JP6836512B2 - 組織透過性ペプチドと抗血管内皮細胞成長因子製剤が融合された融合タンパク質を有効成分として含む眼疾患の予防及び治療用薬学的組成物 - Google Patents

Description

本出願は、2015年3月31日に出願された大韓民国特許出願第10-2015-0045684号に基づく優先権を主張し、前記明細書全体は参照により本出願に援用する。

本発明は、組織透過性ペプチドと抗血管内皮細胞成長因子製剤が融合された融合タンパク質を有効成分として含む、眼疾患の予防及び治療用薬学的組成物に関する発明であり、より具体的には、組織透過性ペプチドと抗血管内皮細胞成長因子（anti-VEGF）製剤が融合された融合タンパク質を有効成分として含む、眼疾患の予防及び治療用薬学的組成物、さらに、組織透過性ペプチドと抗血管内皮細胞成長因子製剤が融合した融合タンパク質をコードする核酸配列を含む組換えベクターを宿主細胞にトランスフェクションする段階；前記細胞を培養する段階；及び前記細胞から融合タンパク質を回収する段階を含む、耐性克服及び効能が向上した抗血管内皮細胞成長因子製剤を生産する方法、本発明に係る融合タンパク質の有効量を、これを必要とする個体に投与することを含む眼疾患の治療方法、さらに、本発明に係る融合タンパク質を有効成分として含む眼疾患の治療用製剤を製造するための用途に対するものである。

黄斑（macula lutea）は目の網膜において視細胞が密集しており、光を最も鮮明で正確に受け入れる部分であり、多様な原因によってこの黄斑部に変性が生じ、視力障害を起こす疾患を黄斑変性（macular degeneration）と呼ぶ。前記黄斑変性は緑内障、糖尿網膜症とともに失明の三大原因の一つである。黄斑変性を引き起こす最大の原因は加齢であり、その他に家族歴、人種、喫煙なども原因として知られており、黄斑が損傷すると小さい活字体、顔立ちや小さい物体のような細部的なものを識別する能力を喪失することになる。これらの黄斑変性は非滲出性（乾性）黄斑変性と滲出性（湿性）黄斑変性の二種があり、黄斑変性を有する人のうち90％は、乾性形態の症状を有する。乾性黄斑変性において、老廃物がドルーゼン（drusen）と呼ばれる黄色沈殿物を形成して黄斑の下の組織に蓄積することがある。ドルーゼンの存在は網膜、特に黄斑への血流の妨げになり、血流が減少すると黄斑への栄養分供給が減少し、感光性細胞の効率的作用を停止させたり萎縮させたりする。湿性黄斑変性症の場合には、新しい弱い血管が網膜内又はその下で成長して、液体及び血液が黄斑の下の空間に染み出るようになる。湿性黄斑変性は時には脈絡膜血管新生と表記されることもあるが、脈絡膜は網膜の下方の血管領域であり、血管新生は組織内の新しい血管の成長を意味するから、脈絡膜血管新生とは、名称から類推できるように湿性黄斑変性の場合、脈絡膜から黄斑に血管が新生されて成長するようになる。このような黄斑変性は高齢者によく生じる疾患とされたが、最近になって40、50代の患者が急増していると知られており、これらの黄斑変性の発症年齢層が低くなった主な原因としては、脂肪摂取量の増加など食生活の欧米化及び喫煙、飲酒、紫外線曝露など良くない生活習慣が指摘されている。

糖尿病性黄斑浮腫（Diabetic Macular Edema、DME）は、網膜の中心の１乳頭径内の網膜及び／又は硬性白斑の肥厚により説明される。DME及び糖尿網膜病症（Diabetic Retinopathy、DR）は、糖尿病患者における毛細血管合併症であって、視力を弱めて最終的には失明を誘発する。DRがある患者はDMEが進行することがあり、膨張された高透過性毛細血管及び微細動脈瘤の漏出のため、血液−網膜障壁の破壊後DMEが生じる。DRと同様に、DMEは損傷又は組織破壊されたブルッフ膜を浸透する脈絡膜血管新生と関連している。

一方、前記黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫をはじめとする眼球での血管新生に関連した多様な眼疾患の予防又は治療のために使われている代表的な治療剤としては、ラニビズマブ（ranibizumab）、ベバシズマブ（bevacizumab）、アフリバーレセプト（aflibercept）、コンバーレセプト（conbercept）などが挙げられる。前記薬剤を含めて現在開発された黄斑変性及び糖尿病性網膜浮腫などの主要な眼疾患治療用バイオ医薬品は、主に眼球内注射剤の形で網膜を含む眼球後部の疾患を治療するために使用されている。近年、注射剤の患者利便性の減少、副作用の増加、心理的恐怖のような問題を解決するため、ラニビズマブ、アフリバーレセプトなどを点眼剤形とする開発を試みる研究があるものの、ラニビズマブは、ウサギに対して臨床の半分の容量（250μg）を2時間おきに6回点眼したとき、3〜7日後に網膜組織に到達する実験結果（Chen et al.,2011.Eye）などに示した通り、眼球透過度が良くないため、病変のある眼球後方まで到達しにくく、点眼時はまばたきによる房水流出により消失する薬剤が多いため、点眼による薬理効果を発揮し難い問題点がある。また、中国で黄斑変性治療剤として2013年に承認されたコンバーセプト（Conbercept、Chengdu Kanghong pharm）は、アフリバーセプトと類似した血管内皮細胞成長因子受容体１（VEGFR-1）の2番目のドメインとVEGFR-2の3番目、4番目のドメインをFcで連結した融合タンパク質であって、現在点眼剤形としても開発中ではあるが、報告によれば、点眼時の生体利用率は約5%未満と知られている（Wang et al.,2013.PLOS ONE）。

さらに、ルセンティス（Lucentis）の商標名で販売されているラニビズマブは開発当時、黄斑変性患者らから90％程度の反応性を示して画期的治療剤として注目されたが、視力改善などの治療効果を示したのは患者の30%だけであり、持続的な薬剤投与の際、耐性が誘発される問題が発生している（Syed et al.,2012. Nature Rev. Drug Discov）。これを改善するために、VEGF-Aに対する結合力が100倍以上増大され、VEGF-B、PlGFまでも阻害できるように考案されたFc融合抗体であるアフリバーセプトが2011年に発売され、急激な成長を見せているが、実際二つの製品間の臨床的効能に差はないことが確認された。

黄斑変性患者の約10％は抗VEGF製剤について無反応の患者で治療効果が期待できず、これは相対的にVEGF-A以外の他の成長因子依存的な血管新生迂回経路が原因と考えられている。さらに、反復投与時の約45％の患者から耐性が誘発され、投与回数が増えるほど薬剤反応性が落ちることが確認されており（Lux et al.,2007.Br.J. Ophthalmol）、これらの耐性の原因は、反復的な抗VEGF製剤投与時の内皮細胞の安定化に寄与する周皮細胞（pericyte）の被覆率（coverage）の増加から始まった血管強化及び周皮細胞依存的VEGF生成による結果として知られている。

これにより、最近の眼疾患治療剤の開発動向は、抗VEGF製剤の耐性克服及び効能増大の方法で周皮細胞の解離を誘導するPDGF阻害剤を併用療法剤として開発する傾向にある。従って、（i）VEGF-Aだけでなく、さらに、別の血管新生関連リガンドを遮断する機能の追加、（ii）抗血管内皮細胞成長因子製剤に対する耐性克服、（iii）薬剤の効能増大のための周皮細胞の被覆率の瓦解、（iv）投与サイクルの改善及び（v）点眼剤の開発が可能な眼疾患治療剤の開発が求められているのが実情である。

本発明の発明者らは、抗血管内皮細胞成長因子製剤に組織透過性ペプチドを融合する場合、薬剤の組織透過性が増大し、周皮細胞の被覆率が瓦解され、薬剤に耐性を示す患者にもその効果が発揮され、投与量が減少又は投与サイクルが改善されて点眼剤としての開発が可能であることを見出だし、本発明を完成した。

従って、本発明の目的は、組織透過性ペプチドと抗血管内皮細胞成長因子製剤が融合された融合タンパク質を有効成分として含む、眼疾患の予防及び治療用の薬学的組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、（a）組織透過性ペプチドと抗血管内皮細胞成長因子製剤が融合された融合タンパク質をコードする核酸配列を含む組換えベクターを宿主細胞にトランスフェクションする段階；（b）前記細胞を培養する段階；及び（c）前記細胞から融合タンパク質を回収する段階を含む、耐性克服及び効能が向上された抗血管内皮細胞成長因子製剤を製造する方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、組織透過性ペプチドと抗血管内皮細胞成長因子製剤が融合された融合タンパク質の有効量を、これを必要とする個体に投与することを含む眼疾患の治療方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、組織透過性ペプチドと抗血管内皮細胞成長因子製剤が融合された融合タンパク質を有効成分として含む眼疾患の治療用製剤を製造するための用途を提供することである。

前記の目的を達成するために、本発明は、組織透過性ペプチドと抗血管内皮細胞成長因子製剤が融合された融合タンパク質を有効成分として含む眼疾患の予防及び治療用薬学的組成物を提供する。

本発明の他の目的を達成するために、本発明は、（a）組織透過性ペプチドと抗血管内皮細胞成長因子製剤が融合された融合タンパク質をコードする核酸配列を含む組換えベクターを宿主細胞にトランスフェクションする段階；（b）前記細胞を培養する段階；及び（c）前記細胞から融合タンパク質を回収する段階を含む、耐性克服及び効能が向上された抗血管内皮細胞成長因子製剤を生産する方法を提供する。

本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、組織透過性ペプチド及び抗血管内皮細胞成長因子製剤が融合された融合タンパク質の有効量を、これを必要とする個体に投与することを含む眼疾患の治療方法を提供する。

本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、組織透過性ペプチドと抗血管内皮細胞成長因子製剤が融合された融合タンパク質を有効成分として含む眼疾患の治療用製剤を製造するための用途を提供する。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の目的を達成するために、本発明は、組織透過性ペプチドと抗血管内皮細胞成長因子製剤が融合された融合タンパク質を有効成分として含む眼疾患の予防及び治療用薬学的組成物を提供する。

自然界に存在するタンパク質の中で血管内皮細胞成長因子Ａ（VEGF-A）は、血液の漏出（溢血、extravasation）を誘導するものとしてよく知られている。これは別の名称で血管透過性因子（vascular permeability factor）とも呼ばれる。この作用は血管内皮細胞成長因子受容体（VEGFR2）の結合による現象として知られているが、興味深いことに、血管内皮細胞成長因子Ａの突然変異実験で血管内皮細胞成長因子受容体に結合できなくても、血管透過性が増進する事例を示した。これは血管内皮細胞成長因子Ａの別の受容体が存在することを提示した（Stacker et al.,1999.J. Biol.Chem）。同時代に他の研究陣が、この受容体がニューロピリン（neuropilin、NRP）であることを明らかにした（Makinen et al.,1999.J.Biol.Chem）。

ニューロピリンは初めてアフリカツメガエルの神経系で発見された。ニューロピリンは膜透過性糖タンパク質（transmembrane glycoprotein）であって、NRP1及びNRP2の二つの形態がある。ニューロピリンはVEGFファミリーリガンド結合によってVEGFR（VEGF receptor）の共受容体（coreceptor）として作用する。特にNRP1はVEGFR1、VEGFR2、VEGFR3の共受容体として作用し、多様なVEGFリガンドと結合する。反面、NRP2はVEGFR2、VEGFR3の共受容体で作用してリンパ管形成（lymphangiogenesis）及び細胞付着（adhesion）に寄与する。さらに、NRP1/NRP2（NRP1/2）は、プレキシンファミリー受容体の共受容体として分泌されたセマフォリン3系列リガンド（class 3 semaphorins：Sema3A、Sema3B、Sema3C、Sema3D、Sema3E、Sema3F、Sema3G）と結合する。

前記組織透過性とは、ニューロピリンを過発現する組織を特異的に認識して蓄積される、血管内皮細胞の細胞間隙を広げて薬剤の血管外流出を促進させ、水溶性分子に対する障壁（barrier）の役割をする組織である角膜の細胞間隙を制御して眼球内薬剤の分布を促進する特性の中のいずれかの特性を有することを意味する。

