CN105315333A - 异喹啉-3-甲酰-RV-OBzl,其制备,纳米结构,活性和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl。公开了它的制备方法，公开了它们的纳米结构，公开了它对PAD4的抑制作用，公开了其抑制肿瘤细胞增殖的活性，进一步公开了其抑制S180实体瘤在小鼠体内的肿瘤增值抑制活性。因而本发明公开了异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl作为以PAD4为靶的抗肿瘤药物的临床应用前景。

Description

异喹啉-3-甲酰-RV-OBzl,其制备,纳米结构,活性和应用

技术领域

本发明涉及异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl。Arg(N^G-NO₂)-Val简称为RV。涉及它的制备方法，涉及它的纳米结构，涉及它对PAD4的抑制作用，涉及它抑制肿瘤细胞增殖的活性，进一步涉及它抑制S180实体瘤在小鼠体内的肿瘤增值抑制活性。因而本发涉及它作为以PAD4为靶的抗肿瘤药物的临床应用前景。本发明属于生物医药领域。

技术背景

癌症是一组可影响身体任何部位的多种疾病的通称。使用的其它术语为恶性肿瘤和赘生物。据世界卫生组织统计，癌症是世界上的头号死因之一，尤其是在发展中国家。而全世界癌症死亡人数预计将继续上升，到2030年将超过1310万。因此，开发新的高效、低毒、毒副作用小的抗肿瘤药物一直是新药研究的重要课题之一。

随着对肿瘤特性和发病本质的认识，最近几年抗肿瘤药物不断从传统的细胞毒药物向发展非细胞毒药物过渡。β-咔啉是天然来源的细胞毒性抗肿瘤化合物。发明人认识到，β-咔啉抗肿瘤的细胞毒性本质是与肿瘤细胞DNA之间的嵌插。这种形式的扦插可造成细胞毒性。发明人曾经发现，β-咔啉可以插入肿瘤细胞DNA之间的双螺旋碱基之间。在进一步的研究中，发明人认识到，β-咔啉的抗肿瘤活性来自嵌插。发明人还认识到，在β-咔啉的1位引入二肽生成β-咔啉-3-羧酸苄酯及衍生物可增强β-咔啉与肿瘤细胞的作用，增强抗肿瘤活性。根据这些认识，发明人提出下式的异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-AA-OBzl。与发明人前期的发明的异喹啉-3-甲酰氨基酸苄酯相比，本发明的突出创造性在于在3-甲酰基与氨基酸苄酯基之间插入Arg(N^G-NO₂)，保留了异喹啉-3-甲酰氨基酸苄酯与肿瘤细胞DNA之间的嵌插作用，又可以通过插入Arg(N^G-NO₂)延缓代谢，使得它们的有效剂量大幅度降低。

精氨酸脱亚氨酶4(PAD4)，是一种钙离子依赖型酶。PAD4在肝癌，乳腺癌，卵巢癌，结肠癌及肺癌等多种肿瘤组织中高表达，是一种潜在的癌症治疗靶点。发明人认识到，发现在3-甲酰基与Val-OBzl之间插入Arg(N^G-NO₂)可抑制PAD4。于是，异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl可以显示更好的抗肿瘤活性。

发明的内容

本发明的第一个内容是提供下式的异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl。

本发明的第二个内容是提供异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-AA-OBzl的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)将L-苯丙氨酸在35％盐酸的催化下与甲醛进行Pictet-Spengler缩合，得到四氢异喹啉-3-羧酸；

(2)将四氢异喹啉-3-羧酸在甲醇溶液中，冰浴下用氯化亚砜催化得到四氢异喹啉-3-羧酸甲酯；

(3)将四氢异喹啉-3-羧酸甲酯在无水的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，用高锰酸钾为氧化剂得到异喹啉-3-羧酸甲酯；

(4)在NaOH存在下，在甲醇中将异喹啉-3-羧酸甲酯皂化为异喹啉-3-羧酸；

(5)在二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三唑(HOBt)存在下，Boc-Arg(NO₂)在无水DMF中与Val-OBzl缩合为Boc-Arg(NO₂)-Val-OBzl；

(6)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中Boc-Arg(NO₂)-Val-OBzl脱去Boc生成Arg(NO₂)-Val-OBzl；

(7)在DCC和HOBt存在下，异喹啉-3-羧酸在无水DMF中与Arg(NO₂)-Val-OBzl缩合得到异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl。

