CN113384715A - 一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗vegf药物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗vegf药物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于脉络膜新生血管治疗药物领域，具体公开了一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF药物及其制备方法和应用。本发明首先以精氨酸为主要原材料，通过氨基酸缩合反应合成细胞穿透肽CPP，随后链接荧光基团5‑FITC，合成载体材料5‑FITC‑CPP，随后使用不同浓度的康柏西普与雷珠单抗在静电力的作用下与载体材料5‑FITC‑CPP相结合，合成滴眼液5‑FCC和5‑FCR。本发明将滴眼液引入脉络膜新生血管治疗方案中：利用载体材料自身的结构和性能优势，在保持疗效的同时，消除传统玻璃体腔内药物注射的给药风险，达到无创治疗的目的；特别适合年龄相关性黄斑变性的治疗。
Description
技术领域
本发明属于脉络膜新生血管治疗药物领域，具体公开了一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF药物及其制备方法和应用。
背景技术
年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是导致老年人中心视力不可逆损害的主要威胁之一。脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)异常生长产生的出血及渗漏会损伤视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)和视网膜神经感觉层(neurosensory retina)，从而导致中心视力永久性损伤。
AMD的临床治疗策略包括激光光凝疗法、维替泊芬光动力疗法 (photodynamictherapy using verteporfin，PDT)、玻璃体腔内注射抗-VEGF 药物等，目前首选治疗方法为玻璃体腔内注射抗-VEGF药物。
玻璃体腔内注射抗-VEGF药物对CNV的治疗有良好的疗效，临床上常用的抗 -VEGF药物主要包括雷珠单抗(Ranibizumab，RBZ)和康柏西普(Conbercept， CBC)。不过玻璃体腔内注药是一种有创操作，仍存在一些注射相关并发症及药物不良反应，如眼内炎、白内障、视网膜脱离等，这些并发症可导致视力的严重下降。同时，该疗法需要多次反复注射，而且药品相对昂贵，也会给患者造成经济方面的压力，因此，如果能使用无创的给药方式对患者具有重要意义。
目前，滴眼液作为眼科常用的无创治疗手段，具有使用方便，患者依从性好，可自行长期反复多次给药的特点而广受好评。同时，滴眼液作为局部给药方法，可极大杜绝全身反应的发生，具有很高的安全系数。因此，滴眼液可作为玻璃体腔注射的良好替代疗法。但是，由于眼球的特殊构造及血眼屏障的存在，单纯应用普通滴眼液给药，药物无法良好的到达眼底视网膜、脉络膜，所以需要一种安全材料能够携带药物穿过眼部结构，到达病变位置，以达到治疗的目的。
发明内容
针对以上问题，本发明公开了一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF药物及其制备方法和应用，成功合成了载体材料5-FITC-CPP，并成功结合雷珠单抗和康柏西普两种抗-VEGF药物，制备出了5-FCR和5-FCC滴眼液，通过细胞及动物水平验证了三者的安全性，为该材料的下一步应用奠定了基础。
本发明的技术方案如下：
一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF滴眼液，所述细胞穿透肽融合蛋白由细胞穿透肽CPP与VEGF拮抗蛋白融合而成；所述细胞穿透肽CPP含有4-10 个连续的精氨酸。
进一步的，上述一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF滴眼液，所述细胞穿透肽CPP含有如SEQ ID NO：1＝RRRRRR所示的氨基酸序列。
进一步的，上述一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF滴眼液，所述细胞穿透肽CPP的N端连接有FITC荧光基团，为5-FITC-CPP。链接上荧光基团FITC，对于细胞穿透肽CPP的穿膜能力影响不大，更加方便药物研究以及药效评估中对药物进行追踪。
进一步的，上述一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF滴眼液，所述VEGF 拮抗蛋白选自康柏西普或雷珠单抗。
进一步的，上述一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF滴眼液的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将5-FITC-CPP冻干粉溶解于康柏西普或雷珠单抗原液中，之后将溶液置于Vortex旋涡振荡器上，震荡反应，得到的澄清液体经过过滤后，收集到容器中，放入4℃冰箱保存直至使用。
