CN113185582A - 一种环五肽Galaxamide及其制备方法与其在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种环五肽Galaxamide及其制备方法与其在制备抗肿瘤药物中的应用，将氨基酸和树脂加入反应装置内，经过链状连接，封闭和检验，再重复连接剩下4个氨基酸，形成带树脂保护的链式五肽，最后通过脱保护、环合，得到环五肽Galaxamide。本发明的优点有：环五肽Galaxamide对宫颈癌细胞Hela、乳腺癌细胞MDA‑MB‑231、胶质瘤细胞GL261、人非小细胞肺癌细胞A549、肝癌细胞Huh7和人病变乳腺癌细胞MCF7的存活率，增殖抑制，凋亡，迁移侵袭有显著影响，同时构建裸鼠皮下宫颈癌细胞Hela和乳腺癌细胞MDA‑MB‑231移植瘤，研究Galaxamide对裸鼠体内移植瘤的影响，有力地证明本发明化合物对肿瘤细胞确实有明显地抑制作用；说明环五肽Galaxamide有明显的抗肿瘤活性，具有制备预防或治疗癌症及其相关疾病制剂的成药潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一种肿瘤药物技术领域，尤其涉及环五肽Galaxamide。
背景技术
当前社会，越来越多人被癌症所困扰，所以找到一种高效且对人体毒性较少的抗肿瘤药已经变得刻不容缓了。癌症，即恶性肿瘤，具有细胞分化和增殖异常、生长失去控制、浸润性和转移性等生物学特征，其发生是一个多因子、多步骤的复杂过程。其最主要的特点是由于细胞发生病变而导致其繁殖能力大大增强，所以其在人体内十分容易扩散，分裂，非常难治愈。且因为癌症细胞的高繁殖性，很多患者被检查出癌症已是晚期，导致错过最佳的治疗时间，故其致死率一直居高不下。根据世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的2020年全球最新癌症负担数据来看，2020年全球新发癌症1930万例，死亡近1000万例；每5人中就有1人将在其一生中患癌症；而预计到2040年，全球新发癌症将达到2840万例。虽然说癌症的病发十分普遍，且致死率高，但不幸的是，人类对于很多癌症的治疗仍处于探索阶段，治疗方法一般只有手术治疗，放化疗和药物治疗，以及中药治疗等综合治疗。同时由于化疗治疗对肿瘤细胞的针对性不强，在清除一定的肿瘤细胞的同时也对正常细胞有不可逆的损伤，所以癌症一般以手术清除病灶和使用抗肿瘤药物治疗为主，手段单一。正因为以上的原因，寻找一种对人体耐受性好，更安全，更温和，更高效的抗肿瘤药物已经变得越来越重要。
海洋中蕴含着丰富的资源，海洋天然产物因其结构新颖，活性显著而广受关注。其中环肽类化合物结构稳定，毒性低，同时具有很多潜在的生物学活性，所以其药用价值受到广泛关注。
发明内容
本发明的目的在于提供一种环五肽Galaxamide及其制备方法与其在制备抗肿瘤药物中的应用，以解决现有癌症治疗技术针对性不强、安全性局限、疗效有限，对人体耐受性差等问题。
为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：
一种环五肽Galaxamide，其结构式如下式(Ⅰ)所示：
一种如权利要求1所述的环五肽Galaxamide的制备方法，详细操作过程是：
(1)多肽合成管中加入2-氯三苯基甲基氯树脂、二氯甲烷搅拌进行溶胀，再用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺交替清洗；用二氯甲烷溶解Fmoc-MeLeu-OH，往Fmoc-MeLeu-OH的二氯甲烷溶液中逐滴加入DIEA；再将Fmoc-MeLeu-OH的二氯甲烷溶液加入2-氯三苯基甲基氯树脂多肽合成管中密封搅拌反应，抽去溶液，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺交替清洗，得到Fmoc-MeLeu-resin；
(2)向多肽合成管中加入甲醇，然后逐滴加入DIEA，搅拌反应，对上一步获得的树脂进行封闭；
(3)向多肽合成管中加入哌啶和N,N-二甲基甲酰胺，搅拌反应，抽去反应液，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺交替清洗，树脂脱保护；用N,N-二甲基甲酰胺溶解Fmoc-Leu-OH、HOAt，然后逐滴加入DIC，再转移到多肽合成管中搅拌反应，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺交替清洗，得到Fmoc-MeLeu-Leu-resin；
(4)向多肽合成管中加入哌啶和N,N-二甲基甲酰胺，搅拌，抽去反应液，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺交替清洗，树脂脱保护；用N,N-二甲基甲酰胺溶解Fmoc-Leu-OH、HOAt，然后逐滴加入DIC，再转移到多肽合成管中，搅拌反应，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺交替清洗，得到Fmoc-MeLeu-Leu-Leu-resin；
(5)向多肽合成管中加入哌啶和N,N-二甲基甲酰胺搅拌，抽去反应液，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺交替清洗，树脂脱保护；用N,N-二甲基甲酰胺溶解Fmoc-MeLeu-OH、HOAt，然后逐滴加入DIC，再转移到多肽合成管中，搅拌反应，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺交替清洗，得到Fmoc-MeLeu-Leu-Leu-MeLeu-resin；
