CN105315334A - 异喹啉-3-甲酰-RF-OBzl,其制备,纳米结构,活性和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl。Arg(N^G-NO₂)-Phe简称RF。公开了它的制备方法，公开了它的体外抗细胞增殖活性，公开了它的体内抗肿瘤活性，公开了它的体内抗血栓活性，进一步公开了它的纳米结构。因而本发明公开了它在制备抗肿瘤药物和抗血栓药物中的应用。

Description

异喹啉-3-甲酰-RF-OBzl,其制备,纳米结构,活性和应用

技术领域

本发明涉及异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl及制备方法，Arg(N^G-NO₂)-Phe简称RF，涉及它的体外抗细胞增殖活性，涉及它的体内抗肿瘤活性，涉及它的体内抗血栓活性，进一步涉及它的纳米结构。因而本发明涉及它在制备抗肿瘤药物和抗血栓药物中的应用。本发明属于生物医药领域。

技术背景

癌症是一组可影响身体任何部位的多种疾病的通称。使用的其它术语为恶性肿瘤和赘生物。据世界卫生组织统计，癌症是世界上的头号死因之一，尤其是在发展中国家。而全世界癌症死亡人数预计将继续上升，到2030年将超过1310万。因此，开发新的高效、低毒、毒副作用小的抗肿瘤药物一直是新药研究的重要课题之一。

随着对肿瘤特性和发病本质的认识，最近几年抗肿瘤药物不断从传统的细胞毒药物向发展非细胞毒药物过渡。β-咔啉是天然来源的细胞毒性抗肿瘤化合物。发明人认识到，β-咔啉抗肿瘤的细胞毒性本质是与肿瘤细胞DNA之间的嵌插。这种形式的扦插可造成细胞毒性。发明人曾经发现，β-咔啉可以插入肿瘤细胞DNA之间的双螺旋碱基之间。在进一步的研究中，发明人认识到，β-咔啉的抗肿瘤活性来自嵌插。发明人还认识到，在β-咔啉的1位引入二肽生成β-咔啉-3-羧酸苄酯及衍生物可增强β-咔啉与肿瘤细胞的作用，增强抗肿瘤活性。根据这些认识，发明人提出下式的异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-AA-OBzl。与发明人前期的发明的异喹啉-3-甲酰氨基酸苄酯相比，本发明的突出创造性在于在3-甲酰基与氨基酸苄酯基之间插入Arg(N^G-NO₂)，保留了异喹啉-3-甲酰氨基酸苄酯与肿瘤细胞DNA之间的嵌插作用，又可以通过插入Arg(N^G-NO₂)延缓代谢，使得它们的有效剂量大幅度降低。发明人还认识到，将Arg(N^G-NO₂)与Phe-OBzl搭配可以带来抗血栓活性。肿瘤患者并发血栓症可以恶化肿瘤患者的预后。于是，异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl的抗血栓作用可以更好地发挥它的抗肿瘤疗效。

发明的内容

本发明的第一个内容是提供下式的异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl。

本发明的第二个内容是提供异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)将L-苯丙氨酸在35％盐酸的催化下与甲醛进行Pictet-Spengler缩合，得到四氢异喹啉-3-羧酸；

(2)将四氢异喹啉-3-羧酸在甲醇溶液中，冰浴下用氯化亚砜催化得到四氢异喹啉-3-羧酸甲酯；

(3)将四氢异喹啉-3-羧酸甲酯在无水的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，用高锰酸钾为氧化剂得到异喹啉-3-羧酸甲酯；

(4)在NaOH存在下，在甲醇中将异喹啉-3-羧酸甲酯皂化为异喹啉-3-羧酸；

(5)在二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三唑(HOBt)存在下，Boc-Arg(NO₂)在无水DMF中与Phe-OBzl缩合为Boc-Arg(NO₂)-Phe-OBzl；

(6)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中Boc-Arg(NO₂)-Phe-OBzl脱去Boc生成Arg(NO₂)-Phe-OBzl；

(7)在DCC和HOBt存在下，异喹啉-3-羧酸在无水DMF中与Arg(NO₂)-Phe-OBzl缩合得到异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl。

本发明的第三个内容是评价异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl对肿瘤细胞增殖的抑制作用。

本发明的第四个内容是评价异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl对S180肿瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用。

