CN105315335A

CN105315335A - 咪唑并吡啶-6-甲酰-Met-Gln-OBzl,其合成,活性和应用

Info

Publication number: CN105315335A
Application number: CN201410327801.9A
Authority: CN
Inventors: 赵明; 彭师奇; 吴建辉; 王玉记; 张帅; 李关宇; 利鹏
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2014-07-10
Filing date: 2014-07-10
Publication date: 2016-02-10

Abstract

本发明公开了下式的4种3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Gln-苄酯。公开了它的制备方法，公开了它对肿瘤生长的抑制作用，进一步公开了它的抗血栓活性，因而本发明公开了它作为抗肿瘤药物和抗血栓药物的双重应用。

Description

咪唑并吡啶-6-甲酰-Met-Gln-OBzl,其合成,活性和应用

发明领域

本发明涉及4种3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Gln-OBzl，涉及它们的制备方法，涉及它们对肿瘤细胞增殖的抑制作用，进一步涉及它们对肿瘤增长的抑制作用，进一步涉及它们的抗血栓活性，因而本发明涉及它们作为抗肿瘤药物和抗血栓药物的双重应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

癌症是一组可影响身体任何部位的多种疾病的通称。使用的其它术语为恶性肿瘤和赘生物。据世界卫生组织统计，癌症是世界上的头号死因之一，尤其是在发展中国家。而全世界癌症死亡人数预计将继续上升，到2030年将超过1310万。因此，开发新的高效，低毒，毒副作用小的抗肿瘤药物一直是新药研究的重要课题之一。

随着对肿瘤特性和发病本质的认识，发明人曾经公开下式代表的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-GLN-OBzl(其中GLN代表甘氨基酸或其它L-氨基酸残基)在1μmol/kg剂量下显示良好的抗肿瘤活性。通过进一步研究发明人认识到，将Met-Gln-OBzl代替3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl中的AA-OBzl，不仅可以延缓它的代谢达到提高抗肿瘤活性的目的，而且可以增加抗血栓活性。血栓是危害肿瘤患者预后的并发症。通过这种修饰，获得具有抗肿瘤和抗血栓双重活性的化合物，具有良好的临床应用前景。根据这些认识，发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供下式的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Gln-OBzl。

本发明的第二个内容是提供3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Gln-OBzl的合成方法，该方法包括：

(1)L-组氨酸在稀硫酸催化下与甲醛进行Pictet-Spengler缩合生成6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸；

(2)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸转化为6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯；

(3)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酯用高锰酸钾氧化为3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯；

(4)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯在NaOH溶液(2N)中皂化成3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸；

(5)Boc-Met与HCl·H-Gln-OBzl在偶联得到Boc-Met-Gln-OBzl；

(6)Boc-Met-Gln-OBzl在4N氯化氢的乙酸乙酯溶液中得到Met-Gln-OBzl；

(7)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸与Met-Gln-OBzl偶联得到3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Gln-OBzl。

本发明的第三个内容是评价3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Gln-OBzl对肿瘤细胞增殖的抑制作用。

本发明的第四个内容是评价3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Gln-OBzl对肿瘤生长的抑制作用。

本发明的第五个内容是评价3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Gln-OBzl对血栓形成的抑制作用。

本发明的第六个内容是3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Gln-OBzl在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的第七个内容是3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Gln-OBzl在制备抗血栓药物中应用。

本发明的第八个内容是3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Gln-OBzl在制备具有抗肿瘤和抗血栓双重作用的药物中应用。

附图说明

图1.3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Gln-OBzl的合成路线.i)HCHO，H₂O，H₂SO₄，65℃；ii)MeOH，SOCl₂，0℃；iii)DMF，三乙胺，KMnO₄；iv)NaOH，H₂O，0℃；v)二环己基碳二亚胺(DCC)，1-羟基苯并三唑(HOBt)，N-甲基吗啉(NMM)，四氢呋喃(THF)；vi)4N氯化氢的乙酸乙酯溶液，0℃；vii)二环己基碳二亚胺(DCC)，1-羟基苯并三唑(HOBt)，N-甲基吗啉(NMM)，DMF。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(1)