(6)向多肽合成管中加入哌啶和N,N-二甲基甲酰胺搅拌，抽去反应液，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺交替清洗，树脂脱保护；用N,N-二甲基甲酰胺溶解Fmoc-Leu-OH、HOAt，然后逐滴加入DIC，再转移到多肽合成管中，搅拌反应，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺交替清洗，得到Fmoc-MeLeu-Leu-Leu-MeLeu-Leu-resin；
(7)向多肽合成管中加入哌啶和N,N-二甲基甲酰胺搅拌，抽去反应液，用二氯甲烷清洗，树脂脱保护；向多肽合成管中加入TFA和DCM溶液，室温下搅拌反应，二氯甲烷清洗得到切肽液，去掉溶剂，加入冰冻乙醚析出白色固体，置在冰箱中过夜，析出更多白色固体，去掉乙醚，得到线性肽；
(8)二氯甲烷溶解线性肽和PyBOP，DIEA调节pH，室温搅拌，去掉部分溶剂，用饱和碳酸氢钠溶液和水各萃取两次，无水硫酸钠干燥，去掉溶剂，得到环五肽Galaxamide。
优选地，
所述步骤(1)的具体过程是：
溶胀：准备好干燥的100mL多肽合成管，称取1.1g 2-氯三苯基甲基氯树脂，负载量：0.969mmol/g，加入到100mL多肽合成管中。
吸取20mL无水二氯甲烷加入到多肽合成管中，密封搅拌30min；
之后将多肽合成管抽去溶液，再分别用10mL二氯甲烷和10mL N，N-二甲基甲酰胺交替各冲洗3次，抽滤；
连接第一个氨基酸：称取1.1g，3mmol，367.44Fmoc-MeLeu-OH到50mL锥形瓶中，再加入10mL二氯甲烷将其溶解，用胶头滴管向盛有Fmoc-MeLeu-OH的锥形瓶中加入0.5mL，3mmol，129.24，ρ＝0.742DIEA，将混合液转移至溶胀后的树脂多肽合成管中密封搅拌反应2.5h；
之后将多肽合成管抽去溶液；分别用10mL二氯甲烷和10mL N，N-二甲基甲酰胺交替各冲洗3次树脂复合物，洗涤一次抽滤一次，尽量抽干树脂中的溶液，得到Fmoc-MeLeu-resin。
优选地，
所述步骤(2)的具体过程是：将步骤(1)得到的树脂复合物进行封闭处理，向多肽合成管中加入18mL甲醇，胶头滴管加入2mL DIEA，搅拌反应30min；
之后将多肽合成管抽去溶液，分别用10mL二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺交替冲洗3次，抽滤。
优选地，
所述步骤(3)的具体过程是：
脱保护：将步骤(2)中带保护的线性一肽-树脂复合物脱保护处理，向多肽合成管中加入2mL哌啶和18mL DMF溶液，搅拌反应15min，抽去反应液；
分别用10mL DCM、10mL DMF交替冲洗3次，抽滤；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，重复上述步骤一次；
连接第二个氨基酸：称取1.1g，3mmol 353.41Fmoc-Leu-OH和0.4g，3mmol136.11HOAt于50mL三角锥形瓶中，向锥形瓶中加入10mL DMF，在超声仪中完全溶解，再用胶头滴管加入0.46mL 3mmol DIC，将其转移到多肽合成管中，再用5mL DMF洗涤锥形瓶，将其中的残余洗净，转移到多肽合成管中；搅拌反应5h；
反应结束后抽干滤液，分别用10mL DCM、10mL DMF交替冲洗3次，抽滤；得到带保护的线性二肽-树脂复合物Fmoc-MeLeu-Leu-resin。
优选地，
所述步骤(4)的具体过程是：
脱保护：将步骤(3)中带保护的线性二肽-树脂复合物脱保护处理，向多肽合成管中加入2mL哌啶和18mL DMF，搅拌15min。
抽去反应液，分别用10mL DCM、10mL DMF交替冲洗3次，抽滤；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，重复上述步骤一次；
连接第三个氨基酸：称取1.1g，3mmol，353.41Fmoc-Leu-OH和0.4g，3mmol，136.11HOAt于50mL三角锥形瓶中，用10mL DMF将其溶解，再加入0.46mL，3mmol，126.2DIC，将混合液转移至脱保护的线性二肽-树脂复合物多肽合成管中，再用5mL DMF洗涤锥形瓶转移到多肽合成管中，搅拌反应3h；
抽去反应液，分别用10mL DCM、10mL DMF交替冲洗3次，抽滤，得到带保护的线性三肽-树脂复合物Fmoc-MeLeu-Leu-Leu-resin。
优选地，
所述步骤(5)具体过程是：
脱保护：将步骤(4)中带保护的线性三肽-树脂复合物脱保护处理，向多肽合成管中加入2mL哌啶和18mL DMF，搅拌反应15min；
抽去反应液，分别用10mL DCM、10mL DMF交替冲洗3次，抽滤；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，重复上述步骤一次；
连接第四个氨基酸：称取1.1g，3mmol 367.44Fmoc-MeLeu-OH和0.4g，3mmol，136.11HOAt于50mL三角锥形瓶中，用10mL DMF将其溶解，再加入0.46mL 3mmol，126.2，ρ＝0.815DIC，将混合液转移至脱保护的线性三肽-树脂复合物多肽合成管中，再用5mL DMF洗涤锥形瓶转移到多肽合成管中，搅拌反应3h；
将反应液抽干，分别用10mL DCM、10mL DMF交替冲洗3次，洗抽滤，得到带保护的线性四肽-树脂复合物Fmoc-MeLeu-Leu-Leu-MeLeu-resin。
