CN105294829B

CN105294829B - 咪唑并吡啶-6-甲酰-氨基酸苄酯，其合成，活性及应用

Info

Publication number: CN105294829B
Application number: CN201410261205.5A
Authority: CN
Inventors: 彭师奇; 赵明; 王玉记; 吴建辉; 彭玉龙
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2014-06-13
Filing date: 2014-06-13
Publication date: 2018-07-27
Anticipated expiration: 2034-06-13
Also published as: CN105294829A

Abstract

本发明公开了下式3H‑咪唑并[4，5‑c]吡啶‑6‑甲酰‑N^G‑NO₂‑Arg‑Ala‑OBzl，公开了它的制备方法、公开了它对肿瘤细胞增殖的抑制作用，公开了它对肿瘤生长的抑制作用，还公开了它的抗血栓活性。

Description

咪唑并吡啶-6-甲酰-氨基酸苄酯，其合成，活性及应用

发明领域

本发明涉及3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-Ala-OBzl，涉及它的制备，涉及它对肿瘤细胞增殖的抑制作用，涉及它对肿瘤生长的抑制作用，进一步涉及它的抗血栓活性。本发明属于生物医药领域。

背景技术

癌症是一组可影响身体任何部位的多种疾病的通称。使用的其它术语为恶性肿瘤和赘生物。据世界卫生组织统计，癌症是世界上的头号死因之一，尤其是在发展中国家。而全世界癌症死亡人数预计将继续上升，到2030年将超过1310万。因此，开发新的高效，低毒，毒副作用小的抗肿瘤药物一直是新药研究的重要课题之一。

随着对肿瘤特性和发病本质的认识，发明人曾经公开下式代表的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl(其中AA代表甘氨基酸或其它L-氨基酸残基)在1μmol/kg剂量下显示良好的抗肿瘤活性。通过进一步研究发明人认识到，在3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl的6-甲酰基和AA-OBzl基之间插入N^G-NO₂-Arg残基，不仅可以延缓它的代谢达到提高抗肿瘤活性的目的，而且可以增加抗血栓活性。血栓是危害肿瘤患者预后的并发症。通过这种修饰，获得具有抗肿瘤和抗血栓双重活性的化合物，具有良好的临床应用前景。根据这些认识，发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-Ala-OBzl。

本发明的第二个内容是提供制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-Ala-OBzl的合成方法，该方法包括：

(1)L-组氨酸在稀硫酸催化下与甲醛进行Pictet-Spengler缩合生成6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸；

(2)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸转化为6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯；

(3)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯用高锰酸钾氧化为3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯；

(4)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯在NaOH溶液(2N)中皂化成3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸；

(5)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸与N^G-NO₂-Arg-OBzl偶联得到3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰N^G-NO₂-Arg-OBzl；

(6)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-OBzl在NaOH溶液(2N)中皂化成3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg；

(7)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg与L-Ala-OBzl偶联得到3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰N^G-NO₂-Arg-Ala-OBzl。

本发明的第三个内容是评价3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-Ala-OBzl对肿瘤细胞增殖的抑制作用。

本发明的第四个内容是评价3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-Ala-OBzl对荷S180小鼠肿瘤生长的抑制作用。

本发明的第五个内容是评价3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-Ala-OBzl对SD雄性大鼠的体内抗血栓活性。

附图说明

图1.3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-Ala-OBzl的合成路线.i)HCHO，H₂O，H₂SO₄，65℃；ii)MeOH，SOCl₂，0℃；iii)DMF，NMM，KMnO₄；iv)NaOH，H₂O，0℃；v)二环己基碳二亚胺(DCC)，1-羟基苯并三唑(HOBt)，N-甲基吗啉(NMM)，DMF；vi)NaOH，H₂O，0℃；vii)二环己基碳二亚胺(DCC)，1-羟基苯并三唑(HOBt)，N-甲基吗啉(NMM)，DMF。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1 制备6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(2)

冰浴下将15.0g(96.8mmol)L-组氨酸置于250mL圆底烧瓶中，加入50mL蒸馏水，再逐滴加入3mL浓硫酸，搅拌均匀，完全溶解后加入15mL甲醛溶液(40％)，60℃反应8小时。反应物冷却至室温，用浓氨水在冰浴下调pH至6，有大量无色沉淀析出，过滤。滤饼用水洗并干燥，得到15g(93％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)167[M+H]⁺。

实施例2 制备6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(3)

