CN104530199B - 一种抗肿瘤多肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有抗肿瘤作用的多肽及其制备方法和应用。本发明所述的抗肿瘤多肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。本发明多肽利用固相化学合成法合成，产量高，工艺稳定，分子量为3299.2Da。研究表明本发明多肽具有抑制血管形成和肿瘤细胞增殖的活性，且治疗肿瘤安全有效。因此，本发明的一种具有高效、低毒的抗肿瘤活性的多肽将在肿瘤的药物研发上具有重要的应用价值。

Description

一种抗肿瘤多肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种多肽及其制备方法和应用，特别涉及一种具有抗肿瘤作用的多肽及其制备方法和应用，属于生物制药领域。

背景技术

肿瘤的生长过程可分为两个时期：血管前期和血管期。血管前期因缺少血液的供应，肿瘤处于休眠状态，直径1-2mm，并不发病；血管期因获得充足的血液供应，肿瘤体积快速增大，产生浸润、转移，并诱导新生血管生成。肿瘤血管形成(angiogenesis)是指肿瘤细胞诱导的微血管生长以及肿瘤中血液循环建立的过程。肿瘤新生血管形成过程受血管形成的促进因子和抑制因子调节血管形成抑制因子通过抑制肿瘤组织血管形成，断绝血液供应，间接的抑制肿瘤细胞的增长。用血管形成抑制因子治疗肿瘤具有抗瘤谱广，没有毒副作用，不产生耐药性等优点。血管形成抑制因子不能直接杀伤肿瘤细胞，停药肿瘤会复发，因此血管形成抑制因子主要是作为化疗药物的辅助药物，配合化疗药物使用，用以减少化疗药物剂量，降低化疗药物的毒性。

恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康和生命的疾病，寻找新型高效、低毒的抗肿瘤药物抑制是国内外医药研发的热点。抗肿瘤小分子多肽具有分子量小、低毒性、高活性、易于穿透肿瘤细胞等特点，且能以多种方式给药、易于多途径吸收、不易产生耐药性。蛋白质类大分子药物分子量大、结构复杂，不易穿透细胞，且具有免疫原性，而小分子多肽结构易于改造，人工合成成本较低，由于其具有相对分子质量(Mr)小、活性高、毒性低的特点，在肿瘤的临床治疗上有重要的价值。近年来，人们主要通过从动植物中提取、从肽库中筛选和化学合成等方法得到抗肿瘤活性小分子多肽，如来源于海兔的Dolastatin10衍生物TZT-1027、来源于海天牛鼠的KahalalideF，它们已进入Ⅱ期临床研究，分别对非小细胞肺癌细胞和黑色素瘤细胞有较强杀伤作用。由于小肽类化学合成的成本低于基因重组，目前小肽类药物多用化学合成法生产。但并不是所有的小肽类药物都适合用固相化学合成法生产。有的小肽固相化学合成产量很低，称为合成困难肽。

本发明公开一种由30个氨基酸组成的多肽，其特点是固相化学合成的产量高，结构稳定，具有抑制血管形成活性和抑制肿瘤细胞增殖活性，并且治疗肿瘤安全有效，可作为抗肿瘤药物。

发明内容

本发明的目的是基于抗肿瘤多肽分子设计理论和固相化学合成技术，提供一种具有高效、低毒的抗肿瘤活性的多肽。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明的多肽由30个氨基酸组成，氨基酸序列见SEQ ID No.1，分子量为3299.2Da。

