CN104045718B - 多功能融合多肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了多功能融合多肽及其制备方法和应用，属于生物工程制药领域。该多功能融合多肽为六种多肽中一种或其任意多种组合，可用于实体肿瘤、类风湿性关节炎以及新生血管性眼病的预防和治疗。本发明的多肽是通过人工合成方法制备，其特征在于通过抑制血管内皮细胞增殖和迁移，抑制血管新生，继而治疗与血管新生相关的疾病，包括实体肿瘤、类风湿性关节炎以及新生血管性眼病等。

Description

多功能融合多肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及药物领域，具体涉及一类多功能融合多肽及其制备方法和在制备治疗实体肿瘤、类风湿性关节炎以及新生血管性眼病药物中的应用。

背景技术

血管新生(angiogenesis)，指在原始血管丛或已存在血管的基础上以发芽方式形成新生血管的过程，从伤口治愈、胎盘形成以至胚胎发育等，血管新生在当中扮演着重要的角色。但与此同时，血管生成在多种病理条件下也会发生，所述病理条件包括：肿瘤生长和转移；炎性障碍，例如类风湿性关节炎、银屑病、骨关节炎、炎性肠病、克隆病、溃疡性结肠类以及其它炎性障碍；眼部新血管生成，如早产儿视网膜病变、局部缺血性视网膜病变、视网膜静脉或动脉闭塞、糖尿病性视网膜病变、脉络膜新生血管形成、年龄相关性黄斑变性(AMD)、角膜新生血管形成、新生血管性青光眼或角膜移植以及多种其它眼病中的新血管生成。

恶性肿瘤是人类健康的首要杀手，无限生长、侵袭和转移是肿瘤的恶性标志，也是导致治疗失败和死亡的主要原因。因此，控制肿瘤的生长、侵袭和转移是改善预后、提高生存率的主要措施。1971年Folkman首先提出肿瘤生长依赖血管新生的理论，肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的形态学基础，它不仅向肿瘤提供营养和氧气，也向宿主输出大量的肿瘤细胞导致肿瘤的生长和转移。绝大多数恶性实体肿瘤如卵巢癌、肝癌、宫颈癌和乳腺癌等都是血管依赖性肿瘤，因此，抑制肿瘤血管形成是重要的抗癌措施。

关节炎是危害人体健康的最常见疾病之一，特别是类风湿性关节炎，国内外很多研究者都在探讨其病因，寻找有效的预防和治疗方法以改变其预后不良的状况。类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种病因至今尚未肯定的慢性进行性的关节炎，通常认为它是一种自身免疫性疾患，是机体防御系统自相残杀所造成的结果，另外遗传、感染、寒冷潮湿等均可能是致病的因素。RA的病理过程中，血管新生是一种标志性的组织学改变，新生血管形成伴随滑膜增生和炎细胞浸润，是RA中血管翳形成及关节破坏的基础。因此，抑制新生血管的形成是治疗这类疾病的关键，通过抑制血管生成不仅可阻止向滑膜输送氧气和营养物质，并且可直接导致血管退化，从而抑制RA滑膜增生。

眼部新生血管主要包括虹膜新生血管(NVI)、脉络膜新生血管(CNV)和视网膜新生血管等，许多眼部病变与新生血管的发生有着密切的关系，常见新生血管性眼病主要包括新生血管性角膜疾病、新生血管性视网膜疾病、新生血管性脉络膜疾病、新生血管性青光眼等几大类。这些新生血管性病变多与眼组织的缺血、缺氧及炎症反应有关，由于新生血管不具备血管的正常生理结构，通透性高，容易破裂使血液流入玻璃体腔内，致使眼底出血，使患者视力模糊或者完全失去视觉，严重影响患者生活质量。因此，抑制血管新生是治疗上述血管新生性眼病的重要途径。

内皮抑素(ES或Endostatin)，是大分子胶原蛋白XVIII的羧基末端非胶原区片段，由183个氨基酸残基组成，相对分子质量为20kD。内皮抑素是通过抑制肿瘤新生血管形成从而阻断其营养供应的血管生成抑制因子，由于它能特异地作用于内皮细胞，对正常组织内的血管不会造成明显的影响，因此具有无毒副作用、不产生耐药性等优势。动物体内试验表明内皮抑素具有一定的抗肿瘤效果，但在临床试验中其抗肿瘤效果并不显著，最终被FDA驳回。相关文献报道内皮抑素的第6-49个氨基酸和第134-178个氨基酸均能够抑制人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移，且活性甚至高于内皮抑素本身。因此将内皮抑素截短，选取其中的活性片段进行研究，不仅利于研究整个大分子的机理，同时能降低开发成本，为该类多肽的开发提供参考。

整合素是一类识别多种细胞外基质成分的受体家族，广泛分布于细胞表面，能介导细胞与细胞外基质及细胞与细胞之间的相互黏附，并能通过连接胞内细胞骨架蛋白和细胞外基质分子的相互作用参与血管生成。该类受体由α和β两条链组成，目前已发现15种α链和9种β链，不同的α链和β链的组合决定配体的特异性，整合素α1β1、α2β1、α3β1、α6β1、α6β4、α5β1、αvβ3、αvβ5参与血管生成和细胞迁移，其中αvβ3可影响癌变中的几个关键过程。αvβ3可以表达于多种细胞类型，能识别配体分子中的精-甘-天冬序列(Arg-Gly-Asp，RGD)，并参与肿瘤的血管生成、侵袭、转移、炎症、伤口愈合和凝血等生理和病理过程。因此，RGD序列可以作为一种载体，靶向运输到肿瘤血管新生部位，从而对新生血管性疾病达到更高效率的治疗。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)家族是一类结构相似和功能相关的蛋白内切酶，MMPs在生理状态下参与胚胎形成、新生血管的形成及伤口的愈合，在病理状态下参与组织重构、风湿性关节炎、恶性肿瘤转移、动脉粥样硬化(AS)和急性冠脉综合征(ACS)的病理进程。它们不仅能切割各种细胞外基质，为炎症细胞和肿瘤细胞的转移打开“通路”；可以切割细胞因子或趋化因子，影响炎症细胞的募集；还可以切割各种膜连接分子，包括受体和细胞间连接分子，从而调节这些分子的功能。

基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)是基质金属蛋白酶的典型代表，研究发现MMP-9可以在几个方面促进肿瘤生长：首先，MMP-9是肿瘤部位血管增生的“开关”，它可以切割细胞外基质，释放连接于基质上的VEGF，促进血管增生，血管增生是肿瘤生长的前提条件；MMP-9还可以通过从细胞外基质释放VEGF的方式促进淋巴管增生，促进肿瘤转移；其次，肿瘤细胞以及进入肿瘤组织的巨噬细胞和T细胞表面都表达有TNF-α前体，几种金属蛋白酶(包括MMP-9)可以切割并释放有活性的TNF-α，促进血管增生和抑制肿瘤细胞的凋亡。另外，肿瘤部位的炎症细胞表达的MMP-9可以通过两个方面激活TGF-β途径，一是把TGF-β前体切割成有活性的TGF-β，二是切割TGF-β连接蛋白，把TGF-β从细胞外基质上释放出来，活化的TGF-β抑制免疫系统，却不抑制肿瘤本身的生长，从而间接的促进肿瘤生长。

