CN112430254B - 一种抗凝血活性肽衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗凝血活性肽衍生物及其制备方法和用途，涉及生物医药领域。该抗凝血活性肽衍生物的氨基酸序列为：X‑Phe‑Lys‑His‑Met‑Asn‑GLu。其中，端基X为对羟基肉桂酸、2‑氨基‑3‑(2,3‑二羟基苯基)丙酸和2‑氨基‑3‑(4‑羟基‑3‑甲氧基苯基)丙酸。本发明制得的抗凝血活性肽衍生物具有高抗凝血和溶血栓活性，半衰期长，稳定性高；且具有强抗氧化活性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗凝血活性肽衍生物及其制备方法和用途。
背景技术
血栓栓塞性疾病被称为心脑血管隐形杀手，它可累及全身各个器官及系统，每年大约有3‰人发生不同形式的血栓性疾病，我国每年死于心脑血管疾病的人数达到300万人以上，它导致的死亡人数占全球每年总死亡人数的51％。存活的患者中75％致残，其中40％以上重残，严重威胁人类健康。
血栓是指血液成分在血液流动过程中，在血管或心脏内膜表面形成的一种半凝块状物质。血栓性疾病包括动脉血栓形成、静脉血栓形成、微血栓形成、血栓栓塞性疾病等。正常情况下体内凝血与抗凝血是处于一种动态平衡之中，当凝血异常形成血栓时，应用抗凝血药物抑制凝血以及使用溶栓药物增强纤溶系统作用，这些是在疾病发生后采取措施纠正体内的失衡。其实从体内凝血状态异常到最终血栓形成引发疾病，其间有比较长的病理过程。通过对患者凝血状态指标变化的监测中获得疾病发生发展的信息，就可以早期预防血栓的形成，对己经发生血栓者的治疗预后也可以做出指导和评估。
目前国内外临床使用的主要抗凝血药物是普通肝素、低分子肝素、华法林等，这些药物存在导致血小板减少、出血等副作用或起效较慢等缺点。而多肽类抗凝血药物具有起效快、副作用较低等突出优点，是今后抗凝血药的重点发展方向。药代动力学研究表明多肽/蛋白类药物主要通过降解、排泄、以及受体介导的内吞等作用在体内被清除。其中分子量小于20kDa的多肽因子在代谢过程中易被肾小球滤过；通过肾小管时多肽因子又被其中的蛋白酶部分降解并从尿中排出，因而半衰期短。故而长效多肽/蛋白类药物的开发已成为对第一代基因工程多肽/蛋白药物进行二次开发的重要方向。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗凝血活性肽衍生物及其制备方法和用途，该抗凝血活性肽衍生物具有高抗凝血和溶血栓活性，半衰期长，稳定性高；且具有强抗氧化活性。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种抗凝血活性肽，其氨基酸序列为：Phe-Lys-His-Met-Asn-GLu。本发明制得的抗凝血多肽，具有较高的抗凝血活性，能够用来弥补肝素类药物的缺陷；同时制得的活性肽可以直接透过胃消化液进入小肠，更好的保护多肽的活性，发挥高抗凝血的作用；且能够有效的溶解血栓，当浓度达到1mg/mL及以上时，有明显地溶血栓效果。且本发明人工合成的多肽相比于天然活性肽具有更长的半衰期，稳定性较好。
优选地，抗凝血活性肽具有抗凝血和溶血栓功效。
优选地，抗凝血活性肽的抗凝血活性＞150ATU/mL。
本发明的又一目的在于提供一种抗凝血活性肽在制备血栓性心脑血管疾病药物中的用途。
本发明的又一目的在于提供一种抗凝血活性肽在制备抗凝血产品中的用途。
本发明还公开了抗凝血活性肽在制备抗凝血和溶血栓功效的功能性食品。
优选地，上述功能性食品为粉剂、片剂、口服液或胶囊。
一种抗凝血活性肽衍生物，其序列为：X-Phe-Lys-His-Met-Asn-GLu，其中，端基X为对羟基肉桂酸或2-氨基-3-(2,3-二羟基苯基)丙酸或2-氨基-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙酸。
