CN101302199B

CN101302199B - 桂德霉素及其在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN101302199B
Application number: CN2008101115789A
Authority: CN
Inventors: 李良; 娄志贤; 甄永苏
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Current assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority date: 2008-06-06
Filing date: 2008-06-06
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2028-06-06
Also published as: CN101302199A

Abstract

本发明涉及一种格尔德霉素新衍生物桂德霉素，抗癌活性实验显示，桂德霉素具有体外、体内抗肿瘤活性，其体外活性特征是，不仅能够抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、降低肿瘤细胞中Hsp90相关靶点蛋白水平，同时还能抑制肿瘤细胞迁移；其体内活性特征是，与格尔德霉素比较，毒性显著降低，桂德霉素经腹腔注射后，对人乳腺癌MCF-7异种移植裸鼠模型具有明显抑制实体瘤生长的活性，有望开发成为临床有效的抗肿瘤药物。

Description

桂德霉素及其在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域：

本发明涉及一种格尔德霉素衍生物，具体而言，涉及引入肉桂酸的衍生物桂德霉素(Guidemycin)；本发明还涉及所述衍生物的制备工艺以及该衍生物在肿瘤治疗中的应用。

背景技术：

热休克蛋白90(heat shock proteins 90，Hsp90)是一种广泛存在于原核以及真核生物中的高丰度蛋白。Hsp90作为分子伴侣，其主要功能是，保证其被陪伴蛋白分子的正确折叠，使其维持正常的生物学构象继而发挥生物学活性。这些蛋白分子种类繁多，在细胞生长、分化、生存过程中发挥着重要的作用。没有经过Hsp90调控形成正确活性构象的蛋白则被泛素标记，经泛素-蛋白酶体途径被降解。更为重要的是，很多参与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭的蛋白因子，如果要发挥其生物学功能，同样需要Hsp90参与其正确构象的形成。这些蛋白因子主要包括：ERBB2、BCR-ABL、AKT、CDK4、RAF-1、突变P53、甾体激素受体等。抑制Hsp90的功能，即可促使这些因子经泛素-蛋白酶体途径被降解。Hsp90的生物学特点，使其成为近年来备受关注的抗肿瘤新靶点。

格尔德霉素(Geldanamycin)是从链霉菌肉汤培养液中分离得到的苯醌安莎类抗生素。上世纪70年代，在筛选具有抗真菌活性化合物的实验过程中发现格尔德霉素的生物活性。后续的研究发现，格尔德霉素对经v-Src转化的细胞具有明显抗增殖作用，证明格尔德霉素具有抗肿瘤活性。研究者们曾一度认为，格尔德霉素的作用靶点就是v-Src。然而，实验结果表明，格尔德霉素并不能与v-Src特异性结合，说明格尔德霉素的作用靶点不是v-Src。1994年，Neckers等人报道表明，格尔德霉素细胞内特异性结合靶点是Hsp90。格尔德霉素可以与ATP竞争Hsp90N端的结合位点，干扰Hsp90的正常功能，以发挥其药理活性。由于肿瘤细胞的恶性增殖涉及多个细胞内蛋白因子表达水平和基因表型的改变，限制某个单一靶点不能完全抑制肿瘤细胞的增殖。格尔德霉素在抑制Hsp90的同时，可以使Hsp90下游多个被陪伴分子靶点的蛋白水平同时受到抑制，从而更好地发挥格尔德霉素的抗肿瘤作用。但是格尔德霉素本身具有明显的体内毒性，在实验动物可以耐受的剂量下，难以获得明确的抗肿瘤疗效。与此同时，水溶性差也限制了格尔德霉素的临床应用。

肉桂酸(cinnamic acid)是一种广泛存在的天然产物，其人工合成品已被用于食用香料、新鲜水果蔬菜的防腐剂及一些生活用品的香精添加剂。由于在限定范围内无毒性，美国将其列入GRAS(一般公认为是安全的)范围。所以，肉桂酸是一类来源广泛和安全的物质。有报道表明，肉桂酸具有一定的抗实体瘤活性，包括黑色素癌、激素难治性前列腺癌、肺癌、胶质细胞瘤、肝癌、白血病等。它对肿瘤细胞具有抑制其生长增殖、诱导其分化的作用，而且其衍生物亦具有抗肿瘤活性。

由于格尔德霉素本身具有明显的体内毒性，在实验动物可以耐受的剂量下难以获得明确的抗肿瘤疗效并且水溶性差，始终未能进入临床实用阶段。本实验室在进行格尔德霉素抗肿瘤研究的过程中发现，引入肉桂酸基团的格尔德霉素衍生物，体内毒性明显降低，溶解性亦有所改善，而且通过生物学实验证实，所得格尔德霉素衍生物依然保持了明显的体外、体内抗肿瘤活性。