本发明的第五个内容是评价异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl的抗血栓活性。

本发明的第六个内容是测定异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl的纳米结构。

附图说明

图1异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl的合成路线.i)HCHO，35％HCl；ii)SOCl₂，CH₃OHiii)DMF，KMnO₂；iv)NaOH，CH₃OH；v)DCC，HOBt，DMF；vi)2NHCl/EtOAc。

图2异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl在纯水环境中1×10^-5M浓度下的透射电镜照片。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备四氢异喹啉-3-羧酸

称取L-苯丙氨酸1g，加入2.4mL的甲醛，再加入8mL35％的盐酸，溶液先澄清后析出白色物质，油浴80℃，反应8小时。反应结束后，除去溶剂，置于茄瓶中。加入乙醚超声搅拌1小时，反复磨洗，过滤，得到0.91g(85％)四氢异喹啉-3-羧酸，为无色固体。熔点246-247℃。ESI-MS(m/e)：176[M-H]^-。

实施例2制备四氢异喹啉-3-羧酸甲酯

向50ml的茄型瓶中加入6ml的甲醇，0.4ml的二氯亚砜，搅拌，活化30min，冰浴。加入四氢异喹啉-3-羧酸239mg，冰浴下反应12小时。抽干溶剂，再加甲醇，反复抽干3次；加入乙醚3次，抽干，得到213mg(82.5％)四氢异喹啉-3-羧酸甲酯，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：192[M+H]⁺。

实施例3制备异喹啉-3-羧酸甲酯

用无水DMF将四氢异喹啉-3-羧酸甲酯213mg溶解，加入蒸馏水溶解的高锰酸钾溶液，在冰浴下缓慢加入，室温下反应24小时。反应结束后，将DMF吹干，用甲醇将黑色粉末溶解后过滤，滤液旋干。柱层析分离纯化。得到77mg(37％)异喹啉-3-羧酸甲酯，为微黄色固体。Rf＝0.25(二氯甲烷∶甲醇，20∶1)；ESI-MS(m/e)：188[M+H]⁺；¹HNMR(DMSO-d₆，500MHz)δ/ppm＝9.421(s，1H)，8.666(s，1H)，8.258(d，J＝4Hz，1H)，8.22(d，J＝4Hz，1H)，7.897(m，2H)，3.944(s，3H)。

实施例4制备异喹啉-3-羧酸

将1g异喹啉-3-羧酸甲酯用甲醇溶解，调PH值为12，室温下反应。反应4小时结束后，调PH值为7，旋除甲醇，调PH值为4，有固体析出，过滤，得到370mg(40％)异喹啉-3-羧酸，为无色固体。Mp231-232℃；ESI-MS(m/e)：172[M-H]^-。

实施例5制备Boc-Arg(NO₂)-Phe-OBzl

将Boc-Arg(NO₂)3g溶于无水DMF中，冰浴下加入HOBt和DCC的无水DMF溶液，冰浴搅拌20min，得到活泼酯溶液A待用。将Phe-OBzl2.4g溶于无水DMF中，NMM调节PH为8-9，得到溶液B。将B倒入A中，室温反应12小时。反应结束后，将反应液减压浓缩至干，用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠、饱和氯化钠水溶液各洗3遍。分出酯层，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，柱层析纯化，得到2.8g(57％)Boc-Arg(NO₂)-Phe-OBzl，为无色固体。Rf＝0.25(二氯甲烷∶甲醇，20∶1)；ESI-MS(m/e)：557[M+H]⁺。

实施例6制备Arg(NO₂)-Phe-OBzl

称取Boc-Arg(NO₂)-Phe-OBzl1g于茄瓶中，加入3NHClEtOAc约10mL。TLC监测反应进度，反应4小时反应结束。水泵抽干液体，加入乙酸乙酯溶解，反复3次；再用无水乙醚磨洗抽干3次，得到0.89mg(99％)Arg(NO₂)-Phe-OBzl，为无色粉末。