10.00g(64.5mmol)L-组氨酸，30mL水混合于100mL茄瓶中，冰浴下，用恒压漏斗逐滴加入2mL浓硫酸，随浓硫酸的加入，原料逐渐溶解，待其完全溶解后，向反应液中加入40％的甲醛溶液10mL，在微波加速反应仪65℃下反应5小时。反应完毕后，冰浴下缓慢滴加浓氨水调溶液pH6-7，有大量无色沉淀析出，减压过滤，得到10.76g(99.2％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：168[M+H]⁺。

实施例2制备6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(2)

冰浴下在100mL茄瓶里加15.6mL甲醇，用恒压漏斗缓慢滴加1.56mL二氯亚砜，30min后加入1.00g(6mmol)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(2)，室温反应3天后，TLC监测反应完全，反应混合物减压浓缩，残留物加甲醇溶解并减压浓缩。该操作重复3次得无色泡状固体，再加乙醚抽干重复3次得无色粉末，最后用甲醇/乙醚重结晶得0.58g(53％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)181[M+H]⁺。

实施例3制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(3)

冰浴下在100mL茄瓶里加1.1g(6.1mmol)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(3)，加DMF使溶解。向该溶液中滴加1mL三乙胺调pH到8，分三次加入1.2g(7.6mmol)高锰酸钾。反应6小时后，TLC监测反应完毕。反应物吹干，得到的黑色固体用1NHCl溶液溶解，冰浴下滴加2NNaOH溶液调pH到7，析出大量无色固体。该固体以二氯甲烷/甲醇为洗脱剂用硅胶柱纯化，得0.68g(63.2％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)177[M+H]⁺。

实施例4制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(4)

冰浴下在100mL茄瓶里加40mLNaOH溶液(2N)，10min后加入5.30g(29.9mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(4)，反应1小时后TLC显示反应完毕，冰浴下向反应液中滴加2NHCl溶液调pH到7，析出大量无色固体。该固体以二氯甲烷/甲醇为洗脱剂用硅胶柱纯化，得1.50g(30％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)162[M-H]^-。

实施例5制备Boc-Met-Gln-OBzl

称取3.2021g(12.9mmol)Boc-Met于250mL茄瓶中，加入80mL无水THF。在冰浴和搅拌下依次加入1.4467g(10.7mmol)HOBt及2.6491g(12.9mmol)DCC，活化30min。称取2.513g(9.2mmol)HCl·H-Gln-OBzl于50mL烧杯中，用无水DMF溶解后，用NMM调pH至7，然后将该溶液滴加至茄形瓶的反应液中，最后用NMM调反应液pH值至8。室温反应过夜，TLC显示反应完毕后，吹干溶剂，之后用二氯甲烷溶解过滤除去二环己基脲(DCU)，二氯甲烷层依次用饱和NaHCO₃溶液(30mL×3)、饱和NaCl溶液(30mL×3)洗三遍，饱和KHSO₄溶液(30mL×3)洗三遍，饱和NaCl溶液(30mL×3)洗三遍，饱和NaHCO₃溶液(30mL×3)、饱和NaCl溶液(30mL×3)洗三遍，有机层用无水Na₂SO₄干燥，过滤、滤液减压浓缩至干，得到的黄色油状物经二氯甲烷/石油醚重结晶后，得到4.458g(97.0％)标题化合物，为淡黄色固体。ESI-MS(m/z)：468[M+H]⁺。

实施例6制备H-Met-Gln-OBzl

称取4.458gBoc-Met-Gln-OBzl于250mL茄瓶中，冰浴和搅拌下加90mL4N氯化氢的乙酸乙酯溶液，加上干燥管。TLC显示反应完毕后，用水泵将乙酸乙酯抽干，再加入二氯甲烷(40mL×3)溶解，再次抽干，之后加入无水乙醚(40mL×3)，浸泡15min，倾倒出上清液，抽干。得到标题化合物3.506g(91.0％)，为棕黄色固体。

