CN104448295B - 聚乙二醇‑多爪寡肽键合的雷帕霉素衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种式I的化合物及其药学上可接受的盐，其制备方法以及含有所述式I的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。在本发明的化合物中，聚乙二醇分子的每个端基通过多爪寡肽，可键合多个雷帕霉素分子，提高了药物负载率。所述化合物可用来诱导免疫抑制和治疗移植排斥、自免疫性疾病、实体肿瘤、真菌感染以及心脑血管疾病。

Description

聚乙二醇-多爪寡肽键合的雷帕霉素衍生物
技术领域
本发明涉及聚乙二醇-多爪寡肽键合的雷帕霉素衍生物，其制备方法以及含有它们的药物组合物。本发明还涉及应用该类化合物来诱导免疫抑制和治疗移植排斥、移植物对宿主的疾病、自免疫性疾病、炎症、成人T-细胞白血病/淋巴瘤、实体肿瘤、真菌感染、心血管疾病、脑血管疾病、末梢血管疾病或血管过度增殖疾病。
背景技术
雷帕霉素(又名“西罗莫司”)是1975年在智利复活节岛的土壤中发现的由吸水链霉菌产生的一种三烯大环内酯类抗生素。雷帕霉素具有抗真菌活性，特别是对白色念珠菌，在体内和体外均有活性。雷帕霉素具有显著的免疫抑制活性，能够预防过敏性脑脊髓炎、多发性硬化症和反应性关节炎。雷帕霉素也可用来预防和治疗全身性红斑狼疮、肺炎、胰岛素依赖型糖尿病、皮肤疾病(如牛皮癣)、肠道紊乱、平滑肌细胞增殖以及内膜增厚而导致的血管损伤、成人T-细胞白血病/淋巴瘤、眼炎、恶性癌、心脏炎性疾病和贫血等。雷帕霉素由美国惠氏公司开发，1999年获美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市，用于肾脏移植病人术后的免疫治疗。
雷帕霉素(Rapamycin)是最早发现的mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白，mammaliantarget of rapamycin)抑制剂(IC50＝1.7μmol/L)，人体半衰期40～50h。1999年FDA批准雷帕霉素作为免疫抑剂应用于肾移植。由于它具有抗冠状动脉再狭窄的作用，2003年雷帕霉素被FDA批准用于药物洗脱支架。在许多肿瘤组织和动物模型中，如白血病、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、小细胞肺癌、肝癌等，雷帕霉素均能浓度依赖性的抑制肿瘤细胞生长。
虽然雷帕霉素在临床中表现出良好的前景，但仍然存在生物利用度低(＜15％),水溶性差等缺点，人们在20世纪90年代后期又继续研发了一些高效、特异性的雷帕霉素衍生物，如依维莫司(2)，坦西莫司(3)，ridaforolimus(4)等。
依维莫司(Everolimus,RAD001，2)即42-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素，是新型的口服mTOR抑制剂，其水溶性优于雷帕霉素，但实验表明依维莫司的口服生物利用度并不佳(约15％～30％)，人体半衰期16～19h。将雷帕霉素的42位-OH用2,2-双羟甲基丙酸进行酯化后得到坦西莫司(Temsirolimus,CCI-779，3)，坦西莫司适于静脉给药，在进入体内水解成雷帕霉素，人体半衰期13～15h。
Ridaforolimus(deforolimus，AP23573，MK-8668，4)是由CADD设计得到的半合成衍生物，具有抑制mTOR活性。
除了已经上市和临床研究阶段的雷帕霉素衍生物外，根据前药原理，利用小分子基团对雷帕霉素的结构修饰相关研究有很多，如US6342507，US20050026868，US20050101624，US5432183等，在雷帕霉素及其衍生物中引入羟基，烷基、氨基、磷酸等基团，达到增加水溶性或是增强稳定性的目的。
聚乙二醇(PEG)是一种线型或带叉链的中性聚合物，具有各种大小的分子量并且可溶于水和大多数有机溶剂。当分子量小于1000时是粘稠的无色液体；较高分子量的PEG是蜡状的白色固体，固体的熔点随分子量增大而升高，达到67℃后就不再增加。PEG在体内无毒，是获得FDA认可的并被中、英、美等多个国家药典收载的药用高分子材料。据报道有机分子的聚乙二醇化可提高有机分子的水溶性，并赋予其它有益的性能，如改善血浆半衰期、改善生物分布和降低毒性等。