实施例7制备异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl

将异喹啉-3-羧酸0.31g溶于无水DMF中，冰浴下加入HOBt和DCC的无水DMF溶液，冰浴搅拌20min，得到活泼酯溶液A待用。将Arg(NO₂)-Phe-OBzl0.9g溶于无水DMF中，NMM调节PH为8-9，得到溶液B。将B倒入A中，室温反应14小时。反应结束后，将反应液减压浓缩至干，用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠、饱和氯化钠水溶液各洗3遍。分出酯层，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，柱层析纯化，得到0.54g(45.7％)异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl，为无色固体。ESI-MS(m/e)：612[M+H]⁺；mp：89-90℃；＝-1.6(c＝0.49，CH₃OH)；IR(KBr)：3294.42，3062.96，3032.10，2935.66，2870.08，1743.65，1654.92，1624.06，1593.20，1516.05，1454.33，1438.90，1388.75，1261.45，1111.00，906.54，748.38，698.23；¹HNMR(DMSO-d₆，300MHz)δ/ppm＝9.39(s，1H)，8.78(d，J＝6Hz，1H)，8.71(d，J＝6Hz，1H)，8.58(s，1H)，8.265(d，J＝9Hz，1H)，8.21(d，J＝6Hz，1H)，7.86(m，3H)，7.23(m，10H)，5.09(m，2H)，4.625(m，2H)，3.045(m，4H)，1.72(m，2H)，1.5(s，2H)；纯度：95.4％流动相：CH₃OH∶H₂O＝75∶25，保留时间：11.990min。

实验例1评价异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl(简称化合物1)抑制肿瘤细胞增殖的作用

异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl用0.5％DMSO1640培养基配制成所需浓度。分别将生长状态良好、处于对数生长期的A549，S180，MCF-7细胞按照5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL。在37℃，5％CO₂培养箱中培养4小时，按预设的浓度梯度100μM、50μM、25μM和12.5μM加入经灭菌处理的化合物异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl的溶液，对照组加入等体积溶解样品的含0.5％DMSO的1640培养基。继续培养48小时后，每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃孵育4小时，小心除去上清液后每孔加入100μlDMSO，振荡约15min溶解沉淀。立即于酶标仪上570nm波长下测定OD(吸光度)值。按抑制率＝[(含0.4％DMSO的1640培养基组的OD平均值-异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl的OD平均值)/含0.4％DMSO的1640培养基组的OD值]×100％”计算抑制率。实验平行重复3次，以抑制率对异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl的浓度作图，计算本IC₅₀(半数有效抑制浓度)值。

异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl用含0.4％DMSO的DMEM培养基配制成所需浓度。分别将生长状态良好、处于对数生长期的U2OS、SH-sy5y和HacaT细胞按照5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL。在37℃、5％CO₂培养箱中培养4小时，按预设的浓度梯度100μM，50μM，25μM和12.5μM加入经灭菌处理的异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl的溶液，对照组加入等体积溶解样品的含0.5％DMSO的DMEM培养基。继续培养48小时后，每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃孵育4小时，小心除去上清液后每孔加入100μlDMSO，振荡约15min溶解沉淀。立即于酶标仪上570nm波长下测定OD(吸光度)值。按抑制率＝[(含0.4％DMSO的DMEM培养基组的OD平均值-异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl组的OD平均值)/含0.5％DMSO的DMEM培养基组的OD平均值]×100％计算抑制率。实验平行重复3次，以抑制率对异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl的浓度作图，计算IC₅₀(半数有效抑制浓度)值。

结果列入表1和表2。从结果可看出，异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl对MCF-7细胞，A549细胞，S180细胞，SH-Sy5y细胞，U2OS细胞和HacaT细胞的IC₅₀值均大于100μM。说明它没有细胞毒作用。

表1化合物1抑制肿瘤细胞增殖的作用(IC₅₀，±SDμM)

n＝18.

表2化合物1抑制肿瘤细胞增殖的作用(IC₅₀，±SDμM)

n＝18.

实验例2评价异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl(简称化合物1)抑制S180小鼠肿瘤生长的活性

测定前将本发明衍生物加吐温80助溶，用生理盐水将样品溶解；将阿霉素溶于生理盐水。无菌条件下取接种于ICR小鼠7-10天的S180肉瘤，加入适量生理盐水配制成瘤细胞悬液，细胞数为1×10⁷个/mL，接种于健康雄性ICR小鼠前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2mL。肿瘤接种24h后，治疗组小鼠每日腹腔注射0.2mL异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl的水溶液，连续给药9天，剂量为5μmol/kg。空白组小鼠每日腹腔注射0.2mL生理盐水。以阿霉素(剂量为2μmol/kg)作阳性对照。实验进行至第10天，称小鼠体重，并剖取各组小鼠的肿瘤称重，最后统计各组动物的抑瘤率。实体瘤的疗效以瘤重抑制百分率表示，计算如下：瘤重抑制率％＝[1-(异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl组瘤重/空白组瘤重)]×100％。结果列入表3。表3结果表明异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl组瘤重与空白组相比显著低，说明它有明确的抗肿瘤活性，它的这个有效剂量(5μmol/kg)比发明人前期的发明的异喹啉-3-甲酰氨基酸苄酯的有效剂量(100μmol/kg)低20倍。