实施例7制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Gln-OBzl(5)

称取0.3498g(2.1mml)在冰浴和搅拌下依次加入0.5215g(3.8mmol)HOBt及1.1190g(5.4mmol)DCC，活化30min。称取1.039g(2.5mmol)HCl·H-Met-Gln-OBzl于50mL小三角瓶中，用DMF溶解后，用NMM调pH至7，然后将该溶液滴加至茄形瓶的反应液中，最后用NMM调反应液pH值至8。室温反应过夜，TLC显示反应完毕后，吹干溶剂，残留物加150mL二氯甲烷溶解，过滤除去二环己基脲(DCU)，滤液层依次用饱和NaHCO₃溶液(30mL×3)、饱和NaCl溶液(30mL×3)洗三遍、饱和KHSO₄溶液(30mL×3)洗三遍，饱和NaCl溶液30mL×3)洗三遍，饱和NaHCO₃溶液(30mL×3)、饱和NaCl溶液(30mL×3)洗三遍，有机层用无水Na₂SO₄干燥，过滤、滤液减压浓缩至干，得到的黄色油状物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇为洗脱剂)，得到标题化合物87.6mg(8.0％)，为棕褐色固体。ESI-MS(m/z)：511[M-H]^-；Mp：108-110℃；[α]_D ²⁵＝-15(c＝0.10，甲醇)；IR(KBr)：3202，3190，2931，2855，1736，1654，1624，1501，1458，1203，1119，752，698；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝9.00(s，1H)，8.79(d，J＝9Hz，1H)，8.68(d，J＝6Hz，1H)，8.55(s，1H)，8.25(s，1H)，7.36(m，5H)，6.77(s，1H)，5.13(s，2H)，4.70(dd，J₁＝9Hz，J₂＝15Hz，1H)，4.34(m，1H)，2.48(m，2H)，2.16(m，2H)，2.07(m，4H)，2.02(s，3H)。

实验例1评价化合物5a-i抗肿瘤细胞增殖的活性

本发明的化合物5均用含1％DMSO的PBS配制成所需浓度。共使用了MCF-7(人乳腺癌细胞)，U₂OS(人骨肉瘤细胞)，SH-Sy5y(神经母细胞瘤细胞)，HaCaT(人永生化表皮细胞)，HL60(人早幼粒细胞白血病细胞)，K562(人白血病慢性粒细胞)6株肿瘤细胞。

将生长状态良好，处于对数生长期的细胞按照5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μl。在37℃、5％CO₂培养箱中培养4小时，按预设的浓度梯度100μM，50μM，25μM，12.5μM，6.25μM，加入经灭菌处理的本发明的化合物，采用阿霉素作对照。继续培养48小时后，每孔加25μl浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃孵育4小时，小心除去上清液(悬浮细胞经离心后除去上清液)后每孔加入100μlDMSO(二甲基亚砜)，振荡约15min溶解沉淀。立即于酶标仪上570nm波长下测定O.D.(吸光度)值。计算IC₅₀。结果列入表1。结果表明，化合物5抑制肿瘤细胞增殖的IC₅₀几乎都大于100μM，说明它们没有明显的细胞毒作用。

表1化合物5的体外抗肿瘤细胞增殖活性(IC₅₀，μM)

实验例2评价化合物5抑制瘤生长的活性

测定前将化合物5加吐温80助溶，溶于生理盐水。无菌条件下取接种于ICR小鼠7-10天的S180肉瘤，加入适量生理盐水配制成瘤细胞悬液，细胞数为2×10⁷/mL，接种于健康雄性ICR小鼠前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2mL。肿瘤接种24h后，治疗组小鼠每日腹腔注射0.2ml5的水溶液，连续给药8天，剂量为100nmol/kg和20nmol/kg。空白组小鼠每日腹腔注射0.2ml生理盐水。以阿霉素(剂量为2μmol/kg)作阳性对照。实验进行至第10天，称小鼠体重，乙醚麻醉并剖取各组小鼠的肿瘤称重，最后统计各组动物的抑瘤率。实体瘤的疗效以瘤重抑制百分率表示，计算如下：瘤重抑制率％＝(1-给药组瘤重/空白组瘤重)×100％。以瘤重或百分抑瘤率表示化合物的活性，数据列入表2。