上述抗凝血活性肽经过对羟基肉桂酸或2-氨基-3-(2,3-二羟基苯基)丙酸或2-氨基-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙酸修饰，制备得到的多肽衍生物，进一步增强了抗凝血活性和溶血栓性能，且具有更高的半衰期，在体内稳定性得到提升。除此之外，制得的多肽衍生物增强了其抗氧化性能。
优选地，序列中，Phe为D构型或L构型，其余均为L构型。
优选地，端基X的结构式为：
或
2-氨基-3-(2,3-二羟基苯基)丙酸；或
2-氨基-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙酸。
一种抗凝血活性肽衍生物的制备方法，采用公知的FMOC-短肽固相合成方法合成，具体包括：
S1：树脂溶胀；
S2：接第一个氨基酸，通过沙芯抽滤掉溶剂，加入2～3倍摩尔Fmoc-氨基酸，再加入2～3倍摩尔的DIEA，2～3倍摩尔的HBTU，最后加入少量DMF溶解，振荡1～2h，用DMF和DCM交替清洗6遍，即DMF(10mL/g)两次，甲醇(10mL/g)两次，DMF(10mL/g)两次；
S3：脱保护，加15～20mL 20％哌啶DMF溶液(10mL/g)，10～15min后抽掉哌啶溶液，再加10～15mL 20％哌啶DMF溶液(10mL/g)，15～20min后抽掉哌啶溶液；进行检测，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105～110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应；
S4：按照S2～S3的操作原理，后续接第二个、第三个.......第六个氨基酸时依次添加第二个、第三个.......第六个氨基酸合成原料，从右至左依次连接，得到的从左到右连接的氨基酸序列；
S5：接X基团，通过沙芯抽滤掉溶剂，加入2～3倍摩尔的对羟基肉桂酸，再加入2～3倍摩尔的DIEA，2～3倍摩尔的HBTU，最后加入少量DMF溶解，振荡1～1.5h，用DMF和DCM交替清洗6遍；
S6：从树脂上切割活性肽衍生物，配制切割液：TFA(三氟乙酸)94.5％、EDT 2.5％和TIS2.5％；将树脂装入烧瓶或者离心管中，树脂和切割液比例按照10～11.5mL/g，恒温震荡，120min。抽滤，收集滤液，加入乙醚，用乙醚层析出多肽衍生物，过滤，再用乙醚洗涤滤饼六次，滤饼常温挥干，同时滤饼残留乙醚用氮气吹干，即得抗凝血活性肽衍生物粗品；
S7：取抗凝血活性肽衍生物粗品用HPLC进行纯化。
优选地，抗凝血活性肽的序列为：X-Phe-Lys-His-Met-Asn-GLu，其中，Phe为D构型或L构型，其余均为L构型；具体结构式如下：
或者，
本发明还公开了抗凝血活性肽衍生物在制备血栓性心脑血管疾病药物中的用途。
本发明有公开了抗凝血活性肽衍生物在制备抗凝血和溶血栓功效的功能性食品，所述功能性食品为粉剂、片剂、口服液或胶囊。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明合成的抗凝血多肽，具有较高的抗凝血活性和溶血栓性能，能够用来弥补肝素类药物的缺陷；同时制得的活性肽可以直接透过胃消化液进入小肠，更好的保护多肽的活性，发挥高抗凝血的作用；且相比于天然活性肽具有更长的半衰期，稳定性较好。采用对羟基肉桂酸或2-氨基-3-(2,3-二羟基苯基)丙酸或2-氨基-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙酸对该活性肽进行化学修饰后得到的多肽衍生物，具有更强抗凝血活性和溶血栓性能，且半衰期更长，在体内稳定性得到提升；同时，制得的多肽衍生物获得更高的抗氧化性能。
因此，本发明提供了一种抗凝血活性肽衍生物及其制备方法和用途，该抗凝血活性肽衍生物具有高抗凝血和溶血栓活性，半衰期长，稳定性高；且具有强抗氧化活性。
附图说明
图1为本发明试验例1中抗凝血活性测试结果；
图2为本发明试验例2中溶血栓功效测试结果；
图3为本发明实施例4中抗氧化活性测试结果。
具体实施方式
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：
实施例1：
1、合成原料及相关试剂：
