CN103044521B

CN103044521B - 天冬氨酸酶靶向激活的阿霉素衍生物、其制备方法和用途

Info

Publication number: CN103044521B
Application number: CN201210573744.3A
Authority: CN
Inventors: 刘辰; 刘源
Original assignee: YAFEI (SHANGHAI) BIO-PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: Shanghai affinity biological pharmaceutical Polytron Technologies Inc
Priority date: 2012-12-26
Filing date: 2012-12-26
Publication date: 2014-11-05
Anticipated expiration: 2032-12-26
Also published as: AU2018203194B2; AU2018203194A1; CN103044521A; AU2015275248B2; AU2015275248A1

Abstract

本发明公开了天冬氨酸酶靶向激活的阿霉素衍生物、其制备方法和用途，该阿霉素衍生物是由化合物A的氨基与化合物B的羧基缩合制得，其结构式为：，化合物A、化合物B的结构为：其中，R3为Leu或没有；R4为Ala,Thr,Val或Ile中的任意一种氨基酸；R5为Ala,Thr,Val或Asn中的任意一种氨基酸；R6为提高药物代谢半衰期的功能基团,选择基团，n=1～20；或基团

Description

天冬氨酸酶靶向激活的阿霉素衍生物、其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤药物化合物，具体地，涉及一种天冬氨酸酶靶向激活及体内代谢高半衰期的阿霉素衍生物制备方法和用途。

背景技术

盐酸阿霉素及表阿霉素是一种目前广谱使用的有效的抗肿瘤剂，用于治疗血液和固体肿瘤，如乳腺癌和卵巢癌，肉瘤，和许多其他实体肿瘤。然而，临床上应用这一蒽环类化合物因为具有严重的毒副作用，而被限制其使用剂量。盐酸阿霉素引发多项不良反应，包括骨髓毒性，胃肠疾病，口腔炎，脱发，外渗，急性和累积性心脏毒性。盐酸阿霉素的主要限制是在每个疗程后，大剂量盐酸阿霉素导致骨髓，骨髓和血液中单核细胞和血小板急剧减少。特别令人关切的是累积性心脏毒性能够引发心肌充血性心力衰竭，是不可逆转的。

因此，需要提供一种能降低盐酸阿霉素、表阿霉素的毒性，并具有高度药效的和低毒性的阿霉素、表阿霉素衍生物作为抗肿瘤剂。

发明内容

本发明目的是提供一种天冬氨酸酶靶向激活及体内代谢高半衰期阿霉素衍生物，此衍生物由于只在肿瘤部位激活而大大降低了药物的毒性，并且药效也有很大的提高。

为了达到上述目的，本发明提供了一种天冬氨酸酶靶向激活的高半衰期阿霉素衍生物，该阿霉素衍生物的结构式为：

，

该阿霉素衍生物是由化合物A的氨基与化合物B的羧基缩合制得，所述化合物A、化合物B的结构如下：

所述化合物B 中， R3 为 Leu 或没有，R3为没有的意思是指化合物B为三肽，即通过Asn的羧基直接与化合物A的氨基共价缩合得到多肽阿霉素, R3 为 Leu的意思是指化合物B为四肽,即Leu- Asn -R4-R5-；

R4为 Ala, Thr, Val或Ile中的任意一种氨基酸；

R5 为 Ala, Thr, Val或Asn中的任意一种氨基酸；

R6为提高药物代谢半衰期的功能基团,选择基团，n=1～20，或基团, 其中， R7为取代或未取代的C1～C20的直链或支链饱和或不饱和脂肪烃以及取代或未取代的C6～C20芳香烃。

所述化合物B (R3- Asn-R4-R6)由被天冬氨酸酶特异性水解的短肽R3- Asn -R4-R5-和提高药物代谢半衰期的功能基团R6构成。其中，天冬氨酸酶能够在Asn氨基酸前面的位置将肽段水解切断,从而释放化合物A-Leu或化合物A。

