CN105315325A

CN105315325A - 咪唑并吡啶-6-甲酰-Met-Arg(NO2)-OBzl,其合成,活性和应用

Info

Publication number: CN105315325A
Application number: CN201410327812.7A
Authority: CN
Inventors: 赵明; 彭师奇; 吴建辉; 王玉记; 王佳楠; 吴建民; 刘程
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2014-07-10
Filing date: 2014-07-10
Publication date: 2016-02-10

Abstract

本发明公开了下式3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Arg(NO₂)-苄酯。公开了它的制备方法、公开了它的抗肿瘤作用，抗血栓活性，以及抗炎活性三重活性，因而本发明公开了它在制备抗肿瘤，抗血栓和抗炎三重作用的药物中的应用。

Description

咪唑并吡啶-6-甲酰-Met-Arg(NO2)-OBzl,其合成,活性和应用

发明领域

本发明涉及3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Arg(NO₂)-OBzl，涉及它的制备方法、涉及它们对MCF-7、HL60、K562、U₂OS、SH-Sy5y、HaCaT六株肿瘤细胞增殖的抑制作用，进一步涉及它对荷S180小鼠肿瘤增长的抑制作用、抗血栓活性和抗炎活性，因而本发明涉及它作为抗肿瘤药物的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

癌症是一组可影响身体任何部位的多种疾病的通称。使用的其它术语为恶性肿瘤和赘生物。据世界卫生组织统计，癌症是世界上的头号死因之一，尤其是在发展中国家。而全世界癌症死亡人数预计将继续上升，到2030年将超过1310万。因此，开发新的高效，低毒，毒副作用小的抗肿瘤药物一直是新药研究的重要课题之一。

随着对肿瘤特性和发病本质的认识，发明人曾经公开下式代表的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl(其中AA代表甘氨基酸或其它L-氨基酸残基)在1μmol/kg剂量下显示良好的抗肿瘤活性。通过进一步研究发明人认识到，将Met-Arg(NO₂)-OBzl代替3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl中的AA-OBzl，不仅可以延缓它的代谢达到提高抗肿瘤活性的目的，而且可以增加抗血栓和抗炎症活性。血栓和炎症是危害肿瘤患者预后的并发症。通过这种修饰，获得具有抗肿瘤，抗血栓和抗炎症三重活性的化合物，具有良好的临床应用前景。根据这些认识，发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Arg(NO₂)-OBzl。

本发明的第二个内容是提供3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Arg(NO₂)-OBzl的合成方法，该方法包括：

(1)L-组氨酸在稀硫酸催化下与甲醛进行Pictet-Spengler缩合生成6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸；

(2)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸转化为6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯；

(3)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酯用高锰酸钾氧化为3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯；

(4)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯在NaOH溶液(2N)中皂化成3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸；

(5)Boc-Met-OH与硝基精氨酸苄酯偶联得到Boc-Met-Arg(NO₂)-OBzl；

(6)Boc-Met-Arg(NO₂)-OBzl在4N氯化氢的乙酸乙酯溶液中得到H-Met-Arg(NO₂)-OBzl；

(7)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸与L-Met-Arg(NO₂)-OBzl偶联得到3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Arg(NO₂)-OBzl。

本发明的第三个内容是评价3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Arg(NO₂)-OBzl对肿瘤细胞增殖的抑制作用。

本发明的第四个内容是评价3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Arg(NO₂)-OBzl对荷S180小鼠肿瘤增长的抑制作用。

本发明的第五个内容是评价3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Arg(NO₂)-OBzl对SD大鼠的抗血栓作用。

本发明的第六个内容是评价3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Arg(NO₂)-OBzl对ICR小鼠炎症的抑制作用。

附图说明

图1.3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Arg(NO₂)-OBzl的合成路线.i)HCHO，H₂O，H₂SO₄，65℃；ii)MeOH，SOCl₂，0℃；iii)DMF，三乙胺，KMnO₄；iv)NaOH，H₂O，0℃；v)二环己基碳二亚胺(DCC)，1-羟基苯并三唑(HOBt)，N-甲基吗啉(NMM)，四氢呋喃(THF)；vi)4N氯化氢的乙酸乙酯溶液；vii)二环己基碳二亚胺(DCC)，1-羟基苯并三唑(HOBt)，N-甲基吗啉(NMM)，DMF。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1化合物6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(1)的制备