在美国专利US 5,955,457、5,780,462、6,432,973、6,331,547以及国际专利WO2007/103348中描述了雷帕霉素及其衍生物的PEG结合物的制备。用PEG或其巯基衍生物与修饰后的雷帕霉素或其衍生物链接，形成水溶性的雷帕霉素衍生物。这种修饰方法虽然改善了雷帕霉素的水溶性，但由于聚乙二醇分子的每个端基仅结合一个药物分子，药物分子的负载率过低，给药物制剂造成了巨大压力。
中国专利CN 02106691、CN 03801105、CN 200410048016和CN200610150011提供了一种用聚乙二醇通过多爪寡肽与药物分子连接来制备前药衍生物的方法，其中提及的药物有萜类的化合物紫杉醇，生物碱类化合物喜树碱等。由于多爪寡肽分子含有两个以上的羧基，可以和两个以上的药物分子结合，因此该方法可大大提高聚乙二醇分子对药物分子的负载率。但由于雷帕霉素的分子结构较大，且分子结构中含有两个活性羟基，在与聚乙二醇多爪寡肽进行酯化反应时，容易反应不完全，而且还可能出现一个雷帕霉素连接多个聚乙二醇分子的现象，从而造成负载率降低和反应产物的复杂化，同时上述文献中PEG分子与寡肽之间的连接基团均没有公开-CO-CH2-的连接基团。
本发明对前期的实验方法进行了改进：(1)先用具有羧基和潜在氨基的小分子片段与雷帕霉素进行酯化连接，反应产物属于小分子化合物，可以通过柱分离等常规化学方法进行纯化；(2)然后通过还原、水解等方法将潜在氨基转化成氨基得到氨基酸雷帕霉素酯；(3)最后再将氨基酸雷帕霉素酯与聚乙二醇-多爪寡肽进行酰胺化连接，由于氨基的亲核性比醇羟基强得多，因此酰胺化反应比酯化反应更容易反应且进行的更完全，而且雷帕霉素中的其余羟基由于活性比氨基弱很多，基本不参与反应。用改进的方法既可提高聚乙二醇的负载率，又可获得结构较为单一的雷帕霉素衍生物。
发明内容
本发明的一个方面提供一种式I的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
MI为大环内酯类免疫抑制剂的残基，具有式II的结构：
其中，R1选自H、C1-C10的直链或支链烷基、C2-C10的直链或支链烯基、C6-C12的取代或未取代芳基和C7-C12的取代或未取代芳烷基；
R2选自H、羟基和C1-C10的直链或支链烷氧基；
R3选自H、C1-C10的直链或支链烷基、C2-C10的直链或支链烯基、C6-C12的取代或未取代芳基、C7-C12的取代或未取代芳烷基和-C(O)R31，其中R31选自H、C1-C10的直链或支链烷基、C2-C10的直链或支链烯基、C6-C12的取代或未取代芳基和C7-C12的取代或未取代芳烷基；
R4选自H、羟基和C1-C10的直链或支链烷氧基；
(A1)m代表多羧基寡肽，其中A1代表形成所述多羧基寡肽的相同或不同的多羧基氨基酸的残基，所述多羧基氨基酸含有两个或两个以上的羧基和一个氨基，且其中一个羧基和所述氨基连在同一个碳原子上；m代表所述多羧基寡肽的聚合度，为2-12的整数；
A2具有如下式的结构，所述结构中的羧基连接MI，氨基连接所述多羧基寡肽：
其中，R5和R6相同或不同，选自H、取代或未取代的C1-C6的烷基；a为1-5的整数；
PEG代表具有直链结构、Y型结构或多分支结构的聚乙二醇，所述聚乙二醇的数均分子量为300-60,000道尔顿；
X具有如下式的结构：
其中，b为0-6的整数。
在一些实施方案中，所述的R1优选为H、C1-C6的直链烷基，更优选为H、甲基、乙基。
在一些实施方案中，所述的R2优选为H、羟基和C1-C6的直链烷氧基，更优选为-OCH3、-OCH2CH3、-O(CH2)2CH3。
在一些实施方案中，所述的R3优选为H、C1-C6的直链烷基、C2-C10的直链烯基、苯基、卤代苯基、苯甲基、苯乙基、-C(O)R31，其中R31选自H、C1-C6的直链烷基、C2-C10的直链烯基、苯基、卤代苯基、苯甲基、苯乙基，更优选为H、-OCH3、-OCH2CH3、-O(CH2)2CH3。
在一些实施方案中，所述的R4优选为H、羟基和C1-C6的直链烷氧基，更优选为-OCH3、-OCH2CH3、-O(CH2)2CH3。
在一些实施方案中，所述多羧基氨基酸具有如下式的结构：
其中，R7和R8相同或不同，选自H、甲基、乙基、正丙基和异丙基；
c为1-10的整数。
在一些实施方案中，R7和R8均为H。
在一些实施方案中，c为2，所述化合物具有式III的结构