本発明の用語“ニューロピリン（neuropilin、NRP）”とは、膜透過性糖タンパク質（transmembrane glycoprotein）であって、NRP1及びNRP2の二つの形態を有する。ニューロピリンは大きく５種のドメインで構成されているが、N末端からa1/a2ドメインはCUBドメインに分類され、セマフォリンのIg様C2型部分が結合する部分である。特にこの部位は、プレキシンと複合体を形成して、セマフォリン−プレキシン（plexin）との結合力を増加させる役割をする。ニューロピリンのb1、b2ドメインはFV/VIIIドメインに分類され、VEGFファミリーのリガンドや分泌されたセマフォリン３系列のリガンド（secreted Sema3）のC末端部位が結合する。VEGFリガンド及びセマフォリン３系列リガンドはヒューリンタンパク質加水分解酵素の認識部位（RXRR、Arg-X-Arg-Arg）を有していて、ヒューリン作用（Furin processing）によって共通的にC末端にアルギニン（Arg）のアミノ酸残基で終わる（Adams et al.,1997 EMBO J.）。これらのVEGF、Sema3リガンドのC末端Arg残基は、ニューロピリンb1b2ドメイン間の相互作用において極めて重要であると報告されている（Teesalu et al.,2009 Proc.Natl.Acad.Sci.USA）。VEGFリガンドとニューロピリンb1b2ドメイン間の複合体の３次構造が明らかにされており、（Parker et al.,2012. J. Biol.Chem.）、ニューロピリンのb1b2ドメインとの結合に重要なVEGFのアミノ酸配列は知ることができる。しかし、NRP1に結合するSema3AのC末端のどの部位が、具体的にNRPに結合するかは未だに究明されていない。

抗血管内皮細胞成長因子製剤は、VEGFと天然VEGF受容体間の相互作用を妨害する分子、例えば、VEGF又はVEGF受容体に結合してVEGFとVEGF受容体間の相互作用を防ぐ、又は阻止する分子を含む。VEGF阻害剤には抗VEGF抗体、抗VEGF受容体抗体及びVEGF受容体基盤キメラ分子が含まれる。

本発明において、“融合”とは、機能又は構造が異なるか又は同一な二つの分子を一体化することで、抗血管内皮細胞成長因子製剤に組織透過性ペプチドが結合できるすべての物理的、化学的又は生物学的方法による融合でもある。前記融合は好ましくはリンカーペプチドによることができ、このリンカーペプチドは例えば抗体のFab（抗原結合断片）又はFc断片のC末端に結合することができる。

本発明の眼疾患は、好ましくは血管新生による眼疾患を意味する。本明細書に使用された通り、表現"血管新生による眼疾患”とは、血管の成長又は増殖による、又は血管漏出による、又はこれらと関連した目の任意の疾患を意味する。

本発明に係る融合タンパク質によると、ニューロピリン受容体との結合により薬剤の組織透過性が増大され、周皮細胞の被覆率が瓦解されて薬剤に対して耐性を示す患者に対してもその効果が発揮されて、投与サイクルが改善されて点眼剤の開発が可能である。

具体的には、本発明の一実施例によれば、本発明者らがラニビズマブのアミノ酸配列からシステイン（C）をセリン（S）に置換する点突然変異を導入したラニビズマブの変異体は、生産性が大幅に増大され、ラニビズマブの変異体に組織透過性ペプチド（TPP）を融合させた改良体でも生産性増大の効果はそのまま維持された（実施例１）。

本発明の他の一実施例でラニビズマブ変異体のC末端に組織透過性ペプチドが融合された融合タンパク質のニューロピリン受容体に対する親和性と内皮細胞間のタイトジャンクション（tight junction）瓦解能を比較した結果、前記融合タンパク質はニューロピリン受容体NRP1とSema3Aリガンドと類似したレベルで極めて優れた結合が確認され、VE-cadherinの顕著な抑制により、内皮細胞間のタイトジャンクション瓦解能が極めて優れていることを確認した（実施例１−３）。

本発明の他の一実施例によると、ラニビズマブ変異体のC末端に組織透過性ペプチドが融合された融合タンパク質が眼球内皮細胞に多く分布するニューロピリン受容体との結合を介して透過度を改善できるか否かを確認するために、摘出した眼球を前記融合タンパク質が含まれた溶液及びラニビズマブが含まれた溶液に浸した後、時間ごとの透過度を比較した（実施例４）。実験の結果、前記組織透過性ペプチドが結合された抗血管内皮細胞成長因子製剤は実験開始1時間から角膜上皮組織から透過が始まり、2時間後にはラニビズマブに比べて眼球内薬剤分布が著しく高いことを確認して、透過度改善を通じた用量調整及び投与間隔の増大可能性を確認した。

つまり、ラニビズマブの眼球透過度が極めて微弱な先行研究の結果と比較して、本発明に係る融合タンパク質は、水溶性分子に対する障壁の役割をする組織の角膜をラニビズマブに比べて速かに透過して眼球の奥まで到達することを確認したことから、今後の製剤の改善を通じて点眼剤としての開発の可能性も確認できた。Fab形態のラニビズマブ改良体だけではなく、分子量が大きくてタンパク質の構造が複雑な抗体全長（whole antibody）形態でも、組織透過性ペプチドの融合による眼球組織の透過度増加の効果が同様に観察された。免疫グロブリンG（IgG）形態のベバシズマブのFc末端に組織透過性ペプチドを融合した融合タンパク質もベバシズマブと比較して顕著に増加した眼球透過能を示して、本発明に係るベバシズマブの改良体も治療効果が増進された薬剤に開発され得ることを知ることができる。

本実施例の結果から、VEGF受容体（VEGFR1、VEGFR2）をFc断片に融合した融合タンパク質形態のアフリバーセプト、コンバーセプトなどからも、ベバシズマブと同様にFc末端に組織透過性ペプチドを融合する場合、従来のFc融合タンパク質に比べて治療効果が顕著に増進された薬剤として開発できることを予測できる。

本発明の他の一実施例では多様な動物疾患モデルを利用して、本発明の融合タンパク質とラニビズマブの血管新生阻害効果及び薬剤耐性モデルでの血管新生阻害効果を比較評価した。角膜血管新生モデルを利用して実験した結果、本発明の融合タンパク質は、対照群に比べ50％以上の有意的な血管新生阻害効果を示し、ラニビズマブと同等程度の効果を示してC末端に融合された組織透過性ペプチドによる効能の増大が可能であることを確認した（実施例５−１）。また、薬剤耐性モデルでの血管新生阻害効果において、本発明の融合タンパク質は、ラニビズマブ対比2倍以上の優れた効能を示し、これは、抗VEGFアプタマー（aptamer）と抗PDGF抗体製剤を併用投与した文献の結果（Jo et al.,2006.Am.J. Pathol.168）と類似した程度の数値であって、ラニビズマブ投薬患者の内、視力改善無く維持だけされる約70％の患者から視力改善の可能性があると予測できる（実施例５−２）。本発明に係る融合タンパク質の眼疾患において血管新生を抑制する優れた効果は、実際の黄斑変性の効能モデルとして使用する脈絡膜血管新生（CNV）と網膜病症の効能モデルとして使用する酸素誘導血管新生（OIR）のモデルからも同様に観察されて、ラニビズマブと比較して臨床的に治療効果が顕著に促進されることを予測できる（実施例６、実施例７）。

本発明で使用される用語“予防”とは、本発明の組成物の投与により眼疾患を抑制させたり進行を遅延させたりするすべての行為を意味する。

本発明で使用される用語“治療”とは、本発明の組成物の投与により眼疾患の症状が好転又は有利に変更されるすべての行為を意味する。より具体的には、前記“治療”とは眼疾患の症状を改善させることを包括的に指称し、これは眼疾患を治癒したり、実質的に予防するか又は状態を改善させることを含むことができ、眼疾患から始まった一種の症状又は大部分の症状を緩和させたり、治癒又は予防することを含め、これに限定されるものではない。

本発明を実施するにあたり、当該分野の通常の知識を有する技術者は、眼疾患の予防又は治療の効果のために、対象の眼疾患の種類及び重症度、投与が必要な個体の年齢、体重、健康状態、性別、食餌及び排泄率などの多様な因子を適切に考慮して、本発明に係る組成物の有効投与量（有効量）、投与回数、投与経路を決定できる。前記“有効量”とは個体に投与したとき、眼疾患の症状を改善させる量を包括的に指称し、これは眼疾患を治療するか、実質的に予防するか又は状態を改善させるかする量を含む。前記“個体”とは動物、好ましくは哺乳動物、特にヒトを含む動物であって、動物から由来した細胞、組織、器官等でもある。前記個体は治療が必要な患者でもある。本発明に係る組成物は、ヒトをはじめとする哺乳動物にどのような方法でも投与することができる。例えば、経口又は非経口的に投与することができる。非経口的な投与方法としては、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髄腔内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下又は直腸内投与を含むが、これに限定されない。さらに、本発明に係る免疫原性複合タンパク質は、単独で投与するか又は対象疾患を予防及び治療する効果を有する公知の化合物と併行して投与できる。

例えば、本発明の薬学的組成物の人体に対する投与量は、患者の年齢、体重、性別、投与形態、健康状態、及び疾患の程度によって異なり、一般的に眼球注射の場合、眼球当たり0.001〜10mg/dayであり、好ましくは、眼球当り0.1〜2mg/dayでもある。点眼剤の場合、投与量の範囲は点眼液1mlあたり0.001〜100mgであり、好ましくは0.01〜10mg/dayでもある。さらに、医師又は薬剤師の判断によって一定の間隔で分割投与することもできる。

本発明の組成物は、薬学的に許容可能な添加剤をさらに含むことができ、薬剤学的に許容可能な添加剤としては、デンプン、ゼラチン化デンプン、微結晶セルロース、乳糖、ポビドン、コロイダルシリコンジオキサイド、リン酸水素カルシウム、ラクトース、マンニトール、飴、アラビアゴム、アルファ化デンプン、トウモロコシデンプン、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、オパドライ、デンプングリコール酸ナトリウム、カルナウバ蝋、合成ケイ酸アルミニウム、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、白糖、デキストロース、ソルビトール、トレハロース及びタルクなどが使用できる。本発明に係る薬剤学的に許容可能な添加剤は、前記組成物に対して0.1〜90重量部で含まれることが好ましいが、これに制限されるものではない。

さらに、前記薬学的組成物は注射剤、点眼剤、眼軟膏剤、眼球挿入剤形を含むが、これらに限定されない任意の投与経路に適した様々な形態でもあって、これを製剤化する場合には、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を使用して調製することができる。注射剤の場合、遊離体腔内注射、結膜注射を含む眼球内局所的に注射する方法を全て含むが、これに限定されない。注射剤には、溶解剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、防腐剤などの従来の添加剤が含まれることもある。

本発明の注射剤に適切な担体は、生理食塩水、細菌発育阻止水、クレモフォアEL（BASF、米国ニュージャージー州パーシーファニーエ）又はリン酸塩緩衝食塩水（PBS）を含む。すべての場合に組成物は、滅菌されるべきであり、容易に注射ができる程度の流体でなければならない。組成物は、製造及び保管条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、溶媒又は、例えば水、エタノール、ポリオール（例：グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物を含有する分散媒でもある。適当な流動性は例えば、レシチンのようなコーティングを利用して、分散液の場合に必要な粒子サイズを維持し、界面活性剤を使用して維持することができる。微生物の作用は各種抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどを使用して予防することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、トレハロース、塩化ナトリウムを含むことが望ましい。注射可能な組成物の吸収は、吸収を遅延する製剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ヒアルロン酸及びゼラチンを組成物中に含有させることにより高めることができる。

