CN117083305A - 抗体融合蛋白及其用途 - Google Patents

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CN117083305A CN202280024655.5A CN202280024655A CN117083305A CN 117083305 A CN117083305 A CN 117083305A CN 202280024655 A CN202280024655 A CN 202280024655A CN 117083305 A CN117083305 A CN 117083305A
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Abstract

本申请提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)特异性识别血管生成素‑2(Ang2)的多价(例如，二价)抗体或其抗原结合片段(“多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段”)，和ii)血管内皮生长因子受体(VEGFR)组分，其中该多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段不抑制Ang2与TEK受体酪氨酸激酶(TIE2)之间的结合。还提供了其制备方法和用途。

Description

抗体融合蛋白及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年3月25日提交的国际专利申请号PCT/CN2021/083093的优先权，其内容通过援引以其全文并入本文。
序列表以ASCII文本文件提交
以下以ASCII文本文件提交的内容通过援引以其全文并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名：759892000940SEQLIST.TXT,记录日期：2022年1月19日，大小：223KB)。
技术领域
本申请提供了一种抗体融合蛋白，该抗体融合蛋白包含：i)特异性识别血管生成素-2(Ang2)的多价(例如，二价)抗体或其抗原结合片段(“多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段”)，和ii)血管内皮生长因子受体(VEGFR)组分，其中多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段不抑制Ang2与TEK受体酪氨酸激酶(Tie2)之间的结合。还提供了其制备方法和用途。
背景技术
维持内皮屏障功能对于血管正常化至关重要，血管正常化涉及包括血管生成在内的几种生理过程，并且其功能障碍将导致几种癌症和非肿瘤性疾病，包括类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、糖尿病性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性(AMD)，以及感染(如脓毒症、登革热和疟疾)。
生理性血管生成发生在繁殖、组织重塑过程中。相反，在病理条件下发生的新血管形成会导致毛细血管渗漏，然后导致组织损伤。病理性毛细血管渗漏背后的潜在分子机制正在深入研究中。血管生成是复杂的过程，由胞外基质衍生的血管生成抑制剂和生长因子(包括血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)和血管生成素)之间的相互作用驱动。
VEGF一直是抗血管生成疗法中应用最广泛的靶点。VEGF与其在血管内皮细胞上表达的酪氨酸激酶受体(VEGFR)的结合触发涉及血管内皮细胞增殖和新血管生长的细胞应答。包含VEGFR组分的重组融合蛋白已被开发用于治疗与VEGF表达相关的疾病，例如癌症和AMD。这些融合蛋白是通过将VEGFR片段融合至免疫球蛋白Fc片段的N末端或免疫球蛋白Fc片段的一部分而产生的，被称为“VEGF-trap”。参见，例如US 6100071、US 7087411和US7521049。VEGFR片段将结合内源性VEGF并使之失活，从而提供一种降低或抑制内源性VEGF活性的方法，进而减少或抑制内皮细胞增殖和血管生成。VEGF-trap(阿柏西普(Aflibercept))捕获VEGF的亲和力(约0.49pM)高于贝伐珠单抗(bevacizumab)(例如，VEGF中和性抗体，约58pM)、布洛赛珠单抗(brolucizumab)(DLX1008，约1pM)和雷珠单抗(ranibizumab)(亲和力约46pM)。然而，对于视网膜血管疾病的治疗，抗VEGF治疗虽然对大量患者有效，但仍不能阻止许多患者发展为法定失明。
Tie2是内皮细胞特异性受体酪氨酸激酶(RTK)，由两种分泌蛋白血管生成素-1(ANGPT-1，Ang1)和血管生成素-2(ANGPT-2，Ang2)反向调节。Ang1作为Tie2激动剂导致其磷酸化诱导各种保护性下游途径，从而诱导血管内皮细胞的稳定并通过加速血管内皮细胞的连接完整性来降低血管通透性。相反，通过与Ang1竞争作为拮抗剂或转化为有效的Tie2激活剂，Ang2是Tie2的内源性、背景特异性拮抗剂/激动剂。Ang2在生理过程中起着重要作用，其表达的错误调节是几种疾病的特征。
目前，多种靶向Ang2的药物正在临床研究中。大多数Ang2靶向性药物(例如抗Ang2拮抗剂抗体)会阻断Ang2与Tie2的结合。在几种疾病或感染(像脓毒症)的情况下，Ang2表达增加，而Ang1和Tie2表达下降。因此，简单地阻断Ang2-Tie2相互作用无法维持血管正常化。
此外，Ang2促进VEGF的促血管生成作用，并且VEGF上调内皮细胞中Ang2的表达(A.Hegen等人,Arterioscler Thromb Vasc Biol.2004；24(10):1803-1809；H.Hashizume等人,Cancer Res.2010；70(6):2213-222.)，靶向VEGF或Ang2只能提供短暂或适度的益处。
本文提到的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的披露内容通过援引以其全文特此并入本文。
发明内容
本申请的一方面提供了一种抗体融合蛋白(以下也称为“抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白”或“抗Ang2/VEGFR抗体融合蛋白”)，该抗体融合蛋白包含：i)多价(例如，二价)抗Ang2抗体(例如，全长抗体)或其抗原结合片段，和ii)VEGFR组分，其中该多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段不抑制Ang2和Tie2之间的结合。在一些实施例中，多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段在结合Ang2后通过抗体结合的Ang2激活Tie2信号传导。在一些实施例中，VEGFR组分包含独立地选自由Flt1、Flk1和Flt4组成的组的一个或多个VEGFR的免疫球蛋白(Ig)样结构域。在一些实施例中，VEGFR组分包含第一VEGFR的Ig样结构域2和第二VEGFR的Ig样结构域3。在一些实施例中，第一VEGFR是Flt1，并且第二VEGFR是Flk1或Flt4。在一些实施例中，VEGFR组分包含Flt1的Ig样结构域2(Flt1d2)和Flk1的Ig样结构域3(Flk1d3)。在一些实施例中，VEGFR组分包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在一些实施例中，VEGFR组分通过任选的接头(例如包含SEQ ID NO:30或31的氨基酸序列的接头)融合至多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段。
在根据上述任何一种抗体融合蛋白的一些实施例中，多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段是全长抗体(“抗Ang2全长抗体”)。在一些实施例中，抗Ang2全长抗体包含以下中任一项：(1)包含SEQ ID NO:33或34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:41-43中任一个的氨基酸序列的轻链；(2)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:44或49的氨基酸序列的轻链；(3)包含SEQ ID NO:36或37的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:45或46的氨基酸序列的轻链；(4)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链和包含SEQ IDNO:41-43中任一个的氨基酸序列的轻链；(5)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链；或(6)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链。在一些实施例中，抗Ang2全长抗体包含以下中任一项：(1)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链；(2)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:41-43中任一个的氨基酸序列的轻链；(3)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链；(4)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的轻链；(5)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链；(6)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链；(7)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链；或(8)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链。在一些实施例中，抗Ang2全长抗体是单特异性的。在一些实施例中，抗Ang2全长抗体是双特异性的。在一些实施例中，VEGFR组分通过任选的接头融合至抗Ang2全长抗体的重链的N末端。在一些实施例中，重链融合多肽包含SEQ ID NO:56-61、75和79中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体融合蛋白包含以下中任一项：(1)包含SEQ ID NO:56或58的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链；(2)包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:41或42的氨基酸序列的轻链；(3)包含SEQ IDNO:59的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链；(4)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的轻链；(5)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链；(6)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链；或(7)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链。