10.00g(64.Smmol)L-组氨酸，30mL水混合于100mL茄瓶中，冰浴下，用恒压漏斗逐滴加入2mL浓硫酸，随浓硫酸的加入，原料逐渐溶解，待其完全溶解后，向反应液中加入40％的甲醛溶液10mL，在微波加速反应仪65℃下反应5小时。反应完毕后，冰浴下缓慢滴加浓氨水调溶液pH6-7，有大量白色沉淀析出，减压过滤，得到无色固体10.76g(99.2％)。ESI-MS(m/z)：168[M+H]⁺。

实施例2化合物6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(2)的制备

冰浴下在100mL茄瓶里加15.6mL甲醇，冰浴下，用恒压漏斗缓慢滴加1.56mL二氯亚砜，30min后加入1.00g(6mmol)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(2)，室温反应3天后，TLC监测反应完全，反应混合物减压浓缩，残留物加甲醇溶解并减压浓缩。该操作重复3次得白色泡状固体，再加乙醚抽干重复3次得无色粉末，最后用甲醇/乙醚重结晶得0.58g(53％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)181[M+H]⁺。

实施例3化合物3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(3)的制备

冰浴下在100mL茄瓶里加1.1g(6.1mmol)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(3)，加DMF使溶解。向该溶液中滴加1mL三乙胺调pH到8，分三次加入1.2g(7.6mmol)高锰酸钾。反应6小时后，TLC监测反应完毕。反应物吹干，得到的黑色固体用1NHCl溶液溶解，冰浴下滴加2NNaOH溶液调pH到7，析出大量无色固体。该固体以二氯甲烷/甲醇为洗脱剂用硅胶柱纯化，得0.68g(63.2％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)177[M+H]⁺。

实施例4化合物3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(4)的制备

冰浴下在100mL茄瓶里加40mLNaOH溶液(2N)，10min后加入5.30g(29.9mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(4)，反应1小时后TLC显示反应完毕，冰浴下向反应液中滴加2NHCl溶液调pH到7，析出大量无色固体。该固体以二氯甲烷/甲醇为洗脱剂用硅胶柱纯化，得1.50g(30％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)162[M-H]^-。

实施例5化合物Boc-Met-Arg(NO₂)-OBzl的制备

称取1.280g(5mmol)Boc-Met于100mL茄形瓶中，加入40mL无水THF溶解。冰浴搅拌下依次加入0.675g(5mmol)HOBt及1.236g(6mmol)DCC，活化30min。称取2.887g(6mmol)Tos·Arg(NO₂)-OBzl于50mL烧杯中，用无水THF溶解后，用NMM调pH至8，然后将该溶液滴加至反应液中，最后用NMM调反应液pH值至8。室温反应48小时，TLC显示反应完毕后，反应液减压蒸干，剩余油状物用乙酸乙酯溶解，过滤除去二环己基脲(DCU)，滤液层依次用饱和NaHCO₃溶液(20mL×3)、饱和NaCl溶液(20mL×3)、饱和KHSO₄溶液(20mL×3)、饱和NaCl溶液(20mL×3)、饱和NaHCO₃溶液(20mL×3)、饱和NaCl溶液(20mL×3)各洗三遍，有机层用无水Na₂SO₄干燥，过滤、滤液减压浓缩至干，得到的黄色油状物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇为洗脱剂)，得到1.904g(87.5％)标题化合物，为白色固体。

实施例6化合物HCl·H-Met-Arg(NO₂)-OBzl的制备

称取1.080g(2mmol)Boc-Met-Arg(NO₂)-OBzl于100ml茄瓶中，加入20ml4N氯化氢的乙酸乙酯溶液，冰浴搅拌反应，6小时后TLC显示反应完毕后，减压抽干溶剂，加入乙酸乙酯分散瓶中固体后减压抽，重复两次，再用无水乙醚分散瓶中固体，减压抽干溶剂，重复三次，得到0.797(86.4％)标题化合物，为淡黄色固体。