本发明所涉及的格尔德霉素衍生物桂德霉素(Guidemycin)及其抗肿瘤作用，迄今尚未见有国内、外的相关报道。

本发明的目的是，通过引入肉桂酸基团对格尔德霉素进行结构改造，以期获得一个疗效肯定、毒性低微、水溶性好的格尔德霉素新衍生物。

发明内容：

本发明提供了一种格尔德霉素衍生物桂德霉素，其结构如式(1)所示：

本发明所述桂德霉素是一种紫色粉末，分子量为774，分子式为C₄₃H₅₈N₄O₉。桂德霉素为引入肉桂酸基团的格尔德霉素衍生物。所述桂德霉素在5％DMSO水溶液中溶解度为5mg/ml，而在该溶媒中，格尔德霉素基本不溶解。

本发明还提供了桂德霉素的制备方法，其基本工艺步骤是：

将格尔德霉素与己二胺溶于氯仿中，室温下搅拌，反应结束后用水萃取，弃水层，留氯仿层。吹干氯仿溶液，得17-己二胺基格尔德霉素(化合物A)。取化合物A溶于DMF，按摩尔比加入肉桂酸，同时加入与肉桂酸等摩尔比的HATU、DIPEA，室温下搅拌反应，得终产物(1)，并用制备型薄层色谱进行纯化。用ESI-MS和¹HNMR确认结构，用HPLC法检测纯度。

本发明又提供了桂德霉素的抗肿瘤活性研究：

a)MTT和MTS/PMS法检测结果显示，桂德霉素对体外培养肿瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用；

b)桂德霉素对肿瘤细胞的凋亡作用随桂德霉素浓度的增加而升高，并且呈现一定的剂量依赖性；

c)对体外培养肿瘤细胞中Hsp90相关靶点蛋白水平检测结果表明，桂德霉素能够明显降低肿瘤细胞中AKT，RAF-1，EGFR，CDK4和HER-2的蛋白水平；

d)对体外培养肿瘤细胞迁移能力的检测结果表明，经不同剂量的桂德霉素和肉桂酸作用后，受试细胞的迁移率均有不同程度的抑制作用；

e)毒性比较实验结果表明，桂德霉素在三个剂量作用下的毒性，明显低于格尔德霉素的三个剂量组；

f)体内裸鼠异种移植模型肿瘤生长研究结果表明，桂德霉素对三个剂量组的细胞移植瘤生长均有抑制作用，并且高剂量给药显示出更强的抑瘤效果。

本发明还提供了桂德霉素在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的优点在于，合成了一种含肉桂酸基团的格尔德霉素衍生物桂德霉素，其制备技术路线可控，产率较高，经纯化后化合物纯度高，分子量及结构明确。在体外，对肿瘤细胞增殖具有抑制作用，不同剂量下，能够诱导肿瘤细胞产生凋亡，能够抑制肿瘤细胞中Hsp90相关蛋白因子水平，同时能够抑制肿瘤细胞迁移；在体内，对实验动物毒性明显低于格尔德霉素，对人乳腺癌细胞株MCF-7异种移植的裸鼠模型具有明显的治疗作用。该化合物有可能成为针对新靶点 Hsp90的抗肿瘤药物，具有较好的开发价值和应用前景。

附图说明：

图1桂德霉素ESI-MS质谱图

其中：[M+Na⁺]分子离子峰为797.8

图2桂德霉素¹HNMR图谱

图3桂德霉素纯度分析HPLC图谱

其中：桂德霉素纯度为95.06％，保留时间为11.3分钟

图4桂德霉素对人乳腺癌MCF-7细胞株Hsp90相关蛋白水平的影响

其中：10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml为桂德霉素细胞给药浓度，control为对照组；细胞因子包括RAF-1、EGFR、AKT、CDK4；β-actin为对照

图5桂德霉素对人肺癌H460细胞株Hsp90相关蛋白水平的影响

其中：10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml为桂德霉素细胞给药浓度；control为对照组；细胞因子包括RAF-1、EGFR、AKT、HER-2；β-actin为对照图6桂德霉素对人肝癌HepG2细胞株Hsp90相关蛋白水平的影响

其中：10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml为桂德霉素细胞给药浓度；control为对照组；细胞因子包括RAF-1、EGFR、AKT、HER-2；β-actin为对照