在一些实施例中，抗体融合蛋白包含第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中该第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至抗Ang2全长抗体的第一重链的N末端，并且其中该第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至抗Ang2全长抗体的第二重链的N末端。在一些实施例中，两个重链融合多肽相同。在一些实施例中，VEGFR组分通过任选的接头融合至抗Ang2全长抗体的重链的C末端。在一些实施例中，重链融合多肽包含SEQ ID NO:50-55、74和78中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体融合蛋白包含以下中任一项：(1)包含SEQ ID NO:50或52的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链；(2)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:41或42的氨基酸序列的轻链；(3)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ IDNO:45的氨基酸序列的轻链；(4)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的轻链；(5)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链；(6)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链；或(7)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链。在一些实施例中，抗体融合蛋白包含第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中该第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至抗Ang2全长抗体的第一重链的C末端，并且其中该第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至抗Ang2全长抗体的第二重链的C末端。在一些实施例中，两个重链融合多肽相同。在一些实施例中，VEGFR组分通过任选的接头融合至抗Ang2全长抗体的轻链的N末端。在一些实施例中，轻链融合多肽包含SEQ ID NO:67-71、73、77和81中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体融合蛋白包含以下中任一项：(1)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链融合多肽；(2)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:67、68和77中任一个的氨基酸序列的轻链融合多肽；(3)包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链融合多肽；(4)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链融合多肽；(5)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链融合多肽；(6)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的轻链融合多肽；(7)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链融合多肽；或(8)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的轻链融合多肽。在一些实施例中，抗体融合蛋白包含第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中该第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至抗Ang2全长抗体的第一轻链的N末端，并且其中该第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至抗Ang2全长抗体的第二轻链的N末端。在一些实施例中，两个轻链融合多肽相同。在一些实施例中，VEGFR组分通过任选的接头融合至抗Ang2全长抗体的轻链的C末端。在一些实施例中，轻链融合多肽包含SEQID NO:62-66、72、76和80中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体融合蛋白包含以下中任一项：(1)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链融合多肽；(2)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:62、63和76中任一个的氨基酸序列的轻链融合多肽；(3)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的轻链融合多肽；(4)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的轻链融合多肽；(5)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的轻链融合多肽；(6)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的轻链融合多肽；(7)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链融合多肽；或(8)包含SEQID NO:40的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的轻链融合多肽。在一些实施例中，抗体融合蛋白包含第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中该第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至抗Ang2全长抗体的第一轻链的C末端，并且其中该第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至抗Ang2全长抗体的第二轻链的C末端。在一些实施例中，两个轻链融合多肽相同。在一些实施例中，抗体融合蛋白包含四个VEGFR组分，其中抗体融合蛋白包含以下中任一项：(1)其中第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至抗Ang2全长抗体的第一重链的N末端，其中第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至抗Ang2全长抗体的第二重链的N末端，其中第三VEGFR组分通过任选的第三接头融合至抗Ang2全长抗体的第一轻链的N末端，并且其中第四VEGFR组分通过任选的第四接头融合至抗Ang2全长抗体的第二轻链的N末端；(2)其中第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至抗Ang2全长抗体的第一重链的C末端，其中第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至抗Ang2全长抗体的第二重链的C末端，其中第三VEGFR组分通过任选的第三接头融合至抗Ang2全长抗体的第一轻链的C末端，并且其中第四VEGFR组分通过任选的第四接头融合至抗Ang2全长抗体的第二轻链的C末端；(3)其中第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至抗Ang2全长抗体的第一重链的N末端，其中第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至抗Ang2全长抗体的第二重链的N末端，其中第三VEGFR组分通过任选的第三接头融合至抗Ang2全长抗体的第一重链的C末端，并且其中第四VEGFR组分通过任选的第四接头融合至抗Ang2全长抗体的第二重链的C末端；(4)其中第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至抗Ang2全长抗体的第一重链的C末端，其中第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至抗Ang2全长抗体的第二重链的C末端，其中第三VEGFR组分通过任选的第三接头融合至抗Ang2全长抗体的第一轻链的N末端，并且其中第四VEGFR组分通过任选的第四接头融合至抗Ang2全长抗体的第二轻链的N末端；(5)其中第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至抗Ang2全长抗体的第一重链的N末端，其中第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至抗Ang2全长抗体的第二重链的N末端，其中第三VEGFR组分通过任选的第三接头融合至抗Ang2全长抗体的第一轻链的C末端，并且其中第四VEGFR组分通过任选的第四接头融合至抗Ang2全长抗体的第二轻链的C末端；或(6)其中第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至抗Ang2全长抗体的第一轻链的N末端，其中第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至抗Ang2全长抗体的第二轻链的N末端，其中第三VEGFR组分通过任选的第三接头融合至抗Ang2全长抗体的第一轻链的C末端，并且其中第四VEGFR组分通过任选的第四接头融合至抗Ang2全长抗体的第二轻链的C末端。在一些实施例中，第一、第二、第三和第四接头各自包含独立地选自SEQ ID NO:30或31的氨基酸序列。在一些实施例中，第一和第二VEGFR组分相同。在一些实施例中，第三和第四VEGFR组分相同。在一些实施例中，四个VEGFR组分相同。在一些实施例中，至少一个VEGFR组分不同于其他组分。
进一步提供了编码本文所述的任何一种抗体融合蛋白的分离的核酸、包含此类核酸的载体、包含此类核酸或载体的宿主细胞(例如，CHO细胞)以及产生本文所述的任何一种抗体融合蛋白的方法。
还提供了包含本文所述的任何一种抗体融合蛋白的组合物(例如，药物组合物)、套件(试剂盒)和制品。还提供了使用有效量的本文所述的任何一种抗体融合蛋白或组合物(例如，药物组合物)治疗个体的疾病或障碍(例如，癌症或非肿瘤性障碍，如类风湿性关节炎、银屑病、动脉粥样硬化、血管瘤、移植排斥、慢性炎症、感染或眼部新生血管障碍(例如，AMD、糖尿病性视网膜病变))的方法。
附图说明
图1显示了示例性抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白(双特异性抗体融合蛋白，“BsFp”)对Tie2信号传导激活的影响，如通过体外磷酸化-Akt生物测定法测量的。抗Ang2抗体hABTAA用作阳性对照。空孔(“空白”)和仅Ang2蛋白用作阴性对照。