上述的天冬氨酸酶靶向激活的阿霉素衍生物，其中，所述的化合物A为阿霉素或表阿霉素，阿霉素的结构式为：

；

其中，表阿霉素为阿霉素的同分异构体，该表阿霉素的结构式为：

上述的天冬氨酸酶靶向激活的阿霉素衍生物，其中，所述的R6优选为：

。

本发明还提供了一种上述的天冬氨酸酶靶向激活的阿霉素衍生物的制备方法，该方法包含以下具体步骤：

步骤1，制备三肽或四肽R3-Asn-R4-R5：偶联氨基酸残基，并分离得到所形成的三肽或四肽R3-Asn-R4-R5；

步骤2，制备化合物B：将步骤1得到的R3-Asn-R4-R5与R6-Cl或R6-OH的酰基或羧基反应得到R3-Asn-R4-R5-R6；

步骤3, 将步骤2所得到的化合物 R3-Asn-R4-R5-R6的R3端的羧基与化合物A的氨基共价结合，形成天冬氨酸酶靶向激活的高半衰期阿霉素衍生物。

上述的天冬氨酸酶靶向激活的阿霉素衍生物的制备方法，其中，所述化合物B中， R3 为 Leu 或没有，R4为 Ala, Thr, Val或Ile中的任意一种氨基酸；R5 为 Ala, Thr, Val或Asn中的任意一种氨基酸；R6为提高药物代谢半衰期的功能基团,选择基团，n=1～20，或基团, 其中，R7为取代或未取代的C1～C20的直链或支链饱和或不饱和脂肪烃以及取代或未取代的C6～C20芳香烃。

上述的天冬氨酸酶靶向激活的阿霉素衍生物的制备方法，其中，所述的R6选择：

。

本发明还提供了一种上述的天冬氨酸酶靶向激活的阿霉素衍生物在用于制备抗肿瘤药物中的应用。

为了降低肿瘤药物对人体正常细胞和组织的毒性，人们一直致力于提高肿瘤治疗药物和技术的生物特异性和选择性。近年来，在肿瘤分子生物学及其他基础学科的发展的推动下，肿瘤靶向治疗药物的研究和开发在多方面取得很大进展。分子靶点是恶性肿瘤细胞所普遍表达的天冬氨酸酶（Legumain）, 是肿瘤细胞表面微环境中大量表达的一种天冬酰胺基内肽蛋白酶，存在于绝大多数的固体肿瘤（Solid tumors）及肿瘤微环境中，在免疫浸润性巨噬细胞和新生血管的内皮细胞中也有大量分布。该酶的过量表达与肿瘤细胞对正常组织细胞的侵蚀（Invasion）、肿瘤的转移扩散（Metastasis）以及肿瘤程序化细胞凋亡具有高度相关性。

由于肿瘤生长增强血管通透性，天冬氨酸酶Legumain在肿瘤微环境中大量表达，同时肿瘤细胞表面局部低pH值的酸性微环境。经改造后的肿瘤微环境靶向激活的多肽盐酸阿霉素，作为Legumain的特异性底物，只在肿瘤微环境中才被有效分解激活，释放其细胞毒性。人体的其他正常细胞虽然也有少量天冬氨酸酶表达，但正常细胞表面微环境中不具备天冬氨酸酶活性，靶向激活的多肽盐酸阿霉素在正常细胞表面不能被水解激活，因而也无法对正常细胞发挥细胞毒性作用。因此靶向激活只对肿瘤细胞发挥细胞毒性作用。

同时,由于天冬氨酸酶水解肽链后可以完全释放药物,我们可以在肽链另一端增加能够提高药物作用效率和血液中半衰期的功能基团,经过实验筛选测定, 添加的基团并不影响的药物释放和药物激活，并提高了抗肿瘤效率。

添加的功能基团是能够与白蛋白结合的R6基团, R6基团与血清白蛋白结合后能够显著提高药物代谢半衰期的功能基团, R6基团包括，n=1～20，或基团, 其中，R7为取代或未取代的C1～C20的直链或支链饱和或不饱和脂肪烃以及取代或未取代的C6～C20芳香烃。R6优选6-马来酰亚胺基己酸基团 ( ε- maleimidocaproic, EMC)和反式丁烯二酸单脂（EFA）基团, 与血清白蛋白结合后增加了靶向药物的溶解性和体内代谢的半衰期。因此，本发明所合成的冬氨酸酶靶向激活阿霉素衍生物与阿霉素相比,同时具有肿瘤特异靶向性和体内代谢的高半衰期的特性, 具有高效安全的抗肿瘤作用。

