将混合液放入37℃恒温水浴中保温5min后，加入20μL ACE溶液，启动反应。混匀后，于37℃恒温水浴中保温30min，再加入1M HCl 0.35mL终止反应。加入1.7mL乙酸乙酯，振荡混匀15s，以萃取被ACE所释放的马尿酸(HA)。3 500r/min离心10min，吸取1.0mL乙酸乙酯层，转入另一试管中，在120℃烘箱中烘干1h,重新溶于3.0mL蒸馏水中，混匀后在228nm处测定吸光度值。

ACE抑制率＝[(B-A)÷(B-C)]×100％

式中：A:样品和ACE溶液同时与HHL反应的吸光度值；

B:不含样品时，ACE与HHL反应的吸光度值，即对照；

C:样品和ACE溶液都不存在时的吸光度值，即空白。

(7)葡聚糖凝胶过滤层析及RP-HPLC纯化：以Sephadex G-10为层析介质，以超纯水为洗脱剂，以1.0mL/min的洗脱流速，以80mg/mL的上样浓度进行层析，葡聚糖凝胶层析分离得到的五个组分(GLFJ-3-A、GLFJ-3-B、GLFJ-3-C、GLFJ-3-D、GLFJ-3-E)中，GLFJ-3-D组分ACE活性最高，如图1所示，IC₅₀为0.585mg/mL。利用RP-HPLC对GLFJ-3-D进行多肽纯化，所得的7个组分(GLFJ-3-D-1、GLFJ-3-D-2、GLFJ-3-D-3、GLFJ-3-D-4、GLFJ-3-D-5、GLFJ-3-D-6、GLFJ-3-D-7)中，GLFJ-3-D-3组分ACE抑制率最高，如图2所示，IC₅₀为0.058mg/mL。

2、LC-MS测序

利用质谱仪对GLFJ-3-D-3组分交替进行一级质谱和二级质谱，借助软件分析，得到四个肽段氨基酸序列，分别是

(1)GLFJ-3-D-3-1

Val-Leu-Asp-Ser-Gly-Asp-Gly-Val-Thr-His(SEQ ID NO.1)

(2)GLFJ-3-D-3-2

Leu-Asp-Ser-Gly-Asp-Gly-Val-Thr-His(SEQ ID NO.2)

(3)GLFJ-3-D-3-3

Val-Val-Val-Gly-Asp-Gly-Ala-Val-Gly-Lys(SEQ ID NO.3)

(4)GLFJ-3-D-3-4

Phe-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-Pro-Arg-Ala(SEQ ID NO.4)。

3、活性验证

分别固相合成四个肽段，验证活性，肽段Val-Leu-Asp-Ser-Gly-Asp-Gly-Val-Thr-His(SEQ ID NO.1)(相对分子质量为999.5)的ACE抑制活性最强，如表1所示，IC₅₀为8.16μmol/L。

表1不同序列菲律宾蛤仔源ACE抑制肽的相对分子质量和IC₅₀

4、菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)降血压肽的作用机理研究

以人脐静脉内皮细胞HUVECs为模型，研究了菲律宾蛤仔源ACE抑制肽对血管内皮细胞功能因子的影响。

试验方法

①血管内皮细胞的培养

在无菌工作台内提取人脐静脉内皮细胞HUVECs，利用高糖DMEM培养液(含20％胎牛血清、100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素)置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养，每隔1天换1次培养液。当HUVECs培养至覆盖培养瓶80％时，用0.25％(m/v)胰蛋白酶-0.02％(m/v)EDTA的PBS消化液消化并传代，利用倒置显微镜观察并计数，转接至96孔板进行细胞功能因子分泌评估试验。

②菲律宾蛤仔源ACE抑制肽对HUVECs细胞增殖的影响

利用PBS缓冲液将菲律宾蛤仔源ACE抑制肽配制成25、50、100、1000μM的不同浓度的溶液，以0.22μm微孔滤膜过滤后，各取20μL加入到培养至对数生长期的HUVECs的96孔板中，每组做三个平行，置于37℃，5％CO₂的恒温培养箱中培养24h后，倒去孔中液体，在每孔中加入180μL的高糖DMEM培养液和20μL的MTT溶液，于37℃，5％CO₂恒温培养中培养24h，倒去上清液。于每孔中加入200μL的DMSO溶液，振荡摇匀，以PBS做空白对照，于酶标仪中测570nm处的吸光度值。结果如图3所示。