本发明中，优选的，在SEQ ID No.1的羧基端氨基酸上连入NH₂，人工酰胺化，以使合成的多肽结构稳定。

本发明的抗肿瘤多肽是通过固相化学合成方法直接获得的。

本发明中，优选的，固相化学合成方法包括以下步骤：

(1)称取Fmoc-Rink Linker–树脂放入小烧杯中，采用PIP/DMF溶液去保护25min，过滤得到去Fmoc的树脂备用；

(2)经保护的氨基酸在树脂上按预先设计的顺序从C端到N端逐个进行耦合并脱保护；

(3)合成的多肽经体积比为TFA：H₂O：EDTA＝95:5:5的裂解液进行裂解3小时后，得到多肽粗品。

多肽的合成从羧基端开始，合成的难易、产量的高低与多肽羧基端7-12位氨基酸的种类有关。如果7-12位氨基酸序列易形成β-折叠或β-转角二级结构，会影响合成过程中的偶联反应，产生不完整肽段，降低完整产物的得率。本发明的抗肿瘤多肽羧基端12-7位氨基酸序列为Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser。用软件预测二级结构既不易形成β-折叠，也不易形成β-转角。用10g树脂起始合成抗肿瘤多肽，得到产品4.6g，纯度95.9％，总收率27.9％。本发明发明人在试验中发现：另一条氨基酸种类和每种氨基酸数量都与本发明抗肿瘤多肽相同，但羧基端12-7位氨基酸序列为Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met(形成β-转角)的30肽，在其他条件完全相同的情况下，10g树脂所得产品1.7g,纯度95.6％，总收率10.3％。本发明抗肿瘤多肽的产率几乎是另一条30肽的3倍。同时用氨基酸种类不同的另外一些30肽作为合成的对照物，本发明抗肿瘤多肽的总收率都比对照物高，有的竟差7-8倍。

对采用上述制备方法制备得到的多肽粗品进行反向液相色谱纯化，并通过质谱分析确证。

鸡胚尿囊膜血管生成抑制试验结果显示，30ug本发明多肽滴加在9日龄的鸡胚尿囊膜血管丰富区，孵育48小时，鸡胚尿囊膜血管的形成受到明显抑制；用脐静脉内皮细胞做MTT试验，本发明多肽对脐静脉内皮细胞的IC₅₀＝16.9ug/mL；上述两项试验结果证实：本发明多肽具有确切的抑制血管形成的活性。

用SGC-7901胃癌细胞和Hela宫颈癌细胞做MTT试验，本发明多肽对SGC-7901胃癌细胞的IC₅₀＝28.5ug/mL，Hela宫颈癌细胞的IC₅₀＝39.9ug/mL，证实本发明多肽具有直接抑制肿瘤细胞增殖的活性。

采用H₂₂小鼠腹水肝癌模型，本发明多肽按照10mg/kg/d进行腹腔注射，顺铂按照2mg/kg/d进行腹腔注射，PBS缓冲液按照200～250uL/只进行腹腔注射，连续给药10天，本发明多肽的抑瘤率为57.01％，顺铂的抑瘤率为82.02％，PBS的抑瘤率为0；试验后动物体重与试验前比，对照组(给予同体积PBS缓冲液)增加39.5％，本发明多肽组增加22.65％，顺铂组降低了12.4％。溶血试验未发现本发明多肽有溶血现象；上述试验结果证实：本发明多肽治疗肿瘤安全有效。

因此，更进一步的，本发明还提出了所述的抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

总之，本发明的多肽具有高效、低毒的抗肿瘤活性，且可采用固相化学合成法合成，产量高，工艺稳定，在肿瘤的药物研发上具有重要的应用价值。

附图说明

图1为本发明多肽的质谱检测图；

图2为本发明多肽对鸡胚尿囊膜血管形成抑制试验结果图，其中，左图为PBS缓冲液对照组，右图为本发明多肽组；

图3为本发明多肽治疗小鼠H22肝癌效果图，其中，上面一行为PBS缓冲液对照组；中间一行为本发明多肽组(10mg/kg/d)；下面一行为顺铂组(2mg/kg/d)；

图4为本发明多肽溶血试验结果图，其中，左侧试管为生理盐水阴性对照组，中间试管为蒸馏水阳性对照组，右侧试管为本发明多肽给药组。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明中所出现的缩略语的说明：