本发明的第三个内容是评价异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl对肿瘤细胞增殖的抑制作用。

本发明的第四个内容是评价异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl对S180肿瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用。

本发明的第五个内容是测定异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl的纳米结构。

本发明的第六个内容是评价异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-AA-OBzl对PAD4的抑制作用。

附图说明

图1异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl的合成路线.i)HCHO，35％HCl；ii)SOCl₂，CH₃OHiii)DMF，KMnO₂；iv)NaOH，CH₃OH；V)DCC，HOBt，DMF；Vi)2NHCl/EtOAc。

图2异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl在纯水中10^-5M浓度下的透射电镜照片。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备四氢异喹啉-3-羧酸

称取L-苯丙氨酸1g，加入2.4mL的甲醛，再加入8mL35％的盐酸，溶液先澄清后析出白色物质，油浴80℃，反应8小时。反应结束后，除去溶剂，置于茄瓶中。加入乙醚超声搅拌1小时，反复磨洗，过滤，得到0.91g(85％)四氢异喹啉-3-羧酸，为无色固体。熔点246-247℃。ESI-MS(m/e)：176[M-H]^-。

实施例2制备四氢异喹啉-3-羧酸甲酯

向50ml的茄型瓶中加入6ml的甲醇，0.4ml的二氯亚砜，搅拌，活化30min，冰浴。加入四氢异喹啉-3-羧酸239mg，冰浴下反应12小时。抽干溶剂，再加甲醇，反复抽干3次；加入乙醚3次，抽干，得到213mg(82.5％)四氢异喹啉-3-羧酸甲酯，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：192[M+H]⁺。

实施例3制备异喹啉-3-羧酸甲酯

用无水DMF将四氢异喹啉-3-羧酸甲酯213mg溶解，加入蒸馏水溶解的高锰酸钾溶液，在冰浴下缓慢加入，室温下反应24小时。反应结束后，将DMF吹干，用甲醇将黑色粉末溶解后过滤，滤液旋干。柱层析分离纯化。得到77mg(37％)异喹啉-3-羧酸甲酯，为微黄色固体。Rf＝0.25(二氯甲烷∶甲醇，20∶1)；ESI-MS(m/e)：188[M+H]⁺；¹HNMR(DMSO-d₆，500MHz)δ/ppm＝9.421(s，1H)，8.666(s，1H)，8.258(d，J＝4Hz，1H)，8.22(d，J＝4Hz，1H)，7.897(m，2H)，3.944(s，3H)。

实施例4制备异喹啉-3-羧酸

将1g异喹啉-3-羧酸甲酯用甲醇溶解，调PH值为12，室温下反应。反应4小时结束后，调PH值为7，旋除甲醇，调PH值为4，有固体析出，过滤，得到370mg(40％)异喹啉-3-羧酸，为无色固体。Mp231-232℃；ESI-MS(m/e)：172[M-H]^-。

实施例5制备Boc-Arg(NO₂)-Val-OBzl

将Boc-Arg(NO₂)3g溶于无水DMF中，冰浴下加入HOBt和DCC的无水DMF溶液，冰浴搅拌20min，得到活泼酯溶液A待用。将Val-OBzl1.9g溶于无水DMF中，NMM调节PH为8-9，得到溶液B。将B倒入A中，室温反应12小时。反应结束后，将反应液减压浓缩至干，用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠、饱和氯化钠水溶液各洗3遍。分出酯层，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，柱层析纯化，得到2.4g(51.6％)Boc-Arg(NO₂)-Val-OBzl，为无色固体。Rf＝0.25(二氯甲烷∶甲醇，20∶1)；ESI-MS(m/e)：509[M+H]⁺。

实施例6制备Arg(NO₂)-Val-OBzl

称取Boc-Arg(NO₂)-Val-OBzl1g于茄瓶中，加入3NHClEtOAc约10mL。TLC监测反应进度，反应4小时反应结束。水泵抽干液体，加入无水乙酸乙酯溶解，反复3次；再用无水乙醚磨洗抽干3次，得到0.89mg(99％)Arg(NO₂)-Val-OBzl，为无色粉末。