③菲律宾蛤仔源ACE抑制肽对HUVECs细胞的NO分泌的影响

参照文献(丁苗.发酵酸肉中ACE抑制肽的分离纯化、特性及其对血管内皮细胞功能因子的影响研究[D].重庆,西南大学,2015,42-50)方法进行。利用PBS缓冲液将菲律宾蛤仔源ACE抑制肽配制成25、50、100μM的不同浓度的溶液，以0.22μm微孔滤膜过滤后，各取20μL加入到培养至对数生长期的HUVECs的96孔板中，每组做三个平行，以0.15mg/mL的卡托普利作对照，置于37℃、5％CO₂的恒温培养箱中培养12、24、48h，利用NO试剂盒测定NO的含量：分别向样品中加入R1、R2试剂，混合均匀，在37℃水浴加热60min后，加入R3、R4，室温静置抽提40min，以3500r/min，离心10min。取上清0.5mL，加入显色剂，静置10min后，于酶标仪中，以纯水做空白，测550nm处的吸光度值。结果如图4所示。

NO含量(μmol/L)＝[(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)]*标准品浓度(100μmol/L)

④菲律宾蛤仔源ACE抑制肽对HUVECs细胞的内皮素-1(ET-1)分泌的影响

参照文献(丁苗.发酵酸肉中ACE抑制肽的分离纯化、特性及其对血管内皮细胞功能因子的影响研究[D]。重庆,西南大学,2015,42-50)方法进行。利用PBS缓冲液将菲律宾蛤仔源ACE抑制肽配制成25、50、100μM的不同浓度的溶液，以0.22μm微孔滤膜过滤后，各取20μL加入到培养至对数生长期的HUVECs的96孔板中，每组做三个平行，以0.15mg/mL的卡托普利作对照，置于37℃、5％CO₂的恒温培养箱中培养12、24、48h,利用ET-1试剂盒测定ET-1的含量：分别向样品孔中加入样品50uL，然后加入HRP试剂50ul。轻轻摇晃，盖上封板膜，于37℃，5％CO2的恒温培养箱中培养60min。弃去液体，晾干，加满洗涤液于每孔，静置30s后弃去，重复5次，拍干。每孔先加入显色剂A 50ul，再加入显色剂B 50ul，轻轻振荡混匀，37℃避光显色10min。每孔加入终止液50ul，终止反应。以空白孔调零，测450nm处的吸光度值。利用ELISAcalc进行计算，拟合模型选用logistic曲线，计算出ET-1的含量。结果如图5所示。

结果表明，菲律宾蛤仔源ACE抑制肽在低于100μM浓度范围内，对血管内皮细胞无毒副作用，可有效增加内皮细胞NO的分泌，降低ET-1的分泌如，从而促进血管扩张和抑制血管收缩，与降压药物卡托普利作用相似，具有降血压功能。

因此，本发明的菲律宾蛤仔源ACE抑制肽具有良好的降血压效果，并且安全性高。

实施例2

1、牡蛎(Ostrea gigas thunberg)源降血压肽的制备

(1)鲜贝预处理：将新鲜牡蛎清洗后蒸煮取肉，将肉切碎后置于-20℃冰箱冷冻，6小时后转入真空冷冻干燥机中，冷冻干燥48小时，粉碎，过40目筛，得鲜贝肉干粉，于-20℃贮藏，备用；

(3)纳豆菌菌悬液的制备：将适量活化后的纳豆菌种转入装有种子培养基的三角瓶中，在35℃、140r﹒min^-1的条件下，摇床振荡培养36小时，制成10⁸CFU﹒mL^-1的种子菌悬液，备用；

(4)液体发酵与后熟：在灭菌后的培养基中接入占培养基体积分数为3％的纳豆菌种子菌悬液，于40℃摇瓶液体发酵36小时，接着于3℃后熟32小时；

(5)超滤：将用超纯水配制成一定浓度的发酵液抽滤后，通过分子量截留值为5KDa的超滤膜，选取20psi的超滤压力、38℃的多肽液温度、1.2％的多肽液浓度的超滤条件，检测各组分的ACE抑制活性，收集ACE抑制活性最高的组分，ACE抑制活性最高的组分IC₅₀为1.273mg/mL；

(6)葡聚糖凝胶过滤层析及RP-HPLC纯化：以Sephadex G-10为层析介质，以超纯水为洗脱剂，以1.0mL/min的洗脱流速，以80mg/mL的上样浓度进行层析；检测得到的各组分的ACE抑制活性，收集ACE抑制活性最高的组分，进一步利用RP-HPLC进行多肽纯化，检测各组分的ACE抑制活性，收集ACE抑制活性最高的组分；