在一些实施方案中，m为2或3。
在一些实施方案中，a为1。
在一些实施方案中，所述A2为选自由甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸组成的组的氨基酸的残基。
在一些实施方案中，所述A2为甘氨酸的残基，即R5和R6为H，a为1。
在一些实施方案中，b为1。
在一些实施方案中，所述PEG具有如下式的直链结构：
其中n为大于零的整数，且所述PEG的数均分子量为300-60,000道尔顿。
在一些实施方案中，PEG的数均分子量为10,000-20,000道尔顿，更优选的PEG的数均分子量为20,000道尔顿。
在一些实施方案中，所述PEG具有如下式的Y型结构：
其中n为大于零的整数，且所述PEG的数均分子量为300-60,000道尔顿。
在一些实施方案中，PEG的数均分子量为10,000-40,000道尔顿，更优选的PEG的数均分子量为20,000-40,000道尔顿。
在一些实施方案中，所述PEG具有如下式的多分支结构：
其中n为大于零的整数；
R是核心分子，选自以下多羟基化合物分子的残基组成的组：季戊四醇、寡聚季戊四醇、甘油、多聚甘油、山梨醇、异丁三醇、甲基葡萄糖苷和蔗糖；
在一些实施方案中，所述的R选自或者
z是分支数，为3-8的整数；
所述PEG的数均分子量为300-60,000道尔顿。
在一些实施方案中，z为4。
在一些实施方案中，所述聚乙二醇的数均分子量为5,000-50,000道尔顿。
在一些实施方案中，PEG的数均分子量为10,000-40,000道尔顿，更优选的PEG的数均分子量为20,000-40,000道尔顿。
在一些实施方案中，R1为甲基，R2为甲氧基，R3为H，R4为甲氧基，所述化合物为雷帕霉素-42酯类衍生物。
在一些实施方案中，本发明的化合物为：
其中n为200-1,000的整数，优选为200-500的整数。
在一些实施方案中，本发明的化合物为：
其中n为100-500的整数，优选为100-250的整数。
本发明的另一方面提供一种制备式I的化合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)化合物IV
与化合物V
发生酯化反应，得到化合物VI
(2)所述化合物VI进行还原反应，得到化合物VII
(3)所述化合物VII与聚乙二醇-寡肽VIII
发生酰胺化反应，得到式I的化合物。
在一些实施方案中，所述的化合物V由与NaN3反应得到。
在一些实施方案中，所述步骤(1)和(3)中的所述酯化反应和所述酰胺化反应在缩合剂的存在下进行，所述缩合剂选自由N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、1-羟基苯并三氮唑、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)、双(2-氧代-3-噁唑烷基)次磷酰氯、1H-苯并三唑-1-氧基三(1-吡咯烷基)膦六氟磷酸盐、1,3-二环己基碳二亚胺、N,N'-羰基二咪唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺、N,N'-二异丙基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶及其组合组成的组。
在一些实施方案中，所述步骤(2)中的所述还原反应在还原试剂的存在下进行，所述还原试剂选自由三苯基膦、氢气、硼氢化钠、硼氢化锌、氢化铝锂、二氯二甲基巯基硼烷、碱土金属、金属铟、金属钐、金属锡、金属锌、肼、金属铁、二价铁盐、三碘化铝以及四硫代钼酸盐组成的组。
本发明的另一方面提供本发明所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗或抑制哺乳动物中的移植排斥作用或移植物对宿主造成的疾病、实体肿瘤、真菌感染、类风湿性关节炎、多发性硬化症、心瓣再狭窄或肺炎的药物中的应用。
本发明的另一方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如本发明所述的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体或赋形剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、散剂、栓剂、注射剂、溶液剂、混悬剂、膏剂、贴剂、洗剂、滴剂、擦剂或喷雾剂。