实施例7化合物3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Arg(NO₂)-OBzl(5)的制备

称取40mg(0.23mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸于100mL茄形瓶中，加入30mLDMF。冰浴搅拌下依次加入31mg(0.23mmol)HOBt及62mg(0.3mmol)DCC，活化30min。称取123mg(0.26mmol)HCl·H-Met-Arg(NO₂)-OBzl于50mL烧杯中，用DMF溶解后，用NMM调pH至8，然后将该溶液滴加至反应液中，最后用NMM调反应液pH值至8。室温反应24小时，TLC显示反应完毕后，反应液转移至表面皿中晾干，皿中固体用乙酸乙酯∶二氯甲烷1∶5混合溶液溶解，过滤除去二环己基脲(DCU)，滤液层依次用饱和NaHCO₃溶液(20mL×3)、饱和NaCl溶液(20mL×3)、饱和KHSO₄溶液(20mL×3)、饱和NaCl溶液(20mL×3)、饱和NaHCO₃溶液(20mL×3)、饱和NaCl溶液(20mL×3)各洗三遍，有机层用无水Na₂SO₄干燥，过滤、滤液减压浓缩至干，得到的黄色油状物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇为洗脱剂)，得到的淡黄色固体，经薄层层析纯化(二氯甲烷/甲醇为展开剂)得到16mg(14.5％)标题化合物，为白色固体。ESI-MS(m/z)：593[M+Na]⁺；；Mp：162～164℃；[α]_D ²⁵＝-7.34(c＝0.10，甲醇)；IR(KBr)：3383，3290，3120，2916，1732，1667，1639，1578，1543，1508，1454，1408，1377，1339，1300，1254，1211，1103，1092，941，907，894，675；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.87(s，1H)，8.76(d，J＝9.0Hz，1H)，8.51(m，1H)，8.34(m，1H)，8.19(s，1H)，7.35(m，5H)，5.13(s，2H)，4.70(dd，J₁＝6.0Hz，J₂＝12.0Hz，1H)，4.35(d，J＝6.0Hz，1H)，2.47(m，2H)，2.03(m，1H)，2.00(s，3H)，1.77(m，4H)，1.68(m，2H)，1.54(m，2H)，1，24(s，1H)。

实验例1化合物5抗肿瘤细胞增殖活性评价

本发明的化合物5用含1％DMSO的PBS配制成所需浓度。共使用了MCF-7(人乳腺癌细胞)，U₂OS(人骨肉瘤细胞)，SH-Sy5y(神经母细胞瘤细胞)，HaCaT(人永生化表皮细胞)，HL60(人早幼粒细胞白血病细胞)，K562(人白血病慢性粒细胞)6株肿瘤细胞。

将生长状态良好，处于对数生长期的细胞按照5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μl。在37℃、5％CO₂培养箱中培养4小时，按预设的浓度梯度100μM，50μM，25μM，12.5μM，6.25μM，加入经灭菌处理的本发明的化合物，采用阿霉素作对照。继续培养48小时后，每孔加25μl浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃孵育4小时，小心除去上清液(悬浮细胞经离心后除去上清液)后每孔加入100μlDMSO(二甲基亚砜)，振荡约15min溶解沉淀。立即于酶标仪上570nm波长下测定O.D.(吸光度)值。计算抑瘤率及IC_s0。结果也列入表1。结果表明本发明的化合物对六种肿瘤细胞都没有明显的细胞毒作用。

表1化合物5的体外抗肿瘤细胞增殖活性(IC₅₀，μM)

实验例2化合物5的体内抗肿瘤活性评价

测定前将本发明的化合物5加吐温80助溶，溶于生理盐水。无菌条件下取接种于ICR小鼠7-10天的S180肉瘤，加入适量生理盐水配制成瘤细胞悬液，细胞数为2×10⁷/mL，接种于健康雄性ICR小鼠前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2ml。肿瘤接种24h后，治疗组小鼠每日腹腔注射0.2ml化合物5的水溶液，连续给药7天，剂量分别为为100nmol/kg和20nmol/kg。空白组小鼠每日腹腔注射0.2ml生理盐水。以阿霉素(剂量为2μmol/kg)作阳性对照。实验进行至第8天，称小鼠体重，并剖取各组小鼠的肿瘤称重，最后统计各组动物的抑瘤率。实体瘤的疗效以瘤重抑制百分率表示，计算如下：瘤重抑制率％＝(空白组瘤重-给药组瘤重/空白组瘤重)×100％。以瘤重或百分抑瘤率表示化合物的活性，数据列入表2。

由表2可以看出，在100nmol/kg和20nmol/kg的剂量下，化合物5治疗小鼠的瘤重明显小于含吐温80的生理盐水治疗小鼠的瘤重，说明化合物5的有效剂量低达20nmol/kg。这个有效剂量比发明人曾经公开的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl(其中AA代表甘氨基酸或其它L-氨基酸残基)的有效剂量1μmol/kg低50倍。