冰浴下在500mL茄瓶里加100mL甲醇，用恒压漏斗缓慢滴加10mL二氯亚砜，1小时后加入5.0g(30mmol)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(2)，室温反应3天后，TLC显示反应完全，反应混合物减压浓缩，残留物加甲醇溶解并减压浓缩。该操作重复3次得无色泡状固体，再加乙醚抽干重复3次得无色粉末，最后用甲醇/乙醚重结晶得4.2g(55％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)181[M+H]⁺。

实施例3 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(4)

冰浴下在100mL茄瓶里加2g(7.9mmol)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯，加DMF使溶解。向该溶液中滴加1mL三乙胺调pH到8，分三次加入1.5g(9.4mmol)高锰酸钾。反应6小时后，TLC监测反应完毕。反应物减压浓缩至干，得到的黑色固体用1NHCl溶液溶解，冰浴下滴加2N NaOH溶液调pH到7，析出大量无色固体。该固体以二氯甲烷/甲醇为洗脱剂用硅胶柱纯化，得0.93g(66.4％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)177[M+H]⁺。

实施例4 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(5)

冰浴下在100mL茄瓶里加3mL NaOH溶液(1.5N)，10min后加入0.93g(5.3mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(4)，反应1小时后TLC显示反应完毕，冰浴下向反应液中滴加2N HCl溶液调pH到7，析出大量无色固体。该固体以二氯甲烷/甲醇为洗脱剂用硅胶柱纯化，得0.56g(65％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)163[M+H]⁺。

实施例5 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-N^G-NO₂-Arg-OBzl(6)

称取194mg(1.2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸于100mL茄形瓶中，加入20mLDMF。在冰浴和搅拌下依次加入211mg(1.6mmol)HOBt及333mg(1.6mmol)DCC，活化30min。称取676mg(1.4mmol)Tos·N^G-NO₂-Arg-OBzl于25mL小三角瓶中，用DMF溶解后，用NMM调pH至7，然后将该溶液滴加至茄形瓶的反应液中，最后用NMM调反应液pH值至8。室温反应过夜，TLC显示反应完毕后，反应混合物减压浓缩至干，残留物加50mL二氯甲烷溶解，过滤除去二环己基脲(DCU)，滤液层依次用饱和NaHCO₃水溶液(20mL×3)和饱和NaCl水溶液(20mL×3)各洗3遍，乙酸乙酯层用无水CaCl₂干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得到的黄色油状物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇为洗脱剂)，得到的淡黄色固体，经二氯甲烷/石油醚重结晶得200mg(37％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)454[M-H]-.Mp184-186℃.[α]_D ²⁵＝12.2(c＝0.12，甲醇).¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)6/ppm＝13.19(s，1H)，9.04(s，2H)，8.57(s，1H)，8.52(s，1H)，8.26(s，1H)，7.44(m，5H)，5.18(m，2H)，4.63(dd，J＝5Hz，J＝15Hz，1H)，3.16(m，2H)，1.95(m，2H)，1.59(m，2H)。

实施例6 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-N^G-NO₂-Arg(7)

称取200mg(0.44mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-N^G-NO₂-Arg-OBzl于100mL茄瓶中，加甲醇溶液使原料溶解，冰浴搅拌下滴加2NNaOH溶液调pH到11，冰浴下反应3小时，TLC显示反应完毕。冰浴下向反应液中滴加饱和硫酸氢钾溶液调pH到7，反应化合物减压浓缩，残留物用甲醇复溶，滤去不溶物，滤液减压浓缩，得74mg(46％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：363[M-H]-；Mp166-169℃.[α]_D ²⁵＝9.8(c＝0.19，甲醇).¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)6/ppm＝13.14(s，1H)，8.99(s，2H)，8.65(s，2H)，8.54(s，1H)，8.53(s，1H)，8.29(m，2H)，4.60(dd，J＝5Hz，J＝15Hz，1H)，3.10(m，2H)，1.79(m，2H)，1.55(m，2H)。

实施例7 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-N^G-NO₂-Arg-Ala-OBzl(8)