Fmoc-L-GLu(ODmab)-OH，艾美捷科技有限公司；
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH，苏州天马医药集团；
Fmoc-L-Met(O2)-OH，吉尔生化(上海)有限公司；
Fmoc-L-His(Boc)-OH，吉尔生化(上海)有限公司；
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH，吉尔生化(上海)有限公司；
Fmoc-L-Phe-OH，吉尔生化(上海)有限公司；
对羟基肉桂酸，上海吉至生化科技有限公司。
2、一种抗凝血活性肽衍生物的制备，采用FMOC-短肽固相合成方法合成，具体为：
S1：称取取代度为0.4mmoL/g的0.8g AM Resin树脂于固相合成器中，加入10mL的无水二氯甲烷(以下用DCM表示)，放置在摇床上摇晃30min，使树脂充分溶胀；
S2：接第一个氨基酸，通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔Fmoc-L-GLu氨基酸，再加入3倍摩尔的DIEA，3倍摩尔的HBTU，最后加入少量DMF溶解，振荡1.5h，用DMF和DCM交替清洗6遍，即DMF(10mL/g)两次，甲醇(10mL/g)两次，DMF(10mL/g)两次；
S3：脱保护，加15mL 20％哌啶DMF溶液(10mL/g)，10min后抽掉哌啶溶液，再加10mL20％哌啶DMF溶液(10mL/g)，20min后抽掉哌啶溶液；进行检测，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105～110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应；
S4：按照S2～S3的操作原理，后续接第二个、第三个.......第六个氨基酸时依次添加第二个、第三个.......第六个氨基酸合成原料，从右至左依次连接，得到的从左到右连接的氨基酸序列为Phe-Lys-His-Met-Asn-GLu；
S5：接X基团，通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔的对羟基肉桂酸，再加入3倍摩尔的DIEA，3倍摩尔的HBTU，最后加入少量DMF溶解，振荡1h，用DMF和DCM交替清洗6遍；
S6：从树脂上切割活性肽衍生物，配制切割液：TFA(三氟乙酸)94.5％、EDT 2.5％和TIS2.5％；将树脂装入烧瓶或者离心管中，树脂和切割液比例按照10mL/g，恒温震荡，120min。抽滤，收集滤液，加入乙醚，用乙醚层析出多肽衍生物，过滤，再用乙醚洗涤滤饼六次，滤饼常温挥干，同时滤饼残留乙醚用氮气吹干，即得抗凝血活性肽衍生物粗品；
S7：取抗凝血活性肽衍生物粗品用HPLC进行纯化：
取抗凝血活性肽衍生物粗品200mg放入器皿中，用4mL 50％的乙腈水溶液溶解，超声2min；用0.45um滤膜过滤溶解液；分析条件：取3μL上述抗凝血活性肽衍生物粗品溶液，流动相是水和乙腈(起始比例：水90％、乙腈10％，结束比例：水10％、乙腈90％)，时间50min，流速为2.5mL/min，梯度洗脱，先将HPLC用起始梯度平衡5min然后进样；收集从检测器出来的样品。对制得的样品进行常规纯度鉴定，纯度达到98.3％。将纯化后的溶液进行常规条件冻干，既得到抗凝血活性肽衍生物。
本实施例得到的抗凝血活性肽衍生物的结构式如下：
实施例2：
一种抗凝血活性肽衍生物的结构式如下：
一种抗凝血活性肽衍生物的制备过程与实施例1相同，制得抗凝血活性肽衍生物的纯度为96.4％。
实施例3：
一种抗凝血活性肽衍生物的结构式如下：
一种抗凝血活性肽衍生物的制备过程与实施例1相同，制得抗凝血活性肽衍生物的纯度为96.9％。
实施例4：
一种抗凝血活性肽衍生物的结构式如下：
一种抗凝血活性肽衍生物的制备过程与实施例1相同，制得抗凝血活性肽衍生物的纯度为97.4％。
实施例5：
一种抗凝血活性肽衍生物的制备过程与实施例1相同，制得抗凝血活性肽衍生物的纯度为95.8％。
实施例6：