进一步的，上述一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF滴眼液的制备方法，所述细胞穿透肽5-FITC-CPP冻干粉与所述VEGF拮抗蛋白的质量比为1:2。
进一步的，上述一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF滴眼液的制备方法，所述康柏西普或雷珠单抗原液的浓度为10mg/ml。
进一步的，上述一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF滴眼液的制备方法，所述5-FITC-CPP冻干粉的制备过程包括如下具体步骤：
(1)树脂溶涨
将2-Chlorotrityl Chloride Resinsh树脂放入反应管中，向反应管中加入DCM(15ml/g)，振荡30min；
(2)链接第一个氨基酸
通过沙芯抽滤掉反应管中溶剂，随后加入3倍摩尔过量的Fmoc-Arg (pbf)-OH精氨酸，利用DMF溶解，再向反应管中加入10倍摩尔过量的DIEA,，振荡60min。加入用甲醇进行封闭；
(3)脱保护
抽掉反应管中的DMF，向其中加入20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，反应 5min，抽出溶液，再次加入20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，继续反应15min；
(4)检测裸露氨基酸位点
抽掉反应管中哌啶溶液，加入2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂，用乙醇清洗三次，去除乙醇，随后加入Kaiser检测试剂，105℃－110℃加热5min, 可观察管中出现深蓝色即为还存在可结合位点；
(5)清洗检测试剂
去除反应管中的溶液，加入DMF(10ml/g)进行清洗，共清洗六次。清洗完成后，抽出DMF；
(6)缩合
取三倍过量的保护用氨基酸以及三倍过量的HBTU粉末，缓慢加入DMF溶解， DMF量为刚好溶解粉末最佳，随后将溶液加入反应管中，立即加入准备好的十倍过量DIEA.反应30min；
(7)再次检测
操作同第(4)步，观察反应管中出现蓝色即为还存在可结合位点。
(8)清洗检测试剂
操作同第(5)步。
(9)重复(3)至(6)步操作，从右到左依次连接序列中的六个精氨酸。最后链接5-FITC，再次进行结合位点检测，未出现蓝色，即为氨基酸结合位点已耗尽，从此步骤开始，后续全部步骤进行避光操作。
(10)抽干管中溶液并清洗树脂。
首先抽干反应管中溶液，随后加入DMF(10ml/g)清洗两次，抽出溶液，再次加入甲醇(10ml/g)清洗两次，去除溶液后继续加入DMF(10ml/g)清洗两次，最后加入DCM(10ml/g)清洗两次，利用机器抽干反应管10min；
(11)从树脂上切割多肽
首先按照比例配制切割液(10ml/g)：TFA 95％；水1％；EDT 2％；TIS 2％，随后将切割液加入反应管中，切割时间：120min；
(12)吹干切割液并洗涤树脂
利用氮气使反应管中的切割液进行浓缩，随后向反应管中加入乙醚进行清洗，重复六次，随后常温挥干反应管中树脂；
(13)分析提纯：
利用高效液相色谱对多肽粗品进行提纯，并对目标多肽溶液进行收集；
(14)冻干
将收集到的目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成淡黄色粉末。
进一步的，上述含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF滴眼液的应用，所述应用为在制备治疗脉络膜新生血管相关疾病的药物中的应用。
进一步的，上述含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF滴眼液的应用，所述疾病为年龄相关性黄斑变性。
本发明公开的一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF药物及其制备方法和应用至少有以下有益效果：
本发明成功合成了载体材料5-FITC-CPP，并成功结合雷珠单抗和康柏西普两种抗-VEGF药物，制备出了5-FCR和5-FCC滴眼液，通过细胞及动物水平验证了三者的安全性，为该材料的下一步应用奠定了基础。目前临床上应用的新生血管治疗手段，如玻璃体腔注射抗-VEGF药物，部分患者注射后会产生不良反应，如眼内炎，白内障，甚至视网膜脱离等。这些患者无法完成后续治疗，甚至导致失明。相比于现有的治疗手段，5-FCR和5-FCC滴眼液具有将抗-VEGF药物成功运送到视网膜的能力，同时对脉络膜新生血管有较好的疗效，更是采用了无创的方式进行给药，降低了患者的治疗风险，舒缓了患者的治疗压力。
附图说明
附图1为本发明实施例1中细胞穿透肽5-FITC-CPP结构图；
附图2为本发明实施例2中5-FITC-CPP、5-FCR和5-FCC合成示意图；
附图3为本发明实施例3中5-FITC-CPP、5-FCR、5-FCC水合粒径表征，从左往右依次是a：5-FITC-CPP；b：5-FCC；c：5-FCR；
附图4为本发明实施例3中对于5-FITC-CPP、5-FCR、5-FCC表面电势检测结果， (a)5-FITC-CPP(b)5-FCR(c)5-FCC；
附图5为本发明实施例4中使用CCK-8检测不同浓度5-FITC-CPP干预下ARPE-19 细胞活性的结果；