综上所述，本发明提供的天冬氨酸酶靶向激活的高半衰期阿霉素衍生物，其中，天冬氨酸酶能在该药物的Asn氨基酸前面的位置将肽段水解切断,从而释放化合物A-Leu或化合物A；从而，使得本发明的阿霉素具有抗肿瘤靶向性和高半衰期的特性，相对于阿霉素及表阿霉素，药效有很大的提高，且药物的毒性大大降低，具有非常好的应用前景。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步地说明。

本发明提供一种天冬氨酸酶靶向肿瘤微环境激活的多肽阿霉素的制备方法,包括如下步骤：首先，使用已知的化学、生物学或重组技术偶联氨基酸残基，并分离得到所形成的多肽R3- Asn -R4-R5；其次，将形成的多肽的氮段通过已知的化学或生物学方法与能与白蛋白结合的R6的羧基或酰基形成共价结合物R3-Asn-R4-R5-R6；然后将R3-Asn-R4-R5-R6的R3的羧基通过已知的化学或生物学方法与阿霉素或其盐或阿霉素衍生物及其盐（即化合物A）的氨基共价结合，从而形成带有短肽以及能与血清白蛋白相结合的基团的阿霉素类似物，化合物A—R3-Asn-R4-R5-R6。反应路线如下：

其中，缩合剂包括用于羧酸与氨基缩合反应成酰胺的已知的化学试剂单独使用或结合使用，如1-羟基苯并三氮唑（HOBT）、N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐）（EDCI）、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯（TATU）、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯（TBTU）、N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑（HOAT）、卡特缩合剂（BOP）、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷（PyBOP）等。

其中，碱包括无机碱和非质子性的有机碱，无机碱如碳酸钠、碳酸钾、碳酸锂、碳酸钙、碳酸镁、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、碳酸氢镁等，非质子性有机碱包括三乙胺、N,N-二异丙基乙基胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶、N-甲基吗啉等。

极性非质子性溶剂包括N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙腈、二氧六环、甲基叔丁基醚、乙二醇二甲醚、二甲亚砜、六甲基磷酰胺等。

实施例1：靶向肿瘤微环境的激活的多肽阿霉素S1、S2的合成

S1、S2的合成路线如下：

。

1) Cbz-L-Ala-L-Ala-OMe（I）的合成

将N-苄氧羰基-L-丙氨酸（100g, 0.45mol）溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺（3L）中，搅拌下加入1-羟基苯并三氮唑（72.6g, 0.54mol）和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（103.3g, 0.54mol），搅拌反应1小时后，冰浴至0℃下滴加L-丙氨酸甲酯（46.2g, 0.45mol）和N,N-二异丙基乙基胺（173.8g, 1.34mol）的N,N-二甲基甲酰胺（1L）溶液，滴加完毕后在室温下搅拌10小时，减压蒸除溶剂，粗产品溶于二氯甲烷（2L），依次用饱和氯化铵溶液、水和饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后粗产物经乙酸乙酯/石油醚重结晶后得到纯品为白色固体I，即Cbz-L-Ala-L-Ala-OMe（101g，收率：73.1%）。

2) Cbz-L-Ala-L-Ala-OH（II）的合成

将Cbz-L-Ala-L-Ala-OMe（100g, 0.34mol）溶于四氢呋喃（2L）和水（1L）的混合溶液中，冷却至0℃下滴加1摩尔/升氢氧化锂溶液（400mL），搅拌反应10小时，滴加浓盐酸中和至PH<6，减压蒸除四氢呋喃，剩余水相用二氯甲烷（1L × 3）萃取，有机相经无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到白色固体II，即Cbz-Ala-Ala-OH（88g，收率：92.2%）。