MMP抑制剂不但可抑制肿瘤的生长和转移，还具有靶向功能，不但可早期检测到肿瘤组织，还可以把目的物带到肿瘤部位。MMP-9多肽抑制剂的优势在于，其序列可以连接到其它有抗肿瘤活性的多肽或蛋白质上，新的分子不但可以抑制MMP-9活力，还可以通过MMP-9多肽抑制剂部分把有抗肿瘤活性的成分富集于肿瘤部位，提高其抗肿瘤效果。

多功能融合多肽是近年在治疗新生血管性疾病中引起极大重视的一类药物，针对肿瘤血管形成分子机制所设计的抗血管生成类药物主要包括内源性多功能融合多肽、VEGF通路抑制剂、COX-2抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂等。在这些多功能融合多肽中，尤其以血管抑素和内皮抑素最引人注目，但其缺陷也非常明显：作用靶点不明确，对血管的专一性和选择性不强，治疗效果有限，导致用药量较大，产生不同程度的耐药性。因此，一个好的抗血管生成药物应该对新生血管的标记分子具有选择性，以达到对新生血管的靶向性作用，从整体上提高药物对血管生成的抑制效果。CN102746380所报道Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu(其中Pyr为3-(3-吡啶基)-L-丙氨酸，Bip为L-4,4'-联苯丙氨酸)多肽片段具有抑制基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-9和肿瘤坏死因子释放酶的活力，因此该多肽具有抗肿瘤的作用。但并未有进一步的文献公开在其他领域的效果和应用。

发明内容

1、发明目的

针对现有的多功能融合多肽作用靶点不明确，对血管的专一性和选择性不强等问题，本发明提供了一种多功能融合多肽及其制备方法和应用，其对多种实体肿瘤、类风湿性关节炎以及新生血管性眼部疾病有很好的预防和治疗效果，增加其适应症范围。

2、技术方案

多功能融合多肽，其结构为下述的一种：

多肽Ⅰ：Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu--Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp(其中Pyr为3-(3-吡啶基)-L-丙氨酸，Bip为L-4,4'-联苯丙氨酸)；

多肽Ⅱ：Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu(其中Pyr为3-(3-吡啶基)-L-丙氨酸，Bip为L-4,4'-联苯丙氨酸)；

多肽Ⅲ：Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu(其中Pyr为3-(3-吡啶基)-L-丙氨酸，Bip为L-4,4'-联苯丙氨酸)；

多肽Ⅳ：Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala(其中Pyr为3-(3-吡啶基)-L-丙氨酸，Bip为L-4,4'-联苯丙氨酸)；

多肽Ⅴ：Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala；

多肽Ⅵ：Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp。

上述多功能融合多肽中的任意两种或两种以上的组合。

上述多功能融合多肽多肽在制备治疗实体肿瘤、类风湿性关节炎以及新生血管性眼病药物中的应用。

所述的肿瘤为起源于人的头颈部、脑部、甲状腺、食管、胰腺、肺脏、肝脏、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠或直肠、卵巢、子宫颈、子宫、前列腺、膀胱或睾丸的原发或继发的癌、黑色素瘤、血管瘤以及肉瘤。

所述的多功能融合多肽在制备治疗在制备治疗或预防类风湿性关节炎药物中的应用。

所述新生血管性眼病包括虹膜新生血管性眼病、脉络膜新生血管性眼病、视网膜新生血管性眼病或角膜新生血管性眼病。

所述的多功能融合多肽的制备方法，以Fmoc-wang-resin或Fmoc-CTC-resin为起始原料，然后用保护氨基酸依次接二肽至二十四肽，接肽工作完成后充分洗涤，然后切肽、后处理即得多功能融合多肽粗品。将粗品溶解，用制备型高效液相经过两次纯化，浓缩冻干得到纯品，最后经过第三次纯化得到多肽。

3、有益效果

本发明公开的多肽具有抑制新生血管生成和抑制包括MMP9在内的几种基质金属蛋白酶活力两种作用，在多肽Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ中加入RGD序列(Arg-Gly-Asp)，使该多肽序列对整合素具有靶向结合作用和亲和性，并通过抑制胞内细胞骨架蛋白和细胞外基质分子的相互作用，来抑制细胞与细胞外介质及细胞与细胞间的信号传导，从而抑制血管生成。前期研究发现多肽能够抑制内皮细胞的增殖、迁移，并发现其能抑制多种肿瘤细胞的生长；进一步研究证实其对类风湿性关节炎有一定的治疗作用，此外对眼科疾病也就有很好的治疗效果。说明本发明涉及的多肽设计科学合理，可行有效，能作为治疗或预防血管及炎症相关疾病，并极大地拓展了该多肽的治疗谱，为将来药物开发提供新的思路和前景。

多肽Ⅰ-Ⅵ是新的氨基酸序列，本申请在前人的基础上构建新的多肽序列，新序列拓展了原来多肽的应用范围，将其应用于治疗类风湿性关节炎和新生血管性眼病领域。

研究发现，本发明中的多肽序列Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala具有抑制血管生成的作用。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列是整合素的一个重要配体，含有RGD序列的多肽X-Arg-Gly-Asp(X可以是1个或多个非极性氨基酸)能够特异性的识别整合素。本发明的多功能融合多肽多肽是在具有抑制血管生成作用的序列Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala的C端或N端连接上与整合素家族具有特异结合能力的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列和(或)基质金属蛋白酶抑制剂多肽序列Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu(为增加整个分子的柔性在多肽Ⅰ-Ⅵ中加入4个Gly为linker)，构建出了一系列具有靶向性的抑制新生血管生成的多肽，且保证所获得序列的不同功能片段相互不受影响，各自发挥作用。

经过大量实验获知该类多功能融合多肽在体外能够明显抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖、迁移，对人宫颈癌HeLa细胞、人结肠癌HCT116细胞、人脑胶质瘤U87细胞、人乳腺癌MDA-MB-231等肿瘤细胞的增殖有显著的抑制作用。

本发明的多肽Ⅰ-Ⅵ可以靶向到RA中血管翳形成过程中的新生血管内皮，抑制新生血管形成，进而达到预防或治疗类风湿性关节炎的效果。发明人经过大量实验获知多肽Ⅰ-Ⅵ能够抑制佐剂型大鼠类风湿关节炎和DBA/1小鼠胶原型类风湿性关节炎的发展，体内实验证明具有显著的治疗类风湿型关节炎的效果，并且副作用少，用量小成本降低。

