CN108348572A - 含有融合组织穿透肽和抗-vegf制剂的融合蛋白的预防和治疗眼疾的药物组合物 - Google Patents
含有融合组织穿透肽和抗-vegf制剂的融合蛋白的预防和治疗眼疾的药物组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明是涉及含有融合了组织穿透肽和抗‑血管内皮生长因子制剂的融合蛋白质这一有效成分的预防和治疗眼疾的药物组合物的发明,具体来说就是含有融合了组织穿透肽和抗‑血管内皮生长因子制剂的融合蛋白这一有效成分的预防和治疗眼疾的药物组合物。本发明所涉及的组合物与传统的抗‑血管内皮细胞生长因子制剂相比,不仅能抑制血管内皮细胞生长因子以外的与新生血管有关的各种生长因子,而且能提高减少周细胞覆盖的药效,而且能够治疗抗药患者。另外,在眼球内注射时,通过改善直达脉络膜组织的药物输送力、减少给药量或延长给药周期以及改善眼球穿透度,可研发为滴眼剂。
Description
技术领域
本发明主张以2015年3月31日韩国专利申请第10-2015-0045684号的优先权利益,该专利的说明书的所有内容都作为本说明书的参考文献。
本发明是涉及含有融合了组织穿透肽和抗-血管内皮生长因子制剂的融合蛋白这一有效成分的预防和治疗眼疾的药物组合物的发明,具体来说就是含有融合了组织穿透肽和抗-血管内皮生长因子(anti-VEGF)制剂的融合蛋白这一有效成分的预防和治疗眼疾的药物组合物。本发明还涉及一种克服了抗药性并提高了功效的抗血管内皮生长因子制剂的制备方法,该方法包括:用含有核酸序列编码的融合蛋白的重组载体转化宿主细胞的步骤,该融合蛋白中融合了组织穿透肽和抗-血管内皮生长因子制剂;培养所述细胞的步骤;以及从所述细胞中收集融合蛋白的步骤。本发明进一步包括了将本发明涉及的融合蛋白的有效药量投入需要其的个体的眼疾治疗法,以及本发明涉及的制备包括融合蛋白这一有效成分的用于眼疾治疗的制剂的用途。
背景技术
黄斑(macula lutea)是眼睛视网膜上视网膜细胞密集、最能清楚并准确感受光线的部分,由于各种原因导致黄斑的变异,从而引起视觉障碍的疾病称为黄斑部病变(macular degeneration)。所述黄斑部病变是绿内障、糖尿病视网膜症以及失明等3大眼疾的病因之一。引起黄斑部病变的最大的原因是年龄的增加,此外可知的原因还有家族史、人种、吸烟等,一旦黄斑部损伤,将丧失观察细小字体、脸部细节或微小物体等细节的能力。这种黄斑部病变包括非穿透性(干性)黄斑部病变和穿透性(湿性)黄斑部病变两种,患有黄斑部病变的人群中有90%为干性症状。干性黄斑病变时,一种称为玻璃疣(糖尿病视网膜病症usen)的体内排泄物形成黄色沉淀物留存在黄斑后组织内。玻璃疣的存在会阻碍视网膜尤其是黄斑的血流,血流减少使得从黄斑摄取的营养成分供给减少,从而终止或减小光感性的有效作用。湿性黄斑病变的情况是,新生的毛细血管在视网膜内或其下层生长,液体及血管从黄斑后面的空间渗漏出来。湿性黄斑病变有时也被陈述为脉络膜新生血管,脉络膜是视网膜下的血管部分,新生血管是指组织内新的血管生长,正如从脉络膜新生血管这一名称进行推测,湿性黄斑病变发生时,就是血管从脉络膜向黄斑区新生并生长。这种黄斑病变最常见于老年人,但最近四五十岁的患者急剧增加,这种黄斑病变患者年龄层变低的原因被认为是脂肪摄取增加等饮食生活的西化及吸烟、饮酒、紫外线暴晒等不好的生活习惯所导致。
糖尿病黄斑水肿(Diabetic Macular Edema,糖尿病黄斑水肿)是由于视网膜中央的1个视盘直径内的视网膜及/或者倾性白斑变厚。糖尿病黄斑水肿及糖尿病视网膜病症(Diabetic Retinopathy,DR)是糖尿病患者的毛细血管合并症,使视力减退,最终导致失明。糖尿病视网膜病症患者可能伴有糖尿病黄斑水肿,膨胀的高穿透性毛细血管及毛细动脉血的渗漏,血液-视网膜保护层破坏后可诱发糖尿病黄斑水肿。和糖尿病视网膜病症相同,糖尿病黄斑水肿也是与渗透到损伤或组织被破坏的布鲁赫膜的脉络膜新生血管形成有关。
另一方面,目前用于所述黄斑病变、糖尿病黄斑水肿等眼球中的新生血管有关的各类眼疾的预防或治疗的典型的治疗剂有雷珠单抗(ranibizumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、阿柏西普(aflibercept)、康柏西普(conbercept)等。包括所述药物的目前研发的治疗黄斑病变及糖尿病视网膜水肿等主要眼疾的生物医药品主要是眼球内注射剂形态的用于包括视网膜的眼球后部疾患的治疗。最近,为解决使用注射剂患者的不便性、副作用增加以及心理惧怕等有关问题,虽然也在尝试研发将雷珠单抗、阿柏西普等制成眼睛滴剂,但雷珠单抗对兔子使用临床的一半用量(250μg)时,每隔两小时滴眼6次,如3~7天后到达视网膜组织的实验结果(Chen et al.,2011.Eye)所示,对眼球的渗透度不高,很难到达病变的后方,滴眼时由于眨眼等引起房水流出带来药物损失大的问题,存在难以达到眼药水药效的问题。另外,2013年在中国被认可的黄斑病变治疗剂康柏西普(Conbercept,成都康弘药业)与阿柏西普相似,虽然目前有报告称正在研发将血管内皮细胞生长因子受体1(VEGFR-1)的第2个结构域和VEGFR-2的第3、第4个结构域与Fc连接的融合蛋白质的眼睛滴剂,但据了解,滴眼时的活体利用率还不到5%(Wang等人.,2013年,《公共科学图书馆》杂志)。
另外,虽然以兰尼单抗(Lucentis)这一商标销售的雷珠单抗由于在研发过程中从90%黄斑病变患者身上看到了反应,故作为重要的治疗剂而备受瞩目,但反应的患者中只有30%可以看到视力改善等疗效,持续用药时却会产生抗药性问题(Syed等人.,2012年,《自然评论:药物发现》期刊)。为了改善这一问题而研制出的将VEGF-A的结合力提高100倍以上,甚至能抑制VEGF-B和P1GF的Fc融合抗体阿柏西普于2011年面世,呈现了急剧发展的趋势,但实际上两个产品之间的临床效果并无差异。
黄斑病变患者中约有10%对anti-VEGF制剂是无反应的患者,是不可期待疗效的,这被认为是由于相对的VEGF-A以外的其他生长因子依赖的新生血管迂回线路。另外证实,反复用药时约有45%的患者产生抗药性,用药次数越多,药物的反应越弱(Lux等人.,2007年,《英国眼科学》杂志),产生这种抗药性的原因被认为是在反复投入VEGF抗体制剂时,有助于内皮细胞稳定性的周细胞覆盖扩大等血管强化以及依赖于周细胞的VEGF生成的结果。
因此,最近眼疾治疗剂研发的动向是研究一种能克服VEGF抗体制剂等的抗药性并增加功效的方法,呈现出研发将诱导周细胞解离的PDGF抑制剂作为联合治疗剂的趋势。眼疾治疗剂的研发要求有(i)增加抑制VEGF-A和其他新生血管有关的配体的机能,(ii)克服对抗-血管内皮细胞生长因子制剂的抗药性,(iii)为加大药物功效瓦解周细胞的覆盖,(iv)用药周期的改善以及(v)研制为滴眼剂。
发明内容
本发明的发明者们发现在抗血管内皮生长因子(anti-VEGF)制剂中融入组织穿透肽时,可使药物的组织穿透性增强,周细胞的覆盖瓦解,即使是对出现药物抗药性的患者也能发挥药效,使研发减少用药量或改善用药周期的滴眼剂成为可能,于是完成了本发明。
因此,本发明的目的就是提供一种包括融合了组织穿透肽与抗-血管内皮生长因子(anti-VEGF)制剂的融合蛋白这一有效成分的药物组合物,该药物组合物用于预防和治疗眼疾。
本发明的另一目的是提供一种克服了抗药性并提高了功效的抗-血管内皮生长因子制剂的生产方法,该方法包括:(a)对融合了组织穿透肽和抗-血管内皮生长因子(anti-VEGF)制剂的融合蛋白进行编码的核酸序列的重组载体转换为宿主细胞的步骤;(b)培养所述细胞的步骤;以及(c)从所述细胞回收融合蛋白这一步骤。
本发明的又一个目的是提供将融合了组织穿透肽和抗-血管内皮生长因子(anti-VEGF)制剂的融合蛋白的有效药量给需要其的个体用药的一种眼疾治疗法。
本发明的又一个目的是提供一种用途,即制备含有融合了组织穿透肽和抗-血管内皮生长因子(anti-VEGF)制剂的融合蛋白这一有效成分的用于眼疾治疗的制剂。
为达到以上目的,本发明提供一种包括融合了组织穿透肽与抗-血管内皮生长因子(anti-VEGF)制剂的融合蛋白这一有效成分的用于预防和治疗眼疾的药物组合物。
为了达成本发明的另一目的,提供一种克服了抗药性并提高了功效的抗-血管内皮生长因子制剂的生产方法,包括(a)将含有对组织穿透肽和抗-血管内皮生长因子(anti-VEGF)制剂相融合的融合蛋白质进行编码的核酸序列的重组载体转换为宿主细胞的步骤;(b)培养所述细胞的步骤;以及(c)从所述细胞回收融合蛋白质的步骤。
为达成本发明的又一个目的,提供将融合了组织穿透性和抗-血管内皮生长因子(anti-VEGF)制剂的融合蛋白质的有效药量给需要其的个体用药的一种眼疾治疗法。
为达成本发明的又一个目的提供一种用途,即制备含有融合了组织穿透肽和抗-血管内皮生长因子(anti-VEGF)制剂的融合蛋白这一有效成分的用于眼疾治疗的制剂。
以下将对本发明进行具体说明。
为达到以上目的,本发明提供一种包括融合了组织穿透肽与抗-血管内皮生长因子(anti-VEGF)制剂的融合蛋白这一有效成分的用于预防和治疗眼疾的药物组合物。
众所周知,自然界所存在的蛋白质中血管内皮生长因子抗体(VEGF-A)是可引起血液渗漏(溢血,extravasation)的。其也被称为血管渗透性因子(vascular permeabilityfactor)。已知这一作用是与血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)结合后引起的现象,有趣的是即使在管内皮生长因子抗体的突变实验中不能与血管内皮生长因子受体结合,也能看到血管渗透性增强的事例。这被提出是血管内皮生长因子抗体存在另一个受体(Stacker等人,1999年.《J.Biol.Chem.》期刊)。同一时期的另一个研究中发现这一受体是神经菌毛素,NRP)(Makinen et al.,1999.《J.Biol.Chem.》期刊)。
神经菌毛素最早在非洲爪蟾神经系统中发现。神经菌毛素作为跨膜糖蛋白(transmembrane glycoprotein),具有NRP1和NRP2两种形态。神经菌毛素与VEGF家族配体结合,作为各VEGFRs(VEGF受体)的共受体发挥作用。尤其是NRP1作为VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3的共受体产生作用,与各种VEGF配体结合。另一方面NRP2作为VEGFR2和VEGFR3的共受体产生作用,有助于淋巴管生成(lymphangiogenesis)和细胞粘合(adhesion)。另外,NRP1/NRP2(NRP1/2)作为Plexin家族受体(Plexin family receptors)的共受体发挥作用,与分泌的信号素3系列配体(class 3semaphorin:Sema3A、Sema3B、Sema3C、Sema3D、Sema3E、Sema3F和Sema3G)结合。
所述组织穿透性是指以下任何一种特性:特异识别过表达神经菌毛素的组织并追踪;扩大血管内皮细胞的细胞间隙,促进药物向血管外流出;调节对水溶性分子起到壁垒作用的组织-角膜细胞间隙,促进眼球内的药物分布。
本发明的用语“神经菌毛素(neuropilin,NRP)”作为跨膜糖蛋白(transmembraneglycoprotein),具有NRP1和NRP2两种形态。神经菌毛素由5大结构域组成,从N-末端开始a1/a2结构域属于CUB结构域,是与信号素的Ig-like C2type部分相结合的部分。尤其是这一部位与plexin形成复合体,起到加强与信号素-plexin的结合力的作用。神经菌毛素的b1、b2结构域是属于FV/VIII结构域,与VEGF家族配体分泌的信号素3系的各配体(secretedSema3s)的C末端部分结合。VEGF配体和信号素3系配体具有嘌呤水解酵素的识别部位(RXRR,Arg-X-Arg-Arg),在嘌呤作用(Furin processing)下于C-末端作为氨基酸精氨酸(Arg)的残基结束(Adams et al.,1997.EMBO J.)。这类VEGF、Sema3s配体的C-末端精氨酸残基被认为对神经菌毛素b1b2结构域之间的相互作用十分重要(Teesalu et al.,2009.Proc.Natl.Acad.Sci.USA)。VEGF配体和神经菌毛素b1b2结构域之间的结合体被发现有3层结构(Parker et al.,2012.J.Biol.Chem.),可知对于和神经菌毛素的b1b2结构域的结合十分重要的VEGF的氨基酸序列。但尚未查明与NRP1结合的Sema3A的C-末端具体是哪一个部位与NRP相结合。抗-血管内皮生长因子制剂是阻止VEGF和天然VEGF受体之间相互作用的分子,例如,包括与VEGF或VEGF受体结合后防止或者阻止VEGF和VEGF受体之间的相互作用的分子。VEGF对抗剂包括抗-VEGF抗体、抗-VEGF受体抗体及VEGF受体嵌合分子。