附图6为本发明实施例4中光学显微镜下ARPE-19细胞的细胞形态(A:对照组； B：50μM 5-FITC-CPP组；C：100μM 5-FITC-CPP组)；
附图7为本发明实施例4中干预28d小鼠角膜荧光素钠染色结果；
附图8为本发明实施例4中干预28d后各脏器HE染色结果(比例尺：50μm)；
附图9为本发明实施例4中干预28d后角膜和视网膜HE染色结果；
附图10A-B为本发明实施例5中FFA观察用药组CNV部位荧光渗漏信号强度；其中附图10A为RBZ用药组，附图10B为CBC用药组；
附图11A-B为本发明实施例5中HE染色观察RBZ用药组CNV病灶大小(比例尺 200μm)，(A：Con组；B：PBS组；C：5-FITC-CPP组；D：低浓度5-FCR组；E：中浓度5-FCR组；F：高浓度5-FCR组；G：RBZ组)，其中附图11A为HE染色观察CNV病灶大小，附图11B为CNV面积统计图；
附图12A-B为本发明实施例5中HE染色观察CBC用药组CNV病灶大小(比例尺 200μm)，(A：Con组；B：PBS组；C：5-FITC-CPP组；D：低浓度5-FCC组；E：中浓度5-FCC组；F：高浓度5-FCC组；G：CBC组)，其中附图12A为HE染色观察CNV病灶大小，附图12B为CNV面积统计图；
附图13A-B为本发明实施例5中5-FCR组RPE-脉络膜-视网膜铺片观察CNV病灶大小，((A：Con组；B：PBS组；C：5-FITC-CPP组；D：低浓度5-FCR组；E：中浓度5-FCR组；F：高浓度5-FCR组；G：RBZ组))其中附图13A为RPE-脉络膜-视网膜铺片IB4和FITC-Dextran荧光双染图(比例尺：200μm)，附图13B 为CNV面积统计图；
附图14A-B为本发明实施例5中FCC组RPE-脉络膜-视网膜铺片观察CNV病灶大小，(A：Con组；B：PBS组；C：5-FITC-CPP组；D：低浓度5-FCC组；E：中浓度5-FCC组；F：高浓度5-FCC组；G：CBC组)其中附图14A为RPE-脉络膜-视网膜铺片IB4和FITC-Dextran荧光双染图(比例尺：200μm)，附图14B为CNV 面积统计图；
附图15A-B为本发明实施例5中组织免疫荧光观察用药组CNV病灶部位CD31与VEGF的定位及表达(比例尺：100μm)，其中附图15A为RBZ用药组，附图15B 为CBC用药组。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明用到的材料如下：Fmoc-Pbf-精氨酸(Fmoc-Arg(pbf)-OH)，成都诚诺新技术有限公司；芴甲氧羰酰基-6-氨基己酸(Fmoc-ACP-OH)，北京百灵威科技有限公司；2-氯三苯甲基氯树脂(2-Chlorotrityl Chloride Resin)，天津市南开合成科技有限公司；5-异硫氰酸荧光素(5-FITC)，上海源叶生物科技有限公司；甲醇(MEOH)，广东翁江化学试剂有限公司；二氯甲烷(DCM)，济南鑫旺化学有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，安阳九天有限公司；N,N-二异丙基乙胺(DIEA),新德化工；苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，昊帆生物科技；三氟乙酸(TFA)，J.T.Baker；三异丙基硅烷(TIS)，上海达瑞精细化工公司；1,2-乙二硫醇(EDT)，上海达瑞精细化工公司；康柏西普 (Combercept)，成都康弘制药；雷珠单抗(Ranibizumab)，瑞士诺华医药；C57 小鼠购自于上海斯莱克实验动物有限公司；人视网膜色素上皮细胞ARPE-19细胞株购自于iCell Bioscience；细胞活性检测试剂盒(CCK-8)购自YEASEN公司，货号：40203ES60；盐酸丙美卡因购自Alcon公司；复方托吡卡胺购自参天制药；其他试剂均为国产。
实施例1
合成5-FITC-CPP
(1)树脂溶涨
将2-Chlorotrityl Chloride Resinsh树脂放入反应管中，向反应管中加入DCM(15ml/g)，振荡30min.
(2)链接第一个氨基酸
通过沙芯抽滤掉反应管中溶剂，随后加入3倍摩尔过量的Fmoc-Arg (pbf)-OH精氨酸，利用DMF溶解，再向反应管中加入10倍摩尔过量的DIEA,，振荡60min。加入用甲醇进行封闭。
(3)脱保护
抽掉反应管中的DMF，向其中加入20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，反应 5min，抽出溶液，再次加入20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，继续反应15min.
(4)检测裸露氨基酸位点
抽掉反应管中哌啶溶液，加入2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂，用乙醇清洗三次，去除乙醇，随后加入Kaiser检测试剂，105℃－110℃加热5min, 可观察管中出现深蓝色即为还存在可结合位点。
(5)清洗检测试剂
去除反应管中的溶液，加入DMF(10ml/g)进行清洗，共清洗六次。清洗完成后，抽出DMF。
(6)缩合
取三倍过量的保护用氨基酸以及三倍过量的HBTU粉末，缓慢加入DMF溶解， DMF量为刚好溶解粉末最佳，随后将溶液加入反应管中，立即加入准备好的十倍过量DIEA.反应30min.