经过大量实验获知该类多功能融合多肽多肽均能够抑制人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)的增殖，在一定范围内呈剂量依赖关系。通过多功能融合多肽多肽对小鼠角膜新生血管和兔虹膜新生血管的作用，表明多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ、多肽Ⅳ、多肽Ⅴ和多肽Ⅵ六种多功能融合多肽均能够抑制角膜和虹膜新生血管的生长，有潜力开发为治疗角膜新生血管性眼病和虹膜新生血管性眼病的药物，具有潜在的治疗新生血管性疾病的作用。

脉络膜位于眼球后部，实验证明多功能融合多肽多肽能够改善脉络膜血流，说明用药后，通过全身循环或巩膜-葡萄膜-视神经途径，能尽快到达脉络膜，对年龄相关性黄斑变性(AMD)的脉络膜新生血管形成有抑制作用，可望用于早期AMD以及其它脉络膜新生血管性疾病的预防或治疗。同时通过多功能融合多肽多肽对大鼠脉络膜新生血管的作用，表明六种多功能融合多肽多肽能够抑制大鼠脉络膜新生血管的生成，说明六种多功能融合多肽对包括年龄相关性黄斑变性在内的脉络膜新生血管性眼病具有一定的治疗作用。

对OIR小鼠模型施用多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ、多肽Ⅳ、多肽Ⅴ和多肽Ⅵ后，六种多肽均能够改善视网膜病理性新生血管的形成，减少视网膜中新生血管丛。说明本发明的多功能融合多肽能够抑制小鼠眼部视网膜的新生血管形成，在一定程度上能够预防或治疗视网膜新生血管性眼病。

本申请多肽Ⅰ-Ⅵ科学合理、可行有效，能作为制备治疗人类实体肿瘤、类风湿性关节炎以及新生血管性眼病的治疗药物，极大拓展了该多功能融合多肽的治疗谱，为将来药物开发提供新的思路和前景。

附图说明

附图1多功能融合多肽多肽Ⅰ对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)的增殖抑制作用；

附图2多功能融合多肽多肽Ⅱ对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)的增殖抑制作用；

附图3多功能融合多肽多肽Ⅲ对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)的增殖抑制作用；

附图4多功能融合多肽多肽Ⅳ对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)的增殖抑制作用；

附图5多功能融合多肽多肽Ⅴ对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)的增殖抑制作用；

附图6多功能融合多肽多肽Ⅵ对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)的增殖抑制作用；

附图7多功能融合多肽多肽对BALB/c小鼠角膜新生血管的作用；

附图8多功能融合多肽多肽对大鼠脉络膜新生血管的作用；

附图9多功能融合多肽多肽在OIR小鼠中对视网膜血管的作用；

附图10多功能融合多肽多肽Ⅰ对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移抑制作用；

附图11多功能融合多肽多肽Ⅱ对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移抑制作用；

附图12多功能融合多肽多肽Ⅲ对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移抑制作用；

附图13多功能融合多肽多肽Ⅳ对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移抑制作用；

附图14多功能融合多肽多肽Ⅴ对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移抑制作用；

附图15多功能融合多肽多肽Ⅵ对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移抑制作用；

附图16多功能融合多肽多肽对人宫颈癌HeLa细胞的增殖抑制作用；

附图17多功能融合多肽多肽对人结肠癌HCT116细胞的增殖抑制作用；

附图18多功能融合多肽多肽对人脑胶质瘤U87细胞的增殖抑制作用；

附图19多功能融合多肽多肽对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用。

具体实施方式

实施例1多功能融合多肽多肽的制备及检验

多肽采用固相合成法合成，采用制备型HPLC进行分离纯化，分析型RP-HPLC测定多肽的纯度。

多肽Ⅰ-Ⅵ固相合成法是以Fmoc-wang-resin或Fmoc-CTC-resin(吉尔生化有限公司)为起始原料，然后用保护氨基酸依次接二肽至二十四肽，接肽工作完成后充分洗涤，然后切肽、后处理即得多功能融合多肽粗品。将粗品溶解，用制备型高效液相经过两次纯化，浓缩冻干得到纯品，最后经过第三次纯化得到多肽精制品。该方法不仅能保证合成的效率，还可提高产物纯度。

1.接肽(包括接二肽至二十四/十七/十三肽)的步骤如下：

称取Fmoc-wang-resin或Fmoc-CTC-resin适量，倒入玻璃砂芯反应柱中，加入CH₂Cl₂适量使树脂充分膨胀。

a.脱帽：加入六氢吡啶/DMF的脱帽液适量，反应一段时间后将脱帽液抽干，中间用DMF洗涤一次，然后再加入一次脱帽液适量反应，脱去Fmoc保护基。

b.洗涤：将脱帽液抽干，用DMF洗涤树脂几次，充分洗净副产物。

c.缩合：将用于接肽的保护氨基酸和激活剂溶于DMF和缩合剂中，摇匀，温度控制在34℃左右，在反应釜中充分反应。

d.洗涤：将反应液抽干，用DMF充分洗涤树脂，洗净副产物。

所述切肽的步骤如下：

将抽干的树脂装入圆底烧瓶中，加入裂解液充分裂解合好的二十四肽中间体，用砂芯漏斗将树脂与多肽分离，所述的裂解液的体积组成为：三氟乙酸：苯酚：水：苯甲硫醚：EDT＝90：3：3：2：2。

2.后处理步骤如下：先加无水乙醚到切割液中将多肽析出，然后离心，把清液倒掉，然后再用无水乙醚洗涤多肽，抽干得多肽粗品。

3.纯化的步骤如下：

a.溶解：称取粗品配制成5-20g/L的溶液，用0.45μm的混合滤膜过滤。

制备：通过半制备型高效液相色谱进行一次纯化、二次纯化和三次纯化得到多肽精制合格品，流动相：A相乙腈，B相0.1％TFA水溶液。

①一次纯化：用30％-40％的乙腈和60％-70％的缓冲溶液，流速为50mL/min-100mL/min，冲洗10min平衡制备柱。溶解过滤后的粗品用输液泵上样。

表1一次纯化洗脱梯度

收集紫外波长220nm吸收值大于200mV的溶液，检测纯度大于95％的合并作为峰顶，待做二次分离纯化。

②二次纯化：将一次纯化收到的峰顶旋转蒸发去除有机溶剂后，用输液泵上样。

表2二次纯化洗脱梯度

收取在紫外波长220nm吸收大于200mV的溶液，通过检测纯度大于98％的作为合格。

b.浓缩、过滤、冻干：将合格溶液用旋转蒸发仪37℃减压浓缩，除去残留溶剂和注射用水。最后用0.22μm滤膜过滤，滤液装入冻干盘中，用冷冻干燥机进行冷冻干燥得纯品。

③三次纯化：二次纯化所得纯度大于98％的合格样品进行三次纯化制备多肽精制品。

表3三次纯化洗脱梯度

收取在紫外波长220nm吸收大于220mV的溶液，通过检测合并大于99.5％的样品，即为精制合格品。

4.纯度检测

收集冻干后的纯化产物，通过分析型RP-HPLC进行多肽纯度检测。分析条件为：流动相：ACN(+0.1％TFA)、H₂O(+0.1％TFA)；乙腈线性梯度：10％-100％；流速：1mL/min；运行时间：20min；上样量：20μL；检测波长：220nm。