点眼剤の場合、水溶性点眼液、非水溶性点眼液又はエマルジョン点眼液でもある。本発明の点眼剤には、前記必須成分である組織透過性ペプチドと抗血管内皮細胞成長因子製剤が融合された融合タンパク質以外に、点眼剤における従来公知の任意成分、例えば、緩衝剤、粘稠剤、安定化剤、等張化剤、防腐剤などを配合することができる。このうち、緩衝剤としては、クエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、アミノ酸塩など公知の緩衝剤が挙げられる。さらに、粘稠剤としては、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポビドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルメロース、ポリエチレングリコール、コンドロイチン又はこれらの塩が挙げられる。さらに、安定化剤としては、亜硝酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メタ亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤；エデト酸ナトリウム、シクロデキストリン、クエン酸、クエン酸塩などのキレート剤などが挙げられる。さらに、等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの塩類；グリセリン、プロピレングリコールなどの多価アルコール；ブドウ糖、ショ糖、トレハロースなどの糖類；キシリトール、ソルビトールなどの糖アルコール；ポリエチレングリコールなどのポリエーテル；タウリンなどのアミドスルホン酸などが挙げられる。さらに、防腐剤としては、塩化ベンザルコニウム（benzalkonium chloride）、塩化ベンゼトニウム（benzethonium chloride）、クロロブタノール、パラオキシ安息香酸エステル、チメロサ−ル（thimerosal）、ソルビン酸、ソルビン酸塩、グルコン酸クロロヘキシジン（chlorohexidine gluconate）などが挙げられる。本発明の点眼剤において、室温でのpHは4.5〜8.5が好ましく、より好ましくは5.5〜8、特に好ましくは6〜8である。pHの測定は、室温下でpHメーター（例えば、Fisher Scientific社製 Accumet model 25 pH / Ion meterなど）を用いて測定される。

一部の眼科薬剤は眼球の障壁を通した浸透性が不良で、点眼剤として投与することができない。従って、軟膏を用いて接触時間を延長して、吸収される薬剤の量を増やすことができる。点眼剤に使用できる担体成分として、非水溶性高分子は、エチルセルロース、エチレン酢酸ビニル共重合体、ポリメタクリル酸メチル、アクリル酸エチル−メタクリル酸メチル−メタクリル酸塩化トリメチルアンモニウムエチル共重合体、メタクリル酸メチル−メタクリル酸ブチル−メタクリル酸ジメチルアミノエチル共重合体などが挙げられる。生体内分解性高分子は、例えばポリ乳酸、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体、ポリシアノアクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリ−ε−カプロラクトンなどが挙げられる。水溶性高分子は、ヒドロキシプロパンメチルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、アルギン酸カルシウム、キトサン、アルブミン、ゼラチン、メタクリル酸−メタクリル酸メチル共重合体などが挙げられる。油脂性成分としては、トリパルミチン、セチルアルコール、コレステロール、各種リン脂質類、パルミチン酸セチル、パルミチン酸コレステロールなどを挙げられる。このような担体成分は通常眼科用治療活性物質を含有した薬効成分の徐放機能（徐々に放出する機能）を有している。また、比重調整剤を添加せずに使用可能な比重が高い担体成分には、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート200731（比重1.65）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート220824（比重1.82）、カルボキシメチルエチルセルロース（比重1.59）などが挙げられる。しかし、このような担体成分を利用する場合にもやはり比重調整剤を添加して比重値を高めることが望ましい。本発明において、担体粒子の比重調整に使用される比重調整剤としては、例えば、酸化チタン（4.17）のような不溶性成分、リン酸三カリウム（比重3.14）、無水リン酸水素カリウム（比重2.89）、リン酸水素カリウム二水和物（比重2.30）のような難溶性成分、塩化ナトリウム（比重2.17）、塩化カリウム（比重1.98）、塩化カルシウム（比重2.0）、塩化マグネシウム（比重2.41）、炭酸ナトリウム（比重2.53）、リン酸二水素ナトリウム（比重1.95）、リン酸一水素ナトリウム（比重1.7）、リン酸二水素カリウム（比重2.34）のような水溶性成分などが挙げられる。

挿入体は、一般的に開いた角膜に付着されるよりも上部盲管に配置されるか、又は頻度は少ないが下部結膜嚢に配置されること以外は、角膜に配置されるソフトコンタクトレンズと類似である。挿入体は一般的に薬剤を放出しながら体液中に溶解されるか又は崩解される生物学的に可溶な物質で製造される。

経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、これらの固形製剤はチロソールに少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース又はゼラチンなどを混ぜて調剤できる。さらに、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウムタルクのような潤滑剤等も使用することができる。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤及びシロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、流動パラフィン以外に様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれる。

さらに、本発明の治療用組成物は、任意の生理学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤（Remington：The Science and Practice of Pharmacy、19th Edition、Alfonso、R.、ed、Mack Publishing Co.（Easton、PA ：1995））を追加して含むことができる。許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤は、使用された投与量及び濃度で服用者に非毒性であって、緩衝溶液、例えばリン酸、クエン酸及び他の有機酸；アスコルビン酸をはじめとする抗酸化剤；低分子量（約10個未満の残基）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性重合体、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、トレハロース、又はデキストリンを初めとする他の炭水化物；キレート剤、例えばEDTA；糖アルコール、例えば、マンニトール又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばTween、Pluronic又はポリエチレングリコール（PEG）が含まれる。

本発明の他の目的を達成するために、本発明の前記組織透過性ペプチドは、配列番号1〜7からなる群から選ばれたいずれか一つのアミノ酸配列を含むことを特徴とする薬学的組成物を提供する。

前記配列番号1〜7からなる群から選ばれたアミノ酸配列で示された組織透過性ペプチドは、ニューロピリンのb1b2ドメインに結合するVEGFAリガンドの結合部位のアミノ酸配列及び長さを分析し、ニューロピリンに結合すると知られたセマフォリン3A及びセマフォリン3FのプリンC末端配列の塩基配列を分析して、それらのC末端の配列が類似していることを基に設計されたペプチドである。

本発明の他の目的を達成するために、本発明の前記抗血管内皮細胞成長因子製剤は、ベバシズマブ（bevacizumab）、ラニビズマブ（ranibizumab）、r84（PLoS One、2010 Aug 6、5（8））、アフリベルセプト（aflibercept）、コンバーセプト（conbercept）、CT01（WO2005056764A2）、DOM15-10-11（WO2008149147A2）、DOM15-26-593（WO2008149143A2）、PRS-050（Mross et al.,2013. PLoS One）、CT-322（Dineen et al.,2008 BMC Cancer）、ESBA903（Asmus et al.,2015 Eur J Pharm Biopharm）とEPI-0030（WO2011/023130A1）で構成された群から選ばれた眼球疾患の予防又は治療に使用される製剤、これらの後発生物製剤（biosimilar）及び変異体を含む薬学的組成物を提供し、より好ましくはラニビズマブ、ベバシズマブ、アフリベルセプト、コンバーセプトでもあるが、これに限定されるものではない。

前記“後発生物製剤（biosimilar）”とは、遺伝子組換え細胞培養技術など生命工学技術を活用して、すでに開発／販売されている特許満了したオリジナルバイオ医薬品を模倣して品質、効能及び安全性の面で同等性を立証した複製医薬品を意味する。

本発明の他の目的を達成するために、本発明の前記変異体は、重鎖定常１ドメイン及び軽鎖定常ドメインのアミノ酸であるシステインは欠失するか、又はシステインを除いてセリンを含む他のアミノ酸残基に置換されたことを特徴とする薬学的組成物を提供する。

本発明の一実施例では、ラニビズマブのアミノ酸配列を変換するタンパク質工学の方法で、ラニビズマブのヌクレオチド配列のうち、最後のシステインがセリンに変更されたラニビズマブ変異体を製作した（実施例１−１）。

本発明の他の目的を達成するために、本発明の前記変異体は、配列番号8で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号10で示されるアミノ酸配列を有する重鎖からなるラニビズマブ（ranibizumab）変異体であることを特徴とする薬学的組成物を提供する。

前記一態様の組織透過性ペプチドは、リンカーペプチドをさらに含むことができる。前記リンカーペプチドは、1〜50個のアミノ酸からなることができ、好ましくは4〜20個、さらに好ましくは4〜15個のアミノ酸からなることができる。さらに、前記リンカーペプチドは、グリシン（glycine、G）、セリン（serine、S）又はアラニン（alanine、A）で構成することができ、好ましくは前記リンカーペプチドの配列は（GA）_n又は（GGGGS）_mのアミノ酸配列からなるもの（ただし、上記n及びmはそれぞれ独立的に整数1〜20であり、括弧内の配列が繰り返される回数を意味する）でもあって、より好ましくは、GAGA又は（GGGGS）₃のアミノ酸配列からなることができる。

本発明の一実施例では、組織透過性ペプチド（TPP）が前記リンカーを介して、ラニビズマブ変異体に融合された融合タンパク質を製作してその効果を確認した。前記融合タンパク質は、本発明に係るラニビズマブ変異体（IDB0061）にTPP＃2がリンカー（（GGGGS）₃）に連結された形で、配列番号12、及び配列番号14で示されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質（IDB0062）；本発明に係るラニビズマブ変異体（IDB0061）にTPP＃5がリンカー（（GGGGS）₃で連結された形態で、配列番号16及び配列番号18で示されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質（IDB0064）；ベバシズマブで重鎖にTPP＃2がリンカー（（GGGGS）₃）で連結された形態で、配列番号20及び配列番号22で示されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質（IDB0072）などである。

本発明の薬学的組成物を利用して任意の血管新生による眼疾患を治療することができる。本明細書で使用された表現“血管新生による眼疾患”とは血管の成長又は増殖によって、又は血管漏出により又はこれらに関連する目の任意の疾患を意味する。

血管新生による前記眼疾患は、増殖硝子体網膜症、黄斑変性、色素性網膜症、糖尿病性網膜症、脈絡膜血管新生、血管新生性緑内障、虚血性視神経障害、早熟児網膜症、未熟児網膜症、流行性角結膜炎、血管新生性虹彩疾患、水晶体繊維増殖症、アトピー性角膜炎、上角膜潤部角膜炎、位相片乾癬性角膜炎、フリックテン性角結膜炎、強膜炎、及び糖尿病性黄斑浮腫からなる群より選ばれ、より好ましくは黄斑変性及び糖尿性黄斑浮腫でもあるがこれに限定されるものではない。

本発明の他の目的を達成するために、本発明は、（a）組織透過性ペプチドと抗血管内皮細胞成長因子製剤が融合した融合タンパク質をコードする核酸配列を含む組換えベクターを宿主細胞にトランスフェクションする段階；（b）前記細胞を培養する段階；及び（c）前記細胞から融合タンパク質を回収する段階を含む、耐性克服及び効能が向上された抗血管内皮細胞成長因子製剤を製造する方法を提供する。

前記融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、及び配列番号23からなる群より選ばれる。具体的には、本発明に係るラニビズマブ改良物であるIDB0062の軽鎖と重鎖をエンコードする核酸は、それぞれ配列番号13と配列番号15の塩基配列に、IDB0064の軽鎖と重鎖をエンコードする核酸は、それぞれ配列番号17と配列番号19の塩基配列に、さらに、ベバシズマブ改良物であるIDB0072の軽鎖と重鎖をエンコードする核酸は、それぞれ配列番号21と配列番号23の塩基配列に記載されている通りである。

さらに、前記ベクターは、当業者が当業界で知られている任意の方法により、本発明のポリヌクレオチドをベクター内に挿入して、適切な転写／翻訳制御配列を利用して、本発明の融合タンパク質を発現するように製造された発現ベクターを意味する。

本発明に基づいてクローニングされた前記ポリヌクレオチド配列は、適切な発現制御配列に作動可能に連結することができ、前記作動可能に連結された遺伝子配列と発現制御配列は、選択マーカー及び複製開始点（replication origin）を共に含めている一つの発現ベクター内に含まれる。“作動可能に連結（operably linked）”とは前記ポリヌクレオチド（核酸）配列が発現制御配列の遺伝子発現を可能にする方法で連結されたことを意味する。前記“発現制御配列（expression control sequence）”とは、特定の宿主細胞において作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現を制御するDNA配列を意味する。そのような制御配列は転写を実施するためのプロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター配列、適切なmRNAリポソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の終結を制御する配列などからなる群から選ばれた一つ以上を含むことができる。

前記発現ベクターの基本ベクターとして使用されるベクターは特別な制限がなく、この発明が属する技術分野で宿主細胞として使用される微生物における発現のために通常使用される全てのプラスミド、ウイルス又はその他の媒介体などが使用可能である。例えば、前記プラスミドには、大腸菌由来のプラスミド（pBR322、pBR325、pUC118とpUC119、pET-22b（+））、バチルス・サブチリス由来のプラスミド（pUB110及びpTP5）及び酵母由来のプラスミド（YEp13、YEp24、及びYCp50）などがあり、前記ウイルスはレトロウイルス、アデノウイルス、又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスのような昆虫ウイルスなどが使用できるが、これらに限定されるものではない。