基于本发明,“融合”一词是使功能或构造不同或相同的两个分子一体化,抗-血管内皮生长因子制剂中可使用所有物理、化学或生物学方法与组织穿透肽结合。所述融合最为理想的是使用连接肽,这一连接肽可与抗体的Fab(抗原结合片段)或Fc片段的C-末端之类结合。
本发明所指的眼疾应该是由血管新生引起的眼疾。本说明书中提及的“血管新生引起的眼疾”是指由血管的生长或增生引起、由血管暴露引起或与这些有关的眼睛的任何疾患。
在本发明中的融合蛋白,在与神经菌毛素受体结合后药物的组织穿透性变强,能瓦解周细胞的覆盖,能对出现药物抗药反应的患者起到有效的作用,用药周期得到改善,并可研制成滴眼剂。
具体来说,根据本发明的一个实施例,本发明的发明者们在雷珠单抗的氨基酸序列中导入将半胱氨酸(C)置换为丝氨酸(S)的点突变的雷珠单抗变异体,大大增加了生产的可能性,雷珠单抗变异体中融合了组织穿透肽(TPP)的改良体也完全保证了提高生产的功效(<实施例1>)。
本发明的另一个实施例中,对雷珠单抗变异体的C-末端中融合了组织穿透肽的融合蛋白质的神经菌毛素受体的亲和度以及瓦解内皮细胞之间的紧密连接(tightjunction)的能力进行比较的结果是,证实了所述融合蛋白和神经菌毛素受体NRP1与Sema3A配体都在相似水平下十分优秀地进行了结合,还证实了其显著地抑制了钙粘蛋白(VE-cadherin),瓦解内皮细胞之间紧密连接的能力也十分优秀(实施例<1-3>)。
根据本发明的另一个实施例,为了确认雷珠单抗变异体的C-末端中融合了组织穿透肽的融合蛋白是否能够通过与广泛分布于眼球内皮细胞中的神经菌毛素受体的结合改善穿透度,将提取的眼球放入含有所述融合蛋白的溶液和含有雷珠单抗的溶液后,比较了每一时段的穿透力度(<实施例4>)。实验结果证实,结合了所述组织穿透肽的抗-血管内皮生长因子制剂从实验1小时后开始穿透角膜上皮组织,在2小时后再与雷珠单抗相比,眼球内药物分布明显更多,证实通过改善穿透度可以调节用药量和用药的间隔。
即,雷珠单抗的眼球穿透度与十分微小的先行研究结果相比较,可以证实本发明涉及的融合蛋白与雷珠单抗相比能更快地穿透对水溶性分子具有壁垒作用的组织-角膜,一举抵达眼球内层。可以看到,不仅是Fab形态的雷珠单抗改良体,在大分子量蛋白质的结构复杂的所有抗体(Whole antibody)形态下融合了组织穿透肽的眼球组织的穿透度提高的效果也差不多。同时也将免疫球蛋白G(Igc)形态的贝伐单抗的FC-末端融合了组织穿透肽的融合蛋白与贝伐单抗进行比较,显著体现了眼球穿透能力的提高,可知本发明涉及的贝伐单抗改良体能够研制为疗效增强的药物。
通过本实施例的结果证实,在Fc片段融合了各VEGF受体(VEGFR1、VEGFR2)的融合蛋白形态下的阿柏西普、康柏西普等均与贝伐单抗相同,在FC-末端融合组织穿透肽时,与原本的Fc融合蛋白相比之下,预计可以研制为疗效显著提高的药物。
本发明的另一个实施例中,用各种动物病患模型对本发明的融合蛋白与雷珠单抗血管新生抑制效应以及药物抗药性模型中的新生血管抑制效应进行了评比。用角膜新生血管模型进行实验的结果是,本发明的融合蛋白与对照组相比,体现出50%以上显著的新生血管抑制效应,体现出与雷珠单抗同等程度的功效,证实可在C-末端融合组织穿透肽提高功效的可能性(实施例<5-1>)。另外,本发明的融合蛋白的药物抗药性模型中的新生血管抑制效应与雷珠单抗相比,表现出双倍的优秀疗效,这与文献中并用抗血管内皮生长因子的核酸适体和抗PDGF抗体制剂的结果(Jo et al.,2006.Am.J.Pathol.168)显现出相似的数值,估计可改善雷珠单抗用药患者中只保持了视力不变但并未得到改善的约70%患者的视力(实施例<5-2>)。本发明涉及的融合蛋白抑制眼疾中血管新生的优秀疗效在实际用作黄斑病变疗效模型的脉络膜新生血管(CNV)和用作视网膜症疗效模型的氧诱导新生血管(OIR)的模型中同样可以发现,预计其临床疗效与雷珠单抗相比有显著提高(<实施例6>、<实施例7>)。
本发明中使用的“预防”一词指的是投入使用本发明的组合物来抑制或延缓眼疾恶化的所有行为。
本发明中使用的“治疗”一词是指投入使用本发明的组合物使眼疾症状好转或发生有利转变的所有行为。具体来说,所述“治疗”是改善眼疾症状的一切行为的统称,这可以包括眼疾的治愈、实质性预防或症状的改善,还包括缓解、治愈或预防眼疾的一种症状或大部分的症状,不过并不限于此。
在本发明的实施例中,具有相关领域普遍常识的技术人员为了体现出眼疾预防或治疗的效果,可针对眼疾的类型及危重程度,切实考虑需用药的个体的年龄、体重、健康状况、性别、饮食及排泄率等各种要素,决定本发明涉及组合物的有效的用药量(有效量)、用药次数、用药途径。所述“有效量”是个体用药时,能改善眼疾症状的量的统称,包括治愈眼疾、实质性预防或改善眼疾症状的量。所述“个体”可包括动物、最好是哺乳动物、尤其是包括人在内的动物,也可以是来自动物的细胞、组织、器官等。所述个体可能是需要治疗的患者。本发明涉及的组合物可以以任何方式对人类等哺乳动物用药。例如,可通过口服或非口服用药。非口服用药的方式并不加以限制,可以是静脉注射、肌肉注射、动脉内、骨髓内、硬脑膜内、心脏内、经皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、肠道、局部、舌下或直肠给药。另外,可单独使用本发明涉及的免疫原性复合蛋白,也可并行使用对对象疾病有预防和治疗效果的公认的化合物。
例如,本发明的药物组合物对人体的用药量会随着患者的年龄、体重、性别、用药形态、健康状况及疾病危重程度而不同,一般情况下进行眼球注射时,每个眼球0.001~10mg/日,较为理想的是每个眼球0.1~2mg/日。如果是滴眼剂,那么总剂量是1ml滴眼液,0.001~100mg/日,较理想的是0.01~10mg/日。另外,可根据医生或药师的判断间隔一定时间分批用药。
本发明的组合物也可能还包括药学上允许使用的添加剂,药剂学上允许使用的添加剂有淀粉、胶凝淀粉、微晶纤维素、乳糖、聚乙烯吡啶酮、胶体二氧化硅、磷酸氢钙、乳糖、甘露醇、饴糖、阿拉伯橡胶、预胶化淀粉、玉米淀粉、纤维素粉、羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、欧巴代、羟基乙酸钠粉、巴西棕榈蜡、合成硅酸铝、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸铝、硬脂酸钙、白砂糖、葡萄糖、山梨醇、海藻糖及滑石粉等。本发明涉及药剂学上允许使用的添加剂在所述组合物中所含的重量比最好是0.1~90,但并不做限制。
此外,所述药物组合物的剂型并无限制,可包括注射剂、滴眼剂、眼药膏剂、眼球插入剂等,也可以是适合某一用药途径的复合剂型,生产该制剂时,一般可使用填料、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂或界面活性剂等稀释剂加以制备。制作成注射剂也不做限制,可以包括玻璃体腔内注射、结膜注射在内的眼球内局部注射的一切方法。注射剂中可包括惯用的增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、防腐剂等添加剂。
本发明涉及的注射剂中合适的载体包括生理盐水、抑菌水、聚氧乙烯蓖麻油EL(巴斯夫,位于美国新泽西洲帕西帕尼)或磷酸盐缓冲液(PBS)。任何情况下组合物必须杀菌,也必须是易于注射的流体。组合物在制造和保管条件下都要稳定,要抵制细菌及真菌等微生物的污染作用而加以保存。载体可以是溶媒,也可以是像水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇及聚乙二醇液体等)以及含有这些的适当混合物的分散介质。适当的流动性是指,例如可使用卵磷脂之类的涂层,维持分散液中必要的颗粒大小,此时可使用界面活性剂。微生物作用中可使用各种抗菌剂和抗真菌剂,如羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇酚、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等进行预防。很多情况下,组合物的等渗剂中最好包括如糖和甘露醇、山梨醇、海藻糖、氯化钠等多元醇。可注射组合物的吸收,因为组合物中含有如硬酯酸铝、透明质酸、凝胶等延长吸收的制剂可帮助吸收。
滴眼剂可以是水溶性眼科溶液、非水溶性眼科溶液或眼科乳剂。本发明的滴眼剂,除了所述融合了必要成分组织穿透肽和抗-血管内皮生长因子(anti-VEGF)制剂的融合蛋白以外,可用滴眼剂中原有公认的任意成分如缓冲剂、粘稠剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂等进行配制。其中,缓冲剂可以是柠檬酸盐、磷酸盐、醋酸盐、氨基酸盐等常用的缓冲剂。另外,粘稠剂可以是聚乙烯醇、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡啶酮、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲纤维素、聚乙二醇、软骨素或它们的盐。另外,稳定剂可以是如亚硝酸钠、亚硫酸氢钠和焦亚硫酸钠等抗氧化剂;也可以是依地酸钠、环式糊精、柠檬酸、柠檬酸盐等螯合剂。另外,等渗剂可以是氯化钠、氯化钾等盐类;甘油、丙二醇等多元醇;葡萄糖、蔗糖、海藻糖等糖类;木糖醇、山梨醇等糖醇;聚乙二醇等聚醚;牛磺酸等磺酸酸。另外,防腐剂可以是杀藻铵、苄索氯铵、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸酯、硫柳汞、山梨酸、山梨酸盐、葡萄糖酸洗必泰等。本发明涉及的滴眼剂,室温下的PH值最好是4.5-8.5,更好的是5.5-8,最理想的是6-8。PH值的测定可在室温下用酸碱度计量器(如赛默飞世尔公司的产品:Accumet model 25pH/Ion meter)测定。
一般的眼科药物通过眼球壁的渗透性不好,不能用作滴眼剂。因此,使用眼药膏延长接触时间以增加吸收的药量。滴眼剂中可使用的载体成分非水溶性高分子有乙基纤维素、聚醋酸乙烯酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚(乙酯-甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸乙酯三金属氯化铵)、聚(甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸丁酯-甲基丙烯酸二甲氨基乙酯)等。活体内分解性高分子,如聚乳酸、聚乳酸乙醇酸共聚物、聚腈基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚-ε-己内酯等。水溶性高分子有羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羧甲基纤维素、羟基丙基纤维素等纤维素衍生物以及藻酸钙、壳聚糖、白蛋白、凝胶、聚(甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯)等。油脂性成分有棕榈酸甘油酯、鲸蜡醇、胆固醇、各种磷脂脂类、鲸蜡、胆固醇棕榈酸酯等。这些载体成分通常具有含有眼科用治疗活性物质的药效成分的缓释性能(慢慢释放的性能)。另外,不添加比重调整剂但可使用比重较高的载体成分如羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯200731(比重1.65)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯220824(比重1.82)、羧甲基纤维素(比重1.59)等。即便如此,在使用这类载体成分时最好还是添加比重调整剂以提高比重值。根据本发明,用于载体粒子的比重调整的比重调整剂可以是如二氧化钛(4.17)之类的不溶性成分、磷酸三钙(比重3.14)、磷酸二钙(比重2.89)、磷酸氢钙-脱水化物(比重2.30)等难溶性成分、氯化钠(比重2.17)、氯化钾(比重1.98)、氯化钙(比重2.0)、氯化镁(比重2.41)、碳酸钠(比重2.53)、磷酸二氢钠(比重1.95)、磷酸一氢钠(比重1.7)、磷酸二氢钾(比重2.34)等水溶性成分。