3) Fmoc-L-Asn(Trt)-L-Leu-O^tBu（III）的合成

在三颈瓶中将L-亮氨酸叔丁酯（22.4g, 0.1mol），N-Fmoc-N’-三苯甲基天冬酰胺（59.6g, 0.1mol）溶于N,N-二甲基甲酰胺（1000mL）中，搅拌下加入1-羟基苯并三氮唑（14.85g, 0.11mol）和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（23g, 0..12mol），冰浴至0℃下后，加入N,N-二异丙基乙基胺（25.8g, 0.2mol），搅拌10小时后，减压蒸出溶剂，粗产品溶于氯仿（1000ml），依次用饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液及水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后减压蒸出溶剂得到的粗产品经重结晶（按体积比计，二氯甲烷：乙酸乙酯=1:1）纯化后得到白色固体III，即Fmoc-L-Asn(Trt)-L-Leu-O^tBu（42.4g, 收率：55.4%）。

4) L-Asn(Trt)-L-Leu-O^tBu（IV）的合成

将Fmoc-L-Asn(Trt)-L-Leu-O^tBu（7.65g, 0.01mol）溶于二氯甲烷（100mL）和N,N-二甲基甲酰胺（100mL）的混合溶液中，加入哌啶（40ml），室温下搅拌5小时后，减压蒸出溶剂，然后置于真空干燥箱高真空干燥除去少量的哌啶，得到IV，即L-Asn(Trt)-L-Leu-O^tBu，为淡黄色固体，未经纯化直接用于下一步。

5) Cbz-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-O^tBu（V）的合成

将上步所得L-Asn(Trt)-L-Leu-O^tBu粗产品溶于N,N-二甲基甲酰胺（200mL）中，加入Cbz-L-Ala-L-Ala-OH（2.94g, 0.012mol）、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU）（6.07g, 0.016mol），冰浴至0℃下后加入N,N-二异丙基乙基胺（2.6g, 0.02mol），室温下搅拌过夜，减压蒸除溶剂，残余物溶于氯仿(100ml)，依次用饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后，蒸除溶剂，所得粗产品经硅胶柱层析（按体积比计，二氯甲烷：甲醇=50:1—20:1）后得到化合物V，即Cbz-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-O^tBu为白色固体（3.1g, 二步总收率：37.8%）。

6) L-Ala-LAla-L-Asn(Trt)-Leu-O^tBu（VI）的合成

将Cbz-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-O^tBu（10g, 12.2mmol）溶于甲醇（400mL）中，加入10%钯炭（1g），通入氢气，常温常压下搅拌反应4小时，过滤除去钯炭，用甲醇洗涤，合并滤液和洗液，减压蒸除溶剂得到VI，即L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-O^tBu，为白色固体（7.6g, 收率：91%）。

7) EMC-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-O^tBu（VII）的合成

将6-马来酰亚胺己酸（1.02g, 4.82mmol）溶于N,N-二甲基甲酰胺（60mL）中，加入苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU）（2.49g, 6.57mmol），室温下搅拌半小时，冰浴至0℃下后滴加L-Ala-L-Ala-L-Asn-L-Leu-O^tBu（3g, 4.38mmol）和N,N-二异丙基乙基胺（1.13g, 8.76mmol）的N,N-二甲基甲酰胺（60mL），完毕后升至室温下搅拌10小时，减压蒸除溶剂，残余物溶于二氯甲烷（200mL），依次用饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后，蒸除溶剂，所得粗产品经硅胶柱层析（按体积比计，二氯甲烷：甲醇=50:1~20:1）后得到化合物VII，EMC-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-O^tBu为淡黄色固体（2.52g, 收率：65.46%）。

8) EFA-L-Ala-L-Ala-L-Asn-L-Leu- O^tBu（VIII）的合成

将富马酸单乙酯（0.69g, 4.82mmol）溶于N,N-二甲基甲酰胺（60mL）中，加入苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU）（2.49g, 6.57mmol），室温下搅拌半小时，冰浴至0℃下后滴加L-Ala-L-Ala-L-Asn-L-Leu-O^tBu（3g, 4.38mmol）和N,N-二异丙基乙基胺（1.13g, 8.76mmol）的N,N-二甲基甲酰胺（60mL），完毕后升至室温下搅拌10小时，减压蒸除溶剂，残余物溶于二氯甲烷（200mL），依次用饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后蒸除溶剂，所得粗产品经硅胶柱层析（按体积比计，二氯甲烷：甲醇=50:1~20:1）后得到化合物VIII，EFA-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-O^tBu为淡黄色固体（2.10g, 收率：59.15%）。