本发明的这些化合物的抗肿瘤活性，可通过用化合物LPR-2和LPR-3作为本发明的代表性化合物，用标准的药理试验操作程序来证实，该试验可测量对人肝癌细胞(plc/prf/5)生长的抑制情况。在这种标准的药理试验操作程序中得到的结果显示，本发明的化合物抑制肿瘤生长，可用作抗肿瘤药。具体地说，本发明的化合物可用来治疗或抑制实体肿瘤的生长，包括肉瘤和癌，诸如星形细胞瘤、肝癌、前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌。
本发明的化合物也可用来治疗或抑制抑制排斥作用，如肾、心脏、肝、肺、骨髓、胰腺、角膜、小肠等的移植、皮肤同种移植、心脏瓣膜异种移植等；并可用来治疗或抑制移植物对宿主造成的疾病；以及用来治疗或抑制自免疫性疾病，如狼疮、类风湿性关节炎、糖尿病、重度肌无力和多发性硬化症；以及炎症，如牛皮癣、皮炎、湿疹、肠炎和肺炎等；成人T-细胞白血病/淋巴瘤；真菌感染；血管过度增殖疾病、心瓣再狭窄、移植血管动脉粥样硬化；以及心血管疾病、脑血管疾病、末梢血管疾病、冠状动脉疾病；以及用来抑制中风或多发性梗死痴呆症。
当用于心瓣再狭窄时，优选用于治疗血管成形术操作后发生的心瓣再狭窄，可以在操作前、操作过程中或操作后服用本发明化合物。
当为了治疗或抑制一种具体的疾病状态或障碍时，应理解本发明化合物的有效剂量可依赖于所使用的特定化合物、服用方式、症状及其严重程度、以及有关被治疗个体的各种因素而变化。
在本发明的一个实施方案中提供了本发明所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备预防、治疗和/或抑制哺乳动物中的移植排斥作用或移植物对宿主造成的疾病、实体肿瘤、真菌感染、类风湿性关节炎、多发性硬化症、心瓣再狭窄或肺炎的药物中的应用。其中，所述的实体肿瘤为星形细胞瘤、肝癌、前列腺癌、乳腺癌或卵巢癌中的一种。
在美国专利US 5,955,457、5,780,462、6,432,973、6,331,547以及国际专利WO2007,103,348中，聚乙二醇的每个端基只能键合一个雷帕霉素药物分子。本发明先将聚乙二醇与多爪寡肽键合，然后再键合雷帕霉素药物分子，可实现聚乙二醇的每个端基键合多个雷帕霉素药物分子，大大增加了聚乙二醇的药物负载率。在给药剂量相同时，可大幅度降低制剂规格；在制剂规格相同时，可大幅度增加给药量。因此，本专利的实施既可增加制剂种类的多元性，又可增加制剂规格的多样性。在药理活性筛选研究中，本专利的发明人还发现聚乙二醇-多爪寡肽-雷帕霉素药物(LPR-2和LPR-3)比聚乙二醇-雷帕霉素药物(LPR-1)具有更强的抗癌活性。特别是LPR-2与LPR-1所使用的聚乙二醇结构和数均分子量都相同，而LPR-2由于增加了多爪寡肽结构，在给予按雷帕霉素计相同药物剂量时，其在人肝癌plc/prf/5皮下移植肿瘤模型中的抗癌活性结果明显优于LPR-1。
附图说明
图1是由LPR-1、LPR-2、LPR-3及溶媒引起的人肝癌细胞plc/prf/5荷瘤小鼠的体重变化结果。
图2是LPR-1、LPR-2、LPR-3及溶媒在人肝癌细胞plc/prf/5皮下移植肿瘤模型中的抗癌活性结果。
具体实施方式
雷帕霉素在临床中表现出良好的前景,但仍然存在生物利用度低(＜15％),水溶性差等缺点，人们在20世纪90年代后期又继续研发了一些高效、特异性的雷帕霉素衍生物，如坦西莫司、依维莫司、ridaforolimus等，都是在分子中引入极性基团，达到增强雷帕霉素水溶性的目的。雷帕霉素对酸和碱均敏感，即使在人体生理条件下,雷帕霉素也会发生降解反应,降解产物无免疫抑制活性，如何增加其稳定性的问题也有待解决。
雷帕霉素结构中包含有羟基，可以通过酯化的形式与聚乙二醇-多爪寡肽形成前药，一方面可以提高水溶性，加速药物分子的分布，以及对肿瘤有更好的通透性，防止药物局部聚集产生过敏反应；另一方面聚乙二醇片段可以形成亲水屏障，防止雷帕霉素的过快降解，从而获得雷帕霉素的合理利用。另外，通过药物与两亲物质的化学键合，形成一种类似于脂质体、更优于脂质体的分子形态，利用对肿瘤的靶向性，提高药物的生物利用度，减少用量，降低毒副作用，延长作用时间。特别地，酯基在生物体中可以通过生物降解的方式释放出药物活性成分。通过本方法改进后的药物水溶性良好，起效快，持续时间长，能够有效的起到治疗的作用。