与附着在打开的角膜上相比,插入物通常分布在上层盲管或偶尔分布在下层结膜囊,除此之外,类似于覆盖在角膜上的软性隐形眼镜。插入物通常由一边释放药物一边溶解或分解在泪液中的生物学上的可用物质制成。
口服用药的固体制剂包括锭剂、丸剂、粉剂、颗粒制剂、胶囊制剂等,这种固体制剂可在对羟苯基乙醇中混合至少一种以上的成型添加剂如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或凝胶后制成。另外,除了纯粹的成型添加剂之外,也可以使用硬脂酸镁、滑石之类的润滑剂。口服的液体制剂有悬浮剂、内服液体制剂、液体油、糖浆等,经常使用的简单的稀释剂除了水、液体石蜡外,也可包括各种成型添加剂如湿润剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。
另外,本发明涉及的用于治疗的组合物还可包括任意的生理学上可用的载体、成型添加剂或稳定剂(雷明顿:药学技术与实践,19版,阿方索,R.等人,麦克出版公司。(伊司顿,PA:1995))。可使用的载体、成型添加剂或稳定剂在所使用的用药剂量浓度上对受用者是非毒性的,包括缓冲溶液,如磷酸、柠檬酸剂和其他有机酸;抗坏血酸等抗氧化剂;低分子量(大约不到10个的残基)多肽;蛋白质,如血清白蛋白、凝胶或免疫球蛋白;亲水性中和体,如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,如甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、精氨酸或赖氨酸;单糖类、双糖类、及葡萄糖、甘露糖、海藻糖、糊精等其他碳水化合物;螯合剂,如EDTA;糖醇,如甘露醇或山梨醇;成盐反离子,如钠;以及(或者)非离子性界面活性剂,如吐温(Tween)、普流罗尼、聚乙二醇(PEG)。
为了达到本发明的另一个目的,本发明提供一种药物组合物,其特征是所述组织穿透肽包括序列号为SEQ ID NO:1至7的实验组中选择的任何一个氨基酸序列。
用所述序列号SEQ ID NO:1至7组成的实验组中所选择的氨基酸序列标示的组织穿透肽,是在分析与神经菌毛素的b1b2结构域相结合的VEGFA配体的结合部位氨基酸序列及长度,分析已知的与神经菌毛素结合的脑信号蛋白3A和脑信号蛋白3F的嘌呤C-末端序列的盐基序列后,基于它们的C-末端的序列相类似而设计的肽。
为了达到本发明的又一个目的,本发明提供一种药物组合物,包括所述抗-血管内皮生长因子制剂,一种从贝伐单抗(bevacizumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、r84(《PLoSOne》期刊,2010年8月6日;5(8))、阿柏西普(aflibercept)、康柏西普(conbercept)、CT01(WO2005056764A2)、DOM15-10-11(WO2008149147A2)、DOM15-26-593(WO2008149143A2)、PRS-050(Mross等人.,2013年,《PLoS One》)、CT-322(Dineen等人,2008年,《BMC Cancer》)、ESBA903(Asmus等人,2015年,《Eur J Pharm Biopharm.》)和EPI-0030(WO2011023130A1)等组成的实验组中选出,在预防或治疗眼疾时使用的制剂,并包括它们的生物仿制药(biosimilar)及变异体,最好是雷珠单抗、贝伐单抗、阿柏西普、康柏西普,不过并不限于此。
所述“生物仿制药(biosimilar)”是指使用重组基因及细胞培养技术等生命工学技术,仿造已开发/销售的专利到期的原始生物医药产品,在品质、功效及安全性上被认为具有同等性的仿制医药品。
为了达到本发明的又一个目的,本发明提供一种药物组合物,其特征是所述变异体的重链恒定区1及轻链恒定区的半胱氨酸缺失,或者置换为了除半胱氨酸外的包括丝氨酸的其他氨基酸残基。
本发明的一个实施例中,用蛋白质工程的方法改变雷珠单抗的氨基酸序列,将雷珠单抗的核苷酸序列中最后的半胱氨酸改变为丝氨酸后制备雷珠单抗变异体(实施例<1-1>)。
为了达到本发明的又一个目的,本发明提供一种药物组合物,其特征是所述变异体是由具有氨基酸序列标示为SEQ ID NO:8的轻链及具有氨基酸序列标示为SEQ ID NO:10的重链组成的雷珠单抗(ranibizumab)变异体。
根据本发明所述的组织穿透肽还可包括连接肽。所述连接肽可由1至50个氨基酸组成,最好是4到20个,更理想的是4到15个的氨基酸组成。另外,所述连接肽可由甘氨酸(glycine,G)、丝氨酸(serine,S)或丙氨酸(alanine,A)组成,所述连接肽的序列最好是由(GA)n或(GGGGS)m的氨基酸序列组成的(但,所述n和m是各自独立的,是整数1到20,表示括号内的序列反复的次数),更为理想的是由GAGA或(GGGGS)3的氨基酸序列组成。
本发明的一个实施例中,组织穿透肽(TPP)通过所述连接肽制成了在雷珠单抗变异体中融合的融合蛋白,并证实了其效果。所述融合蛋白,在本发明涉及的雷珠单抗变异体(IDB0061)中将TPP#2与连接肽((GGGGS)3))连接的形态下,是序列号SEQ ID NO:12和序列号SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成的融合蛋白(IDB0062);本发明涉及的雷珠单抗变异体(IDB0061)中将TPP#5与连接肽((GGGGS)3))连接的形态下,是序列号SEQ ID NO:16和序列号SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成的融合蛋白(IDB0064);在贝伐单抗的重链中TPP#2与连接肽((GGGGS)3))连接的形态下,是序列号SEQ ID NO:20和序列号SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成的融合蛋白(IDB0072)等。
使用本发明的药物组合物可治疗任何一种由新生血管引起的眼疾。如本说明书中使用的词组“新生血管引起的眼疾”是指由于血管的生长或增生、血管的暴露或与此有关的因素引起的眼睛的任何疾患。
由血管新生引起的所述眼疾可由增生玻璃体视网膜病症、黄斑病变、色素性视网膜症、糖尿病视网膜症、脉络膜新生血管、新生血管性绿内障、缺血性视神经障碍、早熟儿视网膜症、早产儿视网膜症、流行性角结膜炎、新生血管性虹膜症、后晶状体纤维增生症、过敏性角膜炎、上角膜缘性角膜炎、翼状胬肉干燥性角膜炎、小疱性角结膜炎、巩膜症及糖尿病黄斑浮肿等组成的实验组中选择,最好是选择黄斑病变及糖尿病黄斑浮肿,不过并不限于此。
为了达到本发明的又一个目的,本发明提供一种克服了抗药性并提高了功效的抗-血管内皮生长因子制剂的生产方法,包括:(a)用含有核酸序列编码的融合蛋白的重组载体转化宿主细胞的步骤,该融合蛋白中融合了组织穿透肽和抗-血管内皮生长因子制剂;(b)培养所述细胞的步骤;以及(c)从所述细胞回收融合蛋白质的步骤。
所述融合蛋白质编码的核酸序列可从序列号SEQ ID NO:13、序列号SEQ ID NO:15、序列号SEQ ID NO:17、序列号SEQ ID NO:19、序列号SEQ ID NO:21及序列号SEQ ID NO:23组成的实验组中选择。具体如下,对本发明涉及的雷珠单抗改良体IDB0062的轻链和重链进行编码的核酸为序列号SEQ ID NO:13和序列号SEQ ID NO:15的盐基序列,编码IDB0064的轻链和重链的核酸为序列号SEQ ID NO:17和序列号SEQ ID NO:19的盐基序列,编码IDB0072的轻链和重链的核酸为序列号SEQ ID NO:21和序列号SEQ ID NO:23的盐基序列。
另外,所述载体是指该行业的从业者们用所属领域常用的任意方法将本发明的多聚核苷酸插入载体内,利用适当的转录/解读控制序列以发现本发明的融合蛋白质而制备的表达载体。
本发明涉及的被克隆的所述多聚核苷酸序列可操作地连接到合适的表达式控制序列中,所述可操作地连接的基因序列和表达式控制序列可能包括在同一个既含有选择标记又含有复制原点(replication origin)的表达载体内。达到‘可操作地连接(operablylinked)’是指所述多聚核苷酸(核酸)序列可将表达式控制序列的基因表达连接到可能的方式。所述‘表达式控制序列(expression control sequence)’是指控制在特定的宿主细胞中可操作地连接的多聚核苷酸序列的发现的DNA序列。但是控制序列可包括为实施转录的促进剂、调节转录的任意控制序列、对合适的mRNA核糖体结合部位进行编码的序列以及控制转录和解读终止的序列等组成的实验组中所选的一个以上的序列。
被用作所述表达载体的母载体的载体没有特别的限定,本发明所属技术领域中为了在被用作宿主细胞的微生物中的表达,可使用通常使用的所有质粒、病毒或其他媒介体等。如,所述质粒有源自大肠菌的质粒(pBR322、pBR325、pUC118和pUC119、pET-22b(+))、源于枯草芽胞杆菌的质粒(pUB110和pTP5)以及源于酵母的质粒(YEp13、Yep24及YCp50)等,所述病毒可使用逆转录酶病毒、腺病毒和牛痘病毒等动物病毒,也可使用杆状病毒等昆虫病毒,但并不仅限于此。
所述宿主细胞可选择调节插入的序列表达或是用理想的特定方式从基因生产目的生成物。不同的宿主细胞具有蛋白质的解读以及针对解读后的过程和改性的具有特征的特殊机制。可选择向合适的细胞系或宿主系统提供已发现的异源蛋白质的理想的改性和过程。酵母中的表达可生成生物学活性生成物。真核细胞中的表达可增加‘天然’折叠的可能性。
本发明涉及的宿主细胞只要在载体稳定的同时能够不断复制和表达,可使用业内所知道的任何一个宿主细胞,如可使用E.coli JM109、E.coli BL21DE、E.coli DH5、E.coliRR1、E.coli LE392、E.coli B、E.coli X 1776和E.coli W3110等。另外,根癌农杆菌A4等土壤杆菌中的菌株、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等杆菌(Bacilli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)等其他肠道杆菌以及各种假单胞菌属(Pseudomonas)中的菌株都可以作为宿主细胞使用。
另外,将本发明涉及载体在真核细胞中进行形质转换时,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、昆虫细胞及人体细胞(如,CHO细胞株(中国仓鼠卵巢细胞,Chinese hamster ovary)、W138、BHK、COS-7、293,HepG2、3T3、RIN和MDCK细胞株)等可作为宿主细胞使用。
将载体传达至宿主细胞内,使宿主细胞发生形质转换的方法是众所周知的,均可使用,不做特别限制。例如,使用大肠菌时,可通过热冲击(hot shock)或电穿孔(electropotation)的方法进行形质转换,利用动物细胞构建产生细胞株时,可使用磷酸钙沉淀法(calcium phosphate precipitation)、DEAE-葡聚糖法、电穿孔法(electroporation)、直接注射法(direct microinjection)、DNA脂质体介导法(DNA-loaded liposome)、阳离子脂质体-DNA复合体(liofectamine-DNA complex)法、细胞声波粉碎法(cell sonication)、使用高速微细喷射(high velocity microprojectile)的基因枪法(gene bombardment)、聚阳离子(polycation)法和受体媒介形质转移法(receptor-mediated transfection)。这些技术中有一部分为了在活体内或活体外使用可被改良。