前記宿主細胞は、挿入された配列の発現を制御するか又は望ましい特定の方法で遺伝子から目的生成物を生産できることを選べる。異なる宿主細胞はタンパク質の翻訳及び翻訳後のプロセシングと修飾の特徴的で特異的な機作を有している。適切な細胞株又は宿主システムには、発現された異種タンパク質の好ましい修飾及びプロセシングを提供することを選ぶことができる。酵母での発現は生物学的活性生成物を生産することができる。真核細胞での発現は“天然”フォールディングの可能性を増加させる。

本発明のベクターを安定させながら連続的にクローニング及び発現させることができる宿主細胞は、当業界に公知されたどんな宿主細胞でも利用することができ、例えば、E. coli JM109、E. coli BL21DE、E. coli DH5、E.coli RR1、E.coli LE392、E. coli B，E. coli X 1776、E. coli W3110などが使用でき、さらに、アグロバクテリウムA4のようなアグロバクテリウム属菌株、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）のような桿菌（bacilli）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）又はセラチア・ マルセッセンス（Serratia marcescens）のようなさらに他の腸内細菌及び多様なシュードモナス（Pseudomonas）属菌株が宿主細胞として利用される。

さらに、本発明のベクターを真核細胞に形質転換させる場合には、宿主細胞としては、酵母（Saccharomyce cerevisiae）、昆虫細胞及びヒトの細胞（例えば、CHO細胞株（Chinese hamster ovary）、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RINとMDCK細胞株）などが利用できる。

ベクターを宿主細胞内に伝達して宿主細胞を形質転換させる方法は、公知の方法であればどのようなものでも可能で特に制限されない。例えば、大腸菌を利用する場合、ヒートショック（heat shock）やエレクトロポレーションの方法で形質転換することができ、動物細胞を利用した生産細胞株構築の際、リン酸カルシウム沈殿法（calcium phosphate precipitation）、DEAE-dextran法、エレクトロポレーション（electroporation）、直接マイクロインジェクション（direct microinjection）、DNA担持リポソーム（DNA-loaded liposome）法、Lipofectamine -DNA複合体（lipofectamine-DNA complex）法、細胞超音波破砕法（cell sonication）、高速ミクロ射出粒子（high velocity microprojectile）を利用した遺伝子銃（gene bombardment）、ポリカチオン（polycation）法及び受容体媒介形質転換法（receptor-mediated transfection）によって形質転換することができる。この技術の一部は生体内又は生体外の使用のため改良することができる。

形質転換細胞の培養は、融合タンパク質の発現を可能にする適切な条件の下で行い、これらの条件は当業者に既に公知された方法により行うことができる。形質転換細胞は、通常の培養方法により大量に培養することができる。培養培地には、炭素源、窒素源、ビタミン及びミネラルで構成された培地を使用することができ、例えば、2×YT培地を使用できる。細胞の培養は通常の細胞培養条件で可能であり、例えば温度範囲15〜45℃で10時間〜40時間培養することができる。培養液中の細胞を除去し、培養培地のみを回収するために遠心分離（centrifugation）又は濾過（filtration）過程を経て、これらの段階は当業者が必要に応じて行うことができる。菌体を除去した培養培地（ろ液）は通常の方法によって冷蔵してその活性を失わないように短期保存することができる。

形質転換細胞（又は形質転換体）で発現させた融合タンパク質は、通常の方法で精製することができ、例えば、塩析（例えば、硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿）、溶媒沈殿（アセトン、エタノール等を利用したタンパク質分画沈殿）、透析、ゲル濾過、イオン交換、逆相カラムクロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーのようなカラムクロマトグラフィー及び限外濾過などの技法を単独又は組み合わせで適用させて本発明の融合タンパク質を精製することができる（Maniatis et al、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY（1982）; Sambrook et al、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、2d Ed.,ld Spring Harbor Laboratory Press（1989）; Deutscher、M.,Guide to Protein Purification Methods Enzymology、vol.182 Academic Press.Inc.,San Diego、CA（1990））。

本発明の組織透過性ペプチドと抗血管内皮細胞成長因子製剤が融合した融合タンパク質を有効成分として含む薬学的組成物は、抗血管内皮細胞成長因子製剤の組織透過性が改善され、眼球内注射時の脈絡膜組織への薬剤伝達力が改善され、薬剤耐性患者の治療、投与量の減少又は投与サイクル増大の効果を示すだけでなく点眼剤として開発することができる。

図１Ａは、組織透過性ペプチドと抗血管内皮細胞成長因子の抗原結合断片（Fab）が融合した融合タンパク質の模式図である。図１Ｂは、組織透過性ペプチドと抗血管内皮細胞成長因子が融合した融合タンパク質がVEGFとニューロピリン受容体-1と結合する様相を示した模式図である。図１Ｃは、多様な血管内皮細胞成長因子の抑制剤形態（Fab、抗体全長（whole IgG）、Fc融合タンパク質）に組織透過性ペプチドが結合された改良体の模式図である。 図２は、ラニビズマブと、本発明の融合タンパク質の生産に伴う主な産物をHPLCで分析した結果である（IDB0062：ラニビズマブ変異体と組織透過性ペプチドTPP＃2が融合されたFab融合タンパク質）。AUは、任意の単位（arbitrary unit）を意味する。 図３は、本発明に係る融合タンパク質の一次精製物を12％非還元条件（non-reduced）SDS-PAGEゲルで分析した結果である（IDB0062、ラニビズマブ変異体と組織透過性ペプチドTPP＃2が融合されたFab融合タンパク質; IDB0064、ラニビズマブ変異体と組織透過性ペプチドTPP＃5が融合されたFab融合タンパク質）。 図４Ａは、ラニビズマブ、ラニビズマブ変異体及び本発明に係る融合タンパク質のVEGFに対する結合親和性の分析結果である。図４Ｂは、組織透過性ペプチドと本発明に係る融合タンパク質のニューロピリン受容体−１に対する結合能を評価した結果である（IDB0061、ラニビズマブ変異体; IDB0062、ラニビズマブ変異体と組織透過性ペプチドTPP＃2が融合されたFab融合タンパク質; Fc-TPP＃2、IgG1のFc末端に組織透過性ペプチドTPP＃2が融合したFc融合タンパク質）。 図５Ａは、本発明に係る融合タンパク質の保管条件別安定性を評価した結果である。図５Ｂは反復的な冷／解凍による融合タンパク質の安定性を評価した結果である。 図６Ａは、ラニビズマブ、ラニビズマブ変異体及び本発明に係る融合タンパク質の血管新生予防モデルから血管新生抑制効果を、角膜血管新生予防モデルから評価した結果である。図６Ｂは、図６Ａでの結果を数値化してグラフで示した結果である。 図７Ａは、ラニビズマブ及び本発明による融合タンパク質の血管新生耐性モデルにおいて血管新生抑制効果を角膜血管新生耐性モデルから評価した結果である。図７Ｂは、図７Ａでの結果を数値化してグラフで表した結果である。図７Ｃは、ラニビズマブ及び本発明による融合タンパク質の周皮細胞被覆率の減少効果を評価した結果である。 図８Ａは、本発明に係る融合タンパク質であるラニビズマブ改良体IDB0062の眼球透過性を蛍光顕微鏡で評価した結果である。図８Ｂは、図８Ａでの結果を数値化してグラフで表した結果である。図８Ｃは2時間反応させた眼球組織断面からFITC標識されたタンパク質の分布をDAPI染色とともに蛍光顕微鏡を用いて分析した結果である。図８Ｄは、図８Ｃでの結果を数値化してグラフで表した結果である。図８Ｅは、網膜組織の断片を共焦点顕微鏡で分析した結果で、IDB0062の網膜透過能に応じた分布を分析した結果である。 図９Ａは、本発明に係る融合タンパク質であるベバシズマブ改良体IDB0072の眼球透過能を蛍光顕微鏡で評価した結果である。図９Ｂは、図９Ａでの結果を数値化してグラフで表した結果である。 図１０Ａは、ラニビズマブ及び本発明による融合タンパク質の脈絡膜血管新生（CNV）モデルで薬剤処理により脈絡膜新生血管の増殖が抑制される様相を示した図である。図１０Ｂは、図１０Ａの結果を数値化してグラフで表した結果である。 図１１Ａは、ラニビズマブ及び本発明による融合タンパク質の酸素誘導網膜病症（OIR）モデルにおいて薬剤処理によって血管末端から漏出現象が抑制されることを蛍光顕微鏡で分析した結果である。図１１Ｂは、図１１Ａの結果を数値化してグラフで表した結果である。 図１２Ａは、ラニビズマブ及び本発明による融合タンパク質の酸素誘導網膜病症（OIR）モデルにおいて薬剤処理によって新生血管及び血管束（tufts）の形成が抑制されることをイソレクチンB4染色後、蛍光顕微鏡で分析した結果である。図１２Ｂは、図１２Ａの結果を数値化してグラフで表した結果である。 図１３は、IDB0062とラニビズマブをラットに眼球内注射後、時間別の網膜組織に存在する薬剤の量をウェスタンブロッティングで分析した結果である。

以下、本発明を詳細に説明する。

但し、下記の実施例は、本発明を例示するのみであり、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。

＜実施例１＞
組織透過性ペプチドが融合されたラニビズマブ改良体製作

＜１−１＞生産性が増加したラニビズマブ変異体IDB0061の製作
ラニビズマブの低い生産収率の問題は、Fab断片の低い培養生産性とペリプラズム発現を通じた生産タンパク質の多形性で複雑な後処理工程が必要なためである。これを克服するために、点突然変異の導入などのタンパク質工学を介してラニビズマブの特定アミノ酸配列を変換させることにより、生産されたタンパク質が殆ど細胞外に排出されるようにして発現率を高め、均一な形態のタンパク質だけを生産するように生産細胞株を最適化してラニビズマブ変異体であるIDB0061を生産した。これを介して培養生産性を高めて精製工程を単純化して生産収率が画期的に改善されたことを確認した。

具体的には、ラニビズマブのアミノ酸配列を変換するタンパク質工学の方法は、ラニビズマブ核酸配列のうち最後のシステインをセリンに変更して遺伝子を合成する。以降SUPEX5（KCTC12657BP）の生産細胞株に形質転換（transformation）した後、発現テストを行った。

ラニビズマブ変異体IDB0061の軽鎖部分の製作過程は次の通りである。ラニビズマブの核酸配列を関連特許から入手してコドン最適化作業を進め、これを基にシグナル配列（signal sequence）が含まれているFab軽鎖可変領域（VL）の核酸を合成し、FabのCL領域は、抗アルブミンFabであるSL335のベクターを鋳型としてプライマー（配列番号24、25）を使用してPCRによって製作した。ラニビズマブ変異体IDB0061の重鎖部分の製作過程は次の通りである。ラニビズマブの核酸配列を関連特許から入手してコドン最適化作業を進めて、これを基にシグナル配列（gIII）が含まれているFab重鎖可変領域（VH）の核酸を合成し、FabのCH1領域は抗アルブミンFabであるSL335のベクターを鋳型としてプライマー（配列番号32、33）を使用してPCRによって製作した。

タンパク質工学の分野で一般的に使用される方法を用いて、ラニビズマブのアミノ酸配列に点突然変異（point mutation）を起こした。具体的には、ラニビズマブの軽鎖アミノ酸配列のうち214番目のアミノ酸であるシステインがセリンで置換されて、ラニビズマブの重鎖アミノ酸配列のうち226番目のアミノ酸であるシステインがセリンに置換された。前記点突然変異が起こったラニビズマブ変異体IDB0061の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を配列番号8及び配列番号10でそれぞれ表示し、これをエンコードする核酸配列を配列番号9及び配列番号11でそれぞれ示した。

PCRを介して最終的に完成されたラニビズマブ変異体IDB0061の配列はpHEKAにクローニングし、SUPEX5株を形質転換した。具体的には、1mmキュベットにコンピテントセル（competent cell）100μlを入れて、ここに前記DNAを3μl添加した後、1800Vで電気ショック（electric shock）を与えて遺伝子を導入し、生産細胞株を完成した。