不同于专利WO2007/103348中的聚乙二醇化雷帕霉素衍生物，本发明利用多爪寡肽实现雷帕霉素与聚乙二醇的键合。本发明中所使用的寡肽是指包括2-12个氨基酸的多肽。寡肽在肽酶的作用下完全被水解成游离氨基酸，并以游离氨基酸形式进入血液循环。氨基酸的生物相容性好，在生物体内易分散，生物降解后较安全，同时，多爪寡肽可提供更多的反应位点，分子的负载率较大，可键合更多的药物分子，增加聚乙二醇的选择范围。
本发明的结合物可以纯化合物形式或适宜的药物组合物形式进行给药，可采用任何可接受的给药方式或用于类似的用途的试剂进行。因此，采用的给药方式可选择通过口、鼻内、非肠道、局部、透皮或直肠方式，其形式为固体、半固体、冻干粉或液体药剂形式给药，例如，片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、散剂、栓剂、注射剂、溶液剂、混悬剂、膏剂、贴剂、洗剂、滴剂、擦剂、喷雾剂等。优选采用适用于精确剂量的简单给药的单元剂量形式。组合物可包含常规药用载体或赋形剂和作为活性成分(一种或多种)的本发明的结合物，此外，还可包含其它药剂、载体、辅剂等。
通常，根据所需给药方式，药学上可接受的组合物将包含约1至约99重量％的本发明结合物、以及99至1重量％的适宜的药用赋形剂。优选组合物包含约5至75重量％的本发明结合物，其余为适宜的药用赋形剂。
可采用液体形式给药的药物组合物例如可通过溶解、分散等手段将本发明的结合物(约0.5至约20％)和选择性存在的药用辅剂溶解、分散于载体中，载体的实例为水、盐水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等，从而形成溶液剂或混悬剂。
如果需要的话，本发明的药物组合物还可包含少量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、抗氧化剂等，例如：柠檬酸、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、丁基化羟基甲苯等。
以下实施例用来说明本发明，但不用来限制本发明。
实施例
实施例中所用的雷帕霉素从武汉远成共创科技有限公司购得，L-(+)-谷氨酸从北京化学试剂公司购得，溴乙酸叔丁酯、三苯基磷、对甲苯磺酸、苯甲醇及二环己基碳二亚胺(DCC)从国药集团化学试剂有限公司购得，4-二甲基氨基吡啶(DMAP)及1-羟基苯并三氮唑(HOBt)从上海共价化学科技有限公司购得，N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-5-苄酯从四川同晟氨基酸有限公司购得，单甲氧基聚乙二醇乙酸，单甲氧基聚乙二醇－谷氨酸二肽和Y型聚乙二醇乙酸由北京键凯科技有限公司提供，其余为市售试剂。
实施例1 甘氨酸雷帕霉素酯的制备
将溴乙酸叔丁酯(5.82g,30mmoL)加到反应瓶中，用丙酮(80mL)溶解，再加入叠氮化钠(4.55g,70mmoL)溶于水(40mL)的溶液，加热回流过夜。反应液蒸去丙酮，残分用乙醚提取，提取液用饱和盐水洗涤，干燥，减压浓缩后得油状液体。将此液体用甲醇(90mL)溶解，再加入1N氢氧化钠溶液(90mL)，搅拌，加热回流3h。冷却后减压蒸去甲醇，残夜用冰浴冷却，加6N盐酸将PH调至2，再用乙醚提取，提取液加水洗涤，干燥，浓缩后得叠氮乙酸，MS m/z:124[M+Na]+。
将叠氮乙酸(253mg,2.5mmoL)和雷帕霉素(2.28g,2.5mmoL)加到反应瓶中，用二氯甲烷溶解，冰浴冷却，再加入4－二甲氨基吡啶(DMAP,611mg,5mmoL)和N,N-二环己基碳酰亚胺(DCC,1.03g,5mmoL)加到反应瓶中，加完后继续在室温下搅拌过夜。反应液浓缩后残分用柱层析纯化，得叠氮乙酸雷帕霉素酯1.42g，收率57％，MS m/z:1020[M+Na]+。
将叠氮乙酸雷帕霉素酯(0.7g,0.7mmoL)和三苯基磷(0.37g,1.4mmoL)加到反应瓶中，再加入四氢呋喃和水的混合液(5:1,180mL)，加热到50℃反应过夜，反应液浓缩后残分用乙酸乙酯提取，提取液用饱和盐水洗涤，干燥。减压浓缩后残分用柱层析纯化，得甘氨酸雷帕霉素酯0.48g，收率70％，MS m/z:994[M+Na]+。
实施例2 单甲氧基聚乙二醇(数均分子量20000)-雷帕霉素结合物(LPR-1)的制备