转基因细胞的培养是在使融合蛋白质的表达可能的合适的条件下进行的,这种条件可根据操作人员所熟知的公认的方法进行。转基因细胞根据一般的培养方法可大量培养。培养的培养基可以使用由碳源、氮源、维生素和矿物质构成的培养基,如可以使用2X YT培养基。细胞的培养可在一般的细胞培养条件下进行,如温度范围为15℃至45℃,时间为10至40小时。为了去除培养液中的细胞而仅回收培养基,要经过离心(centrifugation)或过滤(filtration)过程,这一步骤可根据操作人员的需求进行。去除了菌体的培养基(余液)可用常见的方法冷藏,在不失去活性的前提下短期保存。
转基因细胞(或转基因体)中表达的融合蛋白可用一般的方式提炼,如,单独或综合使用盐析(如硫酸铵沉淀或磷酸钠沉淀)、溶媒沉淀(用丙酮、乙醇等分级沉淀蛋白质)、透析、凝胶过滤、离子交换、反相柱层析和亲和层析等柱层析及超滤等技法,可提炼出本发明的融合蛋白(Maniatis等人,分子克隆:实验指南,冷泉港实验室,冷泉港,纽约(1982);桑布鲁克等人,分子克隆:实验指南,第二版,冷泉港实验室出版社(1989);Deutscher,M.,蛋白纯化方法学指南,卷182。学术出版社。圣地亚哥,加利福尼亚(1990))。
与现有技术相比,本发明的有益效果如下:
含有本发明的融合了组织穿透肽和抗血管内皮生长因子(anti-VEGF)制剂的融合蛋白这一有效成分的药物组合物改善了抗血管内皮生长因子制剂的组织穿透性,改善了在眼球内注射时药物抵达脉络膜组织的输送力,可治疗对药物具有抗药性的患者,减少用药量或延长用药周期,不仅如此,还能研制成滴眼剂。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述,本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
图1A是组织穿透肽和抗-血管内皮生长因子的抗原结合片段(Fab)相融合的融合蛋白的模式图;图1B是示意组织穿透肽和抗-血管内皮生长因子相融合的融合蛋白VEGF以及神经菌毛素受体-1相结合的状态的模式图;图1C是各种血管内皮生长因子抑制剂的各种形态(Fab,所有抗体(whole IgG),Fc融合蛋白)下,组织穿透肽融合的改良体的模式图;
图2是将雷珠单抗和本发明的融合蛋白生产的主要产物用HPLC分析的结果(IDB0062:雷珠单抗变异体和组织穿透肽TPP#2相融合的Fab融合蛋白);AU表示任意单位(arbitrary unit);
图3是本发明涉及的各融合蛋白的第一次提炼物在12%非还原性SDS-PAGE凝胶中分析的结果(IDB0062,雷珠单抗变异体和组织穿透肽TPP#2融合的Fab融合蛋白;IDB0064,雷珠单抗变异体和组织穿透肽TPP#5融合的融合蛋白);
图4A是雷珠单抗、雷珠单抗变异体和本发明涉及的融合蛋白的VEGF的结合亲和度的分析结果;图4B是组织穿透肽和本发明涉及的融合蛋白质的神经菌毛素受体-1的结合力的评估结果(IDB0061,雷珠单抗变异体;IDB0062,雷珠单抗变异体和组织穿透肽TPP#2融合的Fab融合蛋白质;Fc-TPP#2,IgG1的FC-末端融入组织穿透肽TPP#2的Fc融合蛋白质);
图5A是在本发明涉及的融合蛋白;的各保管条件下稳定性的评估结果;图5B是反复的冷/解冻时融合蛋白的稳定性的评估结果;
图6A是雷珠单抗、雷珠单抗变异体和本发明涉及的融合蛋白的新生血管预防模型的血管新生抑制效果在角膜新生血管预防模型中的评估结果;图6B是将图6A中的结果数据化后用图表体现的结果;
图7A是雷珠单抗及本发明涉及的融合蛋白的新生血管抗药性模型的血管新生抑制效果在角膜新生血管抗药性模型中的评估结果;图7B是图7A的结果数据化后用图表体现的结果;图7C是雷珠单抗和本发明涉及的融合蛋白的周细胞覆盖减小效果的评估结果;
图8A是本发明涉及的融合蛋白雷珠单抗改良体IDB0062的眼球穿透性通过光学显微镜评估的结果;图8B是将图8A中的结果数据化后用图表体现的结果;图8C是2小时反应后的眼球组织断面上,FITC结合的蛋白质的分布用DAPI染色和光学显微镜分析的结果;图8D是将图8C中的结果数据化后用图表体现的结果;图8E是用共聚焦显微镜分析视网膜组织片段的结果再分析IDB0062的视网膜穿透力的分布的结果;
图9A是本发明涉及的融合蛋白贝伐单抗改良体IDB0072的眼球穿透性通过光学显微镜评估的结果;图9B是将图9A的结果数据化后用图表体现的结果;
图10A是雷珠单抗和本发明涉及的融合蛋白的脉络膜新生血管(CNV模型)经药物处理后抑制脉络膜新生血管增生的状态的示意图;图10B是将图10A的结果数据化后用图表体现的结果;
图11A是雷珠单抗和本发明涉及的融合蛋白的氧诱导视网膜病变(OIR)模型中经药物处理后对血管末端上渗漏现象的抑制通过光学显微镜分析的结果;图11B是将图11A的结果数据化后用图表体现的结果;
图12A是雷珠单抗和本发明涉及的融合蛋白的氧诱导视网膜病变(OIR)模型中经药物处理后对新生血管和血管多发形成的抑制,在凝集素B4染色后通过光学显微镜分析的结果;图12B是将图12A的结果数据化后用图表体现的结果;
图13是在老鼠眼球内注射IDB0062和雷珠单抗后,各时间段视网膜组织中存在的药物量用西式吸印杂交试验分析的结果。
具体实施方式
以下是本发明详细的说明。
但,下列实施例只是本发明所举的范例,本发明的内容并不仅限于以下实施例。
<实施例1>
制备融合了组织穿透肽的雷珠单抗改良体
<1-1>生成率提高的雷珠单抗变异体IDB0061的制备
雷珠单抗的生产收益率低的问题是因为由于Fab碎片的低培养生产性和通过周质表达生成的蛋白质的多形性而需要复杂的后处理工程。为了克服这一问题,通过引入点突变等蛋白质工程改变雷珠单抗的特定氨基酸序列,使生成的蛋白质大部分向细胞外排出,从而只生成表达率提高的均一形态的蛋白质,产生细胞株最少化,生产了雷珠单抗变异体IDB0061。经证实,由此提高了培养的生成率,使提炼工程单纯化,大大地改善了生产收益率。
具体来说,改变雷珠单抗的氨基酸序列的蛋白质工程方法是将雷珠单抗的核苷酸序列中排在最后的半胱氨酸变为丝氨酸后合成基因。然后,在SUPEX5(KCTC 2657BP)产生细胞株中转换后进行了表达测试。
雷珠单抗变异体IDB0061的轻链部分的制备过程如下。从雷珠单抗的核酸序列有关的专利入手,进行密码子最优化,在此基础上合成了包括信号序列在内的Fab轻链可变部分(VL)的核酸,Fab的CL领域是以抗白蛋白Fab的SL335的载体为模板,并使用引物(序列号SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25)进行聚合酶链式反应(PCR)后制备而成。雷珠单抗变异体IDB0061的重链部分的制备过程如下。从雷珠单抗的核酸序列有关的专利入手,进行密码子最优化,在此基础上合成了包括信号序列(gIII)在内的Fab重链可变部分(VH)的核酸,Fab的CH1领域是以抗白蛋白Fab的SL335的载体为模板,并使用引物(序列号SEQ ID NO:32、SEQID NO:33)进行聚合酶链式反应(PCR)后制备而成。
表1克隆时使用的引物(primer)序列
在蛋白质工程领域,使用通常的方法使雷珠单抗的氨基酸序列中发生点突变(point mutation)。具体来说,雷珠单抗的轻链氨基酸序列中第214号氨基酸半胱氨酸(cysteine)置换为丝氨酸(serine),雷珠单抗的重链氨基酸序列中第226号氨基酸半胱氨酸(cysteine)置换为丝氨酸(serine)。将发生所述点突变的雷珠单抗变异体IDB0061的轻链和重链氨基酸序列分别标为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10,将进行编码的核酸序列分别标记为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11。
经聚合酶链式反应(PCR)最终完成的雷珠单抗变异体IDB0061的序列在pHEKA载体进行克隆,转型为SUPEX5家族菌株。具体来说,在1mm的试管内放入100μl的合适的细胞,添加所述3μl的DNA后,在1,800伏下进行电击,导入基因,完成产生细胞株。
将雷珠单抗和IDB0061的产生细胞株1%(v/v)分别接种在50ml的2×YT培养基(100mM磷酸钾缓冲液,pH值7.2,50μg/ml卡那霉素)中,在28℃、220rpm的转速下培养18个小时,进行预培养。在1升的三角烧瓶中各放入180ml的2×YT培养基,在灭菌处理后的主培养基中加入事先除菌的20ml的1M磷酸钾(pH值7.2)和50μg/ml卡那霉素,将预培养液接种至OD600为0.15左右。然后,在28℃和220rpm转速下培养,直至OD600达到0.5~0.7之后加入0.1mM的IPTG,将温度降低至20℃以诱导表达。经过21个小时的诱导表达后,培养液离心回收上清液,用深度过滤器和无菌膜过滤器过滤之后装入蛋白L柱中,从而完成目标蛋白质的提炼。
本发明涉及的雷珠单抗变异体IDB0061和传统的雷珠单抗的生成率进行比较的结果如表2所示,经证实,IDB0061即使只使用基本培养基进行一次性培养,其生成率也比雷珠单抗更高,且无细胞分裂,在培养液中使用吸附柱的一步工程就可提炼出95%以上的纯度,使工程更加简化。
表2雷珠单抗和本发明涉及的雷珠单抗变异体及改良体的生成率的比较
1:参考“抗—VEGF抗体专利”(PCT/US1998/006604,Genentech)
2:与诺华制药的雷珠单抗最终提炼物的纯度进行比较的是IDB0061、IDB0062通过蛋白L柱的第一次提炼物的纯度
<1-2>雷珠单抗变异体和组织穿透肽的融合
本发明的发明者们为了加大抗-VEGF制剂雷珠单抗的功效及克服抗药性,在雷珠单抗的C-末端上融合都能与神经菌毛素1(NRP1)和2融合的或者只与神经菌毛素1特别结合的组织穿透肽(tissue penetrating peptide,TPP),TPP的氨基酸序列体现于下表3中。具有表3的序列目录中序列号SEQ ID NO:1至4的氨基酸序列的TPP与神经菌毛素1和2都能结合,具有序列号SEQ ID NO:5至7的氨基酸序列的TPP只能与神经菌毛素1特别结合,雷珠单抗上融合了TPP的融合蛋白的模式图如图1所示。具体来说,委托APRILBIO制备了所述实施例中<1-1>中制备的雷珠单抗变异体IDB0061的C-末端中融合了下列表3中记载的多种TPP(与神经菌毛素受体特别结合的肽)的融合蛋白以及其生产的细胞株。
另一方面,表3所示的TPP中,具有序列号为SEQ ID NO:2的氨基酸序列的TPP#2是由神经菌毛素VEGF的内在配体VEGF165和脑信号蛋白3系配体的C-末端部位改性而来,TPP#5是神经菌毛素1的b1b2结构域蛋白质和神经菌毛素2的b1b2结构域蛋白质同时作为竞争者(competitor),从与神经菌毛素1的b1结构域选择性结合的克隆导出的肽分离冷冻出来的,这里设计为,用连接肽融合阿瓦斯丁,利用二价体对神经菌毛素受体起作用,从而使VEGF和Sema3A配体具有相似的亲和力的同时又具备组织穿透性。
表3组织穿透肽(TPP)序列信息
TPP#1(SEQ ID NO:1) | HTPGNSNKWKHL QENKK GRNRR |
TPP#2(SEQ ID NO:2) | HTPGNSNKWKHL QENKK GRPRR |
TPP#3(SEQ ID NO:3) | REAPGAPRSPEP QDQKK PRNRR |
TPP#4(SEQ ID NO:4) | REAPGAPRSPEP QDQKK PRPRR |
TPP#5(SEQ ID NO:5) | HTPGNSKPTRTPRR |
TPP#6(SEQ ID NO:6) | HTPGNSNQFVLTSTRPPR |
TPP#7(SEQ ID NO:7) | HTPGIATRTPR |
在未结合TPP的雷珠单抗变异体IDB0061(在雷珠单抗上只导入点突变的形态)上,TPP#2肽根据连接肽连接的形态IDB0062的制备过程如下。