一种抗凝血活性肽衍生物的结构式如下：
一种抗凝血活性肽衍生物的制备过程与实施例1相同，制得抗凝血活性肽衍生物的纯度为97.8％。
对比例1：
一种抗凝血活性肽的制备：基于现有技术从鱼糜中提取出来的活性肽，Phe-Lys-His-Met-Asn-GLu。具体为：
脱脂，向鱼糜加入体积比为1：1的正己烷和无水乙醇混合液脱脂，在50℃温度下萃取4h，重复2次，抽滤，将所得滤饼自然风干、粉碎，得到脱脂鱼糜；
酶解，取脱脂鱼糜按料液比1：10g/mL加入水混合均匀，90℃加热15min，用0.5MHCl调节溶液pH至8.0，然后加入胰糜蛋白酶-糜蛋白酶-胰蛋白酶(加入量为8000u/mL)，40℃、360rpm搅拌酶解2h，100℃加热灭酶10min，12000rpm离心10min后取上清液得到酶解液；测定抗凝血酶活力；
分离纯化，将上述酶解液经1.0kDa超滤膜超滤、离子交换和凝胶过滤层析后进行反相高效液相色谱(HPLC)纯化得到抗凝血活性肽。
对比例2：
一种抗凝血活性肽的制备与实施例1的不同之处在于：不接X基团。
试验例1：
用凝血酶滴定改进法测定样品的抗凝血酶活力
(1)配置不同浓度的凝血酶溶液
配制含0.05moL/L NaCL的0.05moL/L Tris-HCL溶液，pH7.4，用来配制0.5％纤维蛋白原。配制不同浓度梯度的凝血酶溶液：20NIH/mL(作为基准浓度，即1倍)，该溶液5μL为一个滴定体积，即1V，为0.1ATU：
20NIH÷(1000μL÷5μL)＝20NIH÷200＝0.1NIH，因1NIH＝1ATU，故0.1ATU＝0.1NIH，20NIH/mL(作为基准浓度，即1倍)，40NIH/mL(即2倍)，100NIH/mL(即5倍)，等。
(2)样品抗凝血活性测定
取几支7.5mm×100mm的小试管，各加入0.5％纤维蛋白原200μL，再各加入样品0.5mg，放在37℃恒温水浴锅中5min。
①取其中一支滴加5倍凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，若1min内凝固，说明50μL水解提取液中含有的抗凝血活性少于0.5ATU。为了准确知道该水解提取液含有的抗凝血活性，再取一支滴加1倍凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，若1min内凝固，说明其中抗凝血活性少于0.1ATU；若1min内不凝固，说明其中抗凝血活性大于0.1ATU，再滴加1倍凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，若1min内凝固，说明其中抗凝血活性少于0.2ATU；若1min内不凝固，说明其中抗凝血活性大于0.2ATU，再滴加1倍凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，直到凝固出现，从而知道该样品的活性。
②取其中一支滴加5倍凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，若1min内不凝固，说明50μL水解提取液中含有的抗凝血活性多于0.5ATU。再往其中滴加20倍(400NIH/mL)凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，若1min内凝固，说明其中抗凝血活性少于2ATU。此时，应再从水浴锅中取一支试管，滴加5倍凝血酶溶液10μL，迅速摇匀，若1min内凝固，说明其中抗凝血活性少于1ATU。再取一支滴加5倍凝血酶溶液5μL及1倍凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，若1min内凝固，说明其中抗凝血活性少于0.6ATU；若1min内不凝固，说明其中抗凝血活性多于0.6ATU，往其中滴加1倍凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，若1min内凝固，说明其中样品的活性少于0.7ATU。这样继续下去，直到检测出样品的活性为止。