Fomc         9-芴甲氧羰基

PIP          哌啶

HOBt         1-羟基苯并三唑

DIC          N,N-二异丙基碳二亚胺

DMF          二甲基甲酰胺

TFA          三氟乙酸

EDT          1,2-乙二硫醇

DMSO         二甲基亚砜

实施例1制备本发明多肽

以下制备多肽的Fmoc-Rink Linker-树脂，Fmoc保护氨基酸及缩合试剂、裂解试剂均购买于上海吉尔生化有限公司。

1.1本发明多肽树脂的合成

本发明多肽树脂为：Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Met-His(Trt)-Ser(tBu)-His(Trt)-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Pro-Val-Leu-His(Trt)-Leu-Val-Ala-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Pro-Leu-Ser(tBu)-Gly-Gly-Met-NH-Rink Linker-树脂。使用Fmoc-Rink Linker-树脂为开始载体，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与表1所示的保护氨基酸偶联，制得本发明多肽树脂。本实施例所使用的保护氨基酸从树脂起算第1至第30个氨基酸相对应的保护氨基酸如下表所示：

表1保护氨基酸

1.2接入第30～1个氨基酸

1.2.1接入第30个氨基酸

制备从C端到N端逐个进行。取Fmoc-Rink Linker-树脂(取代值为0.5mmol/g)10g，采用100mL 20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，过滤得到去Fmoc的树脂备用。

取0.015mol Fmoc-Met和0.015mol缩合剂HOBt，用适量DMF溶解；另取0.015mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸的DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液。

去Fmoc的树脂加入活化后的保护氨基酸溶液，偶联反应60～300分钟，过滤洗涤得带一个保护氨基酸的树脂。

1.2.2接入第29～1个氨基酸

采用上述同样方法，依次接入表1中对应的第29～1个保护氨基酸，接完所有保护氨基酸后，即得到的Fmoc-多肽树脂，再用100mL 20％PIP/DMF溶液去Fmoc保护25分钟，过滤洗涤后，即得本发明多肽树脂。

1.3本发明多肽粗品的制备

取制得的本发明多肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT＝95︰5︰5的裂解试剂(裂解试剂10mL/克树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得白色粉末，即为本发明多肽粗品，纯度为55.9％。

1.4本发明多肽粗品的纯化

取制得的多肽粗品，用10％的醋酸溶液溶解，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用。采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，21.4mm×250mm的色谱柱流速为25mL/min，紫外检测波长为280nm，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取多肽粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得多肽纯化中间体浓缩液。

取多肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用。采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，21.4mm×250mm的色谱柱流速为25mL/min，紫外检测波长为280nm，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到多肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得多肽产品4.6g，产品纯度为95.9％，总收率为27.9％。

1.5本发明纯化多肽的质谱鉴定

纯化的多肽质谱图见图1，本发明多肽的理论分子量为3299Da(100％M+H)，质谱检测条件：流速为0.2mL/min，运行时间为1min，流动相系统为0.15％甲酸/水溶液-0.1％甲酸/乙腈溶液，纯化多肽的质谱表明，其分子量与计算值相符。

实施例2本发明多肽抑制血管形成的研究

顺铂(购自哈尔滨医科大学附属第二医院)：1mg/mL常温保存，再用生理盐水稀释成0.2mg/mL的工作液，存于4℃。PBS缓冲液：PBS(购自博士得公司)，用2L去离子水溶解，pH＝7.6，高压灭菌待用。多肽由实施例1方法制备。

2.1本发明多肽抑制鸡胚尿囊膜血管形成的研究

取8d龄胚蛋经0.1％新洁尔灭消毒后置于37.8℃、相对湿度为60～80％的恒温孵箱中，胚头斜向上方孵育，第2天于检卵灯下确定气室及血管丰富部位，在血管丰富区给予30μg的多肽，对照组给同体积的PBS缓冲液(每组鸡胚5只)，以无菌胶带封口，于37.8℃继续孵育48h，用眼科镊子小心去掉鸡胚尿囊膜上的卵壳及卵壳膜，观察尿囊膜血管变化，拍照记录。结果如图2，由图2可知，本发明多肽对鸡胚尿囊膜血管形成有明显的抑制作用。