图2显示了示例性抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白(BsFp)对VEGF中和作用的影响，如通过Bio-GloTM萤光素酶报告基因测定法所测量的。抗VEGF抗体用作阳性对照。空孔(“空白”)和仅VEGF蛋白(“VEGF165”)用作阴性对照。
图3显示了示例性抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白(BsFp)对Tie2信号传导激活的影响，如通过体外磷酸化-Akt生物测定法以剂量依赖性曲线所测量的。抗Ang2抗体hABTAA用作阳性对照。
图4显示了示例性抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白(BsFp)对VEGF中和作用的影响，如通过Bio-GloTM萤光素酶报告基因测定法以剂量依赖性曲线所测量的。亲本VEGF-trap阿柏西普用作阳性对照。
图5描绘了用于构建各种示例性抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白的VEGF-trap和示例性亲本二价抗Ang2抗体(mAb)。
图6A-6J描绘了示例性抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白。VEGF-trap可以相同或不同。亲本二价抗Ang2抗体可以是单特异性或双特异性的。VEGF-trap可以直接或通过接头(例如，肽接头)与亲本二价抗Ang2抗体的多肽融合。
图7A-7C描绘了基于以下修改的在存在或不存在抗Ang2抗体的情况下的Ang1/Ang2/Tie2信号传导模型：S.Han等人(Sci Transl Med.2016；8(335):335ra55)。图7A描绘了当Ang2与Ang1竞争结合Tie2受体时没有Tie2信号传导。图7B描绘了在Ang2被抗Ang2拮抗剂抗体(例如，ABA)阻断后，Tie2受体聚簇和在Ang1结合后的激活。图7C描绘了在被抗Ang2激动剂抗体(例如，ABTAA)结合后的Ang2聚簇，以及抗体结合-聚簇的Ang2触发Tie2受体聚簇和激活。
具体实施方式
维持内皮屏障功能对于血管正常化至关重要，其功能障碍将导致几种癌症和非肿瘤性疾病。VEGF一直是抗血管生成疗法中应用最广泛的靶点。然而，对于视网膜血管疾病的治疗，抗VEGF治疗仍不能阻止许多患者发展为法定失明。Tie2是内皮细胞特异性RTK，由Ang1和Ang2进行相反调节。Ang1作为Tie2激动剂导致其磷酸化诱导各种保护性下游途径，从而诱导血管内皮细胞的稳定并通过加速血管内皮细胞的连接完整性来降低血管通透性。通过与Ang1竞争作为拮抗剂(图7A)或转化为有效的Tie2激活剂，Ang2是Tie2的内源性、背景特异性拮抗剂/激动剂。在没有Ang1的情况下，高浓度使用的Ang2充当Tie2的弱激动剂。目前，大多数Ang2靶向性药物(例如，抗Ang2拮抗剂抗体，如ABA)只是阻断Ang2与Tie2的结合(图7B)，这消除了Ang2作为Tie2激动剂的重要功能。此外，在脓毒症等几种疾病或感染的情况下，Ang2表达增加，而Ang1和Tie2表达下降，因此简单地阻断Ang2-Tie2相互作用无法维持血管正常化。此外，Ang2促进VEGF的促血管生成作用，VEGF上调内皮细胞中Ang2的表达，因此仅靶向VEGF或Ang2是不够的。
本发明提供抗体融合蛋白，其包含：i)多价(例如，二价)抗Ang2抗体或其抗原结合片段，和ii)VEGFR组分，其中该多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段不抑制Ang2和TIE2之间的结合。这些抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白虽然融合了大的部分(VEGFR组分为约23kDa)，但仍能保持分别与亲本VEGF-trap(例如，阿柏西普)和抗Ang2激动剂抗体(例如，ABTAA)类似的对VEGF和Ang2的高结合亲和力以及对应的生物活性(例如，阻断VEGF/VEGFR信号传导、通过Ang2触发Tie2信号传导激活)。
此外，通过使用抗Ang2激动剂抗体或其抗原结合片段作为抗体融合蛋白骨架(该激动剂抗体不像抗Ang2拮抗剂抗体那样抑制Ang2和Tie2之间的结合)，本文所述的抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白可以将Ang2转化为Tie2的激动剂，这在疾病治疗中比阻断Ang2-Tie2相互作用更有效，尤其是在Ang2表达增加而Ang1和Tie2表达下降的疾病病症中。本文中用作抗体融合蛋白骨架的多价(例如，二价)抗Ang2激动剂抗体(诸如全长抗体)或其抗原结合片段特异性结合至Ang2并触发Ang2聚簇，从而组装抗体/Ang2复合物，该复合物随后可以结合、触发Tie2聚簇并激活Tie2(图7C)，从而增强内皮屏障、保护内皮糖萼、减少血管渗漏并减少炎症(S.Han等人,Sci Transl Med.2016；8(335):335ra55)。
此外，本文所述的抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白的针对VEGF和Ang2的双重靶向活性可通过在不与目的靶细胞(例如表达VEGF、Ang2和/或Tie2的癌细胞或组织)结合的情况下减少不期望的活性来增加VEGFR组分和/或多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段的细胞特异性。此特征将特别有助于选择性地掩蔽或减少抗体融合蛋白的细胞毒性/过度激活/过度抑制，从而保护非靶细胞或正常细胞免受不想要的作用或毒性作用，同时仅使靶细胞(例如表达VEGF、Ang2和/或Tie2的癌细胞或组织)暴露于毒性作用。与未融合在一起形成抗体融合蛋白时相比，抗体融合蛋白还可以稳定/增强VEGFR组分对VEGF二聚体的结合，和/或稳定/增强多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段对Ang2的结合。本文所述的抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白的针对VEGF和Ang2的双重靶向活性可以提供比单独靶向任一途径更有效的协同效应，并且可以克服单一药物(例如，单独的抗VEGF抗体或VEGF-trap，或单独的抗Ang2抗体)的耐药性，这显示出有前景的治疗功效。
还提供了包含抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白的组合物(诸如药物组合物)、套件和制品、其制备方法，以及使用这些抗体融合蛋白治疗疾病(例如，癌症、非肿瘤性障碍，诸如眼部新生血管障碍)的方法。
I.定义
如本文所用，当结合结构域(例如，抗体、抗原结合片段或诸如VEGFR等受体)被称为靶分子(例如，诸如Ang2等抗原，或诸如VEGF等配体)的“拮抗剂”时，这意味着在靶分子结合后，结合结构域阻断、阻抑或降低(例如，降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者)靶分子的生物活性(例如，阻断受体信号传导)。例如，抗Ang2拮抗剂抗体是减少或阻断Ang2与其受体Tie2结合的抗体，例如Ang2阻断性抗体(“ABA”)。例如，VEGF-trap是VEGF的拮抗剂，因为它阻断或减少VEGF结合和激活细胞表面的VEGFR。当结合结构域(例如，抗体、抗原结合片段或配体/受体)被称为靶分子(例如，诸如Ang2等抗原，或受体/配体)的“激动剂”时，这意味着在靶分子结合后，结合结构域刺激、激活或增强(例如，增强至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多中的任一者)靶分子的生物活性(例如，激活受体信号传导)。例如，抗Ang2激动剂抗体是一种激活或增强Ang2/Tie2信号传导的抗体，诸如Ang2结合和Tie2激动剂抗体(“ABTAA”)，其在与Ang2结合后触发Ang2聚簇，从而导致Tie2受体的聚簇和激活。
如本文所用，“血管生成”、“血管生成的”或“新血管形成”是指新血管的形成、生长和/或发育。
如本文所用，术语“新生血管障碍”是指除伴随着致癌或肿瘤性转化的障碍(即，癌症)之外，以血管生成改变或失调为特征的障碍。新生血管障碍的实例包括银屑病、类风湿性关节炎和眼部新生血管障碍，例如糖尿病性视网膜病变和年龄相关性黄斑变性(AMD)。
本文所用的术语“眼部新生血管障碍”是指以患者眼中的血管发生改变或失调为特征的障碍。示例性眼部新生血管障碍包括视盘新血管形成、虹膜新血管形成管、视网膜新血管形成(RNV)、脉络膜新血管形成(CNV)、角膜新血管形成、玻璃体新血管形成、青光眼、血管翳、翼状胬肉、黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、黄斑变性和相关病症(例如AMD)、血管性视网膜病变、视网膜变性、葡萄膜炎、视网膜炎性疾病和增生性玻璃体视网膜病变。
“黄斑变性相关病症”是指其中黄斑变性或失去功能活性的多种障碍和病症中的任何一种。变性或失去功能活性可作为例如细胞死亡、细胞增殖减少和/或正常生物学功能丧失的结果发生。黄斑变性可导致和/或表现为黄斑的细胞和/或胞外基质结构完整性的改变、正常细胞和/或胞外基质结构的改变、和/或黄斑细胞功能的丧失。细胞可以是通常存在于黄斑中或黄斑附近的任何细胞类型，包括RPE细胞、感光细胞和/或毛细血管内皮细胞。AMD是主要的黄斑变性相关病症。其他包括贝斯特黄斑营养不良(Best maculardystrophy)、索斯比眼底营养不良(Sorsby Fundus Dystrophy)、Mallatia Leventinese和多恩蜂窝状视网膜营养不良(Doyne honeycomb retinal dystrophy)。
术语“血管生成抑制剂”、“抗血管生成剂”和“抗血管生成疗法”在本文中可互换使用，以指代能够抑制或减少与血管生成相关的一个或多个过程(包括但不限于内皮细胞增殖、内皮细胞存活、内皮细胞迁移、前体细胞分化为内皮细胞以及毛细管形成)的药剂/疗法。
如本文所用，“治疗(treatment或treating)”是用于获得有益的或所希望的结果(包括临床结果)的方法。出于本发明的目的，有益的或所希望的临床结果包括但不限于以下中的一种或多种：缓解由疾病引起的一种或多种症状、减少疾病的程度、稳定疾病(例如，预防或延迟疾病的恶化)、预防或延迟疾病的传播(例如，转移)、预防或延迟疾病的复发、延迟或减缓疾病的进展、改善疾病状态、提供疾病的缓解(部分或全部)、减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量、延迟疾病的进展、增加生活质量和/或延长存活。“治疗”还涵盖减少疾病的病理结果。本发明的方法考虑了这些治疗方面中的任何一个或多个。
术语“预防(prevent)”和诸如“预防的(prevented)”、“进行预防(preventing)”等类似词语表示一种预防、抑制或降低疾病或病症(例如，癌症，新生血管障碍(如眼部新生血管障碍))复发可能性的方法。它还指延迟疾病或病症的复发或延迟疾病或病症的症状的复发。如本文所用，“预防”和类似词语还包括在疾病或病症复发之前降低该疾病或病症的强度、影响、症状和/或负担。