(7)再次检测
操作同第(4)步，观察反应管中出现蓝色即为还存在可结合位点。
(8)清洗检测试剂
操作同第(5)步。
(9)重复(3)至(6)步操作，从右到左依次连接序列中的六个精氨酸。最后链接5-FITC，再次进行结合位点检测，未出现蓝色，即为氨基酸结合位点已耗尽，从此步骤开始，后续全部步骤进行避光操作。
(10)抽干管中溶液并清洗树脂。
首先抽干反应管中溶液，随后加入DMF(10ml/g)清洗两次，抽出溶液，再次加入甲醇(10ml/g)清洗两次，去除溶液后继续加入DMF(10ml/g)清洗两次，最后加入DCM(10ml/g)清洗两次，利用机器抽干反应管10min。
(11)从树脂上切割多肽
首先按照比例配制切割液(10ml/g)：TFA 95％；水1％；EDT 2％；TIS 2％，随后将切割液加入反应管中，切割时间：120min。
(12)吹干切割液并洗涤树脂
利用氮气使反应管中的切割液进行浓缩，随后向反应管中加入乙醚进行清洗，重复六次，随后常温挥干反应管中树脂。
(13)分析提纯：
利用高效液相色谱对多肽粗品进行提纯，并对目标多肽溶液进行收集。
(14)冻干
将收集到的目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成淡黄色粉末，为所述的5-FITC-CPP，结构见附图1所示。
实施例2
合成5-FCR和5-FCC
合成流程见附图2所示，称取5mg 5-FITC-CPP冻干粉溶解于1ml康柏西普 (10mg/ml)或雷珠单抗(10mg/ml)原液中，之后将溶液置于Vortex旋涡振荡器上，震荡反应10s，得到的澄清液体经过过滤后，收集到容器中，放入4℃冰箱保存直至使用。
实施例3
5-FITC-CPP、5-FCR、5-FCC的表征
(1)水合粒径
称取5mg 5-FITC-CPP粉末溶解在1ml超纯水中，并取5-FCR和5-FCC 溶液各1ml。采用Nano-ZS型纳米粒度分析仪测试材料的水合粒径。通过纳米粒度分析仪测试5-FITC-CPP、5-FCR和5-FCC的水合粒径，结果见附图3所示(a： 5-FITC-CPP；b：5-FCC；c：5-FCR)，由于细胞穿透肽与药物结合成功，5-FCR 和5-FCC的尺寸相比5-FITC-CPP有增加，5-FITC-CPP尺寸约900nm，5-FCR尺寸约1700nm，5-FCC尺寸约1900nm
(2)Zeta表面电势
取5-FITC-CPP粉末5mg溶解在1ml超纯水中，再取5-FCR和5-FCC溶液1ml。采用Zeta电位分析仪测试材料的表面电势。采用Zeta电位分析仪对三个材料的表面电势进行测量，结果如附图4所示(a)5-FITC-CPP(b)5-FCR(c) 5-FCC)，发现，5-FITC-CPP、5-FCR和5-FCC的电势分别为12.50±0.38、5.73 ±0.71、0.68±0.44，表面带正电荷。
实施例4
FITC-CPP、5-FCR和5-FCC生物安全性的验证
(1)实验动物分组
Con组：C57BL/6小鼠，4-5周，雄性，清洁级
PBS组：C57BL/6小鼠，眼球滴用10μl 1xPBS滴眼液(2次/天)
5-FITC-CPP组：C57BL/6小鼠，眼球滴用10μl 5-FITC-CPP(5mg/ml)滴眼液(2次/天)
5-FCR组：C57BL/6小鼠，眼球滴用10μl 5-FCR(5mg/ml CPP+10mg/ml RBZ) 滴眼液(2次/天)
5-FCC组：C57BL/6小鼠，眼球滴用10μl 5-FCC(5mg/ml CPP+10mg/ml CBC) 滴眼液(2次/天)
(2)CCK8实验
取实验培养的ARPE-19细胞，待细胞密度长至90％，将细胞消化、重悬，按照5000细胞/孔，100μL/孔，均匀铺入96孔板中，设置6个重复孔。待ARPE-19 细胞贴壁后，在实验组中分别加入浓度为1、2.5、5、10、25、50、100μg/ml 的5-FITC-CPP材料，将处理好的96孔板置于37℃恒温培养箱中孵育24h。24h 后，弃去培养液，每孔加入100μl无血清培养基和10μlCCK-8溶液，置于细胞培养箱中避光孵育1-2h。孵育结束后，用酶标仪检测该96孔板在450nm处的吸光度值。结果见附图5所示，CCK8结果表明，0-100μg/ml的5-FITC-CPP 对ARPE-19细胞无毒性作用，从细胞水平证实其安全性，各组间差异无统计学意义
(3)光学显微镜观察细胞形态
将ARPE-19细胞以3×105/孔的浓度接种于6孔板中，待细胞密度生长至80％时，向其中加入不同浓度的5-FITC-CPP(50,100μM)进行干预，干预24h后，于倒置光学显微镜下采集细胞形态图像。结果如附图6(A:对照组；B：50μM 5-FITC-CPP组；C：100μM 5-FITC-CPP组)所示，0、50、100μM/L的5-FITC-CPP 处理ARPE19细胞24后，各组细胞大多呈扁平多角形或鹅卵石样外观，胞内含少量色素颗粒，处理组无形态学改变。