2.2本发明多肽抑制脐静脉内皮细胞增殖的MTT实验

1.将多肽用细胞培养液R/MINI1640(含10％小牛血清，购买自Gibco公司)分别稀释配制成由低到高的不同浓度(浓度分别为10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL和70μg/mL)，4℃保存备用。

2.取对数生长期的人脐静脉内皮细胞，用0.25％的胰酶消化，计数并且调整细胞浓度为2×10⁴个/mL，180μL/孔接种至96孔板，24h贴壁后，每孔加入不同浓度的多肽20μL。以PBS缓冲液为阴性对照，以化疗药物顺铂为阳性对照。每种浓度设6个复孔，继续培养24h。

3.每孔加入MTT(5mg/mL)20μL，孵育4h(细胞在SDH(琥珀酸脱氢酶)作用下把黄色的MTT还原成紫蓝色结晶)。吸弃培养液，各孔加入100μL DMSO，培养板振荡10～20min。

4.于全自动酶标仪上测A₄₉₀值。以细胞培养液为阴性对照，以化疗药物顺铂为阳性对照。细胞存活率(SR)＝给药组A₄₉₀/对照组A₄₉₀×100％，以存活率(Y轴)与药物浓度(X轴)绘图，并计算半数抑制浓度IC₅₀值。实验重复进行三次。

本发明多肽对脐静脉内皮细胞的IC₅₀＝16.9μg/mL，说明本发明多肽具有通过抑制内皮细胞增殖而抑制血管形成的作用。

实施例3本发明多肽对肿瘤细胞的细胞毒性试验

抗肿瘤药物的细胞毒性实验多用MTT实验检测，实验方法参见实施例2。实验结果表明，本发明多肽对SGC-7901胃癌细胞的IC₅₀＝28.5μg/mL，对Hela宫颈癌细胞的IC₅₀＝39.9μg/mL，证明本发明多肽具有直接抑制肿瘤细胞增殖的活性。

实施例4本发明多肽在动物体内的抗肿瘤活性试验

4.1实验材料

顺铂(购自哈尔滨医科大学附属第二医院)：1mg/mL常温保存，再用生理盐水稀释成0.2mg/mL的工作液，存于4℃。PBS：PBS(购自博士得公司)，用2L去离子水溶解，pH＝7.6，高压灭菌待用。

本发明多肽：取10mg多肽(由实施例1方法制备)溶于250uL2％乙酸中，浓度为40mg/mL，再用PBS缓冲液稀释成1mg/mL，0.22um滤器过滤，作为工作液保存于-20℃。

实验动物：雌性、六周龄昆明小鼠(购自哈尔滨医科大学第二附属医院动物实验中心)。H₂₂小鼠腹水型肝癌细胞由东北农业大学生物技术与生命科学学院提供。

4.2试验方法

4.2.1制备腹水模型小鼠

1)取出H₂₂小鼠腹水型肝癌细胞2支(1mL/支)，37℃水浴至融化，加入PBS缓冲液5mL，1000r/min离心5min，PBS缓冲液洗两次，弃去上清，每支加入PBS缓冲液1mL，混匀。

2)六周龄雌性昆明小鼠腹腔注射上述细胞，500μL/只，持续观察小鼠产生腹水效果。

4.2.2制备肝癌荷瘤小鼠

1)准备：75％酒精、白血球细胞计数板、细胞用PBS缓冲液、5mL注射器、自制简易手术台及手术专用器械，均在无菌操作台中紫外消毒30min；

2)观察腹水模型小鼠：小鼠毛色正常，腹腔胀满，行动缓慢，可取腹水接种小鼠；

3)颈椎脱臼处死腹水模型小鼠，置于75％酒精浸泡15min，将腹水模型小鼠转移至手术台，剪开小鼠外皮，剥去腹膜，用5mL注射器抽取腹腔中的腹水，正常腹水颜色应为乳白色，略呈粘稠状，镜下观察腹水细胞为又亮又圆悬浮细胞；