具体来说,融合了TPP的雷珠单抗变异体IDB0062的轻链部分的制备从雷珠单抗的核酸序列有关的专利入手,进行密码子最优化,在此基础上合成了包括信号序列在内的轻链可变部分(VL)的核酸,在将轻链不变部分(CL)C-末端的半胱氨酸置换为丝氨酸的部分序列上合成含有连接肽和TPP#2序列的核酸(CL’-linker-TPP#2)。Fab的CL领域是以抗白蛋白Fab的SL335的载体为模板,并使用引物(SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25)进行聚合酶链式反应(PCR)后制备而成,以合成的CL’-linker-TPP#2核酸为模板,使用引物(SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27)进行聚合酶链式反应(PCR)后制备CL’-linker-TPP#2。这两个产品通过连接PCR连接后制成CL’-linker-TPP#2寡核苷酸。以合成的VL核酸为模板,使用引物(SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29)制备VL后,同时使用CL’-linker-TPP#2和引物(包括SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、BamHI和XhoI序列)进行装配PCR,最终完成VL-CL’-linker-TPP#2序列。
融合了TPP#2的雷珠单抗变异体IDB0062的重链部分的制备从雷珠单抗的核酸序列有关的专利入手,进行密码子最优化,在此基础上合成了包括信号序列(gIII)在内的重链可变部分(VH)的核酸,在将重链不变部分(CH1)C-末端的半胱氨酸置换为丝氨酸的部分序列上合成含有连接肽和TPP#2序列的核酸(CH1’-linker-TPP#2)。Fab的CH1领域是以抗白蛋白Fab的SL335的载体为模板,并使用引物(SEQ ID NO:32、33)进行聚合酶链式反应(PCR)后制备而成,以合成的CH1’-linker-TPP#2核酸为模板,使用引物(SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35)进行聚合酶链式反应(PCR)后制备CH1’-linker-TPP#2。这两个产品通过连接PCR连接后制成CH1’-linker-TPP#2寡核苷酸。以合成的VH核酸为模板,使用引物(SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37)制备VH后,同时使用CH1’-linker-TPP#2和引物(包括SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:39、EcoRI和HindIII序列)进行装配PCR,最终完成VL-CH1’-linker-TPP#2序列。通过PCR最终完成的片段中,轻链切断为BamHI和XhoI,重链切断为EcoRI和HindIII后,在切断为同一限制性内切酶的pHEKA载体上克隆。用上述方法完成的包括IDB0062序列的pHEKA载体在SUPEX5家族菌株转型。
如上制备的IDB0062的轻链和重链氨基酸序列分别标记为SEQ ID NO:12和SEQIDNO:14,对它们编码的核酸序列分别标记为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15。
<1-3>雷珠单抗改良体IDB0062的筛选
对所述实施例<1-2>中制备的多种雷珠单抗改良体各备用蛋白质,进行了神经菌毛素受体的亲和度以及内皮细胞之间紧密连接(tight junction)的瓦解能力的比较。
首先,对神经菌毛素受体的亲和度对神经菌毛素1(NRP1)进行操作。具体来说,为了确认TPP的神经菌毛素1结构域的结合力,利用Biacore 2000(GE医疗生命科学)进行表面等离子共振(SPR)。具体而言,每个神经菌毛素1结构域在10mM醋酸钠缓冲液(pH值4.0)中稀释,约1,000响应单元(RU)固定在CM5传感芯片(GE医疗生命科学,美国)上。将HBS-EP缓冲液(10mM HEPES,2mM乙二胺四乙酸和0.005%表面活性剂的P20,pH值7.4,GE医疗生命科学)以30μl/分钟的流速进行分析,分析的浓度分别是VEGF165从80nm到5nm,Sema3A从1uM到62.5nM,TPP从25uM到1.5625uM。将结合/解离分析后CM5芯片的再生(regeneration)缓冲液(20mM的NaOH,1M氯化钠,pH值10)以30μl/分钟的流速流动1分钟。通过结合3分钟、解离3分钟获取的各传感图(sensorgram)与空白单元进行比较,正常化(normalization)和减去(subtraction)后计算亲和度。
另外,所述内皮细胞之间的紧密连接瓦解能力是测定并评估所述各蛋白质的VE-钙粘着蛋白和E-粘着蛋白的抑制程度。已知,在内皮细胞中,VE-钙粘蛋白和E-钙粘蛋白的表达被抑制,内皮细胞之间的紧密连接(tight junction)瓦解,于是,药物被用药于眼球内时,向脉络膜组织的传输能力(或组织穿透力)提高。具体来说,作为一种间接确认TPP的血管渗透性提高的实验方法,采用蛋白质印迹法(Western blot.)证实了VE-钙粘蛋白的变化。更具体地说,提高血管渗透性就是在6孔板上的每个孔里接种3×105的HUVEC细胞进行培养,24小时后用1uM的TPP处理10分钟,再采用蛋白质印迹法。将SDS-PAGE的凝胶转移到PVDF膜上,用识别VE-钙粘蛋白和β-肌动蛋白的一次抗体(SantaCruz)和HRP结合后的二次抗体(SantaCruz)进行检测,并用ImageQuant LAS4000mini(GE医疗生命科学)进行分析。
试验结果如下表4所示,证实了融合TPP#2的Fc(Fc-TPP#2)与神经菌毛素受体(NRP1)以高水平(与Sema3A配体相似的水平)结合,体现出显著抑制了VE-钙粘蛋白。融合TPP#5的Fc(Fc-TPP#5)的情况是,可以看出与NRP1的结合力比Sema3A高,对VE-钙粘蛋白的抑制效果也更突出。证实了IDB0062是以更高的水平与神经菌毛素受体(NRP1)结合,同时也证实了其对VE-钙粘蛋白的抑制程度也与Fc-TPP#2相似。
表4备用TPP筛选
<1-4>确认雷珠单抗改良体IDB0062的生成率
用与所述实施例<1-1>同样的方法证实了IDB0062的生成率。其结果证实,如所述表1所示,在IDB0061中融入了TPP#2的IDB0062体现出比雷珠单抗高5倍的生成率。
另外,用HPLC分析利用吸附柱的1次提炼物的纯度。HPLC分析实验按照如下方法进行。利用吸附柱1次提炼出的提炼物用超过滤器(Milipore,10K)浓缩后用配制缓冲液(10mM组氨酸、0.1%吐温20、10%海藻糖)交换,将最终浓度稀释至0.5mg/ml。分析机器是用Waters Alliance e2695,吸附柱用的是BioSuite 250UHR SEC(4.6×300mm,4um,Waters),流动相用的是20mM的磷酸钾缓冲液(250nM氯化钾,pH值6.2)。分析方法是注入20μl所述浓缩标本,以0.35ml/分钟的流速分析20分钟,蛋白峰在UV280nm波长下进行紫外分析。
通过实验结果证实,雷珠单抗是3个主要成分混合而成的,其中只有第3个成分是活性成分,但IDB0062是以单一的形式产生(图2)的。
<1-5>确认雷珠单抗改良体IDB0064的制备和生成率
继雷珠单抗改良体IDB0062之后,制备实施例<1-3>中证实了通过连接后融合TPP#5而构建的雷珠单抗改良体IDB0064的VE-钙粘蛋白抑制效果。
IDB0064的具体制备过程如下。为了在IDB0061中结合新TPP的TPP#5而进行了基因克隆。为了以IDB0062为模板将C-末端的TPP在TPP#2中替换为TPP#5使用了特定引物(SEQID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42),在TPP#2和TPP#5共有的前部分序列中抓住退火范围延长至TPP#5的序列,制备引物,并以此进行克隆。按照PCR的变性(95℃,40秒)、退火(65℃,40秒)、延伸(72℃,1min)的顺序循环30次,获取Fab轻链(light chain)和重链(heavy chain)-TPP#5的基因。PCR的产物中,轻链部分进行BamHI和XhoI处理,而重链部分进行EcoRI和HindIII处理,随后被连接和嵌入pHEKA载体后,在产生细胞株supex5转化。
如此制备的IDB0064的轻链和重链氨基酸序列分别标记为SEQ ID NO:16和SEQ IDNO:18,对此编码的核酸序列分别标记为SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19。
所述制备的IDB0064的产生细胞株的生成率被证实。经证实,将1%(v/v)IDB0064产生细胞株接种在50ml的2×YT培养基(100mM磷酸钾缓冲液,pH值7.2,50μg/ml卡那霉素)中,在28℃下以220rpm的转速下培养18小时,进行预培养。在1升的三角烧瓶中各放入180ml的2×YT培养基,在灭菌的主培养基中加入事先除菌的20ml的1M磷酸钾(pH值6.4)和50μg/ml卡那霉素,将预培养液接种至OD600为0.15左右。然后,在28℃和220rpm转速下培养,直至OD600达到0.5~0.7之后加入0.05mM的IPTG,将温度降低至20℃以诱导表达。经过21个小时的诱导表达后,培养液离心回收上清液,用深度过滤器和无菌膜过滤器过滤之后装入蛋白L柱中,从而完成目标蛋白质的提炼。提炼的结果如表2和图3所示,将制备为人造核酸序列的TPP#5序列连接至IDB0061Fab时,也能很好地诱导表达,仅1次提炼就能获取约3~4mg/L生成率的纯度较高的目标蛋白质。
<实施例2>
确认雷珠单抗改良体IDB0062的二价(二价体)特性
确认了雷珠单抗改良体IDB0062的VEGF-A和神经菌毛素1受体的结合力。
<2-1>对神经菌毛素1受体结合力的表面等离子共振(SPR,Biacore2000)实验
为了确认IDB0062和IDB0072的NRP1的结合力,进行SPR检测。用EDC/NHS混合使CM5芯片具有活性后,目标蛋白质NRP1在一个固定的缓冲区(10mM醋酸钠,pH值5.5)稀释,以Rmax:200计算后最终固定在79R。然后,将IDB0062、IDB0072标本在HBSEP缓冲液中稀释至12.5nM~400nM。分析流速为30μl/分钟,结果以图表为基础获取传感图,计算出Kd值。
如表4所示,证实了IDB0062对神经菌毛素2受体的结合力所维持的结合活性与对照药物(Fc-TPP#2)相似。这意味着融合在雷珠单抗的C-末端的TPP#2肽能很好地融合在神经菌毛素1受体。
<2-2>对神经菌毛素1受体结合力的酶联免疫吸附测定(ELISA)实验
在酶标板(SPL,免疫板Maxi结合)上,用碳酸盐层缓冲液(0.1M NaHCO3,pH值9.6)稀释NRP1(自主制成),最终制备浓度为10μg/ml,每一个孔里放入100μl,在37℃下复制2小时。然后,清洗酶标板3次,在37℃下遮挡(4%脱脂乳,pH值7.4)1小时,之后再清洗3次,各标本分别以适当的倍数稀释,每一个孔用100μl处理,在37℃下反应1小时。标本反应结束后,清洗酶标板3次,将山羊抗-人K轻链抗体Ab-HRP(西格玛奥德里奇,A7164)在封闭液中进行5,000倍的稀释,每个孔用100μl处理,在37℃下反应1小时。清洗酶标板5次后,每个孔用100μl的TMB底物(Bethyl,E102)处理,反应2~3分钟后,每个孔用100μl终止液(1N HCl)处理终止反应,最后用酶标板读取器在450nm波长下测量数值。
在ELISA实验中也证实了,IDB0062对神经菌毛素1受体的结合力与对照药物
(Fc-TPP#2)同等程度(图4B)。因而证实了TPP#2肽融合于雷珠单抗的C-末端时,其特性得以保持。
<2-3>对VEGF结合力的酶联免疫吸附测定(ELISA)实验
在酶标板(SPL,免疫板Maxi结合)上,用碳酸盐层缓冲液(0.1M NaHCO3,pH值9.6)稀释VEGF(R&D系统,293-VE-500/CF),最终制备浓度为3μg/ml,每一个孔里放入100μl,在37℃下复制2小时。然后,清洗酶标板3次,在37℃下遮挡(4%脱脂乳,pH值7.4)1小时,之后再清洗3次,各标本分别以适当的倍数稀释,每一个孔用100μl处理,在37℃下反应1小时。标本反应结束后,清洗酶标板3次,使山羊抗-人K轻链抗体Ab-HRP(西格玛奥德里奇,A7164)在封闭液中进行5,000倍的稀释,每个孔用100μl处理,在37℃下反应30分钟。清洗酶标板7次后,每个孔用100μl的TMB底物(Bethyl,E102)处理,反应2~3分钟后,每个孔用100μl终止液(1NHCl)处理终止反应,最后用酶标板读取器在450nm波长下测量数值。