表4RP-HPLC检测多功能融合多肽多肽Ⅰ-Ⅵ的纯度

结果：合成的多肽经反向液相色谱分析进行纯度鉴定结果表4所示：多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ、多肽Ⅳ、多肽Ⅴ、多肽Ⅵ纯度分别为98.87％，98.23％，98.02％，98.52％，98.46％，98.74％，纯度均大于95％，符合设计要求。

本实验成功采用固相合成法合成多功能融合多肽多肽，此方法重复性高，可操作性强，污染少；实验可采用两种树脂来合成多肽即：wang resin或CTC resin；实验用wang resin，相对其它树脂比较稳定，副反应少，工艺粗品峰型较好，纯化相对收率高，所以成本相对较低；实验用CTC resin反应受温度影响小，反应速率快；并使用反相高效液相法纯化多肽，使用梯度洗脱相对于等度洗脱来说，分离效果更好，分离过程中，保留时间合适，生产效率高，纯度高。

实施例2

多功能融合多肽多肽对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)的增殖抑制作用

采用MTT法检测多功能融合多肽多肽抑制人视网膜血管内皮细胞增殖的活性。HRCEC细胞在37℃、5％CO₂的培养箱中培养至密度90％以上时用胰蛋白酶消化收集，用培养液重悬细胞并在显微镜下计数，将细胞浓度调整为3.0×10⁴个/mL，将细胞悬液接种到96孔板中，每孔100μL，并于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜。待细胞完全贴壁后，以加入多功能融合多肽多肽作为给药组，Avastin作为阳性对照组，以不加任何药物的培养液作为空白对照组，用培养液稀释到各个预定浓度。将各个稀释液分别加入96孔板中，每孔100μL，在37℃，5％CO₂培养箱孵育48h。向96孔板中每孔加入20μL5mg/mL的MTT，继续培养4h。吸去培养基，每孔加入100μL DMSO溶解。用酶标仪在检测波长为570nm，参比波长为630nm处测定吸光值，并计算生长抑制率(proliferation inhibition，PI)，公式如下：

PI(％)＝1-给药组/阴性组

试验独立重复3次，试验得到的结果以mean±SD表示，并进行统计T检验，*P＜0.05为显著性差异，**P＜0.01为极显著性差异。

表5.多功能融合多肽多肽Ⅰ对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)增殖抑制作用

结果：见表5和图1，与阴性对照相比，在0.5-64μg/mL剂量下，多功能融合多肽多肽Ⅰ能够显著抑制人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)的增殖作用，并且呈现剂量依赖关系，当多功能融合多肽多肽Ⅰ的剂量为64μg/mL时，对(HRCEC)增殖的抑制率达到最大值87.49％。

表6.多功能融合多肽多肽Ⅱ对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)增殖抑制作用

结果：见表6和图2，与阴性对照相比，多肽II能够抑制HRCEC的增殖作用，在4-64μg/mL剂量下，多肽II对细胞增殖的抑制率与阴性对照相比有极显著性的差异(**P＜0.01)，并且呈现剂量依赖关系。当多功能融合多肽多肽II的剂量为64μg/mL时，对(HRCEC)增殖的抑制率达到最大值89.60％。

表7.多功能融合多肽多肽III对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)增殖抑制作用

结果：见表7和图3，与对照相比，多肽III能够抑制HRCEC的增殖作用，在16-64μg/mL剂量下，多肽III对细胞增殖的抑制率与阴性对照相比有极显著性的差异(**P＜0.01)，并且呈现剂量依赖关系。当多功能融合多肽多肽III的剂量为64μg/mL时，对(HRCEC)增殖的抑制率达到最大值69.02％。

表8.多功能融合多肽多肽Ⅳ对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)增殖抑制作用

结果：见表8和图4，与对照相比，多肽Ⅳ能够抑制HRCEC的增殖作用，在0.5-8μg/mL剂量下，多肽Ⅳ能显著抑制细胞增殖(*P＜0.05)；在16-64μg/mL时，多肽Ⅳ对细胞增殖的抑制率与阴性对照相比有极显著性的差异(**P＜0.01)，并且呈现剂量依赖关系。当多功能融合多肽多肽Ⅳ的剂量为64μg/mL时，对(HRCEC)增殖的抑制率达到最大值71.89％。

表9.多功能融合多肽多肽Ⅴ对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)增殖抑制作用

结果：见表9和图5，与阴性对照相比，在0.5-8μg/mL剂量下，多肽Ⅴ对HRCEC细胞增殖的抑制率与阴性对照相比有显著性的差异(*P＜0.05)；在16-64μg/mL时，多肽Ⅴ对细胞增殖的抑制率与阴性对照相比有极显著性的差异(**P＜0.01)，并且呈现剂量依赖关系。当多功能融合多肽多肽Ⅴ的剂量为64μg/mL时，对(HRCEC)增殖的抑制率达到最大值70.09％。

表10.多功能融合多肽多肽Ⅵ对人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)增殖抑制作用

结果：见表10和图6，与对照相比，在0.5-8μg/mL剂量下，多肽Ⅵ对HRCEC细胞增殖的抑制率与阴性对照相比有显著性的差异(*P＜0.05)；在16-64μg/mL时，多肽Ⅵ对细胞增殖的抑制率与阴性对照相比有极显著性的差异(**P＜0.01)，并且呈现一定的剂量依赖关系。当多功能融合多肽多肽Ⅵ的剂量为64μg/mL时，对(HRCEC)增殖的抑制率达到最大值73.99％。

实施例3

血管生成阻断剂多肽对BALB/c小鼠角膜新生血管的作用

(1)BALB/c小鼠碱烧伤诱导角膜新生血管模型的制备：

健康BALB/c小鼠35只，雄性，体重20-25g，裂隙灯显微镜下检查双眼眼前段及附属器，排除眼部病变。碱烧伤模型制备前1d予0.3％氧氟沙星眼药水点眼，每日2次。小鼠经腹腔注射1.8％Avertin麻醉后，用镊子夹住直径为2mm的单层滤纸片，浸于1mol/L NaOH溶液中，使其达饱和状态，去除多余液体，将滤纸片置于BALB/c小鼠角膜中央40S，弃掉滤纸，立即用15mL的PBS充分冲洗烧伤区及结膜囊1min。棉签拭去过多水分，于手术显微镜下以角膜刮铲平行于角膜缘的方式旋转刮除角膜上皮，注意勿伤及上皮下基质层及角膜缘，术毕结膜囊内涂红霉素眼膏预防感染。