(4)石蜡切片制作
干预28d后处死各组动物，摘取小鼠眼球和主要脏器(心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺)，将眼球浸泡于眼球固定液中，新鲜组织浸泡于4％多聚甲醛中24h。将处理好的组织置于脱水盒中，将脱水盒放入脱水机内依次梯度酒精进行脱水 (75％、85％、90％、95％、100％)2h，将脱水完毕的组织依次浸入醇苯(5-10min)、二甲苯I(5-10min)、二甲苯II(5-10min)、65℃融化石蜡I(1h)、65℃融化石蜡II(1h)、65℃融化石蜡III(1h)中完成浸蜡。将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒中取出放入包埋框。置于-20℃冷冻台中冷却，待蜡块凝固后将其从包埋框中取出。将蜡块再次放于-20℃冷冻台中冷却，再将冷却后的蜡块置于石蜡切片机切片，厚度 3μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，载玻片将组织捞起，60℃烘箱内烤片，水干蜡融后取出常温保存备用。
(5)HE染色
依次将石蜡切片浸于二甲苯I(20min)、二甲苯II(20min)、无水乙醇I (5min)、无水乙醇II(5min)、75％乙醇(5min)，随后使用ddH2O冲洗。将冲洗好的切片分别采用苏木素染核、1％盐酸酒精分化、反蓝液反蓝、伊红染色处理。梯度乙醇脱水，二甲苯透明后采用中性树胶封片，光学显微镜下采集图像。
(6)角膜荧光素钠染色
将C57BL/6小鼠按照上述分组分别干预7、14、28天，并于干预28天后，腹腔内注射1％戊巴比妥钠进行麻醉。生理盐水湿润荧光素钠检测试纸，将荧光素钠荧光染料均匀涂布于小鼠的角膜表面。使用手持裂隙灯显微镜(目镜10x、物镜2x、裂隙灯宽度5mm、光斑直径5mm、钴蓝光)采集小鼠角膜荧光染色图像。如附图7-9所示，C57小鼠眼睛局部滴用5-FITC-CPP、5-FCR、5-FCC滴眼液后7、 14、28天，与对照组相比，小鼠角膜荧光染色无明显异常；各脏器(心、肝、脾、肾、肺)结构无明显破坏；眼底HE然后结果表明，三种滴眼液滴用后，视网膜ONL层厚度无明显变化，表明视网膜结构未受破坏。
实施例5
5-FCR及5-FCC滴眼液有效性的验证
(1)实验动物分组
1.Con组(n＝10)：C57BL/6小鼠，激光光凝后不作处理。
2.PBS组(n＝10)：C57BL/6小鼠，激光光凝后，光凝眼滴用10μl 1xPBS滴眼液(2次/天)
3.5-FITC-CPP组(n＝10)：C57BL/6小鼠，激光光凝后，光凝眼滴用10μl 5-FITC-CPP(5mg/ml)滴眼液(2次/天)
4.RBZ治疗组(n＝40)：
(1)5-FCR滴眼组(n＝30)：C57BL/6小鼠，激光光凝后，光凝眼滴用10μl 5-FCR 滴眼液(2次/天)：低浓度：5mg/ml CPP+0.072mg/ml RBZ；中浓度：5mg/ml CPP+0.36mg/mlRBZ；高浓度：5mg/ml CPP+1.8mg/ml RBZ。
(2)RBZ注射组(n＝10)：C57BL/6小鼠，激光光凝后，光凝眼玻璃体腔内注射1μl10mg/ml RBZ
5.CBC治疗组(n＝40)：
(1)5-FCC滴眼组(n＝30)：C57BL/6小鼠，激光光凝后，光凝眼滴用10μl 5-FCC 滴眼液(2次/天)：低浓度：5mg/ml CPP+0.072mg/ml CBC；中浓度：5mg/ml CPP+0.36mg/mlCBC；高浓度：5mg/ml CPP+1.8mg/ml CBC。
(2)CBC注射组(n＝10)：C57BL/6小鼠，激光光凝后，光凝眼玻璃体腔内注射 1μl10mg/ml CBC
(2)FFA造影
按照上述分组对小鼠进行干预，分别于干预后7、14、28d对小鼠行眼底照相及荧光素眼底血管造影检查。1％戊巴比妥钠，以40mg/kg剂量腹腔注射麻醉小鼠，麻醉后，使用复方托吡卡胺滴眼液对小鼠双眼进行散瞳，盐酸丙美卡因滴眼液表面麻醉双眼，分别向各组小鼠腹腔内注射2ml 1％荧光素钠溶液，随后行荧光素眼底血管造影并采集造影图像。结果如附图10A-B所示，结果显示，与Con 组相比，PBS组及单纯应用5-FITC-CPP滴眼组7d、14d、28d的CNV荧光渗漏信号高，5-FCR和5-FCC滴眼组可明显于14d及28d观察到荧光渗漏信号降低，病灶范围缩小，且该结果具有剂量相关性，随着药物浓度的升高，荧光渗漏信号降低越明显，病灶范围缩小也更为显著。RBZ和CBC注射组与滴眼组显示相似结果。