优选地，
所述步骤(6)的具体过程是：
脱保护：将步骤(5)中带保护的线性四肽-树脂复合物脱保护处理，向多肽合成管中加入2mL哌啶和18mL DMF，搅拌反应15min；
抽去反应液，分别用10mL DCM、10mL DMF交替冲洗3次，抽滤；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，重复上述步骤一次；
连接第五个氨基酸：称取1.1g，3mmol，353.41Fmoc-Leu-OH和0.4g，3mmol，136.11HOAt于50mL三角锥形瓶中，用10mL DMF将其溶解，再加入0.46mL，3mmol，126.2，ρ＝0.815DIC，将混合液转移至脱保护的线性四肽-树脂复合物多肽合成管中，再用5mL DMF洗涤锥形瓶转移到多肽合成管中，搅拌反应3h；
将反应液抽干，分别用10mL DCM、10mL DMF交替冲洗3次，抽滤，得到带保护的线性五肽-树脂复合物Fmoc-MeLeu-Leu-Leu-MeLeu-Leu-resin。
优选地，
所述步骤(7)的具体过程是
脱保护：将步骤(6)带保护的线性五肽-树脂复合物脱保护处理，向多肽合成管中加入2mL哌啶和18mL DMF，搅拌反应15min；
抽去反应液，用10mL DCM冲洗3次，抽滤；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，重复上述步骤一次；
将脱保护的线性五肽-树脂复合物切肽处理，向多肽合成管中加入0.4mL TFA和19.6mL DCM溶液，室温下搅拌反应1h；
将多肽合成管中的反应液抽滤，再用10mL DCM冲洗树脂3次，得到切肽液；
将切肽液溶剂去掉，加入大量的冰冻乙醚，析出白色固体，再将其密封放置在冰箱中过夜，使其析出更多固体；
之后去掉乙醚，得到线性肽，密封保存在冰箱中；
所述步骤(8)的具体过程是：
称取100mg线形肽和250mg 0.3mmol，520.4PyBOP，将其用100mL DCM溶解，加入DIEA0.5mL，用DIEA调节pH＝8，室温下搅拌反应48h；
去掉部分容剂，依次用饱和碳酸氢钠溶液和水各萃取两次，取下层液体，无水硫酸钠干燥，过滤，干燥，经高效液相色谱纯化得到白色固体。
一种环五肽Galaxamide在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的优点包括：
通过研究环五肽Galaxamide对宫颈癌细胞Hela；乳腺癌细胞MDA-MB-231；胶质瘤细胞GL261；人非小细胞肺癌细胞A549；肝癌细胞Huh7和人病变乳腺癌细胞MCF7的存活率，增殖抑制作用，诱导凋亡，迁移侵袭的影响，同时构建裸鼠皮下宫颈癌细胞Hela和乳腺癌细胞MDA-MB-231移植瘤在裸鼠体外接种宫颈癌细胞Hela和乳腺癌细胞MDA-MB-231，研究Galaxamide对动物体外对裸鼠体内移植瘤的影响，有力地证明本发明对肿瘤细胞确实有明显地抑制作用；说明环五肽Galaxamide有明显的抗肿瘤活性，具有制备预防或治疗癌症及其相关疾病制剂的成药潜力，为开发抗肿瘤创新药物提供新的物质基础，且具有潜在的经济效益和社会效益。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1是环五肽Galaxamide的HRMS图谱；
图2是环五肽Galaxamide的1H NMR图谱；
图3是环五肽Galaxamide的13C NMR图谱；
图4是环五肽Galaxamide的IR图谱；
图5是不同浓度的环五肽Galaxamide对对数生长期的乳腺癌细胞MDA-MB-231的存活率影响实验数据统计图；
图6是不同浓度的环五肽Galaxamide对对数生长期的胶质瘤细胞GL261的存活率影响实验数据统计图；
图7是不同浓度的环五肽Galaxamide对对数生长期的人非小细胞肺癌细胞A549的存活率影响实验数据统计图；
图8是不同浓度的环五肽Galaxamide对对数生长期的宫颈癌细胞Hela的存活率影响实验数据统计图；
图9是对数生长期的肝癌细胞Huh7的存活率的影响实验数据统计图；
图10是对数生长期的人病变乳腺癌细胞MCF7的存活率的影响实验数据统计图；
图11是环五肽Galaxamide在IC50值浓度下对乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞抑制曲线图；
图12是环五肽Galaxamide在IC50值浓度下对人非小细胞肺癌细胞A549细胞抑制曲线图；
图13是环五肽Galaxamide在IC50值浓度下对宫颈癌细胞Hela细胞抑制曲线图；
图14是环五肽Galaxamide在IC50值浓度下对肝癌细胞Huh7的细胞抑制曲线图；
图15a是接种宫颈癌细胞Hela细胞小鼠的相对瘤径变化与时间关系图；
图15b是接种宫颈癌细胞Hela细胞小鼠的相对体重变化与时间关系图；
图15c是接种乳腺癌细胞MDA-MB-231小鼠的相对瘤径变化与时间关系图；
图15d是接种乳腺癌细胞MDA-MB-231小鼠的相对体重变化与时间关系图；
图16是各实验组培养40天后解剖的宫颈癌肿瘤实验图；
图17是各实验组培养35天后解剖的乳腺癌肿瘤实验图。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
发明人从中国南海西沙群岛采集的海藻Galaxaura filamentosa中可分离得到环五肽Galaxamide。Galaxamide的环状结构稳定，有较多可修饰改性的位点，且结构也较为简单，发明人已经完成该化合物的全合成和工艺化流程，为其成药性提供基础。以下是该化合物合成及药性检测相关技术的具体实施方式：