(2)实验动物分组及标本获取

35只小鼠按随机分组，标记为多肽Ⅰ实验组、多肽Ⅱ实验组至多肽Ⅵ实验组和对照组，每组5只，自碱烧伤后分别给予50μg多肽I-Ⅵ和生理盐水玻璃体腔注射，每日1次，持续1周，碱烧伤后1d、7d、14d于裂隙灯显微镜下观察各组角膜的炎症反应及新生血管情况。碱烧伤后第14d于带眼前段照相的裂隙灯显微镜下拍照记录各组角膜新生血管形成情况，随即以颈椎脱臼法处死所有小鼠并摘除眼球，生理盐水冲洗血迹，4％多聚甲醛固定1.5h，含30％蔗糖的PBS中脱水过夜，OCT冰冻切片包埋剂包埋，-80℃冰箱中保存，8μm冰冻切片，免疫组织化学法检测CD31的表达。

(3)角膜组织微血管密度定量测定

微血管密度(Microvessel density，MVD)是评价血管形成的指标。采用抗CD31抗体免疫组织化学法标记血管内皮细胞，计数单位面积中的微血管数目，以此衡量新生血管生成的程度。统计微血管的标准：显微镜下观察角膜组织中与邻近组织分界清楚，并被染成棕黄色或褐色的内皮细胞或细胞团均计入新生血管。在10×20镜下计数整张切片新生血管数目，角膜组织片照相后以图像处理软件Image J计算出整个角膜组织片面积，求出整张切片的新生血管密度。

试验独立重复3次，试验得到的结果以mean±SD表示，并进行统计T检验，*P＜0.05为显著性差异，**P＜0.01为极显著性差异。

表11.多功能融合多肽多肽对小鼠角膜新生血管的作用

结果：见表11和图7，CD31作为微血管标记物，主要表达于血管内皮细胞胞质中，染色阳性细胞为血管内皮细胞染成棕黄色或褐色，无背景染色。多肽Ⅰ、多肽Ⅱ和多肽Ⅲ实验组CD31阳性新生血管与对照组69.66±7.412相比显著减少。多肽Ⅰ实验组切片MVD值为31.49±5.465，多肽Ⅱ实验组切片MVD值为35.71±4.842，多肽Ⅲ实验组切片MVD值为37.17±3.648，与对照组相比均有极显著性差异(**P＜0.01)，多肽Ⅰ、多肽Ⅱ和多肽Ⅲ对小鼠角膜新生血管抑制作用的抑制率分别为54.79％、48.74％、46.64％。多肽Ⅳ、多肽Ⅴ和多肽Ⅵ实验组CD31阳性新生血管与对照组69.66±7.412相比减少。多肽Ⅳ实验组切片MVD值为44.57±6.953，多肽Ⅴ实验组MVD值为42.63±3.047，多肽Ⅵ实验组MVD值为40.25±2.805，与对照组69.66±7.412相比有显著性差异(*P＜0.05)，多肽Ⅳ、多肽Ⅴ和多肽Ⅵ对小鼠角膜新生血管抑制作用的抑制率分别为46.89％、48.01％、42.83％。实验结果表明多肽Ⅰ、多肽Ⅱ和多肽Ⅲ三种多功能融合多肽能够极显著抑制角膜新生血管的生长，多肽Ⅳ、多肽Ⅴ和多肽Ⅵ三种多功能融合多肽能够显著的抑制角膜新生血管的生长，因此六种多肽均可能作为治疗角膜新生血管性眼病的药物。

实施例4

多功能融合多肽多肽对家兔虹膜新生血管的作用

采用577nm氩离子激光凝阻家兔视网膜主分支静脉，经眼底荧光素血管造影(FFA)证实静脉阻塞成功。5-12天后眼虹膜荧光素血管造影(IFA)显示虹膜血管与正常对照组对比荧光素渗漏明显，证实虹膜新生血管化的动物模型(NVI)形成。[0125]取造模成功的21只眼，随机分成7组，每组3只。分别标记为阴性对照组、多肽Ⅰ治疗组、多肽Ⅱ治疗组、多肽Ⅲ治疗组、多肽Ⅳ治疗组、多肽Ⅴ治疗组和多肽Ⅵ治疗组，分别以生理盐水、200μg多肽Ⅰ、200μg多肽Ⅱ、200μg多肽Ⅲ、200μg多肽Ⅳ、200μg多肽Ⅴ和200μg多肽Ⅵ玻璃体腔注射给药，每日1次，持续2周。第3周用光学及电子显微镜观察。

结果：光学显微镜下可观察到虹膜前表面主要是由纤维组织组成的纤维血管膜残迹，仅有极少的开放血管腔。在虹膜基质内可看到血管残存物，为坏死细胞及细胞碎片。而光镜下的对照眼的虹膜表面为有分枝的和潜在管腔的纤维血管膜；治疗组虹膜的超微结构有一系列的退行性改变：虹膜基质中部的大血管的内皮细胞有正常的细胞核、细胞质和细胞连接，虹膜基质中及虹膜前表面有毛细血管残迹，周围有细胞碎片和巨噬细胞浸润，无潜在管腔的毛细血管及退变的壁细胞，表明新生血管消退。

通过虹膜新生血管化的动物模型实验，证明多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ、多肽Ⅳ、多肽Ⅴ和多肽Ⅵ能够抑制新生血管形成并使已形成的血管退化。

实施例5

多功能融合多肽多肽对大鼠脉络膜新生血管的作用

用846复合麻醉剂0.5mL/kg腹腔注射充分麻醉6-8周雄性BN大鼠，激光光凝前5min用复方托品酰胺眼液滴眼一次，充分散大双眼瞳孔。固定动物，在-53.00D角膜接触镜辅助下，围绕视盘并在距视盘2PD位置等距离行氪离子激光光凝，共计8个光凝斑，激光波长为647.1nm，功率为350mW，光凝斑直径和时间分别为50μm及0.05s。光凝后立刻进行眼底照相。于光凝后3、7、14、21、28分别进行FFA、组织病理及透射电镜检查。

通过眼底照相及FFA检查证实，光凝后第21天光凝斑荧光素渗漏达到高峰，同时进行病理组织学检查。光凝后21天，光镜下显示CNV呈现显著的纤维血管增殖，其中可见大量新生血管，管腔内可见红细胞；镜下显示脉络膜黑色素细胞间有毛细血管呈凝聚性改变，内皮细胞凝聚。表明21天后大鼠脉络膜新生血管模型形成。

将造模成功的35只大鼠，随机分成7组，每组5只大鼠。分别标记为空白对照组、多肽Ⅰ治疗组、多肽Ⅱ治疗组、多肽Ⅲ治疗组、多肽Ⅳ治疗组、多肽Ⅴ治疗组和多肽Ⅵ治疗组，分别以生理盐水、200μg多肽Ⅰ、200μg多肽Ⅱ、200μg多肽Ⅲ、200μg多肽Ⅳ、200μg多肽Ⅴ和200μg多肽Ⅵ玻璃体腔注射，每日1次，持续1周。给药后3天、7天、14天及28天均进行FFA检查。