4)PBS缓冲液稀释肝癌腹水细胞浓度为5×10⁶个/mL；

5)雌性昆明小鼠(17g-20g)，自由饮食、饮水，在小鼠右侧大腿腋窝处皮下接种5×10⁶个/mL肝癌腹水细胞，200uL/只。

6)密切观察小鼠成瘤情况，待小鼠皮下触摸到结节时随机分组并给药。

4.2.3给药

1)PBS组：PBS缓冲液200～250μL/只，腹腔注射；本发明多肽组：10mg/kg/d，腹腔注射；顺铂组：2mg/kg/d，腹腔注射。连续给药10天。

2)第十天给药后于次日处死小鼠。天平称取瘤前体重、瘤重、取瘤后体重，游标卡尺测量肿瘤长径、短径以计算肿瘤体积，结果见表2、表3和图3。

表2治疗前后小鼠体重的比较结果

顺铂组治疗后平均体重比治疗前减轻12.04％，说明顺铂2mg/kg/d毒副作用较大，对照组治疗后平均体重比治疗前增加39.5％，本发明多肽治疗后平均体重增加22.65％，说明本发明多肽的毒副作用轻微。

表3本发明多肽的抑瘤率

由表3和图3中可以看出本发明多肽10mg/kg/d腹腔注射，用药10天，对小鼠H22肝癌的抑瘤率为57.01％，且与对照组相比具有统计学差异(n＝8)。

实施例5溶血试验

试验流程：

1.血细胞悬液的配制：取50mL小烧杯加少许ACD抗凝剂(购自Invitrogen)备用，小鼠断头取血，放入上述小烧杯，振摇搅拌10分钟，除去纤维蛋白原，使成脱纤维血液。加入生理盐水约10倍量，摇匀，1500r/min离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用生理盐水按上述方法洗涤2-3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用生理盐水配成2％的混悬液，供试验用。

2.受试物的制备：本发明多肽(由实施例1方法制备)用生理盐水稀释，终浓度为50ug/mL。

3.试验方法：取洁净试管3只，从左至右依次分为为阴性对照管(生理盐水)、阳性对照管(蒸馏水)和给药管(本发明多肽，50ug/mL)。按表4所示依次加入2％红细胞悬液、生理盐水或蒸馏水，混匀后，立即置37℃的恒温箱中进行温育，开始每隔15分钟观察1次，1小时后，每隔1小时观察1次，一般观察3小时。

表4

4.结果观察：

注：各图所示试管分别为阴性对照管(左，加生理盐水)、阳性对照管(中，加蒸馏水)和给药管(右，加本发明多肽)，。

5.结果判断：结果见图4，由图4可知，生理盐水组未发生溶血，蒸馏水组发现溶血，本发明多肽给药组未见发生溶血反应，表明本发明多肽用药相对安全。

Claims (5)

1.一种抗肿瘤多肽，其特征在于，所述的抗肿瘤多肽的氨基酸序列为SEQ IDNo.1所示。

2.根据权利要求1所述的抗肿瘤多肽，其特征在于，在SEQ ID No.1的羧基端氨基酸上连入NH₂，人工酰胺化，以使合成的多肽结构稳定。

3.制备权利要求1或2所述的抗肿瘤多肽的方法，其特征在于，所述制备方法为固相化学合成法。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)称取Fmoc-Rink Linker–树脂，采用PIP/DMF溶液去保护25min，过滤得到去Fmoc的树脂备用；

(2)经保护的氨基酸在树脂上按预先设计的顺序从C端到N端逐个进行偶合并脱保护；

(3)合成的多肽经体积比为TFA：H₂O：EDT＝95:5:5的裂解液进行裂解3小时后，得到多肽粗品。

5.权利要求1或2所述的抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。