ラニビズマブとIDB0061それぞれの生産細胞株を2×YT培地（media, 100mM リン酸カリウムバッファー、pH 7.2、50μg/ml カナマイシン）50mlに1%（v/v）接種し28℃で220rpmで18時間培養して前培養を行った。2×YT培地を1L 羽根付きフラスコに180mlずつ入れて滅菌した本培養培地に予め除菌した1Mリン酸カリウム（pH 7.2）20mlと50μg/mlカナマイシンを添加した後、OD₆₀₀が約0.15になるように前培養液を接種する。以後28℃、220rpmでOD₆₀₀が0.5〜0.7の間になるまで培養した後、0.1mMIPTGを添加して温度を20℃に下げて発現を誘導する。発現誘導21時間後、培養液は遠心分離で上澄み液を回収してデプスフィルター（depth filter）とメンブレンステラルフィルター（membrane sterile filter）を用いて濾過した後、protein Lカラムにローディングして目的タンパク質を精製した。

本発明に係るラニビズマブ変異体IDB0061と元のラニビズマブの生産性を比較した結果、表２に示した通り、IDB0061は基本培地を使用したバッチ培養（batch culture）だけでもラニビズマブに比べて高い生産性を有することを確認し、細胞破砕無しに培養液で、吸着カラムを使用した一段階工程で95％以上の純度で精製が可能で、工程の単純化が可能であった。

＜１−２＞ラニビズマブ変異体と組織透過性ペプチドの融合
本発明者らは抗VEGF製剤であるラニビズマブの効能増大及び耐性克服のために、ラニビズマブのC末端に、ニューロピリン−1（NRP1）及び2に全て結合するか又はニューロピリン−1のみに特異的に結合できる組織透過性ペプチド（tissue penetrating peptide、TPP）の融合を試み、TPPのアミノ酸配列は、下記表３に示した。表３の配列目録中、配列番号1〜4のアミノ酸配列を有するTPPはニューロピリン−1及び2に全て結合が可能であり、配列番号5〜7のアミノ酸配列を有するTPPはニューロピリン−1にのみ特異的に結合が可能である。ラニビズマブにTPPが融合した融合タンパク質の模式図を図１に示した。具体的にはエイプリルバイオ社に依頼して、前記実施例１−１で製作したラニビズマブ変異体IDB0061のC末端に下記表３に記載された様々なTPP（ニューロピリン受容体に特異的に結合するペプチド）が融合された融合タンパク質及びそれを生産する細胞株を製作した。

一方、表３に示したTPPのうち、配列番号2のアミノ酸配列を有するTPP＃2は、ニューロピリンの内在的リガンド（intrinsic ligand）であるVEGF₁₆₅及びセマフォリン3系列のリガンドのC末端部位を変形したものであって、TPP＃5は、ニューロピリン−1のb1b2ドメインタンパク質と同時にニューロピリン−2のb1b2ドメインタンパク質を競合物質（competitor）として利用し、ニューロピリン−1のb1ドメインに選択的に結合するクローンから導出されたペプチドを分離同定したものであり、ここにリンカーとしてアバスチンを融合してニューロピリン受容体に二価で作用できるようにすることにより、VEGFとSema3Aリガンドと類似した親和力を有しながらも組織透過性を有するようにデザインした。

TPPが結合されていないラニビズマブ変異体IDB0061（ラニビズマブに点突然変異だけを導入した形態）にTPP＃2ペプチドがリンカーによって連結されている形態であるIDB0062の製作過程は次の通りである。

具体的には、TPPが融合したラニビズマブ変異体IDB0062の軽鎖部分の製作はラニビズマブの核酸配列を関連特許から入手してコドン最適化作業を行った後、これを基にシグナル配列が含まれている軽鎖可変領域（VL）の核酸を合成し、軽鎖定常領域（CL）C末端のシステインがセリンに置換された一部の配列にリンカーとTPP＃2配列を含む核酸（CL'-リンカー-TPP＃2）を合成した。FabのCL領域は、抗アルブミンFabであるSL335のベクターを鋳型としてプライマー（配列番号24、25）を使用してPCRによって製作し、合成したCL'-リンカー-TPP＃2核酸を鋳型としてプライマー（配列番号26、27）を使用してPCRによってCL'-リンカー-TPP＃2を製作した。この二つの産物はlinking PCRによって連結してCL-リンカー-TPP＃2オリゴヌクレオチドを製作した。合成したVL核酸を鋳型としてプライマー（配列番号28、29）を使用してVLを製作した後、CL-リンカー-TPP＃2とともにプライマー（配列番号30、31、BamHIとXhoI配列を含む）を使用してassembly PCRを行い最終VL-CL-リンカー-TPP＃2配列を完成した。

TPP＃2が融合されたラニビズマブ変異体IDB0062の重鎖部分の製作は、ラニビズマブの核酸配列を関連特許から入手してコドン最適化作業を進めた後、これを基にシグナル配列（gIII）が含まれている重鎖可変領域（VH）の核酸を合成し、重鎖定常領域（CH1）C末端のシステインがセリンに置換された一部配列にリンカーとTPP＃2配列を含む核酸（CH1'-リンカー-TPP＃2）を合成した。FabのCH1領域は、抗アルブミンFabであるSL335のベクターを鋳型としてプライマー（配列番号32、33）を用いてPCRによって製作し、合成したCH1'-リンカー-TPP核酸を鋳型としてプライマー（配列番号34、35）を用いてPCRによってCH1'-リンカー-TPP＃2を製作した。この二つの産物はlinking PCRによって連結してCH1-リンカー-TPP＃2オリゴヌクレオチドを製作した。合成したVH核酸を鋳型としてプライマー（配列番号36、37）を用いてVHを製作した後、CL-リンカー-TPP＃2とともにプライマー（配列番号38、39、EcoRIとHindIII配列を含む）を使用してassembly PCRを行い、最終VH-CH1-リンカー-TPP＃2配列を完成した。PCRによって最終的に完成した断片のうち軽鎖はBamHIとXhoIで、重鎖はEcoRIとHindIIIで切断した後、同じ制限酵素で切断されたpHEKAベクターにクローニングした。前記の方法で完成されたIDB0062配列を含むpHEKAベクターでSUPEX5株を形質転換した。具体的には1mmキュベットにコンピテントセル100μlを入れてここに前記DNAを3μl添加した後、1800Vで電気ショックを与えて遺伝子を導入して生産細胞株を完成した。

このように製作されたIDB0062の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を配列番号12及び配列番号14でそれぞれ表示し、これをエンコードする核酸配列を配列番号13及び配列番号15でそれぞれ表示した。

＜１−３＞ラニビズマブ改良体IDB0062の選別
前記実施例１−２で製造した多様なラニビズマブ改良体の候補タンパク質に対してニューロピリン受容体に対する親和性と内皮細胞間のタイトジャンクション（tight junction）瓦解能を比較した。

まず、ニューロピリン受容体に対する親和性は、NRP1（neuropilin 1）に対して行われた。具体的にはTPPのニューロピリン−1のドメインに対する結合力を確認するためにBiacore2000（GE Healthcare）を利用して、SPR（surface plasmon resonance）を行った。具体的には、ニューロピリン−1のドメインそれぞれを10mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.0）に希釈してCM5センサーチップ（GE Healthcare、USA）に約1,000 response units（RU）で固定化した。HBS-EP緩衝液（10mM HEPES、2mM ethylene diamine tetraacetic acid、0.005％ surfactant P20、pH 7.4、GE Healthcare）を30μl/minの流速で分析し、VEGF165は80nMから5nM、セマフォリン3Aは1μMから62.5nM、TPPは25μMから1.5625μMの濃度で分析した。結合／解離の分析後CM5チップの再生（regeneration）は緩衝液（20mM NaOH、1M NaCl、pH 10.0）を30μl/minの流速で1分間流して実施された。結合3分、解離3分で得られた各センサーグラム（sensorgram）はブランクセルと比較して標準化（normalization）及び減算（subtraction）して親和性を計算した。

さらに、前記内皮細胞間のタイトジャンクション瓦解能は、前記タンパク質らのVE-cadherin及びE-cadherin阻害程度を測定して評価した。内皮細胞でVE-cadherin及びE-cadherinの発現が阻害されると、内皮細胞間のタイトジャンクション（tight junction）が瓦解されることが知られており、これにより薬剤の眼球内投与時の脈絡膜組織への伝達（又は組織透過力）が高くなる。具体的には、TPPの血管透過性増進を間接的に確認できる実験方法であるウェスタンブロッティングによるVE-cadherinの変化を確認した。具体的には、血管透過性増進は、6-wellプレートにHUVEC細胞をウェル当たり3×10⁵個播種（seeding）した後、24時間培養後、TPPを1uMで10分間処理してウェスタンブロッティングを行った。SDS-PAGEを行ったゲルは、PVDF膜にトランスファーし、VE-cadherin及びβ-actinを認識する一次抗体（SantaCruz）とHRPが結合された二次抗体（SantaCurz）を利用して検出し、分析はImageQuant LAS4000 mini（GE Healthcare）を利用した。

実験結果は下記表４に示した通り、TPP＃2が融合されたFc（Fc-TPP＃2）がニューロピリン受容体（NRP1）と高いレベル（Sema3Aリガンドと類似したレベル）で結合することを確認し、VE-cadherinを著しく抑制することを示した。TPP＃5が融合したFc（Fc-TPP＃5）の場合には、NRP1との結合力は、Sema3Aより高く、VE-cadherinの阻害効果もさらに優れていることが分かった。IDB0062もまたニューロピリン受容体（NRP1）と高レベルで結合することを確認しており、VE-cadherin阻害程度もやはりFc-TPP＃2と類似して阻害されることが確認される。

＜１−４＞ラニビズマブ改良体IDB0062の生産性確認
前記実施例１−１と同様の方法でIDB0062の生産性を確認した。その結果は前記表１に示した通り、IDB0061にTPP＃2を融合したIDB0062も、やはりラニビズマブと比べて5倍ほど高い生産性を示すことを確認した。

さらに、吸着カラムを利用した１次精製物の純度をHPLCで分析した。HPLC分析の実験は次のような方法で行った。吸着カラムを利用して一次精製した精製物はamicon（Milipore、10K）を利用して濃縮した後、調剤バッファー（10mM histidine、0.1％tween20、10％trehalose）に交換して最終濃度が0.5mg/mlになるように希釈した。分析機器は、Waters Alliance e2695を使用し、カラムはBioSuite 250 UHR SEC（4.6×300mm、4um、Waters）を使用して、移動相は20mMリン酸カリウムバッファー（250mM KCl、pH 6.2）を利用した。分析方法は前記濃縮試料を20μl注入（injection）して0.35ml/minの流速で20分間分析し、タンパク質のピーク（peak）はUV280nmの波長で分析した。

実験の結果、ラニビズマブは三つの主要成分が混合されており、この内3番目の成分だけが活性成分であるのに反し、IDB0062は単一形態で生産されることを確認した（図２）。

＜１−５＞ラニビズマブ改良体IDB0064の製作と生産性の確認
ラニビズマブ改良体IDB0062に続いて、実施例１−３でVE-cadherin阻害効果が確認されたTPP＃5がリンカーによって連結されて融合したラニビズマブ改良体IDB0064を製作して生産性を確認した。

IDB0064の具体的な製作過程は次の通りである。IDB0061に新しいTPPであるTPP＃5を結合させるために、遺伝子クローニングを行った。IDB0062を鋳型としてC末端のTPPをTPP＃2からTPP＃5に交換するために、特定のプライマー（配列番号40、41、42）を利用したが、TPP＃2とTPP＃5が共有する前部分配列にアニーリング領域を設定して、その後でTPP＃5の配列を延長してプライマーを製作し、これを利用してクローニングを行った。PCRは、変性（95℃、40sec）、アニーリング（65℃、40sec）、伸長（72℃、1min）の順で、30サイクルを行い、Fab軽鎖（light chain）-TPP＃5とFab重鎖（heavy chain）-TPP＃5の遺伝子を得た。PCR産物のうち軽鎖部分はBamHIとXhoIで、重鎖部分はEcoRIとHindIIIで処理した後、pHEKAベクターにライゲーションして挿入し、生産細胞株であるSUPEX5を形質転換した。