如本文所用，“延迟”癌症或新生血管障碍(例如眼部新生血管障碍)的发展是指推迟、阻碍、减缓、减慢、稳定、抑制和/或延缓疾病的发展。该延迟可以具有不同的时间长度，其取决于疾病的历史和/或被治疗的个体。“延迟”癌症或新生血管障碍(诸如眼部新生血管障碍)发展的方法是这样一种方法，与不使用该方法相比，其在给定时间范围内降低疾病发展的概率和/或在给定时间范围内降低疾病的程度。这种比较通常基于使用统计上显著数量的个体的临床研究。可以使用标准方法检测癌症的发展，包括但不限于计算机轴向断层扫描(CAT扫描)、磁共振成像(MRI)、腹部超声、凝血试验、动脉造影或活组织检查。发展还可以指癌症或新生血管障碍(例如眼部新生血管障碍)的最初可能无法检测到的进展，包括发生、复发和发作。
本文所用的术语“有效量”是指足以治疗指定的病症、病状或疾病，诸如改善、缓和、减轻和/或延迟其一种或多种症状的药剂或药剂组合的量。关于癌症，有效量包括足以使肿瘤缩小和/或降低肿瘤生长速率(诸如阻抑肿瘤生长)或预防或延迟其他不必要的细胞增殖的量。在一些实施例中，有效量是足以延迟发展的量。在一些实施例中，有效量是足以预防或延迟复发的量。有效量可以分一次或多次施用来施用。有效量的药物或组合物可实现以下中一项或多项：(i)减少癌细胞的数目；(ii)减小肿瘤大小；(iii)在一定程度上抑制、延迟、减缓并且优选地终止癌细胞浸润到周围器官中；(iv)抑制(即，在一定程度上减缓并且优选地终止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤的发生和/或复发；(vii)在某种程度上缓解与癌症有关的一种或多种症状；和(viii)刺激或激活免疫细胞(例如，免疫效应细胞)，例如用于免疫应答，例如产生一种或多种细胞因子，或用于免疫细胞增殖和/或分化。关于眼部新生血管障碍，有效量包括足以治疗、阻抑、延迟和/或预防新生血管障碍或其症状的量，例如足以实现以下中一项或多项的量：(i)抑制或预防玻璃膜疣的形成；(ii)导致玻璃膜疣数量和/或大小减小(玻璃膜疣消退)；(iii)减少或预防脂褐素沉积；(iv)抑制或预防视力丧失或减缓视力丧失的速度；(v)抑制脉络膜新血管形成或减缓脉络膜新血管形成速率；(vi)引起以脉络膜新血管形成为特征的病变的大小和/或数量减小；(vii)抑制脉络膜新血管形成或减缓视网膜新血管形成速率；(viii)引起以视网膜新血管形成为特征的病变的大小和/或数量减小；(ix)改善视力和/或对比敏感度；(x)减少黄斑水肿和/或减少异常黄斑厚度；(xi)抑制或预防感光细胞或RPE细胞萎缩或凋亡，或降低感光细胞或RPE细胞萎缩或凋亡的速率；以及(xii)抑制或预防非渗出性黄斑变性向渗出性黄斑变性的进展。
如本文所用，“个体”或“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于人、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类。在一些实施例中，个体是人。
术语“抗体”以其最广泛的含义使用，并且涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、全长抗体和其抗原结合片段，只要它们表现出所希望的抗原结合活性即可。术语“抗体”包括常规的4链抗体、单域抗体及其抗原结合片段。
基本的4链抗体单元是由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本的异四聚体单元连同称为J链的附加多肽组成，并且含有10个抗原结合位点，而IgA抗体包含2-5个基本的4链单元，这些单元可以聚合形成与J链组合的多价装配体。在IgG的情况下，4-链单元通常为约150,000道尔顿。每个L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两个H链根据H链同种型通过一个或多个二硫键彼此连接。每个H链和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。每个H链在N端具有可变结构域(VH)，后面是三个恒定结构域CH(对于α链和γ链中的每个链而言)和四个CH结构域(对于μ同种型和ε同种型)。每个L链在N端具有可变结构域(VL)，后面是在其另一末端的恒定结构域。VL与VH对齐并且CL与重链第一恒定区(CH1)对齐。据信特定的氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成界面。VH和VL配对在一起形成单个抗原结合位点。关于不同类别的抗体的结构和特性，参见例如Basicand Clinical Immunology,第8版,Daniel P.Sties,Abba I.Terr和Tristram G.Parsolw(编),Appleton&Lange,Norwalk,Conn.,1994,第71页和第6章。来自任何脊椎动物物种的L链基于其恒定结构域的氨基酸序列可以指定为两种明显不同的类型之一，称为κ和λ。根据重链恒定区(CH)的氨基酸序列，免疫球蛋白可指定为不同的类别或同种型。存在五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，它们分别具有指定为α、δ、ε、γ和μ的重链。基于CH序列和功能中相对较小的差异将γ和α类进一步分成亚类，例如人表达以下亚类：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。可以分别将重链和轻链的可变结构域称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体最易变的部分(相对于相同类别的其他抗体)并且含有抗原结合位点。骆驼科物种的仅有重链的抗体具有单个重链可变区，称为“VHH”。因此，VHH是VH的特殊类型。
术语“可变”是指抗体中可变结构域的某些区段在序列上广泛不同的事实。V结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性不是均匀地分布在可变结构域的整个跨度上。相反，它集中在重链和轻链可变结构域中称为互补决定区(CDR)或超变区(HVR)的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，主要采取β-折叠构型，由三个CDR连接，形成连接β-折叠结构，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分的环。每个链中的CDR通过FR区紧密靠近地结合在一起，并且与来自另一个链的CDR一起有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,Sequences of Immunological Interest,第五版,National Instituteof Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域不直接牵涉于抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即包含该群体的各个抗体是相同的，除了可能少量存在的可能自然发生的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)。单克隆抗体具有针对单抗原位点的高度特异性。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除其特异性之外，单克隆抗体的优势在于其是通过杂交瘤培养物合成的，未被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体中获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产抗体。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“全抗体”可互换用于指基本上完整形式的抗体，与抗体片段相反。具体地，全长4-链抗体包括具有包括Fc区的重链和轻链的那些抗体。仅有全长重链的抗体包括重链可变结构域(诸如VHH)和Fc区。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下，完整抗体可具有一种或多种效应子功能。
“抗体片段”、“抗原结合结构域”或“抗原结合片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双链抗体；线性抗体(参见，美国专利号5,641,870实施例2；Zapata等人,ProteinEng.8(10):1057-1062(1995))；单链抗体(scFv)分子；单域抗体(诸如VHH)和由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段)和残留“Fc”片段，该名称反映了容易结晶的能力。Fab片段由整个L链连同H链的可变结构域(VH)和一个重链的第一恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段就抗原结合而言是单价的，即它具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体得到单个大的F(ab′)2片段，该片段大致对应于具有不同抗原结合活性的两个二硫键连接的Fab片段并且仍能够交联抗原。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基端具有几个附加残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对于Fab′的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基团。F(ab′)2抗体片段最初作为在它们之间具有铰链半胱氨酸的Fab′片段对产生。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
术语“恒定结构域”是指免疫球蛋白分子的一部分，该免疫球蛋白分子的一部分相对于免疫球蛋白的另一部分，即可变结构域，具有更保守的氨基酸序列，该氨基酸序列含有抗原结合位点。恒定结构域含有重链的CH1、CH2和CH3结构域(统称为CH)和轻链的CHL(或CL)结构域。
抗体(免疫球蛋白)的“重链”可分为三个功能区：Fd区、铰链区和Fc区(片段可结晶)。Fd区包含VH和CH1结构域，并与轻链组合形成Fab—抗原结合片段。Fc片段负责免疫球蛋白效应子功能，包括例如补体固定和与效应细胞的同源Fc受体结合。在IgG、IgA和IgD免疫球蛋白类别中发现的铰链区充当柔性的间隔子，其允许Fab部分相对于Fc区在空间中自由移动。与恒定区相反，铰链结构域在结构上是多样的，序列和长度在免疫球蛋白类别和亚类之间变化。对于只有重链的抗体，“重链”包括重链可变结构域(例如VHH)、铰链区和Fc区。
任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”都可以根据其恒定结构域的氨基酸序列指定为两种明显不同的类型之一，分别称为kappa(“κ”)和lambda(“λ”)。
“Fv”是含有完全的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。这两个结构域的折叠产生六个高变环(H链和L链中各3个环)，高变环为抗原结合提供氨基酸残基并赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或仅包含对抗原具有特异性的三个CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，但是比整个结合位点的亲和力更低。
