CN104448300B - 低分子量l-聚谷氨酸-丝裂霉素c及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
低分子量L‑聚谷氨酸‑丝裂霉素C，结构式为：
Description
技术领域
本发明属于化学合成技术领域，具体涉及一种低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C，本发明还涉及该低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C的合成方法及应用。
背景技术
翼状胬肉是局部球结膜纤维血管组织的一种疾病，因其酷似昆虫的翅膀而得名，是临床上最常见的眼病之一。翼状胬肉的发病率随年龄增长呈逐年高发趋势，严重危害国人的视力健康：首先，翼状胬肉生长浸润角膜可导致角膜曲率改变而引起不同程度的散光、眼球转动障碍、视力下降，严重影响了翼状胬肉病人的生活质量；其次，翼状胬肉组织本身也易引发反复发生的眼红、磨不适，导致结膜炎反复发生及由此产生的长期治疗费用；第三，翼状胬肉的生长严重影响了病人的眼部外观。
翼状胬肉最近被发现具有许多肿瘤样特性，包括轻度发育不良，局部的浸润性和高复发率，翼状胬肉与肿瘤在分子生物学水平有着多方面的相似性。
临床上翼状胬肉的治疗主要采用以手术治疗为主的综合治疗，但单纯切除术后复发率高达24％～89％。翼状胬肉术后高复发率是较棘手的问题，复发原因与手术创伤加快了成纤维细胞增生有关，复发通常发生于术后10个月内。复发的胬肉进展快，常较原发者扩大。临床普遍采用抗代谢药物丝裂霉素C(MMC)防止翼状胬肉复发，目前临床上无其他成熟、等效的替代方案。
丝裂霉素C是由头状链霉菌产生的抗生素混合物中分离出来的一种抗肿瘤抗生素，其作用机制是破坏DNA的结构和功能，抑制增殖期细胞的DNA复制，并抑制DNA依赖性RNA合成，从而有效地抑制成纤维细胞的增殖。在术中使用丝裂霉素C滴眼能有效阻止胬肉复发，是目前临床上的通用做法。
丝裂霉素C作为抗肿瘤药物，眼科应用时毒性较大，暴露于10mg/L(0.01g/L)的丝裂霉素C 2小时能无限期地抑制细胞增生。
有报道显示胬肉切除术后滴用0.2g/L丝裂霉素C 2次/天，连用5天，复发率2.61％，并发症有巩膜浅表溶解、脓性肉芽肿及眼压升高，严重并发症有继发性青光眼、巩膜溶解、虹膜炎、角膜穿孔及突然发生成熟白内障等。有些学者甚至认为丝裂霉素C对眼部组织的影响是长期的，完全有可能在10余年后才出现严重的并发症。
丝裂霉素C引起眼部毒性反应与其浓度、用药时间长短有直接关系，即使其使用较低剂量(0.1g/L)的丝裂霉素C，仍难以避免出现严重副作用，且复发率出现升高(4.11％)。
L-聚谷氨酸的分子量一般在100k-2000k道尔顿，然而L-聚谷氨酸的是多羧基聚合物，其链上的羧基使其具有PH响应性，在低PH值环境下，呈直链状；在眼部的生理PH值6-7下则呈卷曲状。这时高分子量L-聚谷氨酸修饰的丝裂霉素C将被卷曲、遮盖、空间位阻大，难以被酯酶水解释放活性物质丝裂霉素C。
综上所述，目前尚无解决丝裂霉素C在翼状胬肉临床应用中的严重毒副作用问题的有效途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种低分子量(1882-5792Da)L-聚谷氨酸-丝裂霉素C，解决了丝裂霉素C在翼状胬肉临床应用中有严重毒副作用的问题。
本发明的另一个目的是提供一种低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C合成方法。
本发明的第三个目的是提供一种低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C的应用。
本发明所采用的技术方案是，低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C(γ-PGA-MMC)，其结构式如下：
其分子量为：1882Da～5792Da，n＝10～40。