一、实验原理：
多肽合成是以固相合成为反应原理，将氨基酸按照一定的顺序从C端向N端不断添加得到多肽。再将得到的多肽C端和N端通过缩合反应生成环肽。
二、仪器：
100mL多肽合成管、磁力搅拌器、磁子、抽滤瓶、水泵、10mL移液管、20mL移液管、胶头滴管、50mL锥形瓶、抽滤瓶、分液漏斗、三角抽滤漏斗、滤纸、圆底烧瓶、旋转蒸发仪、电热套。
三、药品：
Fmoc-MeLeu-OH、Fmoc-Leu-OH、2-氯三苯基甲基氯树脂(负载量：0.969mmol/g)、DCM(二氯甲烷)、DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、DIEA(N,N-二异丙基乙胺)、MeOH(甲醇)、哌啶、HOAt(N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑)、DIC(N,N-二异丙基碳二亚胺)、四氯苯醌检测液、茚三酮检测液、TFA(三氟乙酸)、冰乙醚、PyBOP(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷)、饱和碳酸氢钠水溶液、无水硫酸钠。
四、合成步骤：
①制备芴甲氧羰酰基亮氨酸的树脂复合物(Fmoc-MeLeu-resin)
(1)溶胀：准备好干燥的100mL多肽合成管以及磁子，将磁子沿着管壁缓慢加入。用称量纸在电子天平中称取1.1g 2-氯三苯基甲基氯树脂(负载量：0.969mmol/g)，加入到100mL多肽合成管中。
用20mL移液管吸取20mL无水DCM加入到多肽合成管中，将多肽合成管放置在磁力搅拌器上，密封搅拌30min。
之后将多肽合成管放置在抽滤瓶中用水泵抽去溶液。再分别用10mL DCM和10mLDMF交替各冲洗3次，洗涤一次抽滤一次，尽量抽干树脂中的溶液。
(2)连接第一个氨基酸：用称量纸在电子天平上称取1.1g(3mmol，367.44)Fmoc-MeLeu-OH到50mL锥形瓶中，再加入10mL DCM将其溶解。用胶头滴管向盛有Fmoc-MeLeu-OH的锥形瓶中加入0.5mL(3mmol，129.24，ρ＝0.742)DIEA，将混合液转移至溶胀后的树脂多肽合成管中密封搅拌反应2.5h。
之后将多肽合成管放置在抽滤瓶中用水泵抽去溶液。分别用10mL DCM和10mL DMF交替各冲洗3次树脂复合物，洗涤一次抽滤一次，尽量抽干树脂中的溶液。得到带保护的线性一肽-树脂复合物Fmoc-MeLeu-resin。
②封闭树脂上残余位点
将上述步骤得到的树脂复合物进行封闭处理，向多肽合成管中用移液管加入18mL甲醇，胶头滴管加入2mL DIEA。磁力搅拌器上搅拌反应30min。
之后将多肽合成管放置在抽滤瓶中用水泵抽去溶液，分别用10mL DCM、10mL DMF交替冲洗3次，洗涤一次抽滤一次，尽量抽干树脂中的溶液。
③制备带保护的线性二肽-树脂复合物(Fmoc-MeLeu-Leu-resin)
(1)脱保护：将②中带保护的线性一肽-树脂复合物脱保护处理，向多肽合成管中加入2mL哌啶和18mL DMF溶液，搅拌反应15min，抽去反应液。
分别用10mL DCM、10mL DMF交替冲洗3次，洗涤一次抽滤一次，尽量抽干树脂中的溶液。为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，重复上述步骤一次。
(2)检测：用药匙蘸取少量上述树脂于试管中，加入四氯苯醌，大约2min后颜色呈绿色。说明连接、脱保护成功。
(3)连接第二个氨基酸：用称量纸在电子天平上称取1.1g Fmoc-Leu-OH(3mmol，353.41)和0.4g HOAt(3mmol，136.11)于50mL三角锥形瓶中，向锥形瓶中加入10mL DMF，在超声仪中完全溶解，再用胶头滴管加入0.46mL DIC(3mmol，126.2，ρ＝0.815)，将其转移到多肽合成管中，再用5mL DMF洗涤锥形瓶，将其中的残余洗净，转移到多肽合成管中。搅拌反应5h。
反应结束后抽干滤液，分别用10mL DCM、10mL DMF交替冲洗3次，洗涤一次抽滤一次，尽量抽干树脂中的溶液。得到带保护的线性二肽-树脂复合物Fmoc-MeLeu-Leu-resin。
(4)检测：用钥匙蘸取少量上述树脂于试管中，加入四氯苯醌，大约2min后颜色不变色。说明连接成功。
④带保护的线性三肽-树脂复合物(Fmoc-MeLeu-Leu-Leu-resin)
(1)脱保护：将③中带保护的线性二肽-树脂复合物脱保护处理，向多肽合成管中加入2mL哌啶和18mL DMF，搅拌15min。
抽去反应液，分别用10mL DCM、10mL DMF交替冲洗3次，洗涤一次抽滤一次，尽量抽干树脂中的溶液。为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，重复上述步骤一次。
(2)检测：用钥匙蘸取少量上述树脂于试管中，加入茚三酮并在电子加热套上加热至120℃，大约2min后树脂变成紫色，说明脱保护成功。
(3)连接第三个氨基酸：用称量纸在电子天平上称取1.1g Fmoc-Leu-OH(3mmol，353.41)和0.4g HOAt(3mmol，136.11)于50mL三角锥形瓶中，用10mL DMF将其在超声仪中溶解，再加入0.46mL DIC(3mmol，126.2，ρ＝0.815)，将混合液转移至脱保护的线性二肽-树脂复合物多肽合成管中，再用5mL DMF洗涤锥形瓶转移到多肽合成管中，搅拌反应3h。