2、LC-MS测序

利用质谱仪对步骤(6)制得的ACE抑制活性最高的组分交替进行一级质谱和二级质谱，借助软件分析，确定所得到的肽段的氨基酸序列。结果得到了

Val-Leu-Asp-Ser-Gly-Asp-Gly-Val-Thr-His(SEQ ID NO.5)；

Leu-Asp-Ser-Gly-Asp-Gly-Val-Thr-His(SEQ ID NO.6)；

Val-Val-Val-Gly-Asp-Gly-Ala-Val-Gly-Lys(SEQ ID NO.7)；

Phe-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-Pro-Arg-Ala(SEQ ID NO.8)四个肽段氨基酸序列。

实施例3

1、鲍鱼(Abalone)源降血压肽的制备

(1)预处理：将新鲜鲍鱼清洗后蒸煮取肉，将肉切碎后置于-20℃冰箱冷冻，6小时后转入真空冷冻干燥机中，冷冻干燥48小时，粉碎，过40目筛，得鲜贝肉干粉，于-20℃贮藏，备用；

(3)纳豆菌菌悬液的制备：将适量活化后的纳豆菌种转入装有种子培养基的三角瓶中，在40℃、180r·min^-1的条件下，摇床振荡培养12小时，制成纳豆菌种子菌悬液；

(4)液体发酵与后熟：在灭菌后的培养基中接入占培养基体积分数为3-8％的纳豆菌种子菌悬液，于50℃摇瓶液体发酵18小时，接着于5℃后熟16小时；

(5)超滤：将用超纯水配制成一定浓度的发酵液抽滤后，通过分子量截留值为5KDa的超滤膜，选取30psi的超滤压力、33℃的多肽液温度、1.8％的多肽液浓度的超滤条件，检测各组分的ACE抑制活性，收集ACE抑制活性最高的组分；

2、LC-MS测序

利用质谱仪对步骤(6)制得的ACE抑制活性最高的组分交替进行一级质谱和二级质谱，借助软件分析，确定所得到的肽段的氨基酸序列。结果也得到了

Val-Leu-Asp-Ser-Gly-Asp-Gly-Val-Thr-His(SEQ ID NO.9)；

Leu-Asp-Ser-Gly-Asp-Gly-Val-Thr-His(SEQ ID NO.10)；

Val-Val-Val-Gly-Asp-Gly-Ala-Val-Gly-Lys(SEQ ID NO.11)；

Phe-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-Pro-Arg-Ala(SEQ ID NO.12)四个肽段氨基酸序列。

实施例4大鼠药效实验

1.实验材料

1.1实验动物

SPF级Wistar/SD大鼠，体重350g，雄性。购自于济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号：SCXK鲁20140007。

1.2药物

受试药：多肽Val-Leu-Asp-Ser-Gly-Asp-Gly-Val-Thr-His用生理盐水溶解配制成3.2mg/ml溶液。生理盐水稀释浓度为1.6mg/ml、0.8mg/ml，给药体积为2ml/只。

1.3试剂

10％水合氯醛或者5％戊巴比妥钠(50mg/kg)，注射用青霉素钠，左旋硝基精氨酸(L-NNA)(sigma:)等

1.4仪器

万分之一天平ME204E购自于瑞士梅特勒-托利多，DSI植入式遥测系统。

2.实验方法

(1)DSI植入式遥测系统大鼠模型的建立。

①将DSI植入式遥测系统手术植入大鼠体内。

②观察大鼠存活和伤口愈合状态，一周。

(2)一氧化氮合酶抑制剂左旋硝基精氨酸(L-N-Nitro-Arginine,L-NNA)高血压模型的建立。

①将大鼠随机分成4组，每组1只。

②L-NNA组：L-NNA15mg/kg^-1/d^-1腹腔注射，连续1周，在应用L-NNA第2周起，检测大鼠血压。

③对照组：以生理盐水代替L-NNA进行腹腔注射，连续1周，于第2周起给检测大鼠血压。

(3)待L-NNA组的大鼠血压稳定升高后，开始进行药效实验。

2.2分组处理：

根据受试多肽Val-Leu-Asp-Ser-Gly-Asp-Gly-Val-Thr-His(SEQ ID NO.1)抗高血压细胞实验有效浓度8.16μM＝8.16μg/ml，换算成大鼠的给药剂量为1.57mg/ml，设置给药剂量为0.8,1.6,3.2mg/ml，给药体积为2ml/d/只,共需要78.4mg。