本发明所采用的另一个技术方案是，低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C合成方法，其制备得到的L-聚谷氨酸-丝裂霉素C的结构式为：
其分子量为：1882Da～5792Da，n＝10～40；
其具体合成方法为：取聚谷氨酸(分子量10万道尔顿左右)20-30g，溶于PH＝1-6的水中，在60-100℃下搅拌6-12小时；反应结束后，将反应液使用葡聚糖凝胶色谱进行分离，截取分子量1500-6000的聚谷氨酸，冷冻干燥后所得物加入二氧六环250ml、N-羟基琥珀酰亚胺0.61-1.22g、缩合剂0.51-1.10g和缚酸剂3-5ml，在30-70℃下保温5-10小时，蒸去溶剂，剩余物溶于100-300ml氯仿，用稀盐酸10-70ml洗涤后，氯仿层蒸干，所得物加至0.03-0.10mol/L HBS缓冲液10-60ml中，搅拌下加入丝裂霉素C 1.67-3.34g，期间加入0.5-1.0mol/L氢氧化钠或氢氧化钾水溶液维持PH为7.4；然后搅拌反应液12小时，之后浓缩反应液至干，剩余物使用硅胶柱色谱分离得黄色至白色产物，即低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C。
本发明的特点还在于，
缩合剂为二环己基碳二亚胺或1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二酰亚胺盐酸盐。
缚酸剂为吡啶、N-甲基吗啉、三乙胺、碳酸钾、碳酸钠或咪唑中的一种。
HBS缓冲液的PH为7.4。
硅胶柱色谱分离所采用的洗脱液为二氯甲烷与甲醇按体积比为10：1组成的混合物。
本发明所采用的第三个技术方案是，低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C的应用，用于在手术切除眼表疾病翼状胬肉的术中及术后，滴加以防止翼状胬肉术后复发。
本发明的有益效果是，本发明低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C，利用低分子量L-聚谷氨酸对丝裂霉素C进行修饰，使其：1.由于分子量较大无法透过角膜；2.可以通过EPR effect在翼状胬肉组织中积聚；3.在翼状胬肉组织中由cathepsin B酶介导丝裂霉素C的释放，从而达到治疗作用。而在正常组织中，由于其分子量较大，难以透过角膜、巩膜进入眼内，从而大幅降低其经角膜、巩膜通路的眼内吸收，使其在翼状胬肉治疗的应用中，提高药效、降低全眼副作用。且由于所使用的L-聚谷氨酸分子量较低，不会由于其在泪液的生理PH下形成的扭曲、盘绕、折叠导致的空间位阻效应阻碍cathepsin B酶介导丝裂霉素C的释放。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C(γ-PGA-MMC)，其结构式如下：
其分子量为：1882Da～5792Da，n＝10～40。
上述低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C合成方法：取聚谷氨酸(分子量10万道尔顿左右)20-30g，溶于PH＝1-6的水中，在60-100℃下搅拌6-12小时；反应结束后，将反应液使用葡聚糖凝胶色谱进行分离，截取分子量1500-6000的聚谷氨酸，冷冻干燥后所得物加入二氧六环250ml、N-羟基琥珀酰亚胺0.61-1.22g、缩合剂0.51-1.10g(缩合剂为二环己基碳二亚胺或1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二酰亚胺盐酸盐)和缚酸剂3-5ml(缚酸剂为吡啶、N-甲基吗啉、三乙胺、碳酸钾、碳酸钠或咪唑中的一种)，在30-70℃下保温5-10小时，蒸去溶剂，剩余物溶于100-300ml氯仿，用稀盐酸10-70ml洗涤后，氯仿层蒸干，所得物加至0.03-0.10mol/L HBS缓冲液(PH为7.4)10-60ml中，搅拌下加入丝裂霉素C 1.67-3.34g，期间加入0.5-1.0mol/L氢氧化钠或氢氧化钾水溶液维持PH 7.4；然后搅拌反应液12小时，之后浓缩反应液至干，剩余物使用硅胶柱色谱分离(洗脱液为二氯甲烷与甲醇按体积比为10：1组成的混合物)得黄色至白色产物，即低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C。