表12.多功能融合多肽多肽对大鼠脉络膜新生血管的作用

结果：见表12和图8，各实验组给药后不同时间CNV发生率(发生渗漏的光斑数/总光斑数)。FFA检测，给药后3天，多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ、多肽Ⅳ、多肽Ⅴ和多肽Ⅵ六组治疗组荧光素渗漏与用药前相比无明显变化；给药后7、14天，治疗组荧光素渗漏比用药前逐渐减轻；给药后28天，荧光素渗漏相比用药后14天更少。说明六种多功能融合多肽多肽能够治疗大鼠脉络膜新生血管，有可能开发成为治疗脉络膜新生血管性眼病的药物。

实施例6

多功能融合多肽多肽在OIR小鼠中对视网膜血管的影响

OIR模型的建立：在C57/B16小鼠出生后第7天至第12天将小鼠幼畜及其母鼠暴露置于75％高氧环境中，可致其中央视网膜中毛细管迅速消失。在第12天返回到室内空气中，暴露与高氧中的视网膜血管迅速消失，引起广泛的异常新生血管形成，视网膜的中央部分长期在很大程度上保持无血管状态。在血管消失完全之后，于第13天向玻璃体内注射多肽(给药组，多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ、多肽Ⅳ、多肽Ⅴ和多肽Ⅵ剂量均为50μg)或生理盐水(阴性组)，在第17天对视网膜血管进行评价(为标记未闭合的血管，将50mL德克萨斯红标记的番茄凝集素注射入左心室并循环5min)。

表13.多功能融合多肽多肽在OIR小鼠中对视网膜血管的作用

多功能融合多肽多肽在OIR小鼠中对视网膜血管的影响结果见表13和图9：对OIR小鼠施用多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ、多肽Ⅳ、多肽Ⅴ和多肽Ⅵ后，能够改善病理性新生血管形成。与阴性对照相比，用多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ、多肽Ⅳ、多肽Ⅴ和多肽Ⅵ处理的OIR小鼠视网膜中新生血管丛明显减少，所占的面积分别减少58.60％，61.86％，43.72％，52.09％，45.58％和46.98％。

实施例7

多功能融合多肽多肽对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移抑制作用

将10mg/mL Matrigel用HUVEC专用培养基以1∶2稀释，涂布于transwell小室膜上，室温风干。将培养到对数生长期的HUVEC细胞用胰蛋白酶消化液消化，收集，用PBS洗涤两次后用空白HUVECs专用培养基重悬。在显微镜下计数，将细胞浓度调整到1×10⁵个/mL。配制各组的试验用液，用空白HUVECs专用培养基稀释到100μL。将细胞接种到transwell小室中，每孔100μL，并且将各组试验用液加入小室中。24孔板中加入0.6mL含5％胎牛血清和1％ECGS的内皮细胞培养液刺激细胞迁移，于5％CO₂，37℃培养24h。弃去孔中培液，用90％酒精常温固定30min，0.1％结晶紫常温染色10min，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜下观察并选择四个视野拍照计数。按照公式计算迁移抑制率(migration inhibition，MI)：

$\mathrm{MI}(\%)=1-\frac{N_{\mathrm{test}}}{N_{\mathrm{control}}}\×100\%$

其中N_test为测试组的细胞迁移数，N_control为空白对照组的细胞迁移数。试验独立重复3次，试验得到的结果计算mean±SD，并进行统计t检验，*P＜0.05为显著性差异，**P＜0.01为极显著性差异。

表14.多功能融合多肽多肽Ⅰ对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移抑制作用

结果：见表14和图10，在多功能融合多肽多肽Ⅰ的作用下，迁移的内皮细胞数显著减少。与空白对照组相比，多肽Ⅰ能抑制5％胎牛血清及1％ECGS诱导的HUVEC的迁移作用。在2μg/mL和4μg/mL两个剂量下，多肽Ⅰ对细胞迁移的抑制作用与空白对照相比有极显著性差异(**P＜0.01)，抑制率均达到50％以上，分别为50.79％和62.21％，当剂量为4μg/mL时，多功能融合多肽多肽Ⅰ对HUVEC细胞迁移的抑制率达到最大值62.21％。

表15.多功能融合多肽多肽Ⅱ对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移抑制作用

结果：见表15和图11，在多功能融合多肽多肽Ⅱ的作用下，迁移的内皮细胞数显著减少。与空白对照组相比，多肽Ⅱ能抑制5％胎牛血清及1％ECGS诱导的HUVEC的迁移作用。在2μg/mL、4μg/mL和8μg/mL三个剂量下，多肽Ⅱ对细胞迁移的抑制作用与空白对照相比有极显著性差异(**P＜0.01)，当剂量为4μg/mL时，多功能融合多肽多肽Ⅱ对HUVEC细胞迁移的抑制率达到最大值63.07％。

表16.多功能融合多肽多肽Ⅲ对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移抑制作用

结果：见表16和图12，在多功能融合多肽多肽Ⅲ的作用下，迁移的内皮细胞数显著减少。与空白对照组相比，多肽Ⅲ能抑制5％胎牛血清及1％ECGS诱导的HUVEC的迁移作用。在0.25-2μg/mL剂量下，多肽Ⅲ对细胞迁移的抑制作用与空白对照相比有显著性差异(*P＜0.05)，在4-16μg/mL剂量下，多功能融合多肽多肽Ⅲ对细胞迁移的抑制作用与空白对照相比有极显著性差异(**P＜0.01)，抑制率均达到50％以上，分别为52.79％，60.48％和54.99％，当多功能融合多肽多肽Ⅲ的剂量为8μg/mL时，对HUVEC细胞迁移的抑制率达到最大值60.48％。

表17.多功能融合多肽多肽Ⅳ对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移抑制作用

结果：见表17和图13，在多功能融合多肽多肽Ⅳ的作用下，迁移的内皮细胞数显著减少。与空白对照组相比，多肽Ⅳ能抑制5％胎牛血清及1％ECGS诱导的HUVEC的迁移作用。在0.25-2μg/mL剂量下，多功能融合多肽多肽Ⅳ对细胞迁移的抑制作用与空白对照相比有显著性差异(*P＜0.05)，在4-16μg/mL剂量下，多肽Ⅳ对细胞迁移的抑制作用与空白对照相比有极显著性差异(**P＜0.01)，当多功能融合多肽多肽Ⅳ的剂量为8μg/mL时，对HUVEC细胞迁移的抑制率达到最大值51.63％。

表18.多功能融合多肽多肽Ⅴ对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移抑制作用

结果：见表18和图14，在多功能融合多肽多肽Ⅴ的作用下，迁移的内皮细胞数显著减少。与空白对照组相比，多肽Ⅴ能抑制5％胎牛血清及1％ECGS诱导的HUVEC的迁移作用。在0.5-8μg/mL剂量下，多功能融合多肽多肽Ⅴ对细胞迁移的抑制作用与空白对照相比有显著性差异(*P＜0.05)，在16μg/mL和32μg/mL两个剂量下，多肽Ⅴ对细胞迁移的抑制作用与空白对照相比有极显著性差异(**P＜0.01)，抑制率均达到50％以上，分别为59.73％和54.57％，当多功能融合多肽多肽Ⅴ的剂量为16μg/mL时，对HUVEC细胞迁移的抑制率达到最大值59.73％。