表3化合物1对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

n＝12；a)与生理盐水组比p＜0.01。

实验例3评价异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl(简称化合物1)的体内抗血栓活性

1)评价方法

插管由3段构成，中段长80mm，内径3.5mm，两端为相同的聚乙烯管，长100mm，内径1mm，外径2mm，该管的一端拉成尖管(用于插入大鼠颈动脉或静脉)，3段管的内壁均硅烷化。将提前称重的长60mm的丝线放入中段聚乙烯粗管内，粗管的两端分别与两根聚乙烯细管的未拉细端相套(其中一段将丝线压住0.5mm固定)。用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50IU/kg)备用。

灌胃30min后，将200-220g雄性SD大鼠用20％乌拉坦溶液(6ml/kg，i.p.)进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定，分离出大鼠的左颈外静脉，近心端和远心端分别穿入手术线，结扎远心端，在暴露的左颈外静脉上小心地剪一斜口，将上面制备好的旁路管道的未压线端尖管由斜口插入左颈外静脉开口的近心端，用注射器通过另一端的尖管推入准确量的肝素生理盐水(50IU/kg)，此时注射器不撤离聚乙烯管，分离右颈总动脉，于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别穿入手术线，结扎远心端，在离动脉夹不远处将右颈总动脉小心地剪一斜口。从聚乙烯管的尖部拔出注射器，将聚乙烯管的尖部插入动脉斜口的近心端。旁路管道的两端都用4号手术缝线与动静脉固定。打开动脉夹，使血流通过旁路管道从动脉流向静脉，此即大鼠动静脉旁路抗栓模型。从开始循环时计时，15min后从旁路管道中取出挂有血栓的丝线，精确称重，丝线前后的质量差即为血栓湿重，统计并评价化合物的体内抗栓活性。血栓湿重用均值和标准差表示。

2)给药方法和剂量

灌胃给药；空白对照：生理盐水，给药剂量为1mL/kg；阳性对照为阿司匹林，给药剂量为167μM/kg.；异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl的给药剂量为5μM/kg.

3)结果见表4。

表4.化合物1经口服给药的抗血栓活性

n＝10；a)与生理盐水组比P＜0.01，与阿司匹林组比P＞0.05.

实验例4测定异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl的透射电镜照片

将异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl按照10^-5M的浓度配置水溶液，均匀的铺在铜网上，在透射电镜(TEM，JEM-1230，JEOL)下观察化合物的自组装性质。得到的照片见图2。结果表明，它在水中可形成纳米颗粒，直径在30-150nm之间。

Claims (5)

1.下式的异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl。

2.权利要求1的异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl的制备方法，该方法包括：

(1)将L-苯丙氨酸在35％盐酸的催化下与甲醛进行Pictet-Spengler缩合，得到四氢异喹啉-3-羧酸；

(2)将四氢异喹啉-3-羧酸在甲醇溶液中，冰浴下用氯化亚砜催化得到四氢异喹啉-3-羧酸甲酯；

(3)将四氢异喹啉-3-羧酸甲酯在无水的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，用高锰酸钾为氧化剂得到异喹啉-3-羧酸甲酯；

(4)在NaOH存在下，在甲醇中将异喹啉-3-羧酸甲酯皂化为异喹啉-3-羧酸；

(5)在二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三唑(HOBt)存在下，Boc-Arg(NO₂)在无水DMF中与Phe-OBzl缩合为Boc-Arg(NO₂)-Phe-OBzl；

(6)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中Boc-Arg(NO₂)-Phe-OBzl脱去Boc生成Arg(NO₂)-Phe-OBzl；

(7)在DCC和HOBt存在下，异喹啉-3-羧酸在无水DMF中与Arg(NO₂)-Phe-OBzl缩合得到异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl。

3.权利要求1的异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl的纳米结构。

4.权利要求1的异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl在制备抗肿瘤疾病药物中的应用。

5.权利要求1的异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Phe-OBzl在制备抗血栓疾病药物中的应用。