9) EMC-L-Ala-L-Ala-L-Asn-L-Leu-OH（IX）的合成

将化合物EMC-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-O^tBu（1g, 1.68mmol）溶于二氯甲烷（50mL）中，加入三氟乙酸（10mL），室温下搅拌10小时，反应液经水洗后分液后，有机相无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，高真空蒸除残余的三氟醋酸，得到白色固体IX, 即

EMC-L-Ala-L-Ala-L-Asn-L-Leu-OH（0.60g, 收率：90.9%）。

10) EFA-L-Ala-L-Ala-L-Asn-L-Leu-OH（X）的合成

将化合物EFA-L-Ala-L-Ala-L-Asn(Trt)-L-Leu-O^tBu（1g, 1.23mmol）溶于二氯甲烷（50mL）中，加入三氟乙酸（10mL），室温下搅拌10小时，反应液经水洗后分液后，有机相无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，高真空蒸除残余的三氟醋酸，得到白色固体X, 即EFA-L-Ala-L-Ala-L-Asn-L-Leu-OH（0.51g, 收率：80.9%）。

11) EMC-AANL-Doxorubicin（S1）的合成

将EMC-L-Ala-L-Ala-L-Asn-L-Leu-OH（0.5g，0.85mmol）和N-甲基吗啉（0.18g, 1.78mmol）用干燥的N,N-二甲基甲酰胺（20mL）溶解，冷却至0℃下加入苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU）（0.49g, 1.28mmol），搅拌半小时，加入多柔比星（即阿霉素）盐酸盐（0.45g, 0.78mmol），避光下反应温度缓慢升高至室温下搅拌5小时，将反应液倒入200毫升0.1%醋酸水溶液中，加入二氯甲烷萃取，合并有机相，水洗，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂得到橙红色粗产物，经硅胶柱层析（二氯甲烷/甲醇），纯化得到目标产物S1，即EMC-AANL-DOX，为红色固体粉末（0.45g, 收率：52.24%）。

12) EFA-AANL-Doxorubicin（S2）的合成

将EFA-L-Ala-L-Ala-L-Asn-L-Leu-OH（0.44g，0.85mmol）和N-甲基吗啉（0.18g, 1.78mmol）用干燥的N,N-二甲基甲酰胺（20mL）溶解，冷却至0℃下加入苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU）（0.49g, 1.28mmol），搅拌半小时，加入多柔比星盐酸盐（0.45g, 0.78mmol）,避光下反应温度缓慢升高至室温下搅拌5小时，将反应液倒入200毫升0.1%醋酸水溶液中，加入二氯甲烷萃取，合并有机相，水洗，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂得到橙红色粗产物，经硅胶柱层析（二氯甲烷/甲醇）纯化得到目标产物S2，即EFA-AANL-DOX为红色固体粉末（0.40g, 收率：49.43%）。

其中，ε-maleimidocaproic acid (EMC)的合成参考文献Synthesis, 2008(8), 1316-1318，反应路线如下：

。

实施例2 获得注射剂

合成的S1和S2经过真空干燥，获得红色粉末，通过气体灭菌发无菌处理，在无菌室进行分装。在动物实验前，在无菌室中用含有50%酒精的注射用水溶解,再用注射用水稀释到所需浓度。

实施例3 S1和S2含量测定的方法及含量范围。

S1 和S2样品分析型HPLC（安捷伦1100 (Agilent 1100 series) ，C8 柱 5 μm, 4.6 mm ID x 250 mm, 流动相为 0 ~ 95%乙腈(ACN）纯度在95%-99%)。