表19.多功能融合多肽多肽Ⅵ对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移抑制作用

结果：见表19和图15，在多功能融合多肽多肽Ⅵ的作用下，迁移的内皮细胞数显著减少。与空白对照组相比，多功能融合多肽多肽Ⅵ能抑制5％胎牛血清及1％ECGS诱导的HUVEC的迁移作用。在0.5-16μg/mL剂量下，多肽Ⅵ对细胞迁移的抑制作用与空白对照相比有显著性差异(*P＜0.05)，并且呈现一定的剂量依赖关系，当多功能融合多肽多肽Ⅵ的剂量为32μg/mL时，对HUVEC细胞迁移的抑制率达到最大值55.43％。

实施例8

多功能融合多肽多肽对人宫颈癌HeLa细胞的增殖抑制试验

采用MTT法检测多功能融合多肽多肽抑制人宫颈癌HeLa细胞生长的活性。肿瘤细胞在37℃、5％CO₂的培养箱中培养至90％以上的汇合度时用胰蛋白酶消化收集，用培养液重悬细胞并在显微镜下计数，将细胞浓度调整为2×10⁴个/mL，将细胞悬液接种到96孔板中，100μL/孔，并于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜。多功能融合多肽多肽用培养液稀释到各个预定浓度。恩度用培养液稀释到终浓度。待细胞完全贴壁后，将各个稀释液分别加入96孔板中(100μL/孔)。以加入多功能融合多肽多肽稀释液作为给药组，以加入紫杉醇作为阳性对照组，以不加任何药物的培养液作为阴性对照组。在37℃，5％CO₂培养箱孵育48h。向96孔板中加入5mg/mL的MTT，每孔20μL，继续培养4h。吸掉培养基，每孔加入150μL DMSO溶解，摇床10min轻轻混匀。用酶标仪在测定波长为570nm，参比波长为630nm处测定吸光值，并计算生长抑制率(proliferation inhibition，PI)，公式如下：

PI(％)＝1-给药组/阴性组

试验独立重复3次，试验得到的结果以mean±SD表示，并进行统计T检验，*P＜0.05为显著性差异，**P＜0.01为极显著性差异。

表20.多功能融合多肽多肽对人宫颈癌HeLa细胞增殖抑制作用

结果：见表20和图16，与阴性对照相比，在5-20μg/mL剂量下，多功能融合多肽多肽Ⅰ-Ⅵ在体外均能显著抑制人宫颈癌HeLa细胞的增殖，并且呈现明显的剂量依赖关系，当剂量为20μg/mL时，多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ、多肽Ⅳ、多肽Ⅴ和多肽Ⅵ对人宫颈癌HeLa细胞增殖抑制率达到最大值，分别为66.87％，64.42％，63.50％，63.80％，62.88％和63.50％。

实施例9

多功能融合多肽多肽对人结肠癌HCT116细胞的增殖抑制试验

采用MTT法检测多功能融合多肽多肽抑制人结肠癌HCT116细胞生长的活性。具体实施方案见实施例8。

表21.多功能融合多肽多肽对人结肠癌HCT116细胞增殖抑制作用

结果：见表21和图17，与阴性对照相比，在5-20μg/mL剂量下，多功能融合多肽多肽在体外均能显著抑制人结肠癌HCT116细胞的增殖，并且呈现明显的剂量依赖关系，当剂量为20μg/mL时，多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ、多肽Ⅳ、多肽Ⅴ和多肽Ⅵ对人结肠癌HCT116细胞增殖抑制率达到最大值，分别为69.74％，70.21％，62.88％，60.28％，59.34％和60.05％。

实施例10

多功能融合多肽多肽对人脑胶质瘤U87细胞的增殖抑制试验

采用MTT法检测多功能融合多肽多肽抑制人脑胶质瘤U87细胞生长的活性。具体实施方案见实施例8。

表22.多功能融合多肽多肽对人脑胶质瘤U87细胞增殖抑制作用

结果：见表22和图18，与阴性对照相比，在5-20μg/mL剂量下，多功能融合多肽多肽在体外均能显著抑制人脑胶质瘤U87细胞的增殖，并且呈现明显的剂量依赖关系，当剂量为20μg/mL时，多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ、多肽Ⅳ、多肽Ⅴ和多肽Ⅵ对人脑胶质瘤U87细胞增殖抑制率达到最大值，分别为68.78％，75.28％，60.22％，57.53％，56.89％和57.37％。

实施例11

多功能融合多肽多肽对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖抑制试验

采用MTT法检测多功能融合多肽多肽抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞生长的活性。具体实施方案见实施例8。

表23.多功能融合多肽多肽对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖抑制作用

结果：见表23和图19，与阴性对照相比，在5-20μg/mL剂量下，多功能融合多肽多肽在体外均能显著抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖，并且呈现明显的剂量依赖关系，当剂量为20μg/mL时，多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ、多肽Ⅳ、多肽Ⅴ和多肽Ⅵ对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖抑制率达到最大值，分别为80.92％，83.84％，74.85％，65.01％，67.44％和65.37％。

实施例12

多功能融合多肽多肽对胶原诱导小鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用

构建胶原型小鼠关节炎动物模型，研究多肽对小鼠胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis，CIA)的治疗作用。采用小鼠作为受试动物，SPF级DBA/1小鼠，雄性，7-8周龄，体重为18-22g，随机分组，分别是正常对照组，模型对照组，多肽Ⅰ至多肽Ⅵ组(10mg/kg)，阳性药对照组(甲氨蝶呤1mg/kg)。除正常组外，第0天各实验组建立小鼠CIA模型，方法是鸡软骨Ⅲ型胶原(cIII)用0.1mol/L醋酸溶解成4mg/mL的溶液，于4℃冰箱过夜。实验当天用Ⅲ型胶原与含4mg/mL Myeobaeterium tuberculosis strain H37Rv的完全弗氏佐剂(CFA)等体积充分乳化，待DBA/1小鼠麻醉后，于其尾部皮内每只注射乳化剂50μL进行致敏，21d后用4mg/mL的III型胶原(cIII)与不完全弗氏佐剂(IFA)等体积充分乳化后以相同剂量的乳化剂于尾部进行再次免疫。造模第30d起皮下注射给药：多肽Ⅰ至多肽Ⅵ(10mg/kg)组：每日两次，连续10d；阳性药对照组(甲氨蝶呤1mg/kg)：每5d一次，连续3次；正常对照组和模型对照组(生理盐水)：连续10d。分别于造模后第21天至第70天每3天称量体重、关节评分、分别检测左右后足足踝直径来观察药物对小鼠胶原型关节炎的影响。在第70d，脱臼处死小鼠。