将单氧基聚乙二醇乙酸(20K,1g,0.05mmoL)，实施例1制备的甘氨酸雷帕霉素酯(97mg,0.1mmoL)，1－羟基苯并三氮唑(HOBt,6.8mg,0.05mmoL)和DMAP(12.2mg,0.1mmoL)加到反应瓶中，用二氯甲烷溶解，冰浴冷却，再滴入DCC(15.5mg,0.075mmoL)溶于二氯甲烷的溶液，滴完后自然升到室温，反应过夜，次日将反应液浓缩，残分用异丙醇结晶得单甲氧基聚乙二醇(20K)-雷帕霉素结合物(LPR-1)0.82g(n约为450)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3):0.90(Me,3H,43),0.92(Me,3H,49),0.94(Me,3H,46),0.96(Me,3H,48),0.97(Me,3H,45),1.10(CH2,2H,24),1.11(CH2,2H,36),1.20(CH2,2H,42),1.33(CH2,2H,41),1.37(CH,1H,37),1.45(CH2,2H,5),1.47(CH2,2H,4),1.60(CH2,2H,13),1.61(CH2,2H,12),1.65(CH2,2H,15),1.65(CH2,2H,44),1.74(Me,3H,47),1.75(CH,1H,35),2.07(CH,4H,3,11,23,25),2.08(CH2,2H,33),3.14(Me,3H,50),3.33(CH,1H,31),3.36(Me,3H,51),3.37(CH2,2H,6),3.42(CH,1H,40),3.44(Me,3H,52),3.56(CH,1H,39),3.64(CH2,1800H,PEG),3.71(CH,1H,16),3.72(CH,1H,27),3.86(CH,1H,14),4.17(CH2,2H,54),4.19(CH,1H,28),5.16(CH,1H,2),5.17(CH,1H,34),5.29(＝CH,1H,30),5.39(＝CH,1H,22),5.95(＝CH,1H,18),6.13(＝CH,1H,21),6.31(＝CH,1H,20),6.38(＝CH,1H,19),8.34(CH,1H,55).
实施例3 单甲氧基聚乙二醇(数均分子量20000)－谷氨酸二肽－雷帕霉素结合物(LPR-2)的制备
将单甲氧基聚乙二醇－谷氨酸二肽(20K,0.5g，0.025mmol)，实施例1制备的甘氨酸雷帕霉素酯48.6mg(0.05mmol),HOBt(3.4mg,0.025mmoL)和DMAP 6.1mg(0.05mmoL)加到反应瓶中，用二氯甲烷溶解，冰浴冷却，再滴入DCC 15.5mg(0.075mmol)溶于二氯甲烷的溶液，滴完后自然升到室温，反应过夜。次日将反应液浓缩，残分用异丙醇结晶，得单甲氧基聚乙二醇(20K)－谷氨酸二肽－雷帕霉素结合物(LPR-2)0.41g(n约为450)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3):0.90(Me,9H,43),0.92(Me,9H,49),0.94(Me,9H,46),0.96(Me,9H,48),0.97(Me,9H,45),1.10(CH2,6H,24),1.11(CH2,6H,36),1.20(CH2,6H,42),1.33(CH2,6H,41),1.37(CH,3H,37),1.45(CH2,6H,5),1.47(CH2,6H,4),1.60(CH2,6H,13),1.61(CH2,6H,12),1.65(CH2,6H,15),1.65(CH2,6H,44),1.74(Me,9H,47),1.75(CH,3H,35),2.07(CH,12H,3,11,23,25),2.08(CH2,6H,33),3.14(Me,9H,50),3.33(CH,3H,31),3.36(Me,9H,51),3.37(CH2,6H,6),3.42(CH,3H,40),3.44(Me,9H,52),3.56(CH,3H,39),3.64(CH2,1800H,PEG),3.71(CH,3H,16),3.72(CH,3H,27),3.86(CH,3H,14),4.17(CH2,6H,54),4.19(CH,3H,28),5.16(CH,3H,2),5.17(CH,3H,34),5.29(＝CH,3H,30),5.39(＝CH,3H,22),5.95(＝CH,3H,18),6.13(＝CH,3H,21),6.31(＝CH,3H,20),6.38(＝CH,3H,19),8.34(CH,3H,55).