称取61mg(0.17mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-N^G-NO₂-Arg于100mL茄形瓶中，加入20mL DMF。在冰浴和搅拌下依次加入27mg(0.2mmol)HOBt及41.3mg(0.2mmol)DCC，活化30min。称取60mg(0.17mmol)Tos·Ala-OBzl于25mL小三角瓶中，用DMF溶解后，用NMM调pH至7，然后将该溶液滴加至茄形瓶的反应液中，最后用NMM调反应液pH值至8。室温反应过夜，TLC显示反应完毕，反应混合物减压浓缩至干，残留物加20mL二氯甲烷溶解，过滤除去二环己基脲(DCU)，滤液层依次用饱和NaHCO₃溶液(20mL×3)和饱和NaCl溶液(20mL×3)各洗三遍，有机层用无水CaCl₂干燥，过滤、滤液减压浓缩至干，得到的黄色油状物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇为洗脱剂)，得到的淡黄色固体，经二氯甲烷/石油醚重结晶得17mg(19.2％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：524[M-H]^-；Mp：111.4-114.5℃；[α]_D ²⁵＝-3.3(c＝0.22，甲醇)；IR(KBr)：3225，2948，1740，1642，1522，1455，966，754；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.17(s，1H)，9.00(s，1H)，8.71(d，J＝6Hz，1H)，8.68(d，J＝9Hz，1H)，8.55(s，2H)，8.26(s，1H)，7.93(m，2H)，7.32(m，5H)，5.13(s，2H)4.63(m，1H)，4.38(m，1H)，3.15(m，2H)，1.73(m，2H)，1.55(m，2H)，1.34(d，J＝6Hz，3H)。

实验例1 测定化合物8的细胞毒作用

1)本发明的化合物8用含0.1％DMSO的培养基配制成所需浓度。

2)实验用的肿瘤细胞为MCF-7(人乳腺癌细胞)，HL60(人早幼粒白血病细胞)，K562(人白血病慢性粒细胞)，S180(小鼠腹水瘤细胞)。

3)实验方法

MCF-7，HL-60，K562和S180细胞选用RPMI-1640培养基；培养基中含10％经灭活的胎牛血清和1×10⁵U/L青霉素和100mg/L链霉素。

贴壁细胞MCF-7和半贴壁细胞S180的培养：分别将生长状态良好，处于对数生长期的细胞以3×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养4小时，然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物8与含0.1％DMSO的培养基配制成的溶液，每孔25μL，对照组加入等体积的溶解样品的溶媒。继续培养48小时后，每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养4小时。小心除去上清液后每孔加入100μL的DMSO，振荡约10min溶解紫色残留物(甲瓒)，立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值，波长为570nm。

悬浮细胞HL60和K562的培养：分别将生长状态良好，处于对数生长期的细胞以5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物8与含0.1％DMSO的培养基配制成的溶液，每孔25μL，对照组加入等体积的溶解样品的溶媒，置于37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养48小时后，每孔加入25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，继续置于条件为37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养4小时。2500rpm离心10min，小心吸出上清液，每孔加入100μL DMSO，振荡约10min溶解紫色残留物(甲瓒)，立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值，波长为570nn。

按下式求出各个浓度下化合物8抑制肿瘤细胞增殖的活性：

细胞增殖(％)＝(化合物8组平均O.D.值/对照组平均O.D.值)×100％，实验重复3次，以细胞增殖对药物浓度作图，按作图法求出IC₅₀(半数有效抑制浓度)值。

4)结果见表1。结果表明，化合物8抑制四种肿瘤细胞增殖的IC₅₀均大于100μM，没有细胞毒作用。

表1 化合物8的体外抗肿瘤细胞增殖活性(IC₅₀，μM)

实验例2 评价化合物8抑制肿瘤生长的活性

1)本发明的化合物8用含吐温80的生理盐水溶解，阿霉素用生理盐水溶解作为阳性对照，含吐温80的生理盐水作为阴性对照；

2)化合物8，含吐温80的生理盐水和阿霉素均为腹腔给药，化合物8的给药剂量为100nmol/kg和20nmol/kg，含吐温80的生理盐水的给药剂量为0.2mL/20g，阿霉素给药剂量为2μmol/kg，连续给药7天，共给药7次。

3)实验动物为ICR雄性小鼠(清洁级)，体重20±2g，每组12只小鼠。

4)瘤源为小鼠S180肉瘤，购自北京大学医学部动物实验中心，自行传代维持。

5)动物模型与治疗

无菌条件下抽取接种生长旺盛的S180腹水瘤瘤液，用生理盐水稀释成(1∶2)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞，并按如下公式计算细胞浓度和细胞存活率。细胞浓度＝4大方格内活细胞数/4×10⁴×稀释倍数＝细胞数/mL细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％