表2化合物5对S180荷瘤小鼠的瘤重的影响

瘤重表示为均值±SDg；a)与生理盐水组比较p＜0.01。

实验例3化合物5的动静脉旁路循环抗血栓实验

1)聚乙烯管的组装：将聚乙烯管拉成一端为斜口的细管，定长为10.0cm，分别为右经静脉(管径较粗)及左颈动脉(管径较细)插管；中段聚乙烯管定长为8.0cm，血栓线压在颈动脉插管方向，插管前需在管中充满肝素。

2)手术：以20nmol/kg的剂量进行灌胃给药，30分钟后腹腔注射20％的乌拉坦进行麻醉。仰卧位将大鼠固定于鼠板上，剪开颈部皮肤，分离右颈总动脉及左颈静脉，血管下压线，结扎远心端，静脉靠远心端处剪一小口，进行静脉端插管，注射肝素，系线固定，再用动脉夹夹住动脉近心端，靠近远心端方向剪一小口，进行动脉端结扎，系线固定后松开动脉夹，建立体外循环旁路。循环15分钟后先剪断静脉端观察血液循环是否正常，若正常从动脉端取出血栓线，在纸上沾干浮血后称量并记录其湿重，大鼠断颈处死。每组大鼠15只，最后进行数据统计并评价化合物活性。数据列入表3。从表3可以看出，化合物5治疗大鼠的血栓重量明显小于含吐温80的生理盐水治疗大鼠的血栓重量。表明化合物5在发挥体内抗肿瘤作用的剂量下，还具有体内抗动脉血栓生成的活性。

表3.化合物抗栓活性评价

n＝13；

a，与空白对照(NS)比较p＜0.01；

b，与空白对照(NS)比较p＜0.01，与阳性对照相比p＞0.05；

实验例4化合物5的抗炎活性评价实验

1)实验方法

20±2gICR雄性小鼠随机分为空白对照组、阳性用药组及给药组，小鼠使用前静息1天，操作间保持室内温度22℃，每组小鼠10只。一次给药30分钟后往小白鼠的左耳外廓涂二甲苯(0.03mL)，2小时后将小白鼠颈椎脱臼处死。将小鼠的左，右耳剪下，用直径7mm的打孔器在两耳的相同位置，取圆形耳片，分别称重，求出两圆耳片的重量差作为肿胀度。肿胀度＝左耳原片重量-右耳原片重量。

2)给药方法和剂量

给药方式为灌胃给药。空白对照：生理盐水，给药剂量为0.2mL/20g；阳性对照：阿司匹林，给药剂量为1.11mmol/kg；本发明化合物5的给药剂量为20nmol/kg.

3)统计方法

本实验数据统计均采用t检验和方差分析，肿胀度以表示。

4)实验结果

从表4结果可以看出，化合物5治疗组的鼠耳肿胀度与生理盐水组相比具有显著性差异，表明化合物5在发挥体内抗肿瘤作用的剂量下，还具有抗炎作用。

表4化合物5的体内抗炎活性评价

注：a)n＝9；b)与生理盐水组比较，p＜0.01。

Claims

1.下式的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Arg(NO₂)-OBzl。

2.权利要求1的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Arg(NO₂)-OBzl的制备方法，该方法包括：

(5)Boc-Met-OH与硝基精氨酸苄酯偶联得到Boc-Met-Arg(NO₂)-OBzl；

(6)Boc-Met-Arg(NO₂)-OBzl在4N氯化氢的乙酸乙酯溶液中得到L-Met-Arg(NO₂)-OBzl；

(7)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸与L-Met-Arg(NO₂)-OBzl残基偶联得到3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Arg(NO₂)-OBzl。

3.权利要求1的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Arg(NO₂)-OBzl对肿瘤细胞增殖的抑制作用。

4.权利要求1的通式I的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Arg(NO₂)-OBzl对荷S180小鼠肿瘤增长的抑制作用。

5.权利要求1的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Arg(NO₂)-OBzl作为抗肿瘤药物的应用。

6.权利要求1的通式I的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Arg(NO₂)-OBzl对SD大鼠的抗血栓作用。

7.权利要求1的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Arg(NO₂)-OBzl作为抗血栓药物的应用。

8.权利要求1的通式I的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Arg(NO₂)-OBzl对ICR小鼠炎症的抑制作用。

9.权利要求1的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Arg(NO₂)-OBzl作为抗炎药物的应用。