以下通过药物耐受试验和药效试验证明本发明的有益效果。

试验例1 受试药静脉用药最大耐受剂量（MTD）的测定。

试验目的：通过测定小鼠静脉用药MTD 实验，了解本新药制剂的急性毒性。

治疗药物：S1 和S2注射液，试验时用生理盐水稀释到相应浓度。

动物：一级巴比赛(BALB/C)小鼠，体重19-21g, 全为雌性。

方法和结果：受试 BALB/C小鼠36只，体重19-21g, 全为雌性，按体重随机分为6组，每组6只。如表1所示，按0mg/kg, 50mg/kg, 100 mg/kg，150mg/kg, 200 mg/kg，300mg/kg一次性腹腔注射S1及S2，并且，进行生理盐水组、盐酸阿霉素组注射的对照试验，给药体积0.2ml。连续观察17天，每日观察动物是否出现立毛树立、糟乱无光泽、昏睡、弯腰驼背、过激反应等，记录体重和死亡情况。在第3、5、14天采血样进行全血球计数，在第14天解剖动物采取心脏、肝脏、肾脏、肺、脾脏、胰腺HE染色观察。

表1：受试小鼠分别接受不同剂量的S1和S2注射液与生理盐水、盐酸阿霉素注射液的死亡率结果对照

组别		剂量（mg/kg）	动物（只）	死亡数（只）	死亡率（%）
						1	生理盐水	0 mg/kg	6	0	0
2	S1	50 mg/kg	6	0	0
						3	S1	100 mg/kg	6	0	0
4	S1	150mg/kg	6	0	0
						5	S1	200mg/kg	6	2	33.3%
6	S1	300mg/kg	6	5	100%
						7	S2	50 mg/kg	6	0	0
8	S2	100 mg/kg	6	0	0
						9	S2	150mg/kg	6	0	0
10	S2	200mg/kg	6	2	33.3%
						11	S2	300mg/kg	6	3	50%
17	盐酸阿霉素	10 mg/kg	6	6	100%

结果与讨论：注射S1、S2注射液的小鼠组，在150mg/kg剂量时，动物没有出现立毛树立、糟乱无光泽、昏睡、弯腰驼背、过激反应和死亡情况，如表1所示S1,S2注射液的MTD值远大于100mmol/kg，远大于盐酸阿霉素的MTD值（4～8mmol/kg），受试药静脉用药最大耐受剂量是药物毒性的重要参考指数，表明血清白蛋白结合的盐酸阿霉素衍生物的毒性比盐酸阿霉素显著降低。

试验例2 S1和 S2药物在裸鼠(nude mice)中的药效研究

试验目的：通过小鼠的肿瘤治疗模型，了解S1和 S2药物的抗肿瘤药效。

治疗药物：S1和 S2 注射液和盐酸阿霉素注射液，试验时用生理盐水稀释到相应浓度。

方法和结果：1．动物：裸鼠，6-8周龄，全为雌性。

2．产生肿瘤模型

1）MDA-MB231 cells（细胞）从美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10%胎牛血清达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(简称，DMEM培养液)在37℃，5%的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。 2）肿瘤产生，将10⁶MDA-MB231细胞皮下注射到裸鼠(nude mice)小鼠背部，待肿瘤直径长至0.3～0.4cm左右时随机分组，开始治疗。

3）治疗过程

根据S1和 S2临床用药使用腹腔注射，S1药物治疗组30mg/kg 剂量(<1/2 MTD剂量），S2药物治疗组30mg/kg剂量(<1/2 MTD剂量）, 盐酸阿霉素治疗组4 mg/kg (>1/2 MTD剂量）和对照组（生理盐水）每周两次给药，共三周。

4）分组与结果测量如下表2所示

表2：S1和 S2药物、盐酸阿霉素及对照组对裸鼠治疗肿瘤的效果

5）结果与讨论：如表2所示，与盐酸阿霉素对照组比较，在S1和 S2组腹腔给药后，在裸鼠的肿瘤生长抑制效果被大大提高，S2并且导致了肿瘤缩小和清除，说明此类药物具有良好的抑制肿瘤生长的药效。