③样品活性检测、含量及比活性计算
活性用抗凝血酶活性单位(ATU)表示，检测方法为凝血酶滴定改进法。含量按下式计算：
U＝20C
式中，C为每50μL待测(供试品或对照品)溶液含ATU的单位数，U为每1mL待测溶液含ATU数。
对对比例1～2、实施例1～6进行上述测试，结果如图1所示。从图中分析可知，对比例1和对比例2制得样品的抗凝血活性无明显差异，表明人工合成的活性肽与天然活性肽的抗凝血功效无太大差别；实施例1～6制得的样品的抗凝血活性＞200TUA/mL，其中实施例1制得的样品的抗凝血活性为219.4TUA/mL，明显高于对比例1和对比例2，表明对多肽进行化学修饰制得的多肽衍生物，具有更高的抗凝血活性。实施例1～6制得的抗凝血活性肽衍生物均具有较高抗凝血活性，无显著差异。
试验例2：
体外溶血栓活性试验
材料：琼脂糖，购于上海伯奥生物有限公司；CaCL2溶液，购于上海太阳生物试剂公司；血浆，购于广州健阳生物试剂公司；纳豆激酶，购于翔博生物试剂公司。
实验步骤：
将0.1g琼脂糖倒入30mL蒸馏水中，加热煮沸，冷却至50℃，加入0.05moL/L(pH7.4)的磷酸盐缓冲溶液5mL，再加1.5mL血浆，最后加入0.025moL/L CaCL2溶液1.5mL，快速搅拌均匀，启动反应，同时趁温倒入(d＝9cm)培养皿，均匀铺板，厚度约1cm。铺板均匀后，水平放置30min，待板内凝胶冷却凝固后用内径0.45cm的打孔器打孔，取1mg/mL浓度的各样品液和空白对照液50μL注入，最后放于37℃的恒温培养箱中。40h后观察溶解圈大小，记录下圈直径，并计算其面积，用溶解圈面积来表示溶栓活性。溶解圈面积计算公式如下：
溶解圈面积(mm2)＝[(d长径+d短径)/4]2×π-0.159(其中0.159为打孔面积)
对对比例2、实施例1～6制得的样品进行上述测试，具体结果如图2所示。从图中分析可知，对比例1和对比例2制得样品的溶圈面积无明显差异，表明人工合成的活性肽与天然活性肽的溶血栓血功效无太大差别；实施例1制得的样品的溶圈面积为390.4mm2，明显高于对比例1和对比例2，表明对多肽进行化学修饰制得的多肽衍生物，具有更高的溶血栓活性。实施例1～6制得的抗凝血活性肽衍生物均具有较高抗凝血活性，且无显著差异。且本发明制得的活性肽衍生物可直接口服，口服后人体消化液对其活性影响较小。
试验例3：
半衰期测定
1、线性范围
将样品溶于5mmoL/L乙酸铵溶液(含0.1％(v/v)的甲酸)中，在浓度为1～1000ng/L范围内设10个浓度，即1，5，10，20，50，100，150，250，500，1000ng/μL。分别在10个试管中，准确量取1.0mL空白血浆，按照设计浓度分别加入相应的样品标准品。按照上述过程处理样品，RP-HPLC测定，以样品标准品曲线下面积与其浓度进行线性回归，得到回归方程；
2、血药浓度
在不同时间后的血浆中得到样品的RP-HPLC曲线，拟合样品的血药浓度，做出曲线图得到血药浓度曲线回归方程，进而计算得到半衰期。
对对比例1～2、实施例1进行上述测试，结果如表1所示。
表1样品受试不同时间后的凝血四项指标
从表中数据拟合计算可知，对比例1的半衰期为29±2min，对比例2的半衰期为48±4min，实施例1的半衰期为90±3min；对比例2的半衰期长于对比例2，表明人工合成的抗凝血活性肽具有更高的稳定性；实施例1的半衰期明显高于对比例2，表明经过化学修饰制得的抗凝血活性肽衍生物能够更有效的避免体内酶的分解，进一步提升其稳定性。
试验例4：
抗氧化活性测定
采用DPPH自由基清除活性测定法评价制备样品的抗氧化活性。准确吸取2.00mL浓度分别为0.1、0.5、1、5、10、20mg/mL的样品溶液于试管中，然后分别加入2.00mL 0.1MDPPH-乙醇溶液混匀，室温条件下避光反应30min，于517nm处测定溶液吸光值(A2)。同时设定阳性对照(谷胱甘肽，GSH)，吸光值为A1，空白对照(以蒸馏水代替样品)吸光值为A0。DPPH清除率的计算方式如下：
DPPH·清除率(％)＝[1-(A2-A0)/A1]×100％