实施例4 Y型聚乙二醇(数均分子量40000)－谷氨酸二肽－雷帕霉素结合物(LPR-3)的制备
N-叔丁氧羰基谷氨酸苄酯二肽(0.78g,1.2mmoL)(实施例3)溶解在二氯甲烷(10mL)中，加入三氟乙酸3mL，室温反应2h。除去溶剂，加入100mL二氯甲烷，用5％碳酸氢钠溶液调节pH＝7-8。萃取分液，有机相用5％碳酸氢钠溶液洗两次，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液直接加到反应瓶中，氮气保护下，加入Y型聚乙二醇乙酸(40K,40.0g,1mmoL)DMAP(245mg，2mmol)、HOBt(135mg,1mmol)。全部溶解后，加入DCC(412mg，2mmol)。室温搅拌反应过夜。过滤，旋转蒸发除去溶剂，残余物中添加500mL异丙醇，过滤，产物真空干燥。将该产物溶于200mL无水甲醇中，加入钯炭1.0g，通入氢气室温反应过夜。过滤除去钯炭，旋转蒸发除去溶剂，残余物中添加500mL异丙醇，过滤，产物真空干燥。得到Y型聚乙二醇－谷氨酸二肽(40K)33.4g。
将Y型聚乙二醇－谷氨酸二肽(40K,0.5g，0.0125mmol)，实施例1制备的甘氨酸雷帕霉素酯24.3mg(0.025mmol)，HOBt(1.7mg,0.0125mmo)和DMAP 3mg(0.025mmol)加到反应瓶中，用二氯甲烷溶解,冰浴冷却，再滴入DCC 4.1mg(0.02mmol)溶于二氯甲烷的溶液，滴完后自然升到室温，反应过夜。次日将反应液浓缩，残分用异丙醇结晶，得Y型聚乙二醇(40K)－谷氨酸二肽－雷帕霉素结合物(LPR-3)0.44g(n约为450)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3):0.90(Me,9H,43),0.92(Me,9H,49),0.94(Me,9H,46),0.96(Me,9H,48),0.97(Me,9H,45),1.10(CH2,6H,24),1.11(CH2,6H,36),1.20(CH2,6H,42),1.33(CH2,6H,41),1.37(CH,3H,37),1.45(CH2,6H,5),1.47(CH2,6H,4),1.60(CH2,6H,13),1.61(CH2,6H,12),1.65(CH2,6H,15),1.65(CH2,6H,44),1.74(Me,9H,47),1.75(CH,3H,35),2.07(CH,12H,3,11,23,25),2.08(CH2,6H,33),3.14(Me,9H,50),3.33(CH,3H,31),3.36(Me,9H,51),3.37(CH2,6H,6),3.42(CH,3H,40),3.44(Me,9H,52),3.56(CH,3H,39),3.64(CH2,1800H,PEG),3.71(CH,3H,16),3.72(CH,3H,27),3.86(CH,3H,14),4.17(CH2,6H,54),4.19(CH,3H,28),5.16(CH,3H,2),5.17(CH,3H,34),5.29(＝CH,3H,30),5.39(＝CH,3H,22),5.95(＝CH,3H,18),6.13(＝CH,3H,21),6.31(＝CH,3H,20),6.38(＝CH,3H,19),8.34(CH,3H,55).
实施例5 不同聚乙二醇－多爪寡肽－雷帕霉素结合物对肿瘤细胞的抑制活性
(1)实验方法与步骤
(a)细胞培养
Plc/prf/5细胞体外单层培养，培养条件为MEM培养基中加10％热灭活胎牛血清，于37℃、含5％CO2空气的培养箱中培养。一周两次用胰酶-EDTA进行消化处理传代。当细胞呈指数生长期时，收取细胞，计数，接种。
(b)肿瘤细胞接种、分组及给药
将1×107plc/prf/5肿瘤细胞悬浮于0.1ml混合液(PBS:Matrigel为4:1)，接种于每只NOD/SCID小鼠背部右侧肩胛处。接种24天后肿瘤平均体积达到约350mm3时，剔除瘤体积过小或过大的小鼠，余下小鼠根据瘤体积随机分组并开始给药。
(c)实验方案
表1 实验动物分组及给药方案
a.给药剂量以雷帕霉素计,下同。
其中Q2W×2W表示每周静脉注射给药2次，连续两周，下同。
(2)实验结果
(a)体重
各处理组荷瘤鼠的体重变化如表2和图1所示。
表2.各处理组不同时间点的体重
注:a.平均值±标准误差
(b)瘤体积
各处理组肿瘤体积变化如表3和图2所示。
表3.各处理组不同时间点的瘤体积
注:a.平均值±标准误差
(c)抗肿瘤药效评价指标
LPR1,2,3对plc/prf/5皮下移植瘤模型的抑瘤药效评价指标如表4。
表4.各处理组的抑瘤药效评价
注:a.平均值±标准误差
(3)实验结果总结及讨论
在本实验中，我们评价了LPR-1，LPR-2和LPR-3在人肝癌plc/prf/5皮下移植瘤模型中的体内药效。各处理组在不同时间的瘤体积如表2，图2所示。Plc/prf/5肿瘤细胞接种NOD/SCID小鼠后38天，溶媒对照组瘤体积达到1801mm3。受试物LPR-1，LPR-2和LPR-3都表现出一定的抑瘤作用，其中LPR-2抑瘤作用最为明显，与溶媒组相比T/C小于40％，p值为0.000，具有显著性差异。
各组荷瘤鼠的体重变化影响如表1、图1所示。各给药组在实验过程中未观察到明显的毒性反应。
综上所述，在本实验中，受试药LPR-1，LPR-2和LPR-3对人肝癌plc/prf/5皮下移植瘤模型表现出抗肿瘤效果，其中以LPR-2抑瘤作用最为明显，各给药组实验过程中未观察到明显的毒性反应。LPR-1和LPR-2使用相同结构和相同数均分子量的聚乙二醇，所不同的是，LPR-1的聚乙二醇仅通过甘氨酸与雷帕霉素键合，聚乙二醇分子的一个端基只键合一个雷帕霉素分子；而LPR-2的聚乙二醇通过谷氨酸二肽和甘氨酸与雷帕霉素键合，聚乙二醇分子的一个端基可键合三个雷帕霉素分子。LPR-2的药物负载率是LPR-1的3倍，其抗肿瘤活性也明显高于LPR-1。