关节炎评价指标如下：

(1)关节评分：四肢：按0-4五级评分：0＝无红斑或红肿；1＝轻微的红斑或肿胀，其中的一个前/后趾关节有红斑或肿胀；2＝多于一只趾出现红斑或肿胀；3＝踝或腕关节下的足爪肿胀；4＝包括踝关节在内的全部足爪肿胀。小鼠四只足分别评分，最高评分为16分。分别于造模后第21天至第70天每3天进行关节评分，并记录结果。

(2)测量足踝直径

分别于造模前和造模后第21天至第70天每3天用游标卡尺测量小鼠左、右足踝内侧到外侧的直径和足踝厚度，并记录结果。

试验独立重复3次，试验得到的结果以mean±SD表示，并进行统计T检验，表中*P＜0.05为显著性差异，**P＜0.01为极显著性差异。

表24.多功能融合多肽多肽对胶原型类小鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用

结果：造模后小鼠与正常小鼠相比较，在小鼠尾部皮内注射含灭活的结核分枝杆菌完全弗氏佐剂和胶原等体积混合的乳化剂，21天后尾部皮内注射不完全弗氏佐剂和胶原等体积混合的乳化剂左后，免疫后第27天，CIA小鼠足爪红肿，关节炎指数评分增高，模型组第45-60天为肿胀高峰，模型组自第35天开始体重几乎不增加，后期还略微有下降。

多肽Ⅰ至多肽Ⅵ在胶原诱导小鼠关节炎动物模型都能发挥体内免疫保护作用，结果见表24：阳性对照组、多肽Ⅰ至多肽Ⅵ组足爪肿胀度与模型组比较，均有极显著性差异(p**＜0.01)；阳性对照组、多肽Ⅰ至多肽Ⅵ组关节肿胀度与模型组比较，均有极显著性差异(p**＜0.01)；多肽Ⅰ至多肽Ⅵ组四肢评分显著低于模型对照组，与模型对照组比较极显著性差异(p**＜0.01)，实验结果具有统计学意义。

实施例13

多功能融合多肽多肽对佐剂型大鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用

构建佐剂型大鼠关节炎动物模型，研究多肽对佐剂性关节炎(Adjuvantarthritis，AA)大鼠的治疗作用。采用大鼠作为受试动物，SPF级SD大鼠，雄性，体重为140-160g，随机分组，分别是正常对照组，模型对照组，多肽Ⅰ至多肽Ⅵ组(10mg/kg)和阳性药对照组(甲氨蝶呤1mg/kg)。除正常组外，第0天各实验组建立大鼠AA模型，方法是在大鼠的左侧后足足跎注射含灭活的结核分枝杆菌(H37RA，10mg/mL)完全弗氏佐剂0.08mL造成大鼠佐剂性关节炎模型。造模第10天起皮下注射给药：多肽Ⅰ至多肽Ⅵ组(10mg/kg)：每日两次，连续10天；阳性药对照组(甲氨蝶呤1mg/kg)：每五天一次，连续3次；正常对照组和模型对照组(生理盐水)：连续10天。分别于造模后第8，11，14，17，20，23和26天，关节评分、分别检测左右后足足踝直径来观察药物对大鼠佐剂型关节炎的影响。

关节炎评价指标如下：

(1)关节评分四肢：按0-4五级评分：0＝无红斑或红肿；1＝轻微的红斑或肿胀，其中的一个前/后趾关节有红斑或肿胀；2＝多于一只趾出现红斑或肿胀；3＝踝或腕关节下的足爪肿胀；4＝包括踝关节在内的全部足爪肿胀。大鼠四只足分别评分，最高评分为16分。

分别于造模后8，11，14，17，20，23和26天进行关节评分，并记录结果。

(2)测量足踝直径

分别于造模前和造模后8，11，14，17，20，23和26天用游标卡尺测量大鼠左、右足踝内侧到外侧的直径和足踝厚度，并记录结果。

试验独立重复3次，试验得到的结果以mean±SD表示，并进行统计T检验，表中*P＜0.05为显著性差异，**P＜0.01为极显著性差异。

表25.多功能融合多肽多肽对佐剂型类大鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用

结果：造模后大鼠与正常大鼠相比较，在大鼠左后足跎处注射含灭活的结核分枝杆菌完全弗氏佐剂后，左后足会迅速产生原发性关节炎，出现明显的肿胀，并伴有溃烂；右后足大约10d后开始出现继发性关节炎，评分的分值逐渐增大；同时耳部血管增生明显，红肿明显；尾部关节出现肿胀。

多肽Ⅰ至多肽Ⅵ组对佐剂型类大鼠关节炎动物模型都能发挥体内免疫保护作用，结果见表25：大鼠阳性对照组、多肽Ⅰ至多肽Ⅵ组左后足踝直径与模型组比较，有极显著性差异(**P＜0.01)；大鼠阳性对照组、多肽Ⅰ至多肽Ⅵ组右后足踝直径与模型组比较，有极显著性差异(**P＜0.01)；多肽Ⅰ至多肽Ⅵ组四肢评分与模型对照组比较，有极显著性差异(p**＜0.01)，实验结果具有统计学意义。

Claims (4)

1.多功能融合多肽，其特征在于结构为下列中的一种：

多肽Ⅰ：Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu--Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp，其中Pyr为3-(3-吡啶基)-L-丙氨酸，Bip为L-4,4'-联苯丙氨酸；

多肽Ⅱ：Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu，其中Pyr为3-(3-吡啶基)-L-丙氨酸，Bip为L-4,4'-联苯丙氨酸；

多肽Ⅲ：Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu，其中Pyr为3-(3-吡啶基)-L-丙氨酸，Bip为L-4,4'-联苯丙氨酸；

多肽Ⅳ：Pro-(D-Pyr)-(D-Cys)-Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala，其中Pyr为3-(3-吡啶基)-L-丙氨酸，Bip为L-4,4'-联苯丙氨酸；

多肽Ⅴ：Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala；

多肽Ⅵ：Arg-Gly-Ala-Asp-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp。

2.根据权利要求1所述的多功能融合多肽在制备治疗实体肿瘤、类风湿性关节炎以及新生血管性眼病药物中的应用，其中所述的肿瘤为起源于人的脑部、乳腺、结肠或直肠、子宫颈的原发或继发癌、黑色素瘤、血管瘤以及肉瘤；所述新生血管性眼病包括虹膜新生血管性眼病、脉络膜新生血管性眼病、视网膜新生血管性眼病或角膜新生血管性眼病。

3.根据权利要求2中所述的多功能融合多肽在制备治疗或预防类风湿性关节炎药物中的应用。

4.根据权利要求1中所述的多功能融合多肽的制备方法，其特征在于以Fmoc-wang-resin或Fmoc-CTC-resin为起始原料，然后用保护氨基酸依次接二肽至二十四肽，接肽工作完成后充分洗涤，然后切肽、后处理即得多功能融合多肽粗品；将粗品溶解，用制备型高效液相经过两次纯化，浓缩冻干得到纯品，最后经过第三次纯化得到多肽。