(3)RPE-脉络膜-巩膜铺片
按照上述分组对小鼠进行干预，分别取各组干预28d的小鼠，戊巴比妥钠麻醉后，将小鼠成仰卧位固定在动物手术台上，手术剪打开胸腔，缓慢逐层分离组织，去除肋骨，小心暴露心脏，眼科镊轻柔夹持固定心脏，右心房用眼科剪开一小口，同时迅速于左心室进针，快速推注20ml 1xPBS溶液，随后再推注浓度为 25mg/ml的FITC-Dextran溶液0.2ml，等待3-5min，最后缓慢推注20ml 4％多聚甲醛溶液，推注过程中若观察到小鼠口鼻及尾部轻微黄染，且全身震颤、鼠尾打旋，即视为灌注成功。灌注成功后，摘除小鼠眼球，置于眼球固定液中浸泡固定 2h。固定完成后，使用1xPBS溶液漂洗眼球2次，随后将眼球放于解剖显微镜下。首先，清除眼球表面多余结缔组织，随后沿着赤道部将眼球剪开成两个半球，丢弃角膜侧部分，小心去除眼球内晶状体及玻璃体组织，轻柔分离并去除视网膜神经上皮层，以视乳头为中心，四等分剪开半球，巩膜面朝下，以四叶草的形状将其平铺于载玻片上，滴加事先用一抗稀释液稀释后的IB4抗体，室温染色20min。 1xPBS漂洗3次，再次以四叶草的形状将染色后的铺片平铺于载玻片上，滴加少量抗荧光淬灭剂，盖玻片封片，在荧光显微镜下观察CNV部位的染色情况，并于采集图像后，使用GraphPad软件对病灶面积进行计算。
(4)HE染色
干预28d后处死各组动物，摘取小鼠眼球将眼球浸泡于眼球固定液中24h。将处理好的组织置于脱水盒中，将脱水盒放入脱水机内依次梯度酒精进行脱水(75％、 85％、90％、95％、100％)2h，将脱水完毕的组织依次浸入醇苯(5-10min)、二甲苯I(5-10min)、二甲苯II(5-10min)、65℃融化石蜡I(1h)、65℃融化石蜡 II(1h)、65℃融化石蜡III(1h)中完成浸蜡。
将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒中取出放入包埋框。置于-20℃冷冻台中冷却，待蜡块凝固后将其从包埋框中取出。将蜡块再次放于-20℃冷冻台中冷却，再将冷却后的蜡块置于石蜡切片机切片，厚度3μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，载玻片将组织捞起，60℃烘箱内烤片，水干蜡融后取出常温保存备用。依次将石蜡切片浸于二甲苯I(20min)、二甲苯II(20min)、无水乙醇I(5min)、无水乙醇II(5min)、75％乙醇(5min)，随后使用ddH2O冲洗。将冲洗好的切片分别采用苏木素染核、1％盐酸酒精分化、反蓝液反蓝、伊红染色处理。梯度乙醇脱水，二甲苯透明后采用中性树胶封片，光学显微镜下采集图像。使用GraphPad软件对CNV病灶面积进行计算，采用SPSS20.0进行统计学分析。
结果：见附图11A-B和附图12A-B所示，干预28d后，取各组小鼠眼球，行 HE染色观察视网膜结构形态，各组病理切片在造模区域均可观察到不同程度的视网膜色素上皮层、神经上皮层紊乱及Brunch膜屏障损坏，脱离的色素上皮细胞游离在视网膜各层间，同时，各层存在不同程度的隆起及水肿，神经上皮层下可见生成的CNV病灶，突破了Brunch膜屏障向视网膜内层生长，CNV病灶内可见新生管腔，管腔中存在红细胞。与Con组相比，PBS组及5-FITC-CPP组各层紊乱明显，CNV病灶面积较大；而在RBZ和CBC用药组中，5-FCR、5-FCC滴眼组CNV病灶面积减小，其中高浓度5-FCR和5-FCC缩小程度最为显著，RBZ及CBC 注射组表现与之相当(P<0.05)；具体病灶面积见表1和表2。
表1 RBZ用药组的病灶面积
(A：Con组；B：PBS组；C：5-FITC-CPP组；D：低浓度5-FCR组；E：中浓度5-FCR组；F：高浓度5-FCR组；G：RBZ组)
表2 CBC用药组的病灶面积
(A：Con组；B：PBS组；C：5-FITC-CPP组；D：低浓度5-FCC组；E：中浓度5-FCC组；F：高浓度5-FCC组；G：CBC组)
(5)眼球免疫荧光染色