1.药效学实验
采用MTT法检测低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C对翼状胬肉成纤维细胞(HPFs)的增殖抑制。HPFs组织来源于陕西省人民医院眼科手术室，收集了2015年1月至3月手术切除的原发翼状胬肉10例，均位于鼻侧，病人年龄40～70岁，男性5例，女性5例。由熟练手术者在显微镜下自病变组织剪取。
将手术取得的组织标本，在无菌条件下修剪分出结膜下组织，放入培养皿，含100U/ml青霉素和链霉素的PBS浸泡30分种，清洗3次，剪成1x1mm3组织块，置小烧杯中，以30倍体积0.025％Ⅱ型胶原酶溶液37℃消化20min，移至离心管中1500rpm离心10min，弃上清，再以30倍体积0.5％胰蛋白酶溶液制成悬液，37℃消化10min，加入血清终止消化，经200目金属筛过滤后的滤液于1500rpm离心10min，弃上清。取离心后沉积物加入含20％血清、100U/ml肝素和100u/ml青、链霉素的DMEM和SFM的1：1混合液，制成悬液，接种于经FN处理过的培养皿，放入5％CO2培养箱37℃培养。每2～3天换液1次。待细胞长满后用0.25％胰蛋白酶消化传代。首次传代的细胞经确认为成纤维细胞后，取第3～5代细胞供试验用。分别设为A组(+γ-PGA-MMC 1.5g/L)、B组(+丝裂霉素C 0.1g/L)，同时设立空白对照组。
A组及B组分别将3×104个细胞接种于96孔板中，培养24h后吸弃原培养液，漂洗3次，每孔分别加低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C、丝裂霉素C及空白对照的DMEM 150μL，使其终浓度均为20μg·mL-1，孵育1h，随后吸出含γ-PGA-MMC、MMC的培养液，漂洗3次，每孔加入无血清的DMEM150μL，随后加入的5g·L-1MTT溶液5μL，4h后吸出培养液，每孔加入DMSO150μL，经微量震荡器震荡10min后在酶联检测仪上检测各孔在550nm波长处的吸光度(A值)，并计算各组成纤维细胞的抑制情况。
结论：γ-PGA-MMC和MMC对翼状胬肉成纤维细胞活性均有明显影响(P<0.01)。0.1g/LMMC、1.5g/Lγ-PGA-MMC对翼状胬肉成纤维细胞活性的影响经统计分析无显著性差异(P>0.05)。
采用Franz扩散池法测定了γ-PGA-MMC的角结膜渗透作用。其中，基质液选择GBR液，角膜来源选择家兔，对照组选择MMC。将家兔耳缘静脉注射空气致死。在死后20min内小心分离出角膜，除去巩膜、虹膜、睫状体等多余组织。将新鲜离体角膜小心固定在Franz扩散池的供给池和接收池之间，使上皮层面向供给池，在接收池中加入新鲜配制的GBR4.5mL，在供给池中分别加入γ-PGA-MMC的GBR或MMC的PBS 0.5mL。装置置于透皮扩散试验仪中，搅拌子约6mm,温度控制在(37±1)℃，转速控制在(200±25)r/min。试验开始后，分别在40、80、120、160、200、240min从接收池中取样4.5mL，同时，补充等体积同温度的GBR，样品经0.45μm微孔滤膜滤过后，用HPLC法测定γ-PGA-MMC的浓度。
结论：在40、80、120、160、200、240min从接收池中取样经HPLC测定均未测出γ-PGA-MMC吸收峰。γ-PGA-MMC难以透过离体角膜。
2.毒性试验
健康新西兰兔20只，雌雄各半，分为A、B两组，A组分别在左眼滴入1.5g/Lγ-PGA-MMC眼液0.1ml，B组分别在左眼滴入0.1g/L MMC眼液0.1ml，两组均被动闭合10s，并在右眼滴入生理盐水作为对照。一次给药24h后，连续给药，每3次，持续14d。14d后，用温水去除残留药物，观察1、24、48、72、144、288h眼睛刺激情况，以及上述变化的恢复情况和时间。