如图4A所示,通过ELISA实验证实了IDB0062的VEGF-A结合力与雷珠单抗相比相对较差,这可能是由于IDB0062因特定氨基酸序列的变化而发生3次结构变化的同时,VEGF-A结合的C糖尿病视网膜病症(Complementary-Determining Region)也部分发生了变化。但是,雷珠单抗的结合力与一般的抗体相比高出了许多,所以结合力这一程度上的稍稍微弱是不足以影响在实际临床上的效果的。
<实施例3>
雷珠单抗改良体IDB0062的稳定性评估
由于IDB0062的特定氨基酸序列的变化引起结构变化,VEGF-A结合力与雷珠单抗相比多少有些减弱,这一结果已被证实,为了确定这种变化对IDB0062的稳定性会带来什么样的变化,进行了在各种保管条件下、反复冷/解冻稳定性的分析。
1次提炼的提炼物用配制缓冲液改性后,浓缩至在动物实验中使用的浓度(5mg/ml),进行实验。在各保管条件下的稳定性实验,将所述标本分成每份10μl,在4℃和-80℃下保管5周,每周取出一次,在冰块中解冻后通过VEGF结合ELISA实验进行分析,将所述标本在-80℃下冰冻后再在冰块中解冻,这样反复5次后取部分标本通过VEGF结合ELISA实验分析反复冷/解冻的稳定性。
结果是,如图5所示,IDB0062在4℃和-80℃下保管5周后,VEGF-A结合能力还是保持稳定,经过5次反复冷/解冻并加上物理冲击也没有影响活性,由此判断物质的稳定性并没有随着氨基酸序列变化而降低。
<实施例4>
抗-VEGF制剂改良体的眼球组织穿透度的评估
为分析雷珠单抗改良体的眼球穿透度,构建离体眼球穿透模型评估其功效。除此之外,为了在分子量大、3次结构更复杂的抗体(包括Fc融合蛋白)中评估组织穿透肽的融合是否改善组织穿透度,同时对贝伐单抗及其改良体IDB0072的眼球穿透度进行了分析。
<4-1>雷珠单抗改良体IDB0062的组织穿透度评估
为了确认融合于IDB0062的C-末端的TPP和眼球内皮细胞广泛分布的神经菌毛素受体的结合是否能使组织穿透度得到真正改善,将取出的眼球浸泡在与FITC结合的雷珠单抗和IDB0062溶液中,然后在每一时间段都对穿透程度进行了比较。
为了提高蛋白质和FITC的结合率,将脑白质标本与100mM的碳酸钠缓冲液(pH值9.0)交换,浓度补正为1mg/ml后,与FITC(1mg/ml in DMSO)混合后在室温下反应2小时。由于在TPP#2肽中有大量可以和FITC结合的游离胺基,因此蛋白质糖FITC采用不同的反应摩尔数反应。然后,使用PD-10脱盐柱去除未能结合的FITC,同时用硫化铅缓冲液改性后量化出提炼物用作评估功效用的标本。结合的结果证实,雷珠单抗和IDB0062的荧光素与蛋白的比例(F/P)是1.127和1.133,每个蛋白质分子的摩尔数基本相同的FITC结合。将FITC结合了的雷珠单抗和IDB0062溶液用硫化铅稀释至0.3mg/ml后,取出C57BL/6老鼠眼球后在37℃下浸泡1小时、2小时后,用硫化铅清洗2次,每次清洗10分钟,制成石蜡切片。用戴维森溶液(冰醋酸:乙醇:中性福尔马林:蒸馏水=1:3:2:3),在4℃下将眼球固定4个小时,用剪刀切断部分结膜前部组织,在石蜡切片制备阶段,使视网膜组织的变形最小化。之后,经过整晚在4℃下用10%(v/v)福尔马林溶液的固定,使用自动渗透器将乙醇从低浓度提高至高浓度,去除组织内水分,经过二甲苯透明步骤后进行石蜡渗透。完成石蜡渗透的组织放入底模制备石蜡块,使用显微镜用薄片切片机制备4个切片。石蜡切片在悬浮恒温水箱中打开,首先吸附在用白蛋白、多聚赖氨酸和盐水涂层的切片上。组织切片经脱蜡后直接安装,用共聚焦显微镜观察FTIC,确认眼球组织的穿透性和分布。
如图8A和图8B所示,证实了IDB0062从实验1小时后开始迅速通过角膜和眼球后侧渗透至眼球内侧,到2小时的时候,在眼球组织和玻璃体内的分布量是对照药物雷珠单抗的4倍,明显增加。经DAPI染色能明确区分和分析眼组织,可以证实IDB0062与雷珠单抗不同,在角膜内侧蛋白质过量分布(图8C,白色箭头),同时还能证实眼球内的药物分布与雷珠单抗相比也增长了10倍左右(图8D)。从图8E的数据中可以看到眼球的视网膜组织的断面,证实了作为对照药物的雷珠单抗大部分存在于巩膜(sclera)周围,但IDB0062却穿透了视网膜色素上皮细胞(RPE)膜,药物到达了视网膜。结论是,在眼球内组织穿透率不高的雷珠单抗上连接组织穿透肽,可将眼球穿透率提高至对照药物的4倍左右,从而确认了通过改善药物的渗透度调节用药剂量和用药间隔的可能性以及改善剂型研制滴眼剂的可能性。
<4-2>贝伐单抗改良体IDB0072的组织穿透度的评估
与抗体片段(Fab)相比,贝伐单抗(bevacizumab)等所有抗体(whole antibody)蛋白质的分子量大,蛋白质的3次结构复杂,具有不利于组织穿透的特性。即使如此,为了确认在贝伐单抗的C-末端融合组织穿透肽,克服这种物理上的限制后,与作为对照药物的贝伐单抗相比穿透度是否有所改善。做了同样的实验。
贝伐单抗改良体IDB0072的制备过程如下。IDB0072作为在贝伐单抗的C-末端上通过连接肽融合了TPP的抗体融合蛋白质的一个形态,TPP的氨基酸序列体现于表3中。具有表3的序列目录中序列号SEQ ID NO:1至4的氨基酸序列的TPP与神经菌毛素1和2都能结合,具有序列号SEQ ID NO:5至7的氨基酸序列的TPP只能与神经菌毛素1特别结合。另一方面,表3所示的TPP中,TPP#2是由神经菌毛素的内在配体VEGF165和脑信号蛋白3系各配体的C-末端部位改性而来,TPP#5是神经菌毛素1的b1b2结构域蛋白质选择性地结合克隆导出的人造肽分离冷冻出来的,将其中的TPP#2用连接肽与贝伐单抗融合,利用二价体对神经菌毛素受体起作用,从而设计成VEGF和Sema3A配体具有相似的亲和力的同时又具备组织穿透性的IDB0072。
具体来说,就是制备生成在贝伐单抗的C-末端上融合了具有所述序列号为SEQ IDNO:2氨基酸序列的TPP#2的IDB0072的细胞株。在pcDNA3.4载体上克隆了IDB0072。IDB0072的轻链和重链氨基酸序列分别记录为SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22,对此进行编码的核酸序列被记录为SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:23。对CHO DG44细胞中与所述构建的抗体重链不变部位和NRP1结合的肽相融合的蛋白质进行编码的质粒和编码轻链蛋白的质粒用NeonTM电泳进行转染后,在T25细胞培养瓶接种3×106,在37℃下培养。用筛选标记确保稳定细胞后,在生物反应器中用无血清培养基SFMCHO(海克隆,Hyclone),在100RPM的转速、37℃、PH值7.2和50%D02的条件下,以悬浮状态培养7天。上清液用离心和细胞分离,用0.22过滤器除菌。
回收IDB0072的培养液,参考标准协议,提炼各蛋白质。蛋白质A柱(Mabselectsure树脂,GE医疗生命科学)中加入培养液,用PBS(PH值7.4)清洗。用PH值为3.0的0.1M甘氨酸缓冲液洗脱抗体,再用PH值为7.0的1M Tris缓冲液中和样品。洗脱的抗体片段用超微孔超滤(截留分子量30)离心浓缩机进行浓缩,用PBS(PH值7.4)缓冲液交换。精炼的抗体重链不变部为和筛选的NRP1特别结合而成的肽融合的蛋白质在补正为280nm的波长下利用吸光度和吸光系数进行量化。
为了提高蛋白质和FITC的结合率,用100nM碳酸钠缓冲液(pH值9)交换贝伐单抗和IDB0072,又将浓度补正为3mg/ml与FITC(1mg/ml DMSO)混合,在常温下反应2小时。IDB0072因在TPP#2的融合,为了减少连接的差异,蛋白质糖FITC采用与对照药物贝伐单抗不同的反应摩尔数进行反应。然后,使用PD-10脱盐柱去除未能结合的FITC,同时用硫化铅缓冲液改性后量化出提炼物用作评估功效用的标本。结合的结果证实,贝伐单抗和IDB0072的荧光素与蛋白的比例(F/P)是2.18和1.98,每个蛋白质分子的摩尔数基本相同的FITC结合。将FITC结合了的贝伐单抗和IDB0072溶液用硫化铅稀释至0.9mg/ml后,取出C57BL/6老鼠眼球后在37℃下浸泡1小时、2小时后,用硫化铅清洗5次,每次清洗10分钟,制成石蜡切片。这一过程和实施例<4-1>相同。
为了评估生成的贝伐单抗改良体IDB0072的活性,通过SPR实验确认对神经菌毛素1受体的结合力。如表5所示,IDB0062对神经菌毛素1受体的结合力与对照药物(Fc-TPP#2)及雷珠单抗改良体IDB0062体现出相似的结合活性。这表示融合于贝伐单抗的C-末端的TPP#2肽果然同IDB0062一样很好地融合在神经菌毛素1受体上。
表5 TPP融合体NRP1活性的评估
如图9A所示,证实了IDB0072的眼球穿透力与对照药物贝伐单抗相比果然有所改善。结果证实,IDB0072在1小时和2小时内在眼球内的分布增加明显,是贝伐单抗的1.5倍左右(图9B)。另外还证实了IDB0072不仅具有大分子量和结构,与贝伐单抗相比,通过结膜向角膜扩散并分布。因此,还可以确认在分子量大且结构复杂的抗体中,在Fc C-末端上连接组织穿透肽也可以显著增加组织穿透度。这一结果体现了包括抗体蛋白质的多种Fc融合蛋白质上连接组织穿透肽能改善眼球组织穿透度的可能性。
<实施例5>
利用角膜新生血管模型评估雷珠单抗改良体的功效
为了评估IDB0062的功效,构建了角膜新生血管模型,分为预防模型和抗药性模型,与雷珠单抗就抑制血管新生与否和减少新生血管的效果进行了比较。
<5-1>预防模型
为了比较IDB0062和雷珠单抗的新生血管抑制效果,制作了如下由碱性烧伤诱导的角膜新生血管模型。先将纤维素滤纸剪成直径为2mm的圆,浸在1M氢氧化钠溶液中。使用的老鼠为6周大的雌性C57BL/6,麻醉(Zoletil 40mg/kg+Rompun 5mg/kg,IP)后在左眼角膜放上氢氧化钠过滤纸,30秒的时间诱导碱性烧伤,然后用40ml的硫化铅充分清洗,构建角膜新生血管动物模型。预防模型的情况下,诱导碱性烧伤的当天就用药物处理,各药物浓度为5mg/ml,一天滴4次,每次5μl,用药周期共为5天。用药结束后,取出眼球在4%的多聚甲醛溶液中浸泡1小时进行固定,用硫化铅清洗后,用解剖显微镜分离角膜。分离的角膜再用4%的多聚甲醛溶液浸泡12小时进行加固。加固的角膜用硫化铅清洗后,在常温下用封闭缓冲液(硫化铅、0.3%牛血清白蛋白、0.1%Triton X100)进行2小时的反应。将血管内皮细胞标记的PECAM-1(CD31)中特别的一次抗体(BDPharmingen试剂)和周细胞标记NG-2中特别的一次抗体(Millipore)冷藏一晚发生反应,二次荧光抗体(Alexa fluor488,Alexa fluor594,Life Technologies)在常温下反应4小时染色组织。结束了染色过程的角膜放在显微镜载片上,用解剖显微镜从角膜的中央向4个方向划上切割线。安装结束后,角膜载片用光学显微镜/共聚焦显微镜确认血管和周细胞的形态。
通过预防模型的实验结果证实,正如图6所示,IDB0062与雷珠单抗相比能抑制多出20~30%的新生血管,同时体现了比赋形剂强50%以上的显著的预防效果,IDB0061也体现出与雷珠单抗同等的功效,由雷珠单抗的结构变化引起的VEGF的结合力低下实际上对新生血管抑制效不产生影响,在C-末端上融合TPP带来功效的增强是可能的。
<5-2>抗药性模型
抗药性模型使用与预防模型相同的方法诱导碱性烧伤,放置10天使角膜新生血管充分发生。用药浓度和周期也和预防模型相同,用药从碱性烧伤10天后开始,维持10天,将生成的新生血管的减少程度与雷珠单抗进行了比较(之后制备角膜显微镜载片的过程与预防模型相同)。
如图7A所示,可确认,在赋形剂和雷珠单抗处理实验组中,血管发达直至角膜,而IDB0062处理组的血管只是局部分布在眼球外侧(异组织边缘,limbus),新生血管减少了。实验结果是,IDB0062与赋形剂相比体现出30%以上的新生血管减少的显著功效,与未能体现显著功效的雷珠单抗相比,功效增加了2倍以上(图7B),这一结果与抗-VEGF的适体和抗PDGF抗体的试剂合并给药的文献的结果相似(Jo等人,2006.Am.J.Pathol.)。由此预测,本发明涉及的IDB0062可能改善雷珠单抗的用药患者中并未改善视力而只是保持视力不变的约70%的患者的视力。