2.3给药方式

(1)给药方式：腹腔注射给药；

(2)溶剂组：溶剂对照组腹腔注射同等体积的生理盐水。

2.4给药周期

给药7天

2.5数据收集与检测

(1)各组大鼠体重变化

(2)各组大鼠血压变化

(3)各组大鼠体温的变化

2.6统计学分析

应用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，所得数据用标示，各组数据运用t检验分析，P值比较组间差异。

3.实验结果

表2各组大鼠体温的变化

表3各组大鼠体重变化

表4各组大鼠平均血压变化

表5各组大鼠舒张压变化

表6各组大鼠收缩压变化

4.结果分析

本实验采用一氧化氮合成酶抑制剂左旋硝基精氨酸(L-N-Nitro-Arginine,L-NNA)腹腔注射建立大鼠高血压模型，对样品体内降压作用进行了研究，同时设生理盐水作为阴性对照。

本研究给大鼠腹腔注射L-NNA1周后，通过DSI 植入式遥测系统测定大鼠收缩压，舒张压发现平均绝对值升高均大于30mmHg，形成稳定持续性的高血压，表明造模成功。在腹腔注射受试多肽Val-Leu-Asp-Ser-Gly-Asp-Gly-Val-Thr-His(SEQ ID NO.1)第4天后，高剂量组的收缩压和舒张压均开始降低，给药1周后给药组各大鼠收缩压和舒张压均显著降低，并呈现剂量依赖性。

给药前后各组大鼠的体温和体重均未发生明显变化，表明化合物未显示毒性。

实施例5降血压肽的应用

将实施例1制得的菲律宾蛤仔源降血压肽冷冻干燥，得到产品菲律宾蛤仔源降血压肽,可以作为降血压药物使用；或将发酵物冷冻干燥进一步加工成保健品、食品；或根据本发明提供的降血压肽氨基酸序列全人工合成，产品可作为降血压药物使用。

序列表

<110> 青岛大学

<120> 一种降血压肽及其制备方法

<150> 2017103764881

<151> 2017-05-25

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)

<400> 1

Val Leu Asp Ser Gly Asp Gly Val Thr His

1 5 10

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)

<400> 2

Leu Asp Ser Gly Asp Gly Val Thr His

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)

<400> 3

Val Val Val Gly Asp Gly Ala Val Gly Lys

1 5 10

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)

<400> 4

Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala

1 5

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 牡蛎(ostrea gigas thunberg)

<400> 5

Val Leu Asp Ser Gly Asp Gly Val Thr His

1 5 10

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 牡蛎(ostrea gigas thunberg)

<400> 6

Leu Asp Ser Gly Asp Gly Val Thr His

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 牡蛎(ostrea gigas thunberg)

<400> 7

Val Val Val Gly Asp Gly Ala Val Gly Lys

1 5 10

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 牡蛎(ostrea gigas thunberg)

<400> 8

Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala

1 5

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 鲍鱼(Abalone)

<400> 9

Val Leu Asp Ser Gly Asp Gly Val Thr His

1 5 10

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 鲍鱼(Abalone)

<400> 10

Leu Asp Ser Gly Asp Gly Val Thr His

1 5

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 鲍鱼(Abalone)

<400> 11

Val Val Val Gly Asp Gly Ala Val Gly Lys

1 5 10

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 鲍鱼(Abalone)

<400> 12

Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala

1 5

Claims

1.一种降血压肽，其特征在于，至少包含下列肽的一部分：

(1)Val-Leu-Asp-Ser-Gly-Asp-Gly-Val-Thr-His

(2)Leu-Asp-Ser-Gly-Asp-Gly-Val-Thr-His

(3)Val-Val-Val-Gly-Asp-Gly-Ala-Val-Gly-Lys

(4)Phe-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-Pro-Arg-Ala。

2.一种降血压肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的降血压肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求2所述的降血压肽的制备方法，其特征在于，所述鲜贝为菲律宾蛤仔、扇贝、牡蛎、贻贝或者鲍鱼。

5.根据权利要求2或者3所述的降血压肽的制备方法，其特征在于，利用质谱仪对RP-HPLC纯化收集到的ACE抑制活性最高的组分交替进行一级质谱和二级质谱，借助软件分析，获得肽段的氨基酸序列。

6.权利要求1所述的降血压肽在制备降血压药物方面的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述降血压肽经过乙酰化、磷酸化、糖基化或氨基化修饰。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以贝类为原料制备，或根据权利要求1公布的氨基酸序列人工合成。

9.一种药物组合物，包含权利要求1所述的降血压肽及药学上可接受的赋形剂。

10.一种营养制品组合物，包含权利要求1所述的降血压肽，以及一种或者多种选自如下的营养组分：脂肪、蛋白质、碳水化合物、矿物质和维生素。