“单链Fv”(也缩写为“sFv”或“scFv”)是包含连接到单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，scFv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，该多肽接头使得scFv形成所希望的用于抗原结合的结构。关于scFv的综述，参见Pluckthun于ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
术语“双链抗体”是指通过以下方式制备的小抗体片段：构建在VH结构域和VL结构域之间具有短接头(约5-10个残基)的sFv片段(见前一段落)，以便实现V结构域的链间配对而非链内配对，由此产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双链抗体是两个“交叉”sFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH结构域和VL结构域存在于不同的多肽链上。
本文的单克隆抗体具体地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而该链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们表现出所希望的生物活性。“人源化抗体”用作“嵌合抗体”的子集。
非人(例如，美洲驼或骆驼)抗体的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一些实施例中，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者CDR(下文定义)的残基被来自非人物种(诸如小鼠、大鼠、兔、骆驼、美洲驼、羊驼或非人灵长类)的具有所希望的特异性、亲和力和容量的CDR(供体抗体)的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架(“FR”)残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含未在受者抗体中或供体抗体中发现的残基。可以进行这些修饰以进一步改进抗体性能，诸如结合亲和力。一般来说，人源化抗体将包含至少一个且典型地两个可变结构域的基本上全部，其中高变环全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白序列的那些，并且FR区全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的那些，但是FR区可以包括一个或多个单独的FR残基取代，这些取代改善抗体性能，诸如结合亲和力、异构化、免疫原性等。FR中这些氨基酸取代的数目典型地在H链中不超过6个，并且在L链中不超过3个。人源化抗体还将任选地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的至少一部分。
“人抗体”是这样一种抗体，其具有对应于由人类产生的抗体的氨基酸序列和/或已经使用如本文披露的任何用于制造人抗体的技术来产生。人抗体的此定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术(包括噬菌体展示文库)产生人抗体。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。也可用于制备人单克隆抗体的是在Cole等人,MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985)；Boerner等人,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)。另请参见van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)。人抗体可以通过将抗原施用至已被修饰以响应抗原攻击而产生此类抗体但其内源基因座已失效的转基因动物(例如，已免疫的异种小鼠(xenomice))来制备(参见例如有关XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584)。有关经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体，还参见例如Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。
当在本文中使用时，术语“高变区”、“HVR”或“HV”是指在序列上高变和/或形成结构上限定的环的抗体可变结构域的区域。通常，单域抗体包含三个HVR(或CDR)：HVR1(或CDR1)、HVR2(或CDR2)和HVR3(或CDR3)。HVR3(或CDR3)展示了三个HVR的最大多样性，并且据信在赋予抗体精细特异性中起到独特作用。参见，例如，Hamers-Casterman等人,Nature363:446-448(1993)；Sheriff等人,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。
许多HVR描绘在使用并且涵盖在本文中。Kabat互补决定区(CDR)基于序列可变性并且是最常用的(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR表示Kabat HVR和Chothia结构环之间的折中，并且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。“接触”HVR基于对可用的复杂晶体结构的分析。这些HVR中的每一个的残基在下表A中指出。HVR可以包含如下“扩展HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)以及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一种定义，可变区残基根据上文Kabat等人进行编号。除非本文另外指示，否则免疫球蛋白重链中的残基编号是如上文Kabat等人所述的EU索引的编号。“如Kabat所述的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。
表A.HVR描绘。
术语“表位”是指能够特异性结合至结合结构域(例如，抗体、抗原结合片段或受体)的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团诸如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于在变性溶剂的存在下丧失与前者而不是后者的结合。
如本文所用，术语“特异性结合”、“特异性识别”或“对...具有特异性”是指靶分子(例如，配体)和结合结构域(例如，抗体、抗原结合片段、诸如VEGFR组分等受体)之间可测量和可再现的相互作用，诸如结合，这在存在分子(包括生物分子)的异质群体的情况下确定靶分子是否存在。例如，特异性结合靶点(其可以是表位)的结合结构域(例如，抗原结合片段或受体)是相比于其结合其他靶点，结合此靶点时具有更大亲和力、亲合力、更容易和/或持续时间更长的结合结构域。在一些实施例中，结合结构域(例如，抗原结合片段或受体)与不相关的靶分子(例如，不相关的抗原或配体)的结合程度小于该结合结构域与靶分子的结合程度的约10％，如例如通过放射免疫测定法(RIA)所测量的。在一些实施例中，特异性结合靶点(或特异性结合VEGF的VEGFR组分)的结合结构域(例如，抗体、抗原结合片段、受体)具有≤10-5M、≤10-6M、≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、≤10-11M或≤10-12M的解离常数(KD)。在一些实施例中，结合结构域特异性结合蛋白质(例如，抗原、配体)上的表位，该表位在不同物种的蛋白质中是保守的。在一些实施例中，特异性结合可以包括但不要求排他结合。结合结构域的结合特异性可以通过本领域已知的任何蛋白质结合方法通过实验确定。这类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、BIACORETM-检验和肽扫描。
术语“特异性”是指抗原结合蛋白(例如，抗体、抗原结合片段、抗体融合蛋白、受体如VEGFR组分)对靶分子的特定表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。如本文所用，术语“多特异性”指代抗原结合蛋白(例如，抗体、抗体融合蛋白)具有多表位特异性(即，能够与一个生物分子上的两个、三个或更多个不同表位特异性结合或能够与两个、三个或更多个不同生物分子上的表位特异性结合)。如本文所用，“双特异性”指代抗原结合蛋白具有两种不同的抗原结合特异性。除非另外指示，双特异性抗体或抗体融合蛋白所结合的抗原的顺序是任意的。即，例如，术语“抗-Ang2/VEGF-trap”和“VEGF-trap/抗-Ang2”可互换使用以指特异性同时结合Ang2和VEGF的双特异性抗体融合蛋白。如本文所用，术语“单特异性”指代具有一个或多个结合位点的抗原结合蛋白，每个结合位点结合相同抗原的相同表位。
如本文所用，术语“价”指代抗原结合蛋白中存在指定数目的结合位点。例如天然抗体或全长抗体具有两个结合位点，是二价的。因此，术语“三价”、“四价”、“五价”和“六价”分别指代在抗原结合蛋白中存在两个结合位点、三个结合位点、四个结合位点、五个结合位点和六个结合位点。“多价”可以是二价、三价、四价或更多。
“抗体效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性并且随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；和B细胞活化。“降低或最小化的”抗体效应子功能意指与野生型或未修饰的抗体相比降低至少50％(或者60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)的抗体效应子功能。抗体效应子功能的确定可由本领域普通技术人员容易地确定和测量。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或ADCC是指一种细胞毒性形式，其中结合到某些细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够与带有抗原的靶细胞特异性结合并随后用细胞毒素杀伤靶细胞。抗体“装甲(arm)”细胞毒性细胞并且是通过这种机制杀伤靶细胞所需的。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指靶细胞在补体存在下的裂解。经典补体途径的活化是由补体系统的第一组分(C1q)与结合至其同源抗原的抗体(适当亚类)的结合启动的。具有改变的Fc区氨基酸序列和增加或降低的C1q结合能力的抗体变体描述于美国专利号6,194,551B1和WO 99/51642中。那些专利出版物的内容明确地通过援引并入本文。还参见，Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
本文中的术语“Fc区”、“片段可结晶区”、“Fc片段”或“Fc结构域”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以变化，但是通常将人IgG重链的Fc区定义为从Cys226位置处的氨基酸残基或从Pro230至其羧基端的链段。可以例如抗体或Fc融合蛋白的生产或纯化期间或通过对编码抗体或Fc融合蛋白重链的核酸进行重组工程化来去除Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)。因此，完整抗体的组合物可以包含去除了所有K447残基的抗体群体，没有去除K447残基的抗体群体以及具有带有和不带有K447残基的抗体混合物的抗体群体。适合使用的天然序列Fc区包括但不限于人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