このように製作されたIDB0064の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を配列番号16及び配列番号18でそれぞれ表示し、これをエンコードする核酸配列を配列番号17及び配列番号19でそれぞれ表示した。

前記製作されたIDB0064の生産細胞株の生産性を確認した。IDB0064生産細胞株を2×YT培地（100mM リン酸カリウムバッファー、pH 7.2、50μg/mlカナマイシン）50mlに1％（v/v）接種して28℃で220rpm、18時間培養して前培養を行った。2×YT培地を1L羽根付きフラスコに180mlずつ入れて滅菌した本培養培地にあらかじめ除菌した1Mリン酸カリウム（pH 6.4）20mlと50μg/mlカナマイシンを添加した後、OD₆₀₀が約0.15になるように前培養液を接種する。その後28℃、220rpmでOD₆₀₀が0.5〜0.7になるまで培養した後、0.05mM IPTGを添加し、温度を20℃に下げて発現を誘導する。発現誘導21時間後、培養液は遠心分離を介して上澄み液を回収してデプスフィルターとメンブレンステラルフィルターを用いて濾過した後、protein L カラムにローディングして目的タンパク質を精製した。精製結果は、表２と図３に示した通り、人為的な塩基配列で製作したTPP＃5配列をIDB0061Fabに連結させたときにも発現がよく誘導されて、一次精製だけで比較的純度の高い目的タンパク質を約3〜4mg/Lの生産性で得られることを確認した。

＜実施例２＞
ラニビズマブ改良体IDB0062の二価（bivalent）の特性確認
ラニビズマブ改良体IDB0062のVEGF-A及びニューロピリン1受容体に対する結合力を確認した。

＜２−１＞ニューロピリン１受容体に対する結合力SPR（Biacore2000）分析
IDB0062とIDB0072のNRP1に対する結合能を確認するためにSPR分析を行った。EDC/NHS混合液でBiacore CM5 chipを活性化させた後、ターゲットタンパク質であるNRP1を固定化バッファー（10mM sodium acetate、pH5.5）に希釈してRmax：200で計算して最終79Ruに固定した。その後IDB0062、IDB0072試料を12.5nM〜400nMまでHBSEPバッファーで希釈して分析を行った。分析流速は30μl/minで行い、結果のグラフをもとにセンサーグラムを得てKd値を算出した。

表４に示した通り、ニューロピリン−1受容体に対するIDB0062の結合力は対照薬剤（Fc-TPP＃2）と類似した結合活性を保持することを確認した。これはラニビズマブC末端に融合したTPP＃2ペプチドがニューロピリン−１受容体によく結合することを意味する。

＜２−２＞ニューロピリン−1受容体に対する結合力ELISA分析
ELISAプレート（SPL、Immunoplate Maxi binding）にNRP1（独自生産）を炭酸塩コーティングバッファー（carbonate coating buffer）（0.1M NaHCO₃,pH 9.6）に希釈して10μg/mlの最終濃度にしてウェル当り100μlずつ入れ、37℃で2時間コーティングした。以後プレートを3回洗浄して37℃で１時間ブロッキング（4％skim milk、pH 7.4）を行い3回洗浄後、それぞれの試料を適切な倍数で希釈してウェル当り100μlずつ処理し、37℃で1時間反応させた。試料反応終了後、プレートを3回洗浄し、抗ヒトκL鎖抗体-ペルオキシダーゼ標識-ヤギ宿主抗体（Sigma Aldrich、A7164）をブロッキングバッファーに5000倍に希釈してウェル当り100μlずつ処理して、37℃で1時間反応させた。プレートを５回洗浄した後TMB基質（Bethyl、E102）をウェル当り100μlずつ処理して、2〜3分反応後、停止溶液（1N HCl）をウェル当り100μl処理して反応を終了しELISAプレートリーダーを用いて450nmでの値を測定した。

ELISA分析でもニューロピリン−1受容体に対するIDB0062の結合力は、対照薬剤（Fc-TPP＃2）と同等程度であることを確認した（図４Ｂ）。従って、TPP＃2ペプチドは、ラニビズマブのC末端に融合されたときその特性が維持されたことを再確認した。

＜２−３＞VEGFに対するの結合力ELISA分析
ELISAプレート（SPL、Immunoplate Maxi binding）にVEGF（R＆D system、293-VE-500 / CF）を炭酸塩コーティングバッファー（0.1M NaHCO₃、pH 9.6）に希釈して、3μg/mlの最終濃度に調製してウェル当り100μlずつ入れて37℃で2時間コーティングした。その後プレートを３回洗浄して37℃で１時間ブロッキング（4％skim milk、pH 7.4）を進めて３回洗浄後、それぞれの試料を適切な倍数で希釈してウェル当り100μlずつ処理して、37℃で１時間反応させる。試料反応終了後、プレートを３回洗浄した後、抗ヒトκL鎖抗体-ペルオキシダーゼ標識-ヤギ宿主抗体（Sigma Aldrich、A7164）をブロッキングバッファーで5000倍に希釈してウェル当り100μlずつ処理して37℃で30分間反応させた。プレートを7回洗浄した後TMB基質（Bethyl、E102）をウェル当り100μlずつ処理して2〜3分反応後、停止溶液（1N HCl）をウェル当り100μl処理して反応を終了し、ELISAプレートリーダーを利用して450nmで値を測定した。

図４Ａに示した通り、IDB0062のELISA分析を介してVEGF-A結合力がラニビズマブに比べて多少落ちるのを確認し、これは特定のアミノ酸の配列変更によりIDB0062の３次構造が変化し、VEGF-Aが結合するCDR（Complementary-Determining Region）が部分的に変化したためと予想された。しかし、ラニビズマブの結合力は、一般的な抗体に比べてかなり高いので、この程度の結合力低下が実質的な臨床的効能低下をもたらすことはないものと判断される。

＜実施例３＞
ラニビズマブ改良体IDB0062の安定性評価

IDB0062の特定アミノ酸配列が変更されることにより、構造的変形を起こしてVEGF-A結合力がラニビズマブに比べて多少減少する結果を確認したので、このような変更がIDB0062の安定性にどのような影響を与えるかを確認するために保管条件別に繰り返し冷／解凍安定性の分析を実施した。

１次精製された精製物を調剤バッファーに変更した後、動物実験で使用する濃度（5mg/ml）に濃縮し、安定性の実験を行った。保管条件別の安定性実験は前記試料を10μlずつ分注して4℃、-80℃で5週間保管しながら1週間単位で取り出して氷上で解凍させた後、VEGF結合ELISA分析を介して分析し、繰り返し冷／解凍安定性は前記試料を-80℃で凍らせて氷上で解凍することを5回繰り返しながら一部試料を採ってVEGF結合ELISA分析により評価した。

その結果、図５に示した通り、IDB0062は4℃と-80℃で保管５週までVEGF-A結合能が安定的に維持され、5回繰り返し冷／解凍を通じた物理的な衝撃を加えても活性には影響を与えないので、アミノ酸配列の変更に伴う物質の安定性低下はないと判断された。

＜実施例４＞
抗VEGF製剤改良体の眼球組織透過度評価

ラニビズマブ改良体の眼球透過度を分析するために、ex-vivo ocular penetrationモデルを構築してその効能を評価した。これに加えて組織透過性ペプチドの融合による組織透過度の改善可否を、分子量が大きく、三次構造がより複雑な抗体（Fc融合タンパク質を含む）で評価するため、ベバシズマブとその改良体IDB0072に対する眼球透過度分析を同時に進めた。

＜４−１＞ラニビズマブ改良体IDB0062の組織透過度評価
IDB0062のC末端に融合したTPPが眼球内皮細胞に多く分布するニューロピリン受容体との結合を介して、実際に組織透過度を改善できるか否かを確認するために、摘出した眼球をFITC標識されたラニビズマブ及びIDB0062溶液に浸した後、時間別の透過度を比較した。

タンパク質のFITC標識効率を高めるために、タンパク質試料を100mM炭酸ナトリウムバッファー（pH 9.0）で交換した後、1mg/mlに濃度を補正した後、FITC（1mg/ml in DMSO）と混ぜて室温で二時間反応した。TPP＃2ペプチドには、FITCが結合できる遊離アミノ基が多いので、タンパク質当たりのFITCの反応モル数を別に適用して反応させた。以後PD-10脱塩カラムを利用して標識されていないFITCを除去しながらPBSにバッファー交換した後、精製物を定量して効能評価用試料に使用した。標識の結果、ラニビズマブとIDB0062のF/P比は1.127と1.133でタンパク質分子当たりほぼ同一なモル数のFITCが結合されていることを確認した。FITCが標識されたラニビズマブとIDB0062溶液を、PBSを利用して0.3mg/mlで希釈した後、C57BL/6マウスの眼球を摘出して、37℃で1〜2時間浸した後、PBSで10分ずつ2回洗浄した後、パラフィンスライドを製作した。Davidson固定液（氷酢酸：エチルアルコール：中和ホルマリン：蒸留水=1：3：2：3）を利用して眼球を４℃で４時間固定した後、結膜前方部位の組織をはさみで一部切断して、パラフィンスライド製作段階で網膜組織の変形を最小化した。その後10％（v/v）ホルマリン溶液を利用して、4℃で終夜固定作業を経て、自動浸透機を利用してアルコールを低濃度から高濃度に高めて組織内の水分を除去し、キシレンで透明過程を経た後パラフィン浸透を進めた。パラフィン浸透が完了した組織は包埋皿に入れてパラフィンブロックを作り、薄切機を利用して、4μm切片を作った。パラフィン切片は浮遊恒温水槽で広げて予めアルブミン、ポリ-L-リシン、生理食塩水をコーティングしたスライドに付着した。組織スライドは脱パラフィン過程を経た後すぐに封入して共焦点顕微鏡でFITCを観察して眼球組織透過性及び分布を確認した。

図８Ａと図８Ｂに示した通り、IDB0062は実験1時間から角膜と眼球後部を通じて迅速に眼球の内側に透過され始めて、2時間に至っては対照薬剤であるラニビズマブに比べて眼球組織及び硝子体内分布量が4倍ほど有意に増加したことを確認することができる。DAPI染色を介して眼組織を明確に区別して分析できるが、ラニビズマブとは異なり、IDB0062の場合、角膜の内側にも、タンパク質が過剰に分布していることを確認でき（図８Ｃ、白矢印）、眼球内薬剤分布もラニビズマブ対比10倍程増加していることを確認することができる（図８Ｄ）。図８Ｅのデータは眼球の網膜組織の断面を示しているが、対照薬剤であるラニビズマブは殆ど強膜（sclera）の近くに存在する反面、IDB0062は網膜色素上皮細胞（RPE）層を経て網膜まで薬剤が達していることを確認できる。結論としては、眼球内組織の透過率が良くないラニビズマブに組織透過性ペプチドを連結することにより、対照薬剤対比眼球透過率を約４倍に増加させることができ、これにより、薬剤の透過度の改善を通じた投与量の制御及び投与間隔の増大の可能性、剤形改善を通じた点眼剤開発の可能性を確認することができる。

＜４−２＞ベバシズマブ改良体IDB0072の組織透過度評価
抗体断片（Fab）に比べてベバシズマブ（bevacizumab）のような抗体全長（whole antibody）タンパク質は分子量も大きくタンパク質の３次構造も複雑で組織透過に不利な特性を有する、それにも拘らずベバシズマブのC末端組織透過性ペプチドを融合することにより、このような物理的な限界を克服し、対照薬剤であるベバシズマブに比べて透過度が改善されるか否かを確認するために同じ実験を行った。

ベバシズマブ改良体IDB0072の製作過程は次の通りである。IDB0072はベバシズマブのC末端にTPPをリンカーによって融合した抗体融合タンパク質の一つの形態として、TPPのアミノ酸配列は前記表３に示した通りである。表３の配列目録中、配列番号1〜4のアミノ酸配列を有するTPPはニューロピリン−1及び２に全て結合が可能であり、配列番号5〜7のアミノ酸配列を有するTPPはニューロピリン−1にのみ特異的に結合が可能である。一方、前記表３に示したTPPのうちTPP＃2は、ニューロピリンの内在的リガンドであるVEGF165及びセマフォリン3系列のリガンドのC末端部位を変形したものであり、TPP＃5は、ニューロピリン1のb1b2ドメインに選択的に結合するクローンから導き出された人工ペプチドを分離同定したものであり、このうちTPP＃2を、リンカーを用いてベバシズマッブと融合してニューロピリン受容体に二価として作用させることにより、VEGFとSema3Aリガンドと類似した親和力を有しながらも組織透過性を有するIDB0072をデザインした。