将存活率大于90％的瘤液用匀浆法制备成2.0×10⁷个/mL的细胞悬液，于鼠腋皮下接种，0.2mL/只，制造S180荷瘤小鼠。肿瘤接种24h后，治疗组小鼠每日腹腔注射化合物8，剂量为100nmol/kg和20nmol/kg。空白组小鼠每日腹腔注射0.2mL含吐温80的生理盐水。阳性对照组小鼠每日腹腔注射阿霉素，剂量为2μmol/kg。实验进行至第8天，称小鼠体重，乙醚麻醉，脱颈椎处死小鼠，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤，暴露肿瘤，钝性剥离，称重，按如下公式计算抑瘤率：抑瘤率％＝(阴性对照组平均瘤重-化合物组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重×100％。实验数据采用t检验和方差分析，瘤重以表示。结果见表2。由表2可以看出，在100nmol/kg和20nmol/kg的剂量下，化合物8肿瘤小鼠的瘤重明显小于含吐温80的生理盐水治疗小鼠的瘤重，说明化合物8的有效剂量低达20nmol/kg。这个有效剂量比发明人曾经公开的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl(其中AA代表甘氨基酸或其它L-氨基酸残基)的有效剂量1μmol/kg低50倍。

表2 化合物8对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

n＝15；生理盐水是含吐温80的生理盐水；a)与生理盐水组比p＜0.01；b)与生理盐水组比p＜0.01，与20nmol/kg8组比p＜0.05。

实验例3 化合物8的体内抗栓评价

1)实验材料

实验动物：SD雄性大鼠(清洁级)，体重200±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，每12只大鼠为一组，空白和阳性对照各一组；

实验用插管由3段构成，中段长8.0cm，内径0.3cm，两端为相同的聚乙烯管，长10.0cm，内径0.1cm，外径0.2cm，该管的一端拉成尖管(用于插入大鼠颈动脉或颈静脉)，3段管的内壁使用前均用1％的硅醚硅烷化。将提前称重的长6.0cm的丝线放入中段聚乙烯粗管内，粗管的两端分别与两根聚乙烯细管的未拉细端相套(其中一段将丝线压住0.5mm固定)。用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50IU/kg)备用。

2)动物模型的建立

灌胃给药30min或腹腔注射后，将大鼠用20％的乌拉坦溶液(6mL/kg，i.p.)进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定，分离出大鼠的左侧颈外静脉，近心端和远心端分别穿入手术线，结扎远心端，在暴露的左颈外静脉上小心地剪一斜口，将制备好的插管的未压线端尖管由斜口插入左颈外静脉开口的近心端，用注射器通过另一端的尖管推入准确量的肝素生理盐水(50IU/kg)，此时注射器不撤离聚乙烯管，分离右侧颈总动脉，于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别穿入手术线，结扎远心端，在离动脉夹不远处将右颈总动脉小心地剪一斜口。从聚乙烯管的尖部拔出注射器，将聚乙烯管的尖部插入动脉斜口的近心端。旁路管道的两端都用4号手术缝线结扎固定。打开动脉夹，使血流通过旁路管道从颈动脉流向颈静脉。从开始循环时计时，15min后从旁路管道中取出挂有血栓的丝线，精确称重，丝线前后的质量差即为血栓湿重。

3)统计方法

本实验数据统计均采用t检验和方差分析，栓重以表示。

4)给药方法和剂量

给药方式为灌胃给药。空白对照：生理盐水，给药剂量为0.6mL/200g；阳性对照：阿司匹林，给药剂量为167μmol/kg；本发明化合物8的给药剂量为20nmol/kg.

5)实验结果见表3。

从表3可以看出，化合物8治疗大鼠的血栓重量明显小于含吐温80的生理盐水治疗大鼠的血栓重量。表明化合物8在发挥体内抗肿瘤作用的剂量下，还具有体内抗动脉血栓生成的活性。

表3 化合物8的体内抗血栓活性

n＝12；a)与生理盐水组比较p＜0.01。

Claims

1.下式的3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-Ala-OBzl，

2.权利要求1的3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-Ala-OBzl的制备方法，该方法包括：

(1)L-组氨酸在稀硫酸催化下与甲醛进行Pictet-Spengler缩合生成6S-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸；

(2)6S-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸转化为6S-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯；

(3)6S-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯用高锰酸钾氧化为3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯；

(4)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯在2N的NaOH溶液中皂化成3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸；

(5)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸与N^G-NO₂-Arg-OBzl偶联得到3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰- N^G-NO₂-Arg-OBzl；

(6)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-OBzl在2N的NaOH溶液中皂化成3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg；

(7)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg与L-Ala-OBzl偶联得到3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-Ala-OBzl。

3.权利要求1的3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-Ala-OBzl在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.权利要求1的3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-Ala-OBzl在制备抗血栓药物中的应用。