如本文所用，术语IgG“同种型”或“亚类”是指由其恒定区的化学和抗原特征定义的免疫球蛋白的任何亚类。免疫球蛋白主要分为五类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、γ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的，并在以下文献中进行一般描述：例如，Abbas等人.Cellular andMol.Immunology,第4版.(W.B.Saunders,Co.,2000)。
“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体或Fc融合蛋白的Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体(γ受体)并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体的FcR，包括等位基因变体和可替代地这些受体的剪接形式，FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，主要区别在于其胞内结构域。活化受体FcγRIIA在其胞内结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞内结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。本文的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括将来鉴定的FcR。
术语“Fc受体”或“FcR”还包括负责将母体IgG转运至胎儿的新生儿受体FcRn。测量与FcRn的结合的方法是已知的(参见，例如，Ghetie和Ward,Immunol.Today 18:(12):592-8(1997)；Ghetie等人,Nature Biotechnology 15(7):637-40(1997)；Hinton等人,J.Biol.Chem.279(8):6213-6(2004)；WO 2004/92219(Hinton等人))。可以测定人FcRn高亲和力结合多肽在体内与FcRn的结合和血清半衰期，例如在表达人FcRn的转基因小鼠或转染的人细胞系中，或在施用具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中。WO 2004/42072(Presta)描述了改善或减弱与FcR结合的抗体变体。另请参见例如Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
“结合亲和力”总体上是指分子(例如，抗体，抗原结合片段，VEGFR)的单个结合位点与其结合配偶体(partner)(例如，抗原，VEGF)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指示，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。结合亲和力可用Kd、Koff、Kon或Ka指示。如本文所用，术语“Koff”旨在指分子与其结合配偶体解离的解离速率常数，如由动力学选择设置确定的，以单位s-1表示。如本文所用，术语“Kon”旨在指分子与其结合配偶体结合以形成分子/结合配偶体复合物的缔合速率常数，以单位M-1s-1表示。如本文所用，术语平衡解离常数“KD”或“Kd”是指特定分子-结合配偶体相互作用的解离常数，并且描述了在平衡状态下占据结合配偶体溶液中存在的所有结合配偶体的一半所需的分子浓度，并且等于Koff/Kon，以单位M表示。Kd的测量预先假定所有结合剂都处于溶液中。在抗体被拴系至细胞壁的情况下，例如在酵母表达系统中，相应的平衡速率常数表示为EC50，给出了Kd的良好近似值。亲和常数Ka是解离常数Kd的倒数，以单位M-1表示。解离常数(KD或Kd)用作显示结合配偶体对分子的亲和力的指标。例如，通过Scatchard方法，使用以各种标记剂标记的抗体，以及通过使用作为非处方测量套件的BiacoreX(由Amersham Biosciences制造)或类似套件，根据附于套件的用户手册和实验操作方法，可以容易地进行分析。使用这些方法可以得到的KD值以单位M(摩尔)表示。特异性结合靶点的抗体或其抗原结合片段(或本文所述的特异性结合VEGF的VEGFR组分)可以具有例如≤10-5M、≤10-6M、≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、≤10-11M或≤10-12M的解离常数(Kd)。
半数最大抑制浓度(IC50)是物质(例如抗体、抗原结合片段或VEGFR)抑制特定生物功能或生物化学功能的有效性的量度。它表明需要多少特定的药物或其他物质(抑制剂，诸如抗体、抗原结合片段或VEGFR)来抑制给定的生物过程，或过程的组分(即酶、细胞、细胞受体或微生物)减半。该值典型地表示为摩尔浓度。IC50与激动剂药物或其他物质(例如抗体、抗原结合片段)的EC50相当。EC50也表示在体内获得50％最大效应所需的血浆浓度。如本文所用，“IC50”用于表示在体外中和/降低50％的抗原生物活性所需的抗体或抗原结合片段的有效浓度(或中和/降低50％的VEGF生物活性所需的VEGFR组分的有效浓度)。IC50或EC50可以通过生物测定来测量，诸如通过FACS分析(竞争结合分析)、基于细胞的细胞因子释放测定、细胞信号传导测定(例如，Phospho-Akt)、萤光素酶报告基因表达测定或放大发光邻近均相测定(AlphaLISA)来测量对配体结合的抑制。对于示例性方法还参见实例1。
如本文所用，“共价键”是指共享一个或多个电子的两个原子之间的稳定键。共价键的实例包括但不限于肽键和二硫键。如本文所用，“肽键”是指氨基酸的羧基与相邻氨基酸的胺基之间形成的共价键。如本文所用，“二硫键”是指在两个硫原子之间形成的共价键，例如两个Fc片段通过一个或多个二硫键的组合。一个或多个二硫键可通过连接两个片段中的硫醇基团而在两个片段之间形成。在一些实施例中，一个或多个二硫键可在两个Fc片段的一个或多个半胱氨酸之间形成。二硫键可以通过两个硫醇基团的氧化形成。
将关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”定义为在比对序列并且在必要时引入空位以达到最大序列同一性百分比后，不考虑任何保守性取代作为序列同一性的一部分，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的，可以用本领域技术中的多种方式来实现比对，例如使用公众可得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括需要在被比较序列的全长范围实现最大比对的任何算法。
如本文所用，多肽的“C末端”是指多肽的最后一个氨基酸残基，其提供其胺基与其相邻氨基酸残基的羧基形成肽键。如本文所用，多肽的“N末端”是指多肽的第一个氨基酸，其提供其羧基以与其相邻氨基酸残基的胺基形成肽键。
编码构建体的“分离的”核酸分子是与在其生产环境中从通常与其相关联的至少一种污染物核酸分子中鉴定并分离的核酸分子。编码构建体的分离的核酸分子处于以下形式，该形式不同于其在自然界中发现的形式或环境，还包括存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置的核酸分子。
当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，该核酸是“可操作地连接的”。例如，如果将前序列或分泌性前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则该前序列或分泌性前导序列的DNA可操作地连接至该多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则该启动子或增强子可操作地连接至该序列；或者如果核糖体结合位点被定位以有助于翻译，则该核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是连续的，并且在分泌性前导序列的情形下是连续的并处于阅读相中。然而，增强子不必需是连续的。通过在方便的限制位点处连接来实现连接。如果不存在此类位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
如本文所用，术语“载体”是指能够繁殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及掺入宿主细胞(载体已引入其中)基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
如本文所用，术语“转染”或“转化”或“转导”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代目标细胞及其子代。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，包括原代转化细胞和由其衍生的子代，不考虑传代次数。子代的核酸含量可能与亲本细胞不完全相同，但可能含有突变。具有与在原始转化细胞中筛选或选择的功能或生物学活性相同的突变子代包括在本文中。
“生物相容性”是指材料在数量和使用位置上对接受者的细胞基本上无毒，并且不会在使用位置引起或造成对接受者身体的显著有害或不利影响，例如，不可接受的免疫学或炎症反应、不可接受的疤痕组织形成等。例如，与眼睛生物相容的材料基本上不会干扰眼睛的生理或功能。
“可生物蚀解”或“可生物降解”意指材料能够在细胞内或受试者体内被物理和/或化学分解，例如，通过生理条件下的水解和/或通过自然生物过程，诸如存在于细胞内或体内的酶的作用，和/或通过溶解、分散等过程，以形成较小的化学物质，这些物质通常可以被人体代谢和任选地使用，和/或被排出或以其他方式处置。优选地，可生物降解的化合物是生物相容的。其分子量由于单体数量的减少而在体内随时间降低的聚合物被认为是可生物降解的。
术语“药物组合物”的“药物配制品”是指制剂，该制剂的形式允许活性成分的生物活性有效，并且该制剂不含对将被施用该配制品的受试者具有不可接受的毒性的其他组分。此类配制品是无菌的。“无菌”配制品是经消毒的或无活的微生物及其孢子。
应当理解，本文所述的发明的实施例(例如“包含”实施例)包括“由实施例组成”和/或“基本上由实施例组成”。
本文对“约”值或参数的提及包括(并描述)针对该值或参数本身的变化。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所用，对“不是”值或参数的提及通常意指并描述“不同于”该值或参数。例如，方法不是用于治疗X型癌症，意味着该方法用于治疗不同于X型的癌症。
本文使用的术语“约X-Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。
当在本文和附带的权利要求中使用时，单数形式“一个/种(a)”、“或(or)”和“这些/该(the)”包括复数指代物，除非上下文明确地指示其他的情况。
II.包含多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段和VEGFR组分的抗体融合蛋白