测试样品为对比2、实施例1～6制得的多肽及多肽衍生物进行测试，结果如图3所示。从图中分析可知，实施例1的DPPH·清除率为94.7％，明显高于对比例2，表明制得的抗凝血活性肽衍生物具有更好的抗氧化活性。实施例1～6制得样品的抗氧化活性无显著差异。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 广东海洋大学
<120> 一种抗凝血活性肽衍生物及其制备方法和用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 鲷鱼和腊鱼(Apogon aureus & Pseudobagrus fulvidraco)
<400> 1
Phe Lys His Met Asn Glu
1 5
Claims (10)
1.一种抗凝血活性肽，其氨基酸序列为：Phe-Lys-His-Met-Asn-GLu。
2.根据权利要求1所述的一种抗凝血活性肽，其特征在于：所述抗凝血活性肽具有抗凝血活性和溶血栓功效，其中抗凝血活性＞150ATU/mL。
3.权利要求1所述的抗凝血活性肽在制备血栓性心脑血管疾病药物中的用途。
4.权利要求1所述的抗凝血活性肽在制备抗凝血产品中的用途。
5.权利要求1所述的抗凝血活性肽在制备抗凝血和溶血栓功效的功能性食品中的用途，所述功能性食品为粉剂、片剂、口服液或胶囊。
6.一种抗凝血活性肽衍生物，其序列为：X-Phe-Lys-His-Met-Asn-GLu，其中，端基X为对羟基肉桂酸、2-氨基-3-(2,3-二羟基苯基)丙酸和2-氨基-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙酸。
7.根据权利要求6所述的抗凝血活性肽衍生物，其特征在于：所述序列中，Phe为D构型或L构型，其余均为L构型。
8.权利要求6所述的抗凝血活性肽衍生物在制备血栓性心脑血管疾病药物中的用途。
9.权利要求6所述的抗凝血活性肽衍生物在制备抗凝血产品中的用途。
10.权利要求6所述的抗凝血活性肽衍生物在制备抗凝血和溶血栓功效的功能性食品中的用途，所述功能性食品为粉剂、片剂、口服液或胶囊。
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|---|---|---|---|---|
| EP0275748A1 (fr) * | 1986-12-15 | 1988-07-27 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Nouveaux dérivés peptidiques et leur application notamment en thérapeutique |
| US5495000A (en) * | 1990-07-24 | 1996-02-27 | Merrell Pharmaceuticals Inc. | Anticoagulant peptides |
| CN101372512A (zh) * | 2007-08-23 | 2009-02-25 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一类抗凝血多肽及其用途 |
| CN104004806A (zh) * | 2014-05-12 | 2014-08-27 | 华南理工大学 | 一种具有抗凝血与溶血栓地龙多肽及其酶解制备方法与应用 |
| CN105175510A (zh) * | 2015-10-22 | 2015-12-23 | 江苏大学 | 噬菌体展示技术筛选的具有抗凝血活性的多肽 |
-
2020
- 2020-11-25 CN CN202011335865.5A patent/CN112430254B/zh active Active
Patent Citations (5)
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Also Published As
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