具体的には、ベバシズマブのC末端に前記配列番号２のアミノ酸配列を有するTPP＃2が融合されたIDB0072を生産する細胞株を製作した。pcDNA3.4ベクターにIDB0072をクローニングした。IDB0072の軽鎖及び重鎖アミノ酸配列は配列番号20及び配列番号22にそれぞれ記載しており、これをエンコードする核酸配列は配列番号21及び配列番号23にそれぞれ記載した通りである。CHO DG44細胞に前記構築された抗体重鎖定常領域とNRP1に結合するペプチドが融合されたタンパク質をエンコードするプラスミドと軽鎖タンパク質をエンコードするプラスミドをNeon^TMによるエレクトロポレーションを利用してトランスフェクション（transfection）させた後、T25フラスコに3×10⁶ cellsで接種し、37℃で培養した。選別マーカーを利用して安定発現細胞を確保してバイオリアクターで無血清SFM4CHO（Hyclone）を利用して浮遊状態で7日間100rpm、37℃、pH 7.2、50％ D0₂ の条件で培養した。上澄み液は遠心分離を利用して細胞と分離して0.22μmフィルターを利用して除菌した。

IDB0072の培養液を回収して標準プロトコルを参照してそれぞれのタンパク質を精製した。protein-Aカラム（MabselectSure resin、GE healthcare）に培養液を適用し、PBS（pH 7.4）で洗浄した。0.1Mグリシン緩衝液を利用してpH 3.0で抗体を溶離した後、1M Tris緩衝液を利用してサンプルをpH 7.0に中和した。溶離した抗体分画は、MILLIPORE Amicon Ultra（30 MWCO）遠心分離濃縮機を使用して濃縮してPBS（pH 7.4）緩衝液に交換した。精製された抗体重鎖定常領域と選別されたNRP1に特異的に結合するペプチドが融合されたタンパク質は補正された280nmの波長で吸光度と吸光係数を利用して定量した。

タンパク質のFITC標識効率を高めるために、ベバシズマブとIDBOO72を100mM 炭酸ナトリウムバッファー（pH9.0）で交換して3mg/mlで濃度を補正した後、FITC（1mg/ml in DMSO）と混ぜて室温で２時間反応した。IDB0072はTPP＃2融合による標識の差を減らすために、タンパク質当たりFITCの反応モル数を対照薬剤であるベバシズマブとは別に適用して反応させた。以後PD-10脱塩カラムを用いて標識されていないFITCを除去しながらPBSでバッファー交換した後精製物を定量して効能評価用試料として使用した。標識の結果、ベバシズマブとIDB0072のF/P比は2.18と1.98で、タンパク質一つの分子当たりほぼ同一モル数のFITCが結合されていることを確認した。FITCが接合されたベバシズマブとIDB0072溶液を、PBSを用いて0.9mg/mlに希釈した後、C57BL/6マウスの眼球を摘出して、37℃で1時間、2時間浸した後、PBSで10分間ずつ5回洗浄してパラフィンスライドを製作した。以降の過程は実施例４−１と同様に行った。

生産されたベバシズマブ改良体IDB0072の活性を評価するためにニューロピリン−１受容体に対する結合力をSPR分析を介して確認した。表５に示した通りニューロピリン−１受容体に対するIDB0062の結合力は対照薬剤（Fc-TPP＃2）及びラニビズマブ改良体IDB0062と類似した結合活性を示した。これはベバシズマブのC末端に融合したTPP＃2ペプチドもIDB0062のようにニューロピリン１受容体によく結合することを意味する。

図９Ａに示した通り、IDB0072も対照薬剤であるベバシズマブに比べて眼球透過能を改善するとの事実を確認できた。1時間と2時間でIDB0072はベバシズマブと比べて有意に、1.5倍ほど眼球内分布を増加させる結果を確認することができる（図９Ｂ）。また、大きい分子量と構造を有するにもかかわらず、ベバシズマブに比べてIDB0072は結膜を介して角膜に拡散されて分布することも確認できた。これにより分子量が大きく構造が複雑な抗体でもFcのC末端に組織透過性ペプチドを連結することにより、組織透過度を有意に増加できることを確認できた。これらの結果は、抗体タンパク質を含めて多様なFc融合タンパク質にも組織透過性ペプチドを連結することにより、眼球組織透過度を改善できる可能性を示している。

＜実施例５＞
角膜血管新生モデルを利用したラニビズマブ改良体の効能評価

IDB0062の効能評価のため、角膜血管新生モデルを構築して予防モデルと耐性モデルに分けて血管新生抑制の可否と新生された血管を減少させる効能をラニビズマブと比較した。

＜５−１＞予防モデル
IDB0062とラニビズマブの血管新生阻害効果を比較するために、アルカリ熱傷で誘導した角膜血管新生モデルを次のように作製した。セルロースフィルターペーパーを直径2mm円にカットして準備した後、1M NaOH溶液に浸しておいた。マウスは６週齢の雌C57BL/6を使用し、麻酔（Zoletil 40mg/kg+Rompun 5mg/kg、腹腔内投与）後、左眼角膜にNaOHフィルターペーパーを載せて30秒間アルカリ熱傷を誘導した後、40ml PBSで十分に洗浄して角膜血管新生動物モデルを構築した。予防モデルの場合アルカリ熱傷を誘導した当日から薬剤を処理したが、各薬剤は5mg/mlの濃度で1回5μlずつ、1日4回点眼投与を行い、合計5日間投与を行った。投与が終了した後、眼球を摘出して4％パラホルムアルデヒド溶液に1時間浸して固定し、PBSで洗浄した後、解剖顕微鏡を利用して角膜を分離した。分離された角膜は再び4％パラホルムアルデヒド溶液に12時間追加固定した。固定された角膜は、PBSで洗浄した後、常温でブロッキングバッファー（PBS、0.3％BSA、0.1％Triton X100）で2時間反応させる。血管内皮細胞のマーカーであるPECAM-1（CD31）に特異的な一次抗体（BD pharmingen）と周皮細胞マーカーであるNG-2に特異的な一次抗体（Millipore）を冷蔵で終夜反応させて二次蛍光抗体（Alexa Fluor488、Alexa Fluor594、Life Technologies）は、常温で4時間反応して組織を染色した。染色過程が終了した角膜はスライドに移した後、解剖顕微鏡を用いて、角膜の中心部に向けて四方向に切開腺を入れて封入した。封入が完了した角膜のスライドは、蛍光顕微鏡／共焦点顕微鏡を用いて血管と周皮細胞の様相を確認した。

予防モデル実験の結果、図６に示した通り、IDB0062はラニビズマブ対比25〜30％程さらに血管新生を阻害して溶媒（vehicle）比50％以上の有意的な予防効果を示し、IDB0061もラニビズマブと同等な効能を示してラニビズマブ構造変化に伴うVEGFの結合力低下が、実際の血管新生抑制効能に影響を与えずに、C末端に融合されたTPPによる効能増大が可能であることを確認した。

＜５−２＞耐性モデル
耐性モデルは、予防モデルと同じ方法でアルカリ熱傷を誘導して角膜新生血管が十分に生成できるように10日間放置した。投与濃度と周期は予防モデルと同じく、投与はアルカリ熱傷10日後から10日間行い生成された新生血管を減少させる程度をラニビズマブと比較した（以降、角膜スライドを製作する過程は予防モデルと同一である）。

図７Ａに示した通り、溶媒（vehicle）とラニビズマブ処理群では、角膜まで血管が発達しているがIDB0062処理群は、血管が眼球の外側（limbus）にのみ局所的に分布して血管新生が減少したことを確認した。結果的にIDB0062は溶媒（vehicle）比30％以上の有意的な血管新生減少効能を示し、有意的効能を表せなかったラニビズマブ対比2倍以上の効能が増加され（図７Ｂ）、これらの結果は、抗VEGFアプタマーと抗PDGF抗体製剤を併用投与した文献の結果と類似している（Jo et al.,2006 Am.J. Pathol）。したがって、本発明のIDB0062はラニビズマブ投薬患者のうち視力の改善がなく維持されるだけの約70％の患者らから視力改善の可能性があると予測された。

また、図７Ｃに示した通り、IDB0062処理群では溶媒（vehicle）処理群と比較して有意に40％に近い周皮細胞被覆率の減少を確認することができ、これは、従来の薬剤に耐性を示す患者を治療するための目的で併用投与製剤に開発中のPDGF阻害剤と類似した結果である。従って、IDB0062は抗VEGF阻害剤投与患者の45％において発生することが知られた耐性治療用単一療法剤として使用可能なものと予想された。

＜実施例６＞
脈絡膜血管新生モデルを利用したラニビズマブ改良体の効能評価

黄斑変性（age-related macular degeneration）のモデルである脈絡膜新生血管（choroidal neovascularization、CNV）は、レーザ誘起脈絡膜血管新生法で誘導してラニビズマブ改良体IDB0062の治療効果を確認した。

７週齢雄Brown Norway（BN）ラット（SLC Japan、Tokyo、Japan）を１週間馴化後、ペントバルビタールナトリウム（翰林製薬、25mg/kg）を腹腔注射して麻酔した。以降１％トロピカミド点眼薬で瞳孔を拡張させ、ダイオードレーザー（波長532nm;径100μm;パワー150mW;期間0.1sec）を利用して、視神経頭周りに６箇所の光凝固（photocoagulation）スポットを作った。ブルッフ膜の破壊は特徴的な泡の形成で検証した。泡が形成されていなかったり、出血が発生しなかったりした眼球は以降の実験から除外した。光凝固処理後のラットは、表６に記載された通り、ランダムに群当たり10匹ずつ5群に分けた。薬剤はハミルトンシリンジ（hamilton、USA）を利用して各グループに合った濃度を眼球内投与した。CNVグループには同量の溶媒（vehicle）を投与し、対照薬剤としては、ラニビズマブ100μg/eyeを投与した。薬剤投与による外科的な損傷が発生した個体や、水晶体混濁などが発生した個体は以降の実験過程で除外した。

薬剤投与10日後、脈絡膜血管新生が発生した程度を評価した。ラットの眼球を摘出して顕微鏡下で角膜と強膜隣接部位で眼球を切開して眼球後部の組織を利用して、網膜を除去した後網膜下部位が含まれた結膜組織を分離した。分離した組織は、4％パラホルムアルデヒドに１時間固定した後、PBSで洗浄し、5%Triton X-100と１％BSAを含むPBSで3時間攪拌した。再び洗浄後PBSに1mg/mlで溶かした内皮細胞マーカーであるイソレクチンB4（sigma）を1:50に希釈し、4℃で終夜反応させた。0.05％Tween20が含まれたPBSで2時間洗浄した後、TRITC標識ストレプトアビジンを1：500に希釈して、37℃で4時間反応させた後、PBSで30分洗浄して蛍光顕微鏡（BX51、Olympus、Japan）下で観察した。網膜下血管新生部位の大きさは、ソフトウェア（Image J、NIH、USA）を用いて分析した。

図１０Ａに示した通り、溶媒（vehicle）群はレーザーで傷を与えた部位の内側（脈絡膜）で外側（網膜）に黒色で標識された新生血管が多く伸び出てくることを確認することができる。対照薬剤であるラニビズマブを100μg投与した群では、溶媒（vehicle）群に比べて新生血管の形成が多少抑制されている傾向を示しているが、一部個体では依然として伸び出てくる血管が観察されている。一方、IDB0062の場合、濃度依存的に新生血管の形成を抑制する傾向を確認することができる。IDB0062 50μg群で対照薬剤であるラニビズマブ 100μg投与群と類似した程度の血管新生抑制効能を確認することができ、IDB0062 100μg投与群では、網膜にレーザーによる傷跡が残っているだけで血管新生はほとんど抑制されていることを確認することができる。図１０Ｂのように、前記の結果を数値化すれば、ラニビズマブ100μg投与群とIDB0062 50μg投与群では、溶媒（vehicle）群と比べて血管形成が31％ほど抑制され、IDB0062 100μg投与群では、血管形成が約36％抑制されたことが確認された。その結果、IDB0062はラニビズマブ対比半分の用量でラニビズマブと同じ血管新生抑制効果を示す事実を確認した。