本发明在一方面提供了一种抗体融合蛋白(“抗-Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白”)，其包含：i)多价(例如，二价)抗Ang2抗体(例如，全长抗体)或其抗原结合片段，和ii)VEGFR组分，其中该多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段不抑制Ang2和Tie2之间的结合。在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，和ii)VEGFR组分，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合。在一些实施例中，多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段在结合Ang2后通过抗体结合的Ang2激活Tie2信号传导。
在一些实施例中，VEGFR组分通过任选的接头(例如，SEQ ID NO:30或31)融合至多价(例如，二价)抗Ang2抗体(例如，全长抗体)或其抗原结合片段。在一些实施例中，抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白包含仅一个VEGFR组分。在一些实施例中，抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白包含两个或更多个(例如，2、3、4个或更多个)VEGFR组分。在一些实施例中，两个或更多个VEGFR组分通过一个或多个任选的接头(该接头可以与连接VEGFR组分和多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段的接头相同(例如，SEQ ID NO:30或31)或不同)串联融合，然后通过任选的接头(例如，SEQ ID NO:30或31)融合至多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段的每个抗Ang2结合结构域通过任选的接头与VEGFR组分融合。在一些实施例中，并非多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段的所有抗Ang2结合结构域都与VEGFR组分融合。在一些实施例中，VEGFR组分融合至连接两个或更多个抗Ang2结合结构域的多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段的连接部分(例如，Fc片段或其部分，诸如仅CH2或其部分、仅CH3或其部分或CH2-CH3或其部分，或白蛋白)。在一些实施例中，融合至多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段的两个或更多个VEGFR组分是相同的。在一些实施例中，融合至多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段的两个或更多个VEGFR组分彼此不同，诸如包含不同的Ig样结构域、不同数量的Ig样结构域和/或Ig样结构域的不同组织(N'到C'排列)。在一些实施例中，至少一个VEGFR组分不同于融合至多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段的其他VEGFR组分。在一些实施例中，每个VEGFR组分通过接头(例如，SEQ ID NO:30或31)融合至多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，并非所有VEGFR组分都通过接头融合至多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段(例如直接融合)。在一些实施例中，每个VEGFR组分在没有接头的情况下直接融合至多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，所有接头相同。在一些实施例中，至少一个接头不同于其他一个或多个接头。在一些实施例中，所有接头不同，例如包含不同的接头类型(例如，肽接头与化学接头)、不同的序列和/或不同的长度。
在一些实施例中，抗体融合蛋白仅包含一个VEGFR组分，并且通过VEGFR组分与VEGF二聚体的结合使两个抗体融合蛋白接近，即，每个抗体融合蛋白贡献VEGFR组分，以形成结合VEGF二聚体的VEGF-trap。在一些实施例中，这种设计使得Ang2能够进一步聚簇，以结合至“抗Ang2/VEGFR[VEGF二聚体]VEGFR/抗Ang2”复合物的抗Ang2结合结构域(例如，与包含两个或更多个VEGFR组分的抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白对Ang2的聚簇相比)，从而导致以下一项或多项：i)抗体结合的Ang2与Tie2的结合亲和力更强，ii)Tie2进一步聚簇，或iii)Tie2的激活更强。
在一些实施例中，多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段是全长抗体(“抗Ang2全长抗体”或“二价抗Ang2全长抗体”)。在一些实施例中，抗Ang2全长抗体是单特异性的。在一些实施例中，抗Ang2全长抗体是双特异性的。
在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含i)抗Ang2全长抗体，和ii)VEGFR组分(例如，SEQ ID NO:32)，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，并且其中该抗Ang2全长抗体包含以下中任一项：(1)i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1；ii)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR2；iii)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HC-CDR3；iv)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC-CDR1；v)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LC-CDR2；和vi)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的LC-CDR3；(2)i)包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列的HC-CDR1；ii)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HC-CDR2；iii)包含SEQID NO:13的氨基酸序列的HC-CDR3；iv)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC-CDR1；v)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR2；和vi)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LC-CDR3；(3)i)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HC-CDR1；ii)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR2；iii)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HC-CDR3；iv)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC-CDR1；v)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的LC-CDR2；和vi)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的LC-CDR3；(4)i)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HC-CDR1；ii)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR2；iii)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HC-CDR3；iv)包含SEQID NO:17的氨基酸序列的LC-CDR1；v)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LC-CDR2；和vi)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的LC-CDR3；(5)i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR1；ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR2；iii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HC-CDR3；iv)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR1；v)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的LC-CDR2；和vi)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的LC-CDR3；或(6)i)包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列的HC-CDR1；ii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HC-CDR2；iii)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HC-CDR3；iv)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC-CDR1；v)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的LC-CDR2；和vi)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含i)抗Ang2全长抗体，和ii)VEGFR组分(例如，SEQ ID NO:32)，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，并且其中该抗Ang2全长抗体包含以下中任一项：(1)包含SEQ ID NO:82或83的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:84-86中任一个的氨基酸序列的VL；(2)包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:88或98的氨基酸序列的VL；(3)包含SEQ ID NO:89或90的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:91或92的氨基酸序列的VL；(4)包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:84-86中任一个的氨基酸序列的VL；(5)包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VL；或(6)包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VL。