结论：A组(+γ-PGA-MMC 1.5g/L)与B组(+丝裂霉素C 0.1g/L)实验眼均在出现1h后即出现红肿、流泪等症状，B组较A组严重；A组所出现上述症状随时间逐步缓解，至144h后基本好转，B组至288h未见明显好转。B组出现2例巩膜坏死，随后出现巩膜穿孔及视力丧失。
综上所述，本发明所涉及的低分子量γ-PGA-MMC 1.5g/L相比于丝裂霉素C 0.1g/L对翼状胬肉成纤维细胞具有相同的抑制作用，且毒性较低。
抗癌药物的一个有效发展方向是聚合物治疗法。聚合物-药物偶合物是指将适当的聚合物载体、生物可降解的交联剂和具有生物学活性的抗肿瘤药物结合起来，这一设计思路备受人们关注，并且将很有可能成为新一代抗肿瘤药物设计的基础。将低分子量抗癌药物与较高分子量聚合物通过特定的交联剂连接是一种较有效的方法，其能够提高临床应用抗癌药物的治疗指数，第一批经过临床试验评估的候选药物包括N-(2-羟丙基)异丁烯酰胺与阿霉素、喜树碱、紫杉醇、铂(II)所形成的偶合物。
聚合物-药物偶合物可以通过“增强的通透性和滞留效应”(enhancedpermeability and retention effect，EPR effect)促进肿瘤被动靶向，并且在胞吞捕获后通过向溶酶体药物转运作用使药物更好的发挥抗肿瘤作用。
所谓“EPR effect”，是指电子显微镜下可见外周肿瘤血管内皮在数量上要比正常的血管内皮有更多的接点，由于肿瘤组织中的新血管系统和正常组织中发育成熟的血管在结构上的差异，导致肿瘤组织的血管对大分子物质的通透性要比正常血管高。因此，聚合物-药物偶合物会在肿瘤组织中被动积聚。几乎治疗所有迅速增长的实体瘤的药物设计中都会利用EPR effect作为指导原则，目前，由Maeda和Matsumura发现的EPR effect已经成为以大分子、微团、脂类颗粒为基础的癌症靶向治疗药物设计的金标准。
L-聚谷氨酸(γ-PGA)是谷氨酸的聚合物，具有良好的水溶性和生物相溶性，无毒、无免疫性、无致畸性且无抗原性。与其它的合成聚合物不同，γ-PGA的独特之处在于它是由天然存在的L-谷氨酸通过酰胺键而不是不可降解的C-C长链连接起来的。每一个L-聚谷氨酸的重复单位中凸出的游离γ-羧基在中性pH条件下带有负电荷，致使聚合物呈现较好的水溶性。同时，游离的γ-羧基在功能上还是药物结合位点。L-聚谷氨酸的生物可降解性和无毒性的特征使其成为一种极具发展前景的聚合物-药物偶合物的载体。
而在药物化学研究领域，γ-PGA最经典的应用范例是对紫杉醇的结构修饰，修饰后使紫杉醇获得了理想的水溶性和EPR effect。药动学研究表明，该L-聚谷氨酸-紫杉醇偶合物在体循环中较为稳定，通过内吞作用进入细胞后，而后被具有蛋白水解活性的溶酶体酶类-组织蛋白酶B(cathepsin B)水解，从而释放活性药物紫杉醇。这一发现与恶性肿瘤细胞中cathepsin B的表达上调可能具有生物学相关性，尤其是在进行性增长的肿瘤中cathepsin B的表达上调更为明显。由于翼状胬肉组织与肿瘤组织的高度相似性，可以合理预计翼状胬肉组织中的cathepsin B或其他相关蛋白酶的表达也会上调。
因此，本项目拟利用低分子量γ-PGA对丝裂霉素C进行修饰，使其可以通过EPR effect在翼状胬肉组织中积聚，然后由cathepsin B介导丝裂霉素C的释放，从而达到治疗作用。而在正常组织中，由于其分子量较大，难以透过角膜进入眼内，从而大幅降低其经角膜通路的眼内吸收，使其在翼状胬肉治疗的应用中，提高药效、降低全眼副作用。
实施例1
取聚谷氨酸(分子量10万道尔顿左右)20g，溶于PH＝1的水中，在80℃下搅拌8小时；反应结束后，将反应液使用葡聚糖凝胶色谱进行分离，截取分子量1500-2000的聚谷氨酸，冷冻干燥后所得物加入二氧六环250ml、N-羟基琥珀酰亚胺0.61g、二环己基碳二亚胺1.10g和吡啶3ml，在50℃下保温10小时，蒸去溶剂，剩余物溶于100氯仿，用稀盐酸10ml洗涤后，氯仿层蒸干，所得物加至0.03mol/L HBS缓冲液(PH为7.4)10ml中，搅拌下加入丝裂霉素C 3.34g，期间加入0.5mol/L氢氧化钠或氢氧化钾水溶液维持PH 7.4；然后搅拌12小时反应液后将其浓缩至干，剩余物使用硅胶柱色谱分离(洗脱液为二氯甲烷与甲醇按体积比为10：1组成的混合物)得黄色至白色产物，即低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C。