抽去反应液，分别用10mL DCM、10mL DMF交替冲洗3次，洗涤一次抽滤一次，尽量抽干树脂中的溶液。得到带保护的线性三肽-树脂复合物Fmoc-MeLeu-Leu-Leu-resin。
(4)检测：用钥匙蘸取少量上述树脂于试管中，加入茚三酮并在电子加热炉上加热至120℃，大约2min后树脂不变色。说明连接成功。
⑤带保护的线性四肽-树脂复合物(Fmoc-MeLeu-Leu-Leu-MeLeu-resin)
(1)脱保护：将④中带保护的线性三肽-树脂复合物脱保护处理，向多肽合成管中加入2mL哌啶和18mL DMF，搅拌反应15min。
抽去反应液，分别用10mL DCM、10mL DMF交替冲洗3次，洗涤一次抽滤一次，尽量抽干树脂中的溶液。为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，重复上述步骤一次。
(2)检测：用钥匙蘸取少量上述树脂于试管中，加入茚三酮并在电热套上加热至120℃，大约2min后呈现紫色。说明脱保护成功。
(3)连接第四个氨基酸：用称量纸在电子天平上称取1.1g Fmoc-MeLeu-OH(3mmol，367.44)和0.4g HOAt(3mmol，136.11)于50mL三角锥形瓶中，用10mL DMF将其在超声仪中溶解，再加入0.46mL DIC(3mmol，126.2，ρ＝0.815)，将混合液转移至脱保护的线性三肽-树脂复合物多肽合成管中，再用5mL DMF洗涤锥形瓶转移到多肽合成管中，搅拌反应3h。
将反应液抽干，分别用10mL DCM、10mL DMF交替冲洗3次，洗涤一次抽滤一次，尽量抽干树脂中的溶液。(洗涤时用10mL移液管吸取DCM或DMF，在多肽合成管管口转动加入，将管壁上飞溅的树脂冲洗下去，并摇晃多肽合成管使DCM或DMF充分接触树脂，充分洗涤)，得到带保护的线性四肽-树脂复合物Fmoc-MeLeu-Leu-Leu-MeLeu-resin。
(4)检测：用钥匙蘸取少量上述树脂于试管中，加入茚三酮并在电热套上加热至120℃大约2min后不变色。说明连接成功。
⑥带保护线性五肽-树脂复合物(Fmoc-MeLeu-Leu-Leu-MeLeu-Leu-resin)
(1)脱保护：将⑤中带保护的线性四肽-树脂复合物脱保护处理，向多肽合成管中加入2mL哌啶和18mL DMF，搅拌反应15min。
抽去反应液，分别用10mL DCM、10mL DMF交替冲洗3次，洗涤一次抽滤一次，尽量抽干树脂中的溶液。(洗涤时用10mL移液管吸取DCM或DMF，在多肽合成管管口转动加入，将管壁上飞溅的树脂冲洗下去，并摇晃多肽合成管使DCM或DMF充分接触树脂，充分洗涤)，为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，重复上述步骤一次。
(2)检测：用钥匙蘸取少量树脂于试管中，加入四氯苯醌，大约2min后树脂呈现绿色。说明脱保护成功。
(3)连接第五个氨基酸：用称量纸在电子天平上称取1.1g Fmoc-Leu-OH(3mmol，353.41)和0.4g HOAt 3mmol，136.11)于50mL三角锥形瓶中，用10mL DMF将其在超声仪中溶解，再加入0.46mL DIC(3mmol，126.2，ρ＝0.815)，将混合液转移至脱保护的线性四肽-树脂复合物多肽合成管中，再用5mL DMF洗涤锥形瓶转移到多肽合成管中，搅拌反应3h。
将反应液抽干，分别用10mL DCM、10mL DMF交替冲洗3次，洗涤一次抽滤一次，尽量抽干树脂中的溶液。得到带保护的线性五肽-树脂复合物Fmoc-MeLeu-Leu-Leu-MeLeu-Leu-resin。
(4)检测：用钥匙蘸取少量上述树脂于试管中，加入四氯苯醌，大约2min后树脂不变色。说明连接成功。
⑦树脂切割
(1)脱保护：将⑥中带保护的线性五肽-树脂复合物脱保护处理，向多肽合成管中加入2mL哌啶和18mL DMF，搅拌反应15min。
抽去反应液，用10mL DCM冲洗3次，洗涤一次抽滤一次，尽量抽干树脂中的溶液。为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，重复上述步骤一次。
(2)检测：用钥匙蘸取少量上述树脂于试管中，加入茚三酮并在带热套上加热至120℃大约2min后树脂呈现紫色。说明脱保护成功。
(3)将脱保护的线性五肽-树脂复合物切肽处理，向多肽合成管中加入0.4mL TFA和19.6mL DCM溶液，室温下搅拌反应1h。
将多肽合成管中的反应液抽滤到提前转备好的抽滤瓶中，再用10mL DCM冲洗树脂3次，将其中的反应液洗脱完全，得到切肽液。
将切肽液转移到圆底烧瓶中并在旋转蒸发仪上蒸发掉溶剂，加入大量的冰冻乙醚，析出白色固体，再将其密封放置在冰箱中过夜，使其析出更多固体。
之后用胶头滴管将乙醚吸出并将多余的乙醚在旋转蒸发仪上蒸发掉，得到线性肽。得到的线性肽密封保存在冰箱中。
⑧Galaxamide环合(线性肽环合)
用称量纸称取100mg线性肽和250mg(0.3mmol，520.4)PyBOP、磁子于250mL圆底烧瓶中，将其用100mL DCM溶解，用DIEA调节pH＝8(加入DIEA 0.5mL)，室温下磁力搅拌器上搅拌反应48h。
旋转蒸发仪上减压蒸去部分溶剂，依次用饱和碳酸氢钠溶液和水各萃取两次，取下层液体，无水硫酸钠干燥，三角抽滤漏斗过滤，减压旋干，经高效液相色谱纯化得到白色固体环五肽Galaxamide，其结构式及相关检测数据如下：
HRMS[M+H]+m/z＝594.4589(calcd for C32H59N5O5 594.4600)，[M+Na]+