图7桂德霉素与格尔德霉素毒性比较

其中：

格尔德霉素1.25mg/Kg；

格尔德霉素2.5mg/Kg；

格尔德霉素2.5mg/Kg；

桂德霉素40mg/Kg；

桂德霉素20mg/Kg；

桂德霉素10mg/Kg；对照组

图8桂德霉素腹腔注射给药后，裸鼠体重变化

其中：对照组；

桂德霉素40mg/Kg；

桂德霉素20mg/Kg；

桂德霉素10mg/Kg

图9桂德霉素对人乳腺癌MCF-7裸鼠异种移植模型的体内抗肿瘤活性

其中：

对照组；

桂德霉素40mg/Kg；

桂德霉素20mg/Kg；桂德霉素10mg/Kg

具体实施方案：

以下所列实施例是为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

<实施例1>：桂德霉素的制备

取格尔德霉素(Sigma产品)与己二胺溶于氯仿中，反应物摩尔比＝1∶10，于室温下搅拌反应3h，反应结束后用水萃取反应溶液，弃水层，留氯仿层。用氮气吹干氯仿溶液，得化合物17-己二胺基格尔德霉素(化合物A)。

取化合物A溶于DMF，按摩尔比＝1∶3加入肉桂酸，同时加入与肉桂酸等摩尔比的DIPEA(N，N-Diisopropylethylamine)和HATU(O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N，N，N′，N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate)，室温下搅拌反应12～24h，得终产物(1)。终产物用制备型薄层色谱进行纯化，展开剂展开条件为氯仿∶丙酮＝2∶1，取R_f＝0.5处的紫色条带。将得到的硅胶粉末填装在色谱柱中，然后用甲醇洗脱。最后将甲醇洗脱液蒸干。所得产物纯化后用ESI-MS和¹HNMR确认结构，用HPLC法检测纯度，MW：774(图1，图2)。

<实施例2>：桂德霉素纯度测定

桂德霉素纯度检测仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪，VWD检测器，色谱柱Kromasil C-18250×4.6mm 5μm(迪马公司)，工作站操作系统Chemstation。

色谱条件：流动相：乙腈-水(0.1％TFA)溶液(A：水，B：乙腈)流速：1mL/min。

梯度洗脱条件：

Time	Solvent A(％)	Solvent B(％)
			0	90	10
10	10	90
			14	10	90
15	90	10
			20	90	10

检测波长：254nm，

色谱柱温度：28℃，

将约1mg的桂德霉素样品溶解于3ml流动相中，得桂德霉素测试液，进样体积5μl，采用面积归一化法，测得桂德霉素的纯度为95.06％(图3)。

<实施例3>：桂德霉素对体外培养肿瘤细胞生长的抑制作用

采用MTT法测定桂德霉素对人乳腺癌细胞MCF-7、人胰腺癌SW1990细胞、人肝癌HepG2细胞、人肺癌H460细胞、人大肠癌HCT116细胞的增殖抑制作用；MTS/PMS法测定桂德霉素对人骨髓瘤U266细胞的增殖抑制作用。MTT和MTS/PMS结果显示，桂德霉素对肿瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用，其IC₅₀ 值分别列于表1中。

表1桂德霉素对不同肿瘤细胞的增殖抑制作用

<实施例4>：桂德霉素诱导肿瘤细胞凋亡的作用

肿瘤细胞用10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml三种不同浓度桂德霉素处理24h、48h后，经过Annexin V-FITC/PI染色，利用流式细胞仪检测，可以得到早期凋亡、中晚期凋亡、坏死及活细胞百分率。实验结果表明，使用三种不同浓度的桂德霉素处理细胞24h和48h后，细胞凋亡比率随桂德霉素浓度的增加而升高。此外，桂德霉素处理细胞48h与处理24h相比，前者细胞早期凋亡率明显升高。桂德霉素处理24h和48h后肿瘤细胞凋亡比率分别列于表2和表3中。

表2桂德霉素处理24h后肿瘤细胞凋亡比率

表3桂德霉素处理48h小时后肿瘤细胞凋亡比率

<实施例5>：桂德霉素对体外培养肿瘤细胞增殖Hsp90相关蛋白因子水平影响采用免疫印迹法(westernblot)测定不同剂量桂德霉素对体外培养人乳腺癌MCF-7细胞、肺癌H460细胞、肝癌HepG2细胞中HER-2、EGFR、AKT、c-RAF、CDK4等靶点的影响。结果表明，桂德霉素在10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml三个剂量均能不同程度地抑制上述与Hsp90相关蛋白因子的水平(图4、图5、图6)。