由表2可以看出，在100nmol/kg和20nmol/kg的剂量下，化合物5治疗小鼠的瘤重明显小于含吐温80的生理盐水治疗小鼠的瘤重，说明化合物5的有效剂量低达20nmol/kg。这个有效剂量比发明人曾经公开的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-GLN-OBzl(其中GLN代表甘氨基酸或其它L-氨基酸残基)的有效剂量1μmol/kg低50倍。

实验观察到，在低于2μmol/kg剂量下，阿霉素不显示抗肿瘤作用。在2μmol/kg剂量下，阿霉素虽然显示抗肿瘤作用。相反，0.1μmol/kg和0.02μmol/kg剂量下5全部显示优秀的抗肿瘤作用。

表2化合物5a～i对S180荷瘤小鼠的瘤重的影响

瘤重为均值±SDg；生理盐水是含吐温80的生理盐水；a)与含吐温80的生理盐水组比较p＜0.01。

实验例3评价化合物5a-的抗栓活性

1)聚乙烯管的组装：将聚乙烯管拉成一端为斜口的细管，定长为10.0cm，分别为右经静脉(管径较粗)及左颈动脉(管径较细)插管；中段聚乙烯管定长为8.0cm，血栓线压在颈动脉插管方向，插管前需在管中充满肝素。

2)手术：测定前将化合物5加吐温80助溶，溶于生理盐水。化合物5以20nmol/kg的剂量灌胃，阿司匹林以167μmol/kg的剂量灌胃30分钟后腹腔注射20％的乌拉坦进行麻醉。仰卧位将大鼠固定于鼠板上，剪开颈部皮肤，分离右颈总动脉及左颈静脉，血管下压线，结扎远心端，静脉靠远心端处剪一小口，进行静脉端插管，注射肝素，系线固定，再用动脉夹夹住动脉近心端，靠近远心端方向剪一小口，进行动脉端结扎，系线固定后松开动脉夹，建立体外循环旁路。循环15分钟后先剪断静脉端观察血液循环是否正常，若正常从动脉端取出血栓线，在纸上沾干浮血后称量并记录其湿重，大鼠乙醚麻醉，断颈处死。每组大鼠10只，最后进行数据统计并评价化合物活性。以栓重表示化合物的活性，数据列入表3。从表3可以看出，化合物5治疗大鼠的血栓重量明显小于含吐温80的生理盐水治疗大鼠的血栓重量。表明化合物5在发挥体内抗肿瘤作用的剂量下，还具有体内抗动脉血栓生成的活性。

表3化合物5对SD大鼠血栓重量的影响

生理盐水是含吐温80的生理盐水；a)与含吐温80的生理盐水比p＜0.01；b)与含吐温80的生理盐水比p＜0.01，与阿司匹林比p＞0.05。

Claims

1.下式的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Gln-OBzl。

2.权利要求1的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Gln-OBzl的制备方法，该方法包括：

(5)Boc-Met-OH与HCl·H-Gln-OBzl偶联得到Boc-Met-Gln-OBzl；

(6)Boc-Met-Gln-OBzl在4N氯化氢的乙酸乙酯溶液中得到Met-Gln-OBzl；

(7)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸与7种Met-Gln-OBzl残基偶联得到3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰Met-Gln-OBzl。

3.权利要求1的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Gln-OBzl在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.权利要求1的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Gln-OBzl在制备抗血栓药物中应用。

5.权利要求1的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-Met-Gln-OBzl在制备具有抗肿瘤和抗血栓双重作用的药物中应用。