m/z＝616.4408(calcd for C32H59N5O5 616.4423)。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δH 8.37(d,J＝7.9Hz,1H),7.43(d,J＝9.5Hz,1H),6.98(d,J＝9.9Hz,1H),4.77(dt,J＝9.4,6.7Hz,1H),4.37(dd,J＝8.0,3.0Hz,1H),4.34(d,J＝8.6Hz,1H),4.12(dd,J＝10.8,3.5Hz,1H),3.95(dd，J＝9.1，4.6Hz，1H)，2.65(s，3H)，2.60(s，3H)，1.93(ddd，J＝13.6，8.9，4.5Hz，1H)，1.86–1.83(m,1H),1.82(dd，J＝5.9，3.7Hz,1H),1.81–1.77(m,1H),1.56(dt,J＝11.2,3.0Hz，1H),1.50–1.48(m,1H),1.47(s,2H),1.44(s,1H)，1.43(s，1H)，1.39(d,J＝4.6Hz,1H),1.37(d,J＝4.8Hz,1H)，1.35(dt，J＝6.6，3.1Hz，1H),1.20–1.18(m,1H),1.17(t,J＝4.5Hz,1H),0.96(d,J＝6.5Hz,3H),0.93(d,J＝2.0Hz,3H),0.91(d,J＝5.5Hz,6H),0.87(d,J＝4.2Hz,6H),0.86(s,6H),0.85(s,6H)。
13C NMR(151MHz，DMSO-d6)δC 170.3，170.1，169.9，168.4，168.3,58.5，57.9,53.0,47.3，47.0，42.0，41.2,41.1,37.8,36.9,30.3，29.8,24.6，24.5，24.4，24.3,24.2,23.2,23.1，23.0，22.6，22.4，22.3,22.0，21.8，21.7，21.5。
五、药性实验：
1、检测不同浓度的环五肽Galaxamide对宫颈癌细胞Hela；乳腺癌细胞MDA-MB-231；胶质瘤细胞GL261；人非小细胞肺癌细胞A549；肝癌细胞Huh7和人病变乳腺癌细胞MCF7的细胞抑制率的影响。
供试品：所述的环五肽Galaxamide均由上述四中记载的步骤合成提纯所得
处理方法：取对数生长期的宫颈癌细胞Hela、乳腺癌细胞MDA-MB-231、胶质瘤细胞GL261、人非小细胞肺癌细胞A549、肝癌细胞Huh7和人病变乳腺癌细胞MCF7，以每孔3×105个/ml的密度接种于96孔板内。24小时后等待细胞贴壁后加入培养基和药物，每孔100μl，其中环五肽Galaxamide设置六组浓度和一组空白对照组，取倍半浓度法，分别是100μg/ml，50μg/ml，25μg/ml，12.5μg/ml，6.25μg/ml，3μg/ml，且每组浓度设置6个副孔。继续孵育72h后，检测细胞吸光度。实验结果数据如图5-10所示。对数浓度越高，各癌细胞活力均呈下降趋势，数据进一步处理后，环五肽Galaxamide作用于肿瘤细胞的IC50值如下表1所示：
表1：
2、制备环五肽Galaxamide对宫颈癌细胞Hela；乳腺癌细胞MDA-MB-231；人非小细胞肺癌细胞A549；肝癌细胞Huh7的细胞抑制曲线
供试品：所述的环五肽Galaxamide均由上文步骤四合成提纯所得；
处理方法：取对数生长期的宫颈癌细胞Hela；乳腺癌细胞MDA-MB-231；人非小细胞肺癌细胞A549；肝癌细胞Huh7，以每孔3×105个/ml的密度接种于96孔板内。24小时后等待细胞贴壁后加入培养基和药物，每孔100μl，其中环五肽Galaxamide的浓度设定为药性实验1中测定的表1中记载的IC50值，每天同样时间给药后，测定其吸光度，持续六天。
如图11-14所示，从四种细胞A549，Hela，Huh7，MDA-MB-231的抑制曲线可以看出，在没有任何干预的条件下，OD值在六天后会增大到第一天的3-5倍，这也符合肿瘤细胞增殖的特点，而在增加干预后，即使所用的干预浓度为IC50值，可以看见肿瘤细胞明显被抑制，且环五肽Galaxamide还能促进细胞凋亡。这对于后续的实验有明确的指导意义。
3、环五肽Galaxamide体外动物实验
供试品：所述的环五肽Galaxamide均由上文步骤四合成提纯所得；
处理方法：体外实验所选择的细胞为宫颈癌细胞Hela和乳腺癌细胞MDA-MB-231，受试动物为BALB/C裸鼠，鼠龄为四周，设置一个给药实验组，一个空白对照组，单侧种瘤，每只老鼠种癌细胞数为3×106个。成瘤后，隔天腹腔给药，给药实验组的给药浓度为2mg/kg，空白对照组，打同样剂量的生理盐水，20天后，解剖取材，处理数据。
本实验考察了BALB/C裸鼠在环五肽Galaxamide腹腔给药后对宫颈癌细胞Hela和乳腺癌细胞MDA-MB-231移植瘤的体内生长抑制。结果如图15所示，环五肽Galaxamide对裸鼠体内移植瘤具有一定的抑制作用。如图16所示，培养结束后解剖的宫颈癌肿瘤照片，上一行是空白对照组，下面一行是给药对照组的，两者肿瘤存在肉眼可见的体积差别，如图17所示，培养结束后解剖的乳腺癌肿瘤照片，上一行是空白对照组，下面一行是给药对照组的，两者肿瘤存在肉眼可见的体积差别，经过数据统计，环五肽Galaxamide对宫颈癌Hela的抑瘤率达到61％，对乳腺癌MDA-MB-231的抑瘤率达到68％，且环五肽Galaxamide对于裸鼠体重影响不大，说明其毒性较小。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (10)
1.一种环五肽Galaxamide，其特征在于：