Claims (15)

1.一种式III的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
MI为大环内酯类免疫抑制剂的残基，具有式II的结构：
其中，R1选自H、C1-C10的直链或支链烷基、C2-C10的直链或支链烯基、C6-C12的取代或未取代芳基和C7-C12的取代或未取代芳烷基；
R2选自H、羟基和C1-C10的直链或支链烷氧基；
R3选自H、C1-C10的直链或支链烷基、C2-C10的直链或支链烯基、C6-C12的取代或未取代芳基、C7-C12的取代或未取代芳烷基和-C(O)R31，其中R31选自H、C1-C10的直链或支链烷基、C2-C10的直链或支链烯基、C6-C12的取代或未取代芳基和C7-C12的取代或未取代芳烷基；
R4选自H、羟基和C1-C10的直链或支链烷氧基；
PEG代表具有直链结构、Y型结构或多分支结构的聚乙二醇，所述聚乙二醇的数均分子量为20,000-40,000道尔顿；
X具有如下式的结构：-CH2-CO-；
所述m为2；
所述A2为甘氨酸的残基。
2.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述PEG具有如下式的直链结构：
其中n为大于零的整数，且所述PEG的数均分子量为20,000-40,000道尔顿。
3.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述PEG具有如下式的Y型结构：
其中n为大于零的整数，且所述PEG的数均分子量为20,000-40,000道尔顿。
4.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述PEG具有如下式的多分支结构：
其中n为大于零的整数；
R是核心分子，选自以下多羟基化合物分子的残基组成的组：季戊四醇、寡聚季戊四醇、甘油、多聚甘油、山梨醇、异丁三醇、甲基葡萄糖苷和蔗糖；
z是分支数，为3-8的整数；
所述PEG的数均分子量为20,000-40,000道尔顿。
5.如权利要求4所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中z为4。
6.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1为甲基，R2为甲氧基，R3为H，R4为甲氧基。
7.如权利要求6所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物为：
其中所述PEG的数均分子量为20,000道尔顿。
8.如权利要求6所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物为：
其中所述PEG的数均分子量为40,000道尔顿。
9.一种制备如权利要求1所述的式III的化合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)化合物IV
与化合物V
发生酯化反应，得到化合物VI
(2)所述化合物VI进行还原反应，得到化合物VII
(3)所述化合物VII与聚乙二醇-寡肽VIII
发生酰胺化反应，得到式III的化合物。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述步骤(1)和(3)中的所述酯化反应和所述酰胺化反应在缩合剂的存在下进行，所述缩合剂选自由N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、1-羟基苯并三氮唑、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)、双(2-氧代-3-噁唑烷基)次磷酰氯、1H-苯并三唑-1-氧基三(1-吡咯烷基)膦六氟磷酸盐、1,3-二环己基碳二亚胺、N,N'-羰基二咪唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺、N,N'-二异丙基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶及其组合组成的组。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述步骤(2)中的所述还原反应在还原试剂的存在下进行，所述还原试剂选自由三苯基膦、氢气、硼氢化钠、硼氢化锌、氢化铝锂、二氯二甲基巯基硼烷、碱土金属、金属铟、金属钐、金属锡、金属锌、肼、金属铁、二价铁盐、三碘化铝以及四硫代钼酸盐组成的组。
12.如权利要求1-8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备预防、治疗和/或抑制哺乳动物中的移植排斥作用或移植物对宿主造成的疾病、实体肿瘤、真菌感染、类风湿性关节炎、多发性硬化症、心瓣再狭窄或肺炎的药物中的应用。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述的实体肿瘤为星形细胞瘤、肝癌、前列腺癌、乳腺癌或卵巢癌。
14.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-8之任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体或赋形剂。
15.如权利要求14所述的药物组合物，其中，所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、散剂、栓剂、注射剂、溶液剂、混悬剂、膏剂、贴剂、洗剂、滴剂、擦剂或喷雾剂。
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