实施例7制备异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl

将异喹啉-3-羧酸0.34g溶于无水DMF中，冰浴下加入HOBt和DCC的无水DMF溶液，冰浴搅拌20min，得到活泼酯溶液A待用。将Arg(NO₂)-Val-OBzl0.88g溶于无水DMF中，NMM调节PH为8-9，得到溶液B。将B倒入A中，室温反应14小时。反应结束后，将反应液减压浓缩至干，用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和碳酸氢钠、饱和氯化钠水溶液各洗3遍。分出酯层，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，柱层析纯化，得到0.57g(51％)异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl，为无色固体。ESI-MS(m/e)：564[M+H]⁺；Mp：97-99℃；＝-1.455(c＝0.50，CH₃OH)；IR(KBr)：3307.92，2962.66，2937.59，2877.79，1739.79，1647.21，1624.06，1597.06，1506.41，1390.68，1267.23，1145.72，1114.86，954.76，908.47，748.38；¹HNMR(DMSO-d₆，300MHz)δ/ppm＝9.4(s，1H)，8.865(d，J＝9Hz，1H)，8.58(s，1H)，8.505(d，J＝9Hz，1H)，8.26(d，J＝6Hz，1H)，7.855(m，3H)，7.34(m，5H)，5.14(dd，J₁＝12.3Hz，J₂＝16.5Hz，1H)，4.78(m，1H)，4.28(m，1H)，3.165(d，J＝3Hz，2H)，2.105(m，1H)，1.77(m，2H)，1.57(s，2H)，0.885(dd，J₁＝3.9Hz，J₂＝6.6Hz，6H)。

实验例1评价异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl(简称化合物1)抑制肿瘤细胞增殖的作用

异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl用0.5％DMSO1640培养基配制成所需浓度。分别将生长状态良好、处于对数生长期的A549，S180，MCF-7细胞按照5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL。在37℃，5％CO₂培养箱中培养4小时，按预设的浓度梯度100μM，50μM，25μM和12.5μM加入经灭菌处理的化合物异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl的溶液，对照组加入等体积溶解样品的含0.5％DMSO的1640培养基。继续培养48小时后，每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃孵育4小时，小心除去上清液后每孔加入100μlDMSO，振荡约15min溶解沉淀。立即于酶标仪上570nm波长下测定OD(吸光度)值。按抑制率＝[(含0.4％DMSO的1640培养基组的OD平均值-异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl的OD平均值)/含0.4％DMSO的1640培养基组的OD值]×100％”计算抑制率。实验平行重复3次，以抑制率对异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl的浓度作图，计算本IC₅₀(半数有效抑制浓度)值。

异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl用含0.4％DMSO的DMEM培养基配制成所需浓度。分别将生长状态良好、处于对数生长期的U2OS、SH-sy5y和HacaT细胞按照5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL。在37℃、5％CO₂培养箱中培养4小时，按预设的浓度梯度100μM，50μM，25μM和12.5μM加入经灭菌处理的异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl的溶液，对照组加入等体积溶解样品的含0.5％DMSO的DMEM培养基。继续培养48小时后，每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃孵育4小时，小心除去上清液后每孔加入100μlDMSO，振荡约15min溶解沉淀。立即于酶标仪上570nm波长下测定OD(吸光度)值。按抑制率＝[(含0.4％DMSO的DMEM培养基组的OD平均值-异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl组的OD平均值)/含0.5％DMSO的DMEM培养基组的OD平均值]×100％计算抑制率。实验平行重复3次，以抑制率对异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl的浓度作图，计算IC₅₀(半数有效抑制浓度)值。

结果列入表1和表2。从IC₅₀值可看出，异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl对MCF-7细胞，A549细胞，S180细胞，SH-Sy5y细胞，U2OS细胞和HacaT细胞的均有抑制增殖的作用。

表1化合物1抑制肿瘤细胞增殖的作用(IC₅₀，μM)

n＝18.

表2化合物1抑制肿瘤细胞增殖的作用(IC₅₀，μM)

n＝18.