其结构式如下式(Ⅰ)所示：
2.一种如权利要求1所述的环五肽Galaxamide的制备方法，其特征在于：
详细操作过程是：
(1)多肽合成管中加入2-氯三苯基甲基氯树脂、二氯甲烷搅拌进行溶胀，再用二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺交替清洗；用二氯甲烷溶解Fmoc-MeLeu-OH，往Fmoc-MeLeu-OH的二氯甲烷溶液中逐滴加入DIEA；再将Fmoc-MeLeu-OH的二氯甲烷溶液加入2-氯三苯基甲基氯树脂多肽合成管中密封搅拌反应，抽去溶液，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺交替清洗，得到Fmoc-MeLeu-resin；
(2)向多肽合成管中加入甲醇，然后逐滴加入DIEA，搅拌反应，对上一步获得的树脂进行封闭；
(3)向多肽合成管中加入哌啶和N，N-二甲基甲酰胺，搅拌反应，抽去反应液，用二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺交替清洗，树脂脱保护；用N，N-二甲基甲酰胺溶解Fmoc-Leu-OH、HOAt，然后逐滴加入DIC，再转移到多肽合成管中搅拌反应，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺交替清洗，得到Fmoc-MeLeu-Leu-resin；
(4)向多肽合成管中加入哌啶和N,N-二甲基甲酰胺，搅拌，抽去反应液，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺交替清洗，树脂脱保护；用N,N-二甲基甲酰胺溶解Fmoc-Leu-OH、HOAt，然后逐滴加入DIC，再转移到多肽合成管中，搅拌反应，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺交替清洗，得到Fmoc-MeLeu-Leu-Leu-resin；
(5)向多肽合成管中加入哌啶和N,N-二甲基甲酰胺搅拌，抽去反应液，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺交替清洗，树脂脱保护；用N,N-二甲基甲酰胺溶解Fmoc-MeLeu-OH、HOAt，然后逐滴加入DIC，再转移到多肽合成管中，搅拌反应，用二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺交替清洗，得到Fmoc-MeLeu-Leu-Leu-MeLeu-resin；
(6)向多肽合成管中加入哌啶和N,N-二甲基甲酰胺搅拌，抽去反应液，用二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺交替清洗，树脂脱保护；用N,N-二甲基甲酰胺溶解Fmoc-Leu-OH、HOAt，然后逐滴加入DIC，再转移到多肽合成管中，搅拌反应，用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺交替清洗，得到Fmoc-MeLeu-Leu-Leu-MeLeu-Leu-resin；
(7)向多肽合成管中加入哌啶和N，N-二甲基甲酰胺搅拌，抽去反应液，用二氯甲烷清洗，树脂脱保护；向多肽合成管中加入TFA和DCM溶液，室温下搅拌反应，二氯甲烷清洗得到切肽液，去掉溶剂，加入冰冻乙醚析出白色固体，置在冰箱中过夜，析出更多白色固体，去掉乙醚，得到线性肽；
(8)二氯甲烷溶解线性肽和PyBOP，DIEA调节pH，室温搅拌，去掉部分溶剂，用饱和碳酸氢钠溶液和水各萃取两次，无水硫酸钠干燥，去掉溶剂，得到环五肽Galaxamide。
3.根据权利要求2所述的一种环五肽Galaxamide的制备方法，其特征在于：
所述步骤(1)的具体过程是：
溶胀：准备好干燥的100mL多肽合成管，称取1.1g 2-氯三苯基甲基氯树脂，负载量：0.969mmol/g，加入到100mL多肽合成管中。
吸取20mL无水二氯甲烷加入到多肽合成管中，密封搅拌30min；
之后将多肽合成管抽去溶液，再分别用10mL二氯甲烷和10mL N,N-二甲基甲酰胺交替各冲洗3次，抽滤；
连接第一个氨基酸：称取1.1g，3mmol，367.44 Fmoc-MeLeu-OH到50mL锥形瓶中，再加入10mL二氯甲烷将其溶解，用胶头滴管向盛有Fmoc-MeLeu-OH的锥形瓶中加入0.5mL，3mmol，129.24，ρ＝0.742 DIEA，将混合液转移至溶胀后的树脂多肽合成管中密封搅拌反应2.5h；
之后将多肽合成管抽去溶液；分别用10mL二氯甲烷和10mL N,N-二甲基甲酰胺交替各冲洗3次树脂复合物，洗涤一次抽滤一次，尽量抽干树脂中的溶液，得到Fmoc-MeLeu-resin。
4.根据权利要求2所述的一种环五肽Galaxamide的制备方法，其特征在于：
所述步骤(2)的具体过程是：将步骤(1)得到的树脂复合物进行封闭处理，向多肽合成管中加入18mL甲醇，胶头滴管加入2mL DIEA，搅拌反应30min；
之后将多肽合成管抽去溶液，分别用10mL二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺交替冲洗3次，抽滤。
5.根据权利要求2所述的一种环五肽Galaxamide的制备方法，其特征在于：
所述步骤(3)的具体过程是：
脱保护：将步骤(2)中带保护的线性一肽-树脂复合物脱保护处理，向多肽合成管中加入2mL哌啶和18mL DMF溶液，搅拌反应15min，抽去反应液；