实施例2
取聚谷氨酸(分子量10万道尔顿左右)22g，溶于PH＝1.3的水中，在90℃下搅拌6小时；反应结束后，将反应液使用葡聚糖凝胶色谱进行分离，截取分子量1500-6000的聚谷氨酸，冷冻干燥后所得物加入二氧六环250ml、N-羟基琥珀酰亚胺0.82g、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二酰亚胺盐酸盐1.08g和N-甲基吗啉5ml，在40℃下保温7小时，蒸去溶剂，剩余物溶于200ml氯仿，用稀盐酸20ml洗涤后，氯仿层蒸干，所得物加至0.05mol/L HBS缓冲液(PH为7.4)30ml中，搅拌下加入丝裂霉素C 1.67g，期间加入0.7mol/L氢氧化钠或氢氧化钾维持水溶液PH 7.4；然后搅拌12小时反应液后将其浓缩至干，剩余物使用硅胶柱色谱分离(洗脱液为二氯甲烷与甲醇按体积比为10：1组成的混合物)得黄色至白色产物，即低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C。
实施例3
取聚谷氨酸(分子量10万道尔顿左右)24g，溶于PH＝2.5的水中，在60℃下搅拌12小时；反应结束后，将反应液使用葡聚糖凝胶色谱进行分离，截取分子量2000-3000的聚谷氨酸，冷冻干燥后所得物加入二氧六环250ml、N-羟基琥珀酰亚胺1.0g、二环己基碳二亚胺0.51g和三乙胺4ml，在30℃下保温6小时，蒸去溶剂，剩余物溶于300ml氯仿，用稀盐酸30ml洗涤后，氯仿层蒸干，所得物加至0.08mol/L HBS缓冲液(PH为7.4)40ml中，搅拌下加入丝裂霉素C 2.0g，期间加入0.6mol/L氢氧化钠或氢氧化钾水溶液维持PH 7.4；然后搅拌12小时反应液后将其浓缩至干，剩余物使用硅胶柱色谱分离(洗脱液为二氯甲烷与甲醇按体积比为10：1组成的混合物)得黄色至白色产物，即低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C。
实施例4
取聚谷氨酸(分子量10万道尔顿左右)26g，溶于PH＝3.6的水中，在70℃下搅拌9小时；反应结束后，将反应液使用葡聚糖凝胶色谱进行分离，截取分子量3500-4500的聚谷氨酸，冷冻干燥后所得物加入二氧六环250ml、N-羟基琥珀酰亚胺1.22g、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二酰亚胺盐酸盐0.75g碳酸钾3.5ml，在60℃下保温5小时，蒸去溶剂，剩余物溶于150ml氯仿，用稀盐酸40ml洗涤后，氯仿层蒸干，所得物加至0.07mol/L HBS缓冲液(PH为7.4)20ml中，搅拌下加入丝裂霉素C 3.15g，期间加入0.8mol/L氢氧化钠或氢氧化钾水溶液维持PH 7.4；然后搅拌12小时反应液后将其浓缩至干，剩余物使用硅胶柱色谱分离(洗脱液为二氯甲烷与甲醇按体积比为10：1组成的混合物)得黄色至白色产物，即低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C。
实施例5
取聚谷氨酸(分子量10万道尔顿左右)28g，溶于PH＝4.1的水中，在100℃下搅拌6小时；反应结束后，将反应液使用葡聚糖凝胶色谱进行分离，截取分子量5000-6000的聚谷氨酸，冷冻干燥后所得物加入二氧六环250ml、N-羟基琥珀酰亚胺1.15g、二环己基碳二亚胺0.88和碳酸钠4.5ml，在70℃下保温8小时，蒸去溶剂，剩余物溶于250ml氯仿，用稀盐酸50ml洗涤后，氯仿层蒸干，所得物加至0.06mol/L HBS缓冲液(PH为7.4)50ml中，搅拌下加入丝裂霉素C 2.5g，期间加入1.0mol/L氢氧化钠或氢氧化钾维持PH7.4；然后搅拌12小时反应液浓缩至干，剩余物使用硅胶柱色谱分离(洗脱液为二氯甲烷与甲醇按体积比为10：1组成的混合物)得黄色至白色产物，即低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C。