试验例3 S1和 S2药品在BALB/C小鼠的肿瘤转移模型中的药效研究

试验目的：通过BALB/C小鼠的肿瘤转移治疗模型，了解S1和 S2药物的抗肿瘤药效。

治疗药物：S1和 S2注射液和盐酸阿霉素注射液，试验时用生理盐水稀释到相应浓度。

1. 动物：BALB/C小鼠,6-8周龄，全为雌性。

2．产生肿瘤模型

1）4T1 cells从ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10%胎牛血清DMEM培养液在37℃，5%的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。 2）、肿瘤转移的产生，将10⁶T1 cells细胞皮下注射到BALB/C小鼠背部，待肿瘤长至1.5cm左右时随机分组，手术去除皮下肿瘤，并开始用药物治疗，在第27天时麻醉后处死小鼠，取出整个肺，放入布安溶液 (Bouin’s solution)中染色，在解剖显微镜下统计转移到肺部的肿瘤数量。

3）治疗过程：根据S1和S2临床用药使用腹腔注射，S1药物治疗组10mmol/kg (<1/10 MTD剂量）， S2药物治疗组10mmol/kg (<1/10 MTD剂量），盐酸阿霉素治疗组3mmol/kg (>1/2 MTD剂量）和对照组（生理盐水）每天给药，共8天。

4）分组与结果测量如表3所示

表3：S1和 S2药物、盐酸阿霉素及对照组对于裸鼠肿瘤转移抑制的效果

组别	动物	转移肿瘤数量	抑制转移率
				S 1组	10	12±4	91.6%
S 2组	10	10±7	93%
				盐酸阿霉素对照组	10	98±18	31.4%
模型对照组	10	143.0±29	—

5）结果与讨论：如表3所示，与盐酸阿霉素对照组比较，在S1和S2组腹腔给药后，在BALB/C小鼠的肿瘤转移抑制效果被大大提高，说明此类药物具有良好的抗肿瘤转移药效。

综上所述，本发明合成了天冬氨酸酶激活并能与血清白蛋白结合的盐酸阿霉素衍生物，并通过毒性和药效试验证明化合物比盐酸阿霉素具有更低的毒性的，同时还具有显著的抗肿瘤生长和转移的活性。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims

1.一种天冬氨酸酶靶向激活的阿霉素衍生物，其特征在于，该阿霉素衍生物的结构式为：

，

所述化合物B中， R3 为 Leu氨基酸；

R4为 Ala氨基酸；

R5 为 Ala氨基酸；

R6选择基团，或基团 , 其中，R7为取代或未取代的C1～C20的直链或支链饱和或不饱和脂肪烃以及取代或未取代的C6～C20芳香烃。

2.如权利要求1所述的天冬氨酸酶靶向激活的阿霉素衍生物，其特征在于，所述的R6选择：

。

3.如权利要求1所述的天冬氨酸酶靶向激活的阿霉素衍生物，其特征在于，所述的阿霉素衍生物为S1，其结构式为：

。

4.如权利要求2所述的天冬氨酸酶靶向激活的阿霉素衍生物，其特征在于，所述的阿霉素衍生物为S2，其结构式为：

。

5.一种根据权利要求1所述的天冬氨酸酶靶向激活的阿霉素衍生物的制备方法，其特征在于，该方法包含以下具体步骤：

步骤3, 将步骤2所得到的化合物 R3-Asn-R4-R5-R6的R3端的羧基与化合物A的氨基共价结合，形成天冬氨酸酶靶向激活的阿霉素衍生物；

所述化合物B中， R3 为 Leu，R4为 Ala氨基酸；R5 为 Ala氨基酸；R6为提高药物代谢半衰期的功能基团，选择基团

，或基团 , R7为取代或未取代的C1～C20的直链或支链饱和或不饱和脂肪烃以及取代或未取代的C6～C20芳香烃。

6.如权利要求5所述的天冬氨酸酶靶向激活的阿霉素衍生物的制备方法，其特征在于，所述的R6选择：

。

7.一种根据权利要求1所述的天冬氨酸酶靶向激活的阿霉素衍生物在用于制备抗肿瘤药物中的应用。