分别用10mL DCM、10mL DMF交替冲洗3次，抽滤；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，重复上述步骤一次；
连接第二个氨基酸：称取1.1g，3mmol 353.41 Fmoc-Leu-OH和0.4g，3mmol 136.11HOAt于50mL三角锥形瓶中，向锥形瓶中加入10mL DMF，在超声仪中完全溶解，再用胶头滴管加入0.46mL 3mmol DIC，将其转移到多肽合成管中，再用5mL DMF洗涤锥形瓶，将其中的残余洗净，转移到多肽合成管中；搅拌反应5h；
反应结束后抽干滤液，分别用10mL DCM、10mL DMF交替冲洗3次，抽滤；得到带保护的线性二肽-树脂复合物Fmoc-MeLeu-Leu-resin。
6.根据权利要求2所述的一种环五肽Galaxamide的制备方法，其特征在于：
所述步骤(4)的具体过程是：
脱保护：将步骤(3)中带保护的线性二肽-树脂复合物脱保护处理，向多肽合成管中加入2mL哌啶和18mL DMF，搅拌15min。
抽去反应液，分别用10mL DCM、10mL DMF交替冲洗3次，抽滤；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，重复上述步骤一次；
连接第三个氨基酸：称取1.1g，3mmol，353.41 Fmoc-Leu-OH和0.4g，3mmol，136.11HOAt于50mL三角锥形瓶中，用10mL DMF将其溶解，再加入0.46mL，3mmol，126.2DIC，将混合液转移至脱保护的线性二肽-树脂复合物多肽合成管中，再用5mL DMF洗涤锥形瓶转移到多肽合成管中，搅拌反应3h；
抽去反应液，分别用10mL DCM、10mL DMF交替冲洗3次，抽滤，得到带保护的线性三肽-树脂复合物Fmoc-MeLeu-Leu-Leu-resin。
7.根据权利要求2所述的一种环五肽Galaxamide的制备方法，其特征在于：
所述步骤(5)具体过程是：
脱保护：将步骤(4)中带保护的线性三肽-树脂复合物脱保护处理，向多肽合成管中加入2mL哌啶和18mL DMF，搅拌反应15min；
抽去反应液，分别用10mL DCM、10mL DMF交替冲洗3次，抽滤；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，重复上述步骤一次；
连接第四个氨基酸：称取1.1g，3mmol 367.44 Fmoc-MeLeu-OH和0.4g，3mmol，136.11HOAt于50mL三角锥形瓶中，用10mL DMF将其溶解，再加入0.46mL 3mmol，126.2，ρ＝0.815DIC，将混合液转移至脱保护的线性三肽-树脂复合物多肽合成管中，再用5mL DMF洗涤锥形瓶转移到多肽合成管中，搅拌反应3h；
将反应液抽干，分别用10mL DCM、10mL DMF交替冲洗3次，洗抽滤，得到带保护的线性四肽-树脂复合物Fmoc-MeLeu-Leu-Leu-MeLeu-resin。
8.根据权利要求2所述的一种环五肽Galaxamide的制备方法，其特征在于：
所述步骤(6)的具体过程是：
脱保护：将步骤(5)中带保护的线性四肽-树脂复合物脱保护处理，向多肽合成管中加入2mL哌啶和18mL DMF，搅拌反应15min；
抽去反应液，分别用10mL DCM、10mL DMF交替冲洗3次，抽滤；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，重复上述步骤一次；
连接第五个氨基酸：称取1.1g，3mmol，353.41 Fmoc-Leu-OH和0.4g，3mmol，136.11HOAt于50mL三角锥形瓶中，用10mL DMF将其溶解，再加入0.46mL，3mmol，126.2，ρ＝0.815DIC，将混合液转移至脱保护的线性四肽-树脂复合物多肽合成管中，再用5mL DMF洗涤锥形瓶转移到多肽合成管中，搅拌反应3h；
将反应液抽干，分别用10mL DCM、10mL DMF交替冲洗3次，抽滤，得到带保护的线性五肽-树脂复合物Fmoc-MeLeu-Leu-Leu-MeLeu-Leu-resin。
9.根据权利要求2所述的一种环五肽Galaxamide的制备方法，其特征在于：
所述步骤(7)的具体过程是
脱保护：将步骤(6)带保护的线性五肽-树脂复合物脱保护处理，向多肽合成管中加入2mL哌啶和18mL DMF，搅拌反应15min；
抽去反应液，用10mL DCM冲洗3次，抽滤；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，重复上述步骤一次；
将脱保护的线性五肽-树脂复合物切肽处理，向多肽合成管中加入0.4mL TFA和19.6mLDCM溶液，室温下搅拌反应1h；
将多肽合成管中的反应液抽滤，再用10mL DCM冲洗树脂3次，得到切肽液；
将切肽液溶剂去掉，加入大量的冰冻乙醚，析出白色固体，再将其密封放置在冰箱中过夜，使其析出更多固体；
之后去掉乙醚，得到线性肽，密封保存在冰箱中；
所述步骤(8)的具体过程是：
称取100mg线形肽和250mg 0.3mmol，520.4 PyBOP，将其用100mL DCM溶解，加入DIEA0.5mL，用DIEA调节pH＝8，室温下搅拌反应48h；
去掉部分容剂，依次用饱和碳酸氢钠溶液和水各萃取两次，取下层液体，无水硫酸钠干燥，过滤，干燥，经高效液相色谱纯化得到白色固体。
10.一种如权利要求1-9任一所述的环五肽Galaxamide在制备抗肿瘤药物中的应用。
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