实验例2评价异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl(简称化合物1)抑制S180小鼠肿瘤生长的活性

测定前将本发明衍生物加吐温80助溶，用生理盐水将样品溶解；将阿霉素溶于生理盐水。无菌条件下取接种于ICR小鼠7-10天的S180肉瘤，加入适量生理盐水配制成瘤细胞悬液，细胞数为1×10⁷个/mL，接种于健康雄性ICR小鼠前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2mL。肿瘤接种24h后，治疗组小鼠每日腹腔注射0.2mL异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl的水溶液，连续给药9天，剂量为5μmol/kg。空白组小鼠每日腹腔注射0.2mL生理盐水。以阿霉素(剂量为2μmol/kg)作阳性对照。实验进行至第10天，称小鼠体重，并剖取各组小鼠的肿瘤称重，最后统计各组动物的抑瘤率。实体瘤的疗效以瘤重抑制百分率表示，计算如下：瘤重抑制率％＝[1-(给药组瘤重/空白组瘤重)]×100％。结果列入表3。表3结果表明异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl组瘤重与空白组相比有显著性差异，说明它的有效剂量(5μmol/kg)比发明人前期的发明的异喹啉-3-甲酰氨基酸苄酯的有效剂量(100μmol/kg)低20倍。

表3化合物1对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

n＝12；a)与空白组比p＜0.01。

实验例3测定异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl的透射电镜照片

将异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl按照1×10^-5M的浓度配置化合物的水溶液，均匀的铺在铜网上，在透射电镜(TEM，JEM-1230，JEOL)下观察化合物的自组装性质。得到的照片见图2。结果表明，化合物在水中均可形成纳米颗粒，直径大部分在30-200nm之间。

实验例4测定异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl(简称化合物1)对U2OS细胞中PAD4的抑制作用

将细胞制成单细胞悬液，种板每孔2mL，贴壁过夜。以60μM/L的浓度给药作用48h，吸去培养基，用PBS洗3次，加入细胞裂解液200μL/孔，冰上混匀裂解30min。吸入1.5mL的EP管中，4℃离心，吸上清，分装后，-20度保存，待用。试剂的配制：标准品：逐级稀释配制S7-S0八个浓度的标准品；洗涤液工作液：用1∶25倍去离子水进行稀释；生物素标记抗体工作液：用1∶100倍生物素标记抗体稀释液进行稀释；辣根过氧化物酶标记亲和素工作液：用1∶100倍辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液进行稀释。试剂盒操作步骤：首先将各种试剂移至室温平衡30min，分别设标准品孔、待测样品孔，重复两空。每孔100μL，覆上板贴，37℃温浴2小时，弃去液体，甩干，不洗涤；每孔加生物素标记抗体工作液100μL，覆上新的板贴，37℃温浴1小时；弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡2min，200μL/孔，甩干；每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μL，覆上板贴，37℃温浴1小时；弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每次浸泡2min，200μL/孔，甩干；依序每孔加底物溶液90μL，37℃避光显色，至前四孔有明显颜色变化，每10分钟观察一次，十分钟后已有变化；依序每孔加终止溶液50μL。反应终止后5min内用酶标仪在450nm波长依序测量每孔的光密度。将测出的O.D.值换算成浓度，做出标准曲线，根据标准曲线计算出PAD4的浓度，以及化合物对PAD4的抑制率。

抑制率＝(C空白-C给药)/C空白*100％

结果显示，异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl对U2OS细胞中PAD4的抑制率为68.7％，作用明显。

表4化合物1对PAD4酶在U2OS细胞中的抑制率

注：抑制率＝(C空白-C给药)/C空白*100％。

Claims (4)

1.下式的异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl。

2.权利要求1的异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl的制备方法，该方法包括：

(1)将L-苯丙氨酸在35％盐酸的催化下与甲醛进行Pictet-Spengler缩合，得到四氢异喹啉-3-羧酸；

(2)将四氢异喹啉-3-羧酸在甲醇溶液中，冰浴下用氯化亚砜催化得到四氢异喹啉-3-羧酸甲酯；

(3)将四氢异喹啉-3-羧酸甲酯在无水的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，用高锰酸钾为氧化剂得到异喹啉-3-羧酸甲酯；

(4)在NaOH存在下，在甲醇中将异喹啉-3-羧酸甲酯皂化为异喹啉-3-羧酸；

(5)在二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三唑(HOBt)存在下，Boc-Arg(NO₂)在无水DMF中与Val-OBzl缩合为Boc-Arg(NO₂)-Val-OBzl；

(6)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中Boc-Arg(NO₂)-Val-OBzl脱去Boc生成Arg(NO₂)-Val-OBzl；

(7)在DCC和HOBt存在下，异喹啉-3-羧酸在无水DMF中与Arg(NO₂)-Val-OBzl缩合得到异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl。

3.权利要求1的异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl的纳米结构。

4.权利要求1的异喹啉-3-甲酰-Arg(N^G-NO₂)-Val-OBzl在制备抗肿瘤疾病药物中的应用。