按照上述步骤对眼球进行固定、包埋、切片，随后将组织芯片放置在60℃的恒温箱中烘烤60分钟。取出烘干的组织芯片，将其放入盛满二甲苯的玻璃染缸中浸泡30min，随后更换染缸中的二甲苯，再次浸泡30min。取出组织芯片，放入另一只盛满无水乙醇的染缸中，浸泡10分钟，更换无水乙醇后，再次继续浸泡10min，随后转入95％乙醇，85％乙醇中各自浸泡10分钟。浸泡完成后，蒸馏水洗3次，每次5分钟，继续1X PBS洗涤3次，每次5min。将组织芯片放入盛满EDTA抗原修复液的染缸中，放入提前预热到95℃的恒温水浴锅中，热修复20min，修复完成后，1X PBS洗涤3次，每次5min。血清封闭组织芯片30min，随后将封闭好的组织芯片放入加水的暗盒中，组织表面滴加一抗(VEGF:一抗稀释剂＝1:50)，放于4℃冰箱中过夜。第二天取出冰箱中的组织芯片，室温下，1X PBS洗3次，每次5min。完成后在组织表面滴加FITC标记山羊抗兔二抗，暗盒室温放置30min，随后1X PBS洗涤3次，每次5min。DAPI复染组织细胞核，完成后在组织芯片上滴加抗荧光淬灭剂后封片。荧光显微镜下采集图像。
结果：如附图13A-B和附图14A-B所示，在干预后28d，对小鼠心脏行 FITC-Dextran灌注染色后取其眼球制成RPE-脉络膜-视网膜铺片，并使用IB4 抗体对CNV病灶进行双荧光染色，荧光显微镜下采集图片并对CNV病灶面积进行统计学分析，铺片染色结果与HE染色结果相当，相较于Con组，高浓度5-FCR 和5-FCC病灶面积减小明显，RBZ和CBC注射组也体现其良好的疗效，病灶面积也出现缩小。具体病灶面积见下表(表3和表4)，差异具有统计学意义。
表3 RBZ用药组的CNV病灶面积
(A：Con组；B：PBS组；C：5-FITC-CPP组；D：低浓度5-FCR组；E：中浓度 5-FCR组；F：高浓度5-FCR组；G：RBZ组)
表4 CBC用药组的CNV病灶面积
(A：Con组；B：PBS组；C：5-FITC-CPP组；D：低浓度5-FCC组；E：中浓度5-FCC组；F：高浓度5-FCC组；G：CBC组)。
利用CD31(红色荧光)，VEGF(绿色荧光)对小鼠视网膜切片进行双荧光染色，DAPI对细胞核进行标记。结果见附图15A-B所示，与正常组相比，Con组、 PBS组、5-FITC-CPP组的切片中，大量的红色和绿色颗粒分布于CNV病灶及视网膜各层级中间，呈现阳性表达，且视网膜各层间结构紊乱明显。而5-FCR和5-FCC 治疗组，红色和绿色颗粒数量明显减少，视网膜结构较未治疗组紊乱减轻，CNV 病灶阳性区域明显缩小。
总结
根据上述实施例1-5的结果表明，本发明成功合成了载体材料5-FITC-CPP，并成功结合雷珠单抗和康柏西普两种抗-VEGF药物，制备出了5-FCR和5-FCC滴眼液，通过细胞及动物水平验证了三者的安全性，为该材料的下一步应用奠定了基础。目前临床上应用的新生血管治疗手段，如玻璃体腔注射抗-VEGF药物，部分患者注射后会产生不良反应，如眼内炎，白内障，甚至视网膜脱离等。这些患者无法完成后续治疗，甚至导致失明。相比于现有的治疗手段，5-FCR和5-FCC 滴眼液具有将抗-VEGF药物成功运送到视网膜的能力，同时对脉络膜新生血管有较好的疗效，更是采用了无创的方式进行给药，降低了患者的治疗风险，舒缓了患者的治疗压力。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，不能以此限定本发明的保护范围，即大凡依本发明权利要求书及发明内容所做的简单的等效变化与修改，皆仍属于本发明专利申请的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市第十人民医院
<120> 一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF药物及其制备方法和应用
<130> 2021
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> artificial
<400> 1
Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
Claims (10)
1.一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF滴眼液，其特征在于，所述细胞穿透肽融合蛋白由细胞穿透肽CPP与VEGF拮抗蛋白融合而成；所述细胞穿透肽CPP含有4-10个连续的精氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF滴眼液，其特征在于，所述细胞穿透肽CPP含有如SEQ ID NO：1＝RRRRRR所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF滴眼液，其特征在于，所述细胞穿透肽CPP的N端连接有FITC荧光基团，为5-FITC-CPP。
4.根据权利要求3所述的一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF滴眼液，其特征在于，所述VEGF拮抗蛋白选自康柏西普或雷珠单抗。