另外,如图7C所示,可以确认的是,与赋形剂处理组相比,IDB0062处理组中的周细胞覆盖显著减少了40%左右,这一点与以治疗对传统药物产生抗药性的患者为目的而正在研制的合并用药制剂PDGF抑制剂出现相似的结果。因此可以预想,IDB0062可能作为治疗抗-VEGF抑制剂用药患者中45%的抗药性患者的单一疗法药物。
<实施例6>
用脉络膜新生血管模型评估雷珠单抗改良体的功效
黄斑病变(age-related macular degeneration)的模型脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)用激光诱导脉络膜新生血管法诱导证实了雷珠单抗改良体IDB0062的疗效。
七周龄的雄性棕色挪威(BN)大鼠(SLC日本、东京,日本)驯化一周后,经腹腔注射戊巴比妥钠(翰林制药,25mg/kg)后麻醉,然后滴入1%托吡卡胺眼药水使瞳孔扩张,使用半导体激光(波长532nm;直径100μm;功率150mW;时间0.1秒)在视神经头周边制造六处光凝固点(photocoagulation)。布鲁赫膜的破坏经验证是由于特性气泡的形成。气泡未形成或出血的眼球在之后的实验中被排除在外。光凝固处理后,将大鼠如图6所示随机分为五组,每组10只。给药时使用汉密尔顿注射器(汉密尔顿,美国)在眼球内用药,每组用适当的浓度。CNV组的用药是相同剂量的赋形剂,作为对照药物则使用了100μg/眼的雷珠单抗。由于用药引起的发生外部损伤的个体或发生晶状体浑浊等的个体在之后的实验中也被排除在外。
表6脉络膜新生血管(CNV)模型实验组
给药10天后,对脉络膜新生血管生成的程度进行了评估。取出大鼠的眼球,在显微镜下,在眼角膜和巩膜临近部位解剖眼球后,利用眼球的后部组织取下视网膜,剥离包括视网膜下部位的结膜组织。离体组织在4%的多聚甲醛中固定1小时后,用PBS清洗,然后在5%Triton X-100和含有1%牛血清白蛋白的PBS中搅拌3小时,再次清洗后,在PBS中按照1:50的比例稀释溶解为1mg/ml的血管内皮细胞标记物的凝集素B4(Sigma),在4℃下反应一个晚上。用含0.05%吐温20的PBS清洗2小时后,用streptavidin TRITC以1:500的比例进行稀释,使其在37℃下反应4小时后,再用PBS洗30分钟,最后在光学显微镜(BX51,奥林匹斯,日本)下观察,视网膜下新生血管部位的大小用Image J软件分析(美国国立卫生研究院,美国)进行了分析。
如图10A所示,赋形剂实验组证实了激光损伤区的从内(脉络膜)到外(视网膜)出现了大量有黑色标记的新生血管。与赋形剂相比,在用了100μg对照药物雷珠单抗的实验组中新生血管的形成多少出现被抑制的倾向,但部分个体中仍然能够观察到血管。另外再看一下IDB0062的情况,可以确认浓度依赖性地抑制新生血管的形成的倾向。可以证实50μg的IDB0062给药组具有与对照药物雷珠单抗100μg给药组相似程度的新生血管功效,同时也证实了100μg的IDB0062给药组中视网膜上只留下了激光伤痕,新生血管大部分被抑制。如图10B,将所述结果数据化,与赋形剂相比,雷珠单抗100μg给药组和50μg的IDB0062给药组抑制的血管形成约31%左右,而100μg的IDB0062给药组对血管形成的抑制率约为36%。结果证实,与雷珠单抗相比,IDB0062仅使用了一半的剂量但却达到了相同的对新生血管的抑制功效。
<实施例7>
利用氧诱导视网膜病变模型评估雷珠单抗改良体的功效
用早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity)的模型诱导氧诱导的视网膜病变(oxygen-induced retinopathy,OIR),来确认雷珠单改良体IDB0062的功效。
实验动物使用的是购自Koatech的7-8周龄的C57BL/6大鼠交配后生下的小鼠。在生下后第7天,将小鼠(出生第7天,P7)放置在氧气室,并且调节氧气室的氧浓度,在5天内(P7-P11)始终保持75%的高氧(hyperoxia)。实验室内的照明每12小时间隔开启或关闭,温度保持在24±2℃,饲料和饮水可自由取食。5天后暴露在氧气室外的室内大气(正常氧,normoxia)中放置5天(P12-P17)诱导视网膜新生血管。为了给药,出生第12天的小鼠被放置在大气之后,立即按照表7的记录随机分为5组,每组10只。药物使用汉密尔顿注射器(汉密尔顿,美国)按各组适当的浓度注射至眼球内。OIR实验组使用的是相同剂量的赋形剂,作为对照药物则使用了10μg/眼的雷珠单抗。给药引起的发生外部损伤的个体或是发生晶状体浑浊等的个体在实验过程中被排除。
表7氧诱导视网膜病变(OIR)模型实验组
在出生后第17天对视网膜浮肿的程度进行评估。用戊巴比妥钠(翰林制药,25mg/kg)对小鼠进行腹腔注射麻醉。打开腹腔后注射10μL的右旋糖酐(FD40S-1G,西格玛;50毫克/毫升PBS)至心脏。10分钟后取出眼球,以4%的多聚甲醛固定10分钟,然后剥离视网雷珠单抗膜,平式制备视网膜的显微镜载片,并在光学显微镜(BX51,奥林匹斯,日本)下观察。渗出血管的荧光用Image J软件对荧光强度进行定量分析。
如图11A所示,可以证实,未经药物处理的赋形剂实验组中,中央视神经部和视网膜外部血管末端的荧光外渗因为渗血而增加。对照药物10μL雷珠单抗处理组中,血管渗漏的程度与赋形剂实验组相比多少有些减少,但是在血管末端部位仍然存在由渗漏的血管引起的荧光外渗。但另一方面,在IDB0062处理组可以看到浓度依赖性的血管渗漏被抑制的倾向,使用与雷珠单抗同样剂量的10μL以上剂量的给药组中,虽然从统计上看不出来,但是可以确认其对血管渗漏的抑制功效比雷珠单抗更好(图11B)。尤其是使用15μL的IDB0062的给药组中,血管表现出细密和稳定的结构,完全看不出渗血的部分。
另外还评估了视网膜中血管的形成程度。剥离的视网膜在4%的多聚甲醛中固定3小时候用PBS清洗,然后在5%Triton X-100和含有1%牛血清白蛋白的PBS中搅拌3小时,再次清洗后,在PBS中按照1:50的比例稀释溶解浓度为1mg/ml的血管内皮细胞标记物的凝集素B4(L2140,Sigma),在4℃下反应一个晚上。用含0.05%吐温20的PBS清洗2小时后,用streptavidin TRITC以1:500的比例进行稀释,使其在37℃下反应4小时后,再用PBS清洗30分钟,最后在光学显微镜(BX51,奥林匹斯,日本)下观察。
P7小鼠在5天的高氧条件下又被转移到正常氧下,处于一种相对缺血的状态。此时,视网膜中过度的新生血管滋生,这时形成的新生血管的特征是血管是从视网膜开始向无血管区的玻璃体方向滋生,并且形成容易渗血的不规则的血管形态tufts(簇)的结构。这些簇的形成可以被用来作为定量新生血管的标准。正如通过图12A可以确认,赋形剂实验组中被染色的血管中,各血管间界限分明,具有比较纤细和稳定结构的是正常的视网膜血管,反之,总体上不太规则和较粗的血管形成一种丛生的簇的则是新生血管。再看IDB0062的情况,归类为浓度依赖性新生血管的簇的分布大量减少,在10μg以上给药组中,大部分的血管结构区分明确,与簇的形态相比,看到更多的是纤细和稳固的正常的血管状态。将此数据化后用图表形式来体现并可确认,在赋形剂实验组、雷珠单抗10μg处理组、5μg的IDB0062给药组中看到的新生血管的形成程度都是相同的,但是与这些组相比,10μg的IDB0062给药组大约抑制了40%的新生血管(图12B)。结果证实,OIR模型中未能确认雷珠单抗对视网膜新生血管的抑制功效,但是可以看到IDB0062在与雷珠单抗使用同样的剂量下可以明显抑制由OIR诱导的新生血管的形成。
<实施例8>
眼球注射后药物分布的分析
为了确认将雷珠单抗和IDB0062注射入眼球时,组织内药物的分布,从视网膜组织提取蛋白质并进行了蛋白质印迹法实验(Western blot assay)。
眼球内注射后4小时、72小时后,取出大鼠的眼球并剥离视网膜。离体的视网膜用PBS清洗3次,放入裂解缓冲液(20mM的Tris-Cl,150mM的NaCl,1mM的EDTA,0.1%tritonX-100)后用高速搅拌器使组织破碎。之后,离心(14,000转速,4℃,10分钟)回收上清液,用考马斯亮蓝法测定溶解产物的蛋白质含量。为了进行蛋白质印迹法实验,使用了12%非还原性SDS-PAGE凝胶。在每个孔内注入40μg蛋白质标本,在25mA电流下运转一个小时。然后转移到PVDF膜上,再用抗-kappa抗体HRP(Sigma,F3761)检测蛋白,使用Bio-Rad公司的chemidoc成像系统将每个蛋白带量化。
由于重链和轻链因二硫键连接而结合,所以在非还原性SDS-PAGE凝胶分析中,证实雷珠单抗在48kDa部位一个蛋白带。另一方面,由于重链和轻链之间没有二硫化连接,故在同一条件下进行非还原性SDS-PAGE凝胶,证实IDB0062在28kDa部位分为2个蛋白带(重链和轻链)。如图13所示,可证实眼球内注射4小时后,注射IDB0062后视网膜中留存的药物量高出雷珠单抗的3.6倍左右。这些结果表明,IDB0062可由TPP与蛋白表达组织特异结合,因此针对视网膜新生血管引起的各种疾病,可以瞄准患病部位的视网膜组织。将药物注射入眼球,弥漫在玻璃体内,与病变组织结合去除VEGF的机会增加,可以用更少的药量发挥同等的药效,这一结果可以作为判断利用脉络膜新生血管模型和视网膜病变模型的药效评估中IDB0062优越疗效的依据。
【产业利用的可行性】
本发明涉及的含有融合了组织穿透肽和抗-血管内皮生长因子(anti-VEGF)制剂的融合蛋白这一有效成分的药物组合物与传统的抗-血管内皮生长因子制剂相比较,不仅能抑制血管内皮生长因子以外的与新生血管有关的各种生长因子,而且能提高减少周细胞覆盖的药效,并能够治疗抗药患者。另外,在眼球内注射时,通过改善直达脉络膜组织的药物输送力、减少给药量或延长给药周期以及改善眼球穿透度,研发为滴眼剂的可能性非常之高,在产业上利用的可行性十分优秀。
本发明具体应用途径很多,以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出,以上实施例仅用于说明本发明,而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进,这些改进也应视为本发明的保护范围。
Claims (14)
1.一种含有融合了组织穿透肽和抗-血管内皮生长因子制剂的融合蛋白这一有效成分的用于预防和治疗眼疾的药物组合物。
2.根据权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述组织穿透肽含有从SEQ IDNO:1至7中选择的任意一个氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述抗-血管内皮生长因子制剂选自雷珠单抗、贝伐单抗、阿柏西普、康柏西普及其生物仿制药和变异体中的任意一个。
4.根据权利要求3所述的药物组合物,其特征在于,所述变异体的重链恒定区1和轻链恒定区的半胱氨酸缺失,或者置换为了除半胱氨酸外的包括丝氨酸的其他氨基酸残基。
5.根据权利要求3所述的药物组合物,其特征在于,所述变异体是雷珠单抗变异体,其包括序列为SEQ ID NO:8所示的轻链和序列为SEQ ID NO:10所示的重链。
6.根据权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述融合蛋白包括如SEQ ID NO:12或16所示的氨基酸序列;以及如SEQ ID NO:14或18所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述融合蛋白包括如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列以及如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述融合依靠连接肽完成。
9.根据权利要求1至8任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述眼疾选自增生玻璃体视网膜病症、黄斑病变、色素性视网膜症、糖尿病视网膜症、脉络膜新生血管、新生血管性绿内障、缺血性视神经障碍、早熟儿视网膜症、早产儿视网膜症、流行性角结膜炎、新生血管性虹膜症、后晶状体纤维增生症、过敏性角膜炎、上角膜缘性角膜炎、翼状胬肉干燥性角膜炎、小疱性角结膜炎、巩膜症及糖尿病黄斑浮肿。
10.一种克服了抗药性并提高了功效的抗-血管内皮生长因子制剂的生产方法,其特征在于,所示方法包括:
(a)对组织穿透肽和抗-血管内皮生长因子制剂相融合的融合蛋白进行编码的核酸序列的重组载体转换为宿主细胞的步骤;
(b)培养所述细胞的步骤;以及
(c)从所述细胞中回收融合蛋白的步骤。
11.根据权利要求10所述的生产方法,其特征在于,所述抗-血管内皮生长因子制剂选自雷珠单抗、贝伐单抗、阿柏西普、康柏西普及其生物仿制药和变异体中的任意一个。
12.根据权利要求10所述的生产方法,其特征在于,所述融合依靠连接肽完成。
13.一种治疗眼疾的方法,其特征在于,对有需要的个体使用有效药量的含有融合了组织穿透肽和抗-血管内皮生长因子制剂。
14.一种采用含有融合了组织穿透肽和抗-血管内皮生长因子制剂的融合蛋白作为有效成分制备用于眼疾治疗的制剂的用途。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113384715A (zh) * | 2021-06-03 | 2021-09-14 | 上海市第十人民医院 | 一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗vegf药物及其制备方法和应用 |
WO2023280157A1 (zh) * | 2021-07-05 | 2023-01-12 | 武汉纽福斯生物科技有限公司 | 一种抗vegf抗体体内表达系统的构建和应用 |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10561707B2 (en) | 2013-09-08 | 2020-02-18 | Technion Research And Development Foundation Ltd. | Semaphorin 3C variants, compositions comprising said variants and methods of use thereof in treating eye diseases |
US9840553B2 (en) | 2014-06-28 | 2017-12-12 | Kodiak Sciences Inc. | Dual PDGF/VEGF antagonists |
CN108348572B (zh) | 2015-03-31 | 2021-06-29 | 日东制药株式会社 | 含有融合组织穿透肽和抗-vegf制剂的融合蛋白的预防和治疗眼疾的药物组合物 |
CA3010056A1 (en) | 2015-12-30 | 2017-07-06 | Kodiak Sciences Inc. | Antibodies and conjugates thereof |
EP3407846B1 (en) * | 2016-01-25 | 2021-09-22 | Technion Research & Development Foundation Limited | Composition comprising a semaphorin 3c or variant thereof for use in treating age-related macular degeneration |
EP3790532A1 (en) * | 2018-05-10 | 2021-03-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | High concentration vegf receptor fusion protein containing formulations |
EP3808842A4 (en) * | 2018-06-14 | 2022-11-23 | Avixgen Inc. | PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF SEVERE COMPLEX IMMUNE DEFICIENCY WITH A CELL-PERFORMING PEPTIDE AND ADENOSINDEAMINASE FUSION PROTEIN |
US20210068733A1 (en) * | 2019-09-06 | 2021-03-11 | United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs | Methods and systems for self-administered measurement of critical flicker frequency (cff) |
EP4041312A4 (en) | 2019-10-10 | 2023-12-20 | Kodiak Sciences Inc. | METHOD FOR TREATING AN EYE DISORDER |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070071756A1 (en) * | 2005-09-26 | 2007-03-29 | Peyman Gholam A | Delivery of an agent to ameliorate inflammation |
KR20140138539A (ko) * | 2013-05-23 | 2014-12-04 | 아주대학교산학협력단 | 뉴로필린에 특이적인 종양 침투성 펩타이드 및 이 펩타이드가 융합된 융합 단백질 |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005056764A2 (en) | 2003-12-05 | 2005-06-23 | Compound Therapeutics, Inc. | Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors |
GB0724331D0 (en) | 2007-12-13 | 2008-01-23 | Domantis Ltd | Compositions for pulmonary delivery |
CN101679511A (zh) | 2007-06-06 | 2010-03-24 | 杜门蒂斯有限公司 | 多肽、抗体可变域和拮抗剂 |
WO2009105669A2 (en) * | 2008-02-20 | 2009-08-27 | Genzyme Corporation | Angiogenesis inhibition |
FI121959B (fi) * | 2008-05-09 | 2011-06-30 | Pirjo Laakkonen | Aivokasvaimiin hakeutuva peptidi |
US8821870B2 (en) | 2008-07-18 | 2014-09-02 | Allergan, Inc. | Method for treating atrophic age related macular degeneration |
PL2433953T3 (pl) * | 2009-05-20 | 2015-12-31 | Toray Industries | Peptydy o zdolności przenikania przez błonę komórkową |
CA2766634A1 (en) * | 2009-06-22 | 2011-01-13 | Burnham Institute For Medical Research | Methods and compositions using peptides and proteins with c-terminal elements |
CN102002104A (zh) | 2009-08-28 | 2011-04-06 | 江苏先声药物研究有限公司 | 一种抗vegf的单克隆抗体及含有该抗体的药物组合物 |
CA2810668A1 (en) * | 2010-09-08 | 2012-03-15 | Halozyme, Inc. | Methods for assessing and identifying or evolving conditionally active therapeutic proteins |
ES2753135T3 (es) | 2012-05-07 | 2020-04-07 | Allergan Inc | Método de tratamiento de DMAE en pacientes resistentes a terapia anti-VEGF |
JO3405B1 (ar) * | 2013-01-09 | 2019-10-20 | Regeneron Pharma | الأجسام المضادة لمضاد مستقبل عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية - بيتا واستخداماتها |
JP6138973B2 (ja) | 2013-09-19 | 2017-05-31 | フィリップス ライティング ホールディング ビー ヴィ | 連続出力調整範囲を有するコンパクト電力変換装置 |
KR102157618B1 (ko) | 2013-10-21 | 2020-09-18 | 주식회사 아이티엘 | 서빙셀별로 듀플렉스 방식을 달리하는 무선 통신 시스템에서 통신을 수행하는 장치 및 그 방법 |
CN108348572B (zh) | 2015-03-31 | 2021-06-29 | 日东制药株式会社 | 含有融合组织穿透肽和抗-vegf制剂的融合蛋白的预防和治疗眼疾的药物组合物 |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070071756A1 (en) * | 2005-09-26 | 2007-03-29 | Peyman Gholam A | Delivery of an agent to ameliorate inflammation |
KR20140138539A (ko) * | 2013-05-23 | 2014-12-04 | 아주대학교산학협력단 | 뉴로필린에 특이적인 종양 침투성 펩타이드 및 이 펩타이드가 융합된 융합 단백질 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
LESLIE N JOHNSON, ET AL.: "Cell-penetrating Peptide for Enhanced Delivery of Nucleic Acids and Drugs to Ocular Tissues Including Retina and Cornea", 《VISION RESEARCH》 * |
LESLIE N. JOHNSON, ET AL.: "Cell penetrating peptide POD mediates delivery of recombinant proteins to retina, cornea and skin", 《VISION RESEARCH》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113384715A (zh) * | 2021-06-03 | 2021-09-14 | 上海市第十人民医院 | 一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗vegf药物及其制备方法和应用 |
CN113384715B (zh) * | 2021-06-03 | 2023-08-04 | 上海市第十人民医院 | 一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗vegf药物及其制备方法和应用 |
WO2023280157A1 (zh) * | 2021-07-05 | 2023-01-12 | 武汉纽福斯生物科技有限公司 | 一种抗vegf抗体体内表达系统的构建和应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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