＜実施例７＞
酸素誘導網膜症モデルを利用したラニビズマブ改良体の効能評価

未熟児網膜症（retinopathy of prematurity）のモデルで酸素誘導網膜症（oxygen-induced retinopathy、OIR）を誘発してラニビズマブ改良体IDB0062の効果を確認した。

実験動物は、コアテックから購入した7〜8週齢C57BL/6を交配させて生まれたマウスを用いた。生後7日目にマウス（postnatal day 7、P7）を酸素チャンバーに入れて5日間（P7-P11）チャンバー内の酸素濃度が75％（高酸素、hyperoxia）に維持されるように制御した。実験室の照明は12時間間隔で灯火されるようにし、温度は24±2℃に維持し、飼料と飲料水は自由供給した。5日後にチャンバー外室内大気（酸素正常状態、normoxia）で5日間（P12-P17）露出させて網膜血管新生を誘導した。薬剤投与のためにP12日に酸素正常状態に露出させた直後、ランダムに表７に記載された通り、群当たり10匹ずつ5群に分けた。薬剤はハミルトンシリンジ（Hamilton、USA）を利用して各グループに合った濃度を眼球内に投与した。OIRグループには同量の溶媒（vehicle）を投与し、対照薬剤としてはラニビズマブ10μg/eyeを投与した。薬剤投与に因る外科的損傷が発生した個体や、水晶体混濁などが発生した個体は、その後の実験過程では除外した。

生後17日の網膜浮腫の程度を評価した。ペントバルビタールナトリウム（翰林製薬、25mg/kg）を腹腔注射して麻酔した。開腹後、心臓にデキストラン（FD40S-1G、sigma; 50mg/ml in PBS）10μlを注射し、10分後に眼球を摘出して4％パラホルムアルデヒドに10分間固定し、網膜分離後、平らに封入した網膜スライドを製作して蛍光体顕微鏡（BX51、Olympus、Japan）下で観察した。血管外に流出した蛍光の量はImage Jを用いて蛍光強度を定量分析した。

図１１Ａに示した通り、薬剤を処理していない溶媒（vehicle）群では、中心部の視神経乳頭部位と網膜の外側の血管の末端部位で漏出による蛍光流出が増加していることが確認できた。対照薬剤のラニビズマブ10μg処理群では、溶媒（vehicle）群に比べて、血管漏出（vascular leakage）をある程度減少させたが、血管の末端部位には依然として漏出する血管による蛍光流出が多少存在していることを確認できる。一方、IDB0062処理群は、濃度依存的に血管漏出を抑制させる傾向を示し、ラニビズマブと同じ容量の10μg以上投与群では、統計的に有意ではないが、ラニビズマブと対比して血管漏出をより効果的に抑制できる可能性を確認することができた（図１１Ｂ）。特にIDB0062 15μg投与群では、血管の形状が稠密で安定的な構造を有しており漏出部分が全く見えない特徴を示す。

さらに、網膜からの血管生成程度を評価した。分離した網膜を4％パラホルムアルデヒドに3時間固定後、PBSで洗浄して、5％Triton X-100と１％BSAを含むPBSで3時間攪拌した。再び洗浄後PBSに1mg/mlで溶かしたイソレクチンB4（L2140、sigma）を1:50に希釈して4℃で終夜反応させた。0.05％Tween 20を含むPBSで２時間洗浄後、TRITC標識ストレプトアビジンを1:500に希釈して、37℃で４時間反応させ、PBSで30分間洗浄して蛍光顕微鏡（BX51、Olympus、Japan）下で観察した。

P7マウスが5日間高酸素条件下に置かれていたものが酸素正常状態に移動すると、相対的な局所貧血（ischemia）状態に置かれる。このとき網膜では過度な新生血管が育成され、この時形成された新生血管の特徴は網膜から無血管野の硝子体側に血管が伸び出る点と漏出し易い不規則な血管形態的な血管束という特異的な構造を形成する事実である。これらの血管束の形成は血管新生を定量する尺度として使用することができる。図１２Ａで確認した通り、溶媒（vehicle）群で染色された血管は、血管同士の境界が明確に区分されて、比較的細く安定した構造の正常的な網膜血管の特徴を示しているに反し、殆ど不規則で太い血管らが一箇所に固まり血管束を形成している新生血管が多く観察された。対照薬剤のラニビズマブ10μg処理群でも溶媒（vehicle）群と同様に血管束の形を帯びている新生血管が多く分布していることを確認することができた。反面、IDB0062の場合、濃度依存的に新生血管に規定される血管束の分布を多く減らしたが10μg以上の投与群では、ほとんどの血管構造が明確に区分され、血管束の形態よりは稠密で堅い正常血管の形態を確認することができた。これを数値化してグラフで表すと溶媒（vehicle）群、ラニビズマブ10μg処理群、IDB0062 5μg投与群では、すべて同じ新生血管形成程度を示すのに反し、IDB0062 10μg投与群では、これらの対比は40％ほど血管新生を阻害する事実を確認することができる（図１２Ｂ）。結論として、OIRモデルでラニビズマブを処理することにより、網膜血管新生抑制効能は確認できなかったが、IDB0062はラニビズマブと同じ容量でOIRに誘導される新生血管の形成を有意に抑制することができることを確認した。

＜実施例８＞
眼球内注射後の薬剤の分布分析

ラニビズマブとIDB0062を眼球内注射したときの、組織内の薬剤分布を確認するために、網膜組織からタンパク質を抽出してウェスタンブロッティング分析を行った。

眼球内注射後4時間、72時間が経過した後、ラットの眼球を摘出して網膜を分離した。分離した網膜はPBSを用いて3回洗浄した後溶解バッファー（20mM Tris-Cl、150mM NaCl、1mM EDTA、0.1％triton X-100）に移してホモジナイザーを用いて組織を破砕した。以降遠心分離（14,000rpm、4℃、10min）を用いて上澄み液を回収し、ブラッドフォード定量法を利用して溶解物のタンパク質含有量を測定した。ウェスタンブロッティング分析のため12％の非還元条件（non-reduced）SDS-PAGEゲルを利用した。タンパク質試料はウェル当り40μgずつローディングし、25mAで1時間泳動した。以後PVDFメンブレンにトランスファーした後、抗κ抗体-HRP（sigma、F3761）を利用して、タンパク質を検出しBio-Rad社のChemiDocシステムを利用してそれぞれのタンパク質バンドを定量した。

ラニビズマブは重鎖と軽鎖が二硫化結合によって連結されているので、非還元条件SDS-PAGE分析から約48kDaの部位に一つのバンドに確認される。一方、IDB0062は重鎖と軽鎖の間に二硫化結合がないので、同じ条件でSDS-PAGE分析すると、28kDaの部位から二つのバンド（重鎖と軽鎖）に分かれて確認される。図１３に示した通り、眼球内注射４時間後網膜に存在する薬剤の量はIDB0062がラニビズマブに比べて約3.6倍高いことが確認できる。これはIDB0062がTPPによってNRP1を発現する組織に特異的に結合する事実を示す結果として、網膜の血管新生に因る様々な疾病について疾患部位の網膜組織をターゲットとすることができる可能性を示している。薬剤を眼球内注射した場合、硝子体内に広がって存在する場合よりも、病変組織に結合するとVEGFを削除することができる機会が増えて、より少ない容量で同じ薬効を発揮できる可能性があり、これらの結果は、脈絡膜血管新生モデルと網膜病症モデルを利用した効能評価でIDB0062の優れた効能を裏付ける結果と判断される。

本発明の組織透過性ペプチドと抗血管内皮細胞成長因子製剤が融合した融合タンパク質を有効成分として含む薬学的組成物は、従来の抗血管内皮細胞成長因子製剤に比べて血管内皮細胞成長因子以外の血管新生と関連した様々な成長因子を阻害するだけでなく、周皮細胞被覆率を減少させる効能が増大して薬剤耐性患者まで治療することができると考えられる。また、眼球内注射時脈絡膜組織への薬剤伝達力が改善され、投与量の減少又は投与サイクルの増大及び眼球透過度の改善を介して点眼剤として開発される可能性が高い点で産業上の利用可能性が優れている。

Claims (10)

1. 組織透過性ペプチドと抗血管内皮細胞成長因子（anti-VEGF）が融合した融合タンパク質を有効成分として含む眼疾患の予防及び治療用薬学的組成物であって、
   前記組織透過性ペプチドが配列番号1〜7からなる群より選ばれたいずれか一つのアミノ酸配列を含み、
   前記抗血管内皮細胞成長因子（anti-VEGF）が、ラニビズマブ（ranibizumab）、ベバシズマブ（bevacizumab）、アフリベルセプト（aflibercept）、コンバーセプト（Conbercept）、r84、CT01、DOM15-10-11、DOM15-26-593、CT-322、ESBA903、及びEPI-0030並びにこれらの変異体で構成された群から選ばれる、眼疾患の予防及び治療用薬学的組成物。
2. 前記変異体は、重鎖定常1ドメイン及び軽鎖定常ドメインのアミノ酸であるシステインが欠失しているか、又はシステインを除いてセリンを含む他のアミノ酸残基に置換されたことを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
3. 前記変異体は、配列番号8で表示される軽鎖及び配列番号10で表示される重鎖からなるラニビズマブ変異体であることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
4. 前記融合タンパク質は、配列番号12又は配列番号16で表示されるアミノ酸配列、及び、配列番号14又は配列番号18で表示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
5. 前記融合タンパク質は、配列番号20で表示されるアミノ酸配列及び配列番号22で表示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
6. 前記融合は、リンカーペプチドによるものであることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
7. 前記眼疾患は、増殖硝子体網膜病症、黄斑変性、色素性網膜症、糖尿病性網膜症、脈絡膜血管新生、血管新生性緑内障、虚血性視神経障害、早熟児網膜症、未熟児網膜症、流行性角結膜炎、血管新生性虹彩疾患、厚水晶体繊維増殖症、アトピー性角膜炎、上角膜潤部角膜炎、位相編乾癬角膜炎、フリックテン性角結膜炎、強膜炎、及び糖尿性黄斑浮腫からなる群より選ばれたことを特徴とする請求項１〜６のうちいずれか一つに記載の薬学的組成物。
8. （ａ）組織透過性ペプチドと抗血管内皮細胞成長因子が融合した融合タンパク質をコードする核酸配列を含む組換えベクターを宿主細胞にトランスフェクションする段階;
   （ｂ）前記細胞を培養する段階；及び
   （ｃ）前記細胞から融合タンパク質を回収する段階を含み、
   前記組織透過性ペプチドが配列番号1〜7からなる群より選ばれたいずれか一つのアミノ酸配列を含み、
   前記抗血管内皮細胞成長因子（anti-VEGF）が、ラニビズマブ（ranibizumab）、ベバシズマブ（bevacizumab）、アフリベルセプト（aflibercept）、コンバーセプト（Conbercept）、r84、CT01、DOM15-10-11、DOM15-26-593、CT-322、ESBA903、及びEPI-0030並びにこれらの変異体で構成された群から選ばれる、耐性克服及び効能が向上した抗血管内皮細胞成長因子を製造する方法。
9. 前記融合は、リンカーペプチドによるものであることを特徴とする請求項８記載の方法。
10. 組織透過性ペプチドと抗血管内皮細胞成長因子が融合した融合タンパク質を有効成分として含む眼疾患の治療用製剤を製造するための前記融合タンパク質の使用方法であって、
    前記組織透過性ペプチドが配列番号1〜7からなる群より選ばれたいずれか一つのアミノ酸配列を含み、
    前記抗血管内皮細胞成長因子（anti-VEGF）が、ラニビズマブ（ranibizumab）、ベバシズマブ（bevacizumab）、アフリベルセプト（aflibercept）、コンバーセプト（Conbercept）、r84、CT01、DOM15-10-11、DOM15-26-593、CT-322、ESBA903、及びEPI-0030並びにこれらの変異体で構成された群から選ばれる、方法。