实施例6
取聚谷氨酸(分子量10万道尔顿左右)30g，溶于PH＝6的水中，在85℃下搅拌7小时；反应结束后，将反应液使用葡聚糖凝胶色谱进行分离，截取分子量1500-6000的聚谷氨酸，冷冻干燥后所得物加入二氧六环250ml、N-羟基琥珀酰亚胺0.78g、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二酰亚胺盐酸盐0.92g和咪唑3ml，在45℃下保温9小时，蒸去溶剂，剩余物溶于275ml氯仿，用稀盐酸70ml洗涤后，氯仿层蒸干，所得物加至0.10mol/L HBS缓冲液(PH为7.4)60ml中，搅拌下加入丝裂霉素C 2.75g，期间加入0.9mol/L氢氧化钠或氢氧化钾维持PH 7.4；然后搅拌12小时反应液浓缩至干，剩余物使用硅胶柱色谱分离(洗脱液为二氯甲烷与甲醇按体积比为10：1组成的混合物)得黄色至白色产物，即低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C。
Claims (6)
1.低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C，其特征在于，其结构式如下：
其分子量为：1882Da～5792Da，n＝10～40。
2.低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C合成方法，其特征在于：其制备得到的L-聚谷氨酸-丝裂霉素C的结构式为：
其分子量为：1882Da～5792Da，n＝10～40；
其具体合成方法为：取聚谷氨酸20-30g，溶于pH＝1-6的水中，在60-100℃下搅拌6-12小时；反应结束后，将反应液使用葡聚糖凝胶色谱进行分离，截取分子量1500-6000的聚谷氨酸，冷冻干燥后所得物加入二氧六环250mL、N-羟基琥珀酰亚胺0.61-1.22g、缩合剂0.51-1.10g和缚酸剂3-5mL，在30-70℃下保温5-10小时，蒸去溶剂，剩余物溶于100-300mL氯仿，用稀盐酸10-70mL洗涤后，氯仿层蒸干，所得物加至0.03-0.10mol/L HBS缓冲液10-60mL中，搅拌下加入丝裂霉素C 1.67-3.34g，期间加入0.5-1.0mol/L氢氧化钠或氢氧化钾水溶液维持pH为7.4；然后搅拌12小时反应液后将其浓缩至干，剩余物使用硅胶柱色谱分离得黄色至白色产物，即低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C。
3.根据权利要求2所述的低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C合成方法，其特征在于：缩合剂为二环己基碳二亚胺或1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二酰亚胺盐酸盐。
4.根据权利要求2所述的低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C合成方法，其特征在于：缚酸剂为吡啶、N-甲基吗啉、三乙胺、碳酸钾、碳酸钠或咪唑中的一种。
5.根据权利要求2所述的低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C合成方法，其特征在于：HBS缓冲液的pH为7.4。
6.根据权利要求2所述的低分子量L-聚谷氨酸-丝裂霉素C合成方法，其特征在于：硅胶柱色谱分离所采用的洗脱液为二氯甲烷与甲醇按体积比为10：1组成的混合物。
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