5.如权利要求所述4的一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF滴眼液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将5-FITC-CPP冻干粉溶解于康柏西普或雷珠单抗原液中，之后将溶液置于Vortex旋涡振荡器上，震荡反应，得到的澄清液体经过过滤后，收集到容器中，放入4℃冰箱保存直至使用。
6.根据权利要求5所述的一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF滴眼液的制备方法，其特征在于，所述细胞穿透肽5-FITC-CPP冻干粉与所述VEGF拮抗蛋白的质量比为1:2。
7.根据权利要求5所述的一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF滴眼液的制备方法，其特征在于，所述康柏西普或雷珠单抗原液的浓度为10mg/ml。
8.根据权利要求5所述的一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF滴眼液的制备方法，其特征在于，所述5-FITC-CPP冻干粉的制备过程包括如下具体步骤：
(1)树脂溶涨
将2-Chlorotrityl Chloride Resinsh树脂放入反应管中，向反应管中加入DCM(15ml/g)，振荡30min；
(2)链接第一个氨基酸
通过沙芯抽滤掉反应管中溶剂，随后加入3倍摩尔过量的Fmoc-Arg(pbf)-OH精氨酸，利用DMF溶解，再向反应管中加入10倍摩尔过量的DIEA,，振荡60min，加入用甲醇进行封闭；
(3)脱保护
抽掉反应管中的DMF，向其中加入20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，反应5min，抽出溶液，再次加入20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，继续反应15min；
(4)检测裸露氨基酸位点
抽掉反应管中哌啶溶液，加入2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂，用乙醇清洗三次，去除乙醇，随后加入Kaiser检测试剂，105℃－110℃加热5min,可观察管中出现深蓝色即为还存在可结合位点；
(5)清洗检测试剂
去除反应管中的溶液，加入DMF(10ml/g)进行清洗，共清洗六次，清洗完成后，抽出DMF；
(6)缩合
取三倍过量的保护用氨基酸以及三倍过量的HBTU粉末，缓慢加入DMF溶解，DMF量为刚好溶解粉末最佳，随后将溶液加入反应管中，立即加入准备好的十倍过量DIEA.反应30min；
(7)再次检测
操作同第(4)步，观察反应管中出现蓝色即为还存在可结合位点；
(8)清洗检测试剂
操作同第(5)步；
(9)重复(3)至(6)步操作，从右到左依次连接序列中的六个精氨酸，最后链接5-FITC，再次进行结合位点检测，未出现蓝色，即为氨基酸结合位点已耗尽，从此步骤开始，后续全部步骤进行避光操作；
(10)抽干管中溶液并清洗树脂
首先抽干反应管中溶液，随后加入DMF(10ml/g)清洗两次，抽出溶液，再次加入甲醇(10ml/g)清洗两次，去除溶液后继续加入DMF(10ml/g)清洗两次，最后加入DCM(10ml/g)清洗两次，利用机器抽干反应管10min；
(11)从树脂上切割多肽
首先按照比例配制切割液(10ml/g)：TFA 95％；水1％；EDT 2％；TIS 2％，随后将切割液加入反应管中，切割时间：120min；
(12)吹干切割液并洗涤树脂
利用氮气使反应管中的切割液进行浓缩，随后向反应管中加入乙醚进行清洗，重复六次，随后常温挥干反应管中树脂；
(13)分析提纯：
利用高效液相色谱对多肽粗品进行提纯，并对目标多肽溶液进行收集；
(14)冻干
将收集到的目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成淡黄色粉末。
9.如权利要求1-4任一项所述的含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF滴眼液的应用，其特征在于，所述应用为在制备治疗脉络膜新生血管相关疾病的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF滴眼液在应用，其特征在于，所述疾病为年龄相关性黄斑变性。
Priority Applications (1)
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