<实施例6>：桂德霉素对体外培养肿瘤细胞迁移能力的影响

取Ttranswell小室，用1％明胶处理后，以无血清的RPMI1640培养基于培养箱中平衡1小时后，上室分别加入100μl用无血清的RPMI1640培养基培养的人乳腺癌MCF-7细胞、肝癌HepG2细胞、肺癌H460细胞及不同浓度的药物(桂德霉素10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml，肉桂酸3mmol/ml、1mmol/ml)，细胞数为4000/孔。下室加入600μl RPMI1640培养基(含有20％血清用以刺激细胞迁移)和相应浓度的所述药物。同时设置相应对照组，置于CO₂培养箱中培养8h，然后弃去孔中培液，用90％酒精常温固定30分钟，0.1％结晶紫常温染色10分钟，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，最后用10％乙酸100μl/孔抽提10分钟，于600nm处测定OD值。细胞迁移抑制率计算公式为：抑制率(％)＝[(OD值对照组-OD值给药组)/OD值对照组]×100％。结果表明，桂德霉素能够明显抑制人乳腺癌MCF-7细胞、肝癌HepG2细胞、肺癌H460细胞的迁移能力，抑制能力具有一定的剂量依赖性，而且桂德霉素对三个瘤株细胞迁移的抑制作用明显强于肉桂酸。实验结果如表4所示。

表4桂德霉素和肉桂酸对肿瘤细胞迁移能力的影响

注：GUM为桂德霉素，CA为肉桂酸

<实施例7>：桂德霉素与格尔德霉素毒性比较实验

实验用昆明种雄性小鼠(购自医科院动物所)70只，随机分配成7组，每组10只。分别以不同剂量的桂德霉素和格尔德霉素给药，给药周期为10天，给药次数共10次。格尔德霉素分为3个剂量组，其剂量分别为1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg。桂德霉素分为3个剂量组，其剂量分别为10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg。两种药物给药途径均为腹腔注射给药。在第11天统计动物只数。格尔德霉素给药组中，高剂量(5mg/kg)给药组实验动物在第7天全部死亡，中剂量(2.5mg/kg)给药组实验动物在第11天存活1只，低剂量(1.25mg/kg)给药组实验动物在第11天存活3只。桂德霉素给药组中，高、中、低剂量(40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg)给药组实验动物在第11天均无动物死亡。对照组在第11天无动物死亡(图7)。

<实施例8>：桂德霉素对人乳腺癌细胞株MCF-7异种移植裸鼠模型的治疗作用

采用人乳腺癌细胞株MCF-7裸鼠体内移植模型检测桂德霉素在体内的抗肿瘤作用。选择6-8周的雌性BALB/c裸鼠，将MCF-7细胞1000万个消化成单细胞后，用无血清培养基洗一次，用不多于0.4ml的培养液悬浮细胞，用一次性注射器将细胞悬液注射至裸鼠右侧腋窝。待瘤块长至足够大小时，将其在生理盐水中剪成2×2×2mm³大小的小块。用套管针将瘤块移植到裸鼠右侧腋窝，用火棉胶将切口粘住。待瘤块长至大约3×3×3mm³大小时，将裸鼠按瘤块大小分组，使每组动物的瘤块大小平均值接近，同时要考虑动物的体重，尽量使各组动物体重的平均值接近。实验分为4组，每组6只裸鼠，在瘤块接种后的第7天开始给药。将给药组分为3个剂量，分别为40mg/kg、20mg/kg和10mg/kg，桂德霉素通过腹腔注射给药，给药间隔为隔天给药。实验期间，每5天测量1次瘤块的长径a与短径b，并记录动物体重。根据公式V＝ab²/2计算瘤块的体积，绘制肿瘤生长曲线，计算抑瘤率。结果表明：裸鼠经腹腔注射桂德霉素40mg/kg、20mg/kg和10mg/kg的抑瘤率分别为65.8％、45.9％、15.4％。40mg/kg在裸鼠体内对人乳腺癌MCF-7细胞具有明显的抑制作用。动物体重变化如图8所示，肿瘤生长曲线如图9所示。

Claims

1.一种格尔德霉素衍生物桂德霉素，其结构如式(1)所示：

所述桂德霉素为紫色粉末，分子量为774，分子式为C₄₃H₅₈N₄O₉，在5％DMSO水溶液中溶解度为5mg/ml。

2.制备权利要求1所述桂德霉素的方法，其工艺步骤如下：

将格尔德霉素与己二胺溶于氯仿中，室温下搅拌，反应结束后用水萃取，

弃水层，留氯仿层，用氮气吹干氯仿溶液，得17-己二胺基格尔德霉素(A)；

取17-己二胺基格尔德霉素溶于DMF，按摩尔比1∶3加入肉桂酸，同时加入与肉桂酸等摩尔比的氧-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐和N，N-二异丙基乙胺，室温搅拌反应，得终产物(1)，再用制备型薄层色谱进行纯化。

3.权利要求1所述桂德霉素在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.桂德霉素的药物组合物，是以权利要求1所述桂德霉素为有效成分，与药学上可接受的载体所组成。

5.权利要求4所述组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。