在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含i)抗Ang2全长抗体，和ii)VEGFR组分(例如，SEQ ID NO:32)，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，并且其中该抗Ang2全长抗体包含以下中任一项：(1)包含SEQID NO:33或34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:41-43中任一个的氨基酸序列的轻链；(2)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:44或49的氨基酸序列的轻链；(3)包含SEQ ID NO:36或37的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:45或46的氨基酸序列的轻链；(4)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:41-43中任一个的氨基酸序列的轻链；(5)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链；或(6)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链。在一些实施例中，抗Ang2全长抗体在与Ang2结合后通过抗体结合的Ang2激活Tie2信号传导。在一些实施例中，抗Ang2全长抗体是单特异性的。在一些实施例中，抗Ang2全长抗体是双特异性的。在一些实施例中，VEGFR组分通过任选的接头(例如，SEQID NO:30或31)融合至抗Ang2全长抗体的重链的N末端。在一些实施例中，VEGFR组分通过任选的接头(例如，SEQ ID NO:30或31)融合至抗Ang2全长抗体的重链的C末端。在一些实施例中，VEGFR组分通过任选的接头(例如，SEQ ID NO:30或31)融合至抗Ang2全长抗体的轻链的N末端。在一些实施例中，VEGFR组分通过任选的接头(例如，SEQ ID NO:30或31)融合至抗Ang2全长抗体的轻链的C末端。在一些实施例中，抗体融合蛋白包含两个或更多个(例如，2、3、4、5、6、7、8个或更多个)VEGFR组分。在一些实施例中，两个或更多个VEGFR组分通过一个或多个任选的接头(例如，SEQ ID NO:30或31)融合至以下中的一个或多个：i)抗Ang2全长抗体的一个或两个重链的N末端；ii)抗Ang2全长抗体的一个或两个重链的C末端；iii)抗Ang2全长抗体的一个或两个轻链的N末端；或iv)抗Ang2全长抗体的一个或两个轻链的C末端。在一些实施例中，两个或更多个VEGFR组分通过一个或多个任选的接头(可以与连接VEGFR组分和抗Ang2全长抗体的接头相同(例如，SEQ ID NO:30或31)或不同)串联融合，然后通过任选的接头(例如，SEQ ID NO:30或31)融合至抗Ang2全长抗体。在一些实施例中，所有接头相同。在一些实施例中，至少一个接头不同于其他接头。在一些实施例中，所有接头彼此不同。在一些实施例中，用于VEGFR组分的重链融合的接头相同。在一些实施例中，用于VEGFR组分的轻链融合的接头相同。在一些实施例中，所有VEGFR组分相同。在一些实施例中，至少一个VEGFR组分不同于其他VEGFR组分。在一些实施例中，所有VEGFR组分彼此不同。
在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，和ii)VEGFR组分(例如，SEQ ID NO:32)，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，并且其中该VEGFR组分通过任选的接头(例如，SEQ ID NO:30或31)融合至该抗Ang2全长抗体的重链的N末端。在一些实施例中，重链融合多肽包含SEQ ID NO:56-61、75和79中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，和ii)VEGFR组分，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，其中该VEGFR组分通过接头融合至该抗Ang2全长抗体的重链的N末端，其中该抗体融合蛋白包含以下中任一项：(1)包含SEQ ID NO:56或58的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链；(2)包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:41或42的氨基酸序列的轻链；(3)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ IDNO:45的氨基酸序列的轻链；(4)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的轻链；(5)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链；(6)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链；或(7)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链。在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，和ii)VEGFR组分，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，其中该VEGFR组分通过接头融合至该抗Ang2全长抗体的重链的N末端，其中该抗体融合蛋白包含以下中任一项：(1)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的重链融合多肽，包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链，以及两个各自包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链；(2)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的重链融合多肽，包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链，以及两个各自包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链；(3)包含SEQID NO:57的氨基酸序列的重链融合多肽，包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链，以及两个各自包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的轻链；(4)包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的重链融合多肽，包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链，以及两个各自包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链；(5)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的重链融合多肽，包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重链，以及两个各自包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链；(6)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的重链融合多肽，包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链，以及两个各自包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的轻链；(7)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链融合多肽，包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链，以及两个各自包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链；(8)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链融合多肽，包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列的重链，以及两个各自包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链；或(9)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的重链融合多肽，包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链，以及两个各自包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链。在一些实施例中，抗Ang2全长抗体在与Ang2结合后通过抗体结合的Ang2激活Tie2信号传导。
在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，ii)第一VEGFR组分(例如，SEQ ID NO:32)，和iii)第二VEGFR组分(例如，SEQ ID NO:32)，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，其中该第一VEGFR组分通过任选的第一接头(例如，SEQ ID NO:30或31)融合至该抗Ang2全长抗体的第一重链的N末端，并且其中该第二VEGFR组分通过任选的第二接头(例如，SEQ ID NO:30或31)融合至该抗Ang2全长抗体的第二重链的N末端。参见，例如，图6C。在一些实施例中，第一和第二接头相同。在一些实施例中，第一和第二接头不同。在一些实施例中，第一和第二VEGFR组分相同。在一些实施例中，第一和第二VEGFR组分不同。在一些实施例中，两个重链融合多肽相同。在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，ii)第一VEGFR组分，和iii)第二VEGFR组分，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，其中该第一VEGFR组分通过第一接头融合至该抗Ang2全长抗体的第一重链的N末端，其中该第二VEGFR组分通过第二接头融合至该抗Ang2全长抗体的第二重链的N末端，并且其中该抗体融合蛋白包含以下中任一项：(1)两个各自包含SEQ ID NO:56或58的氨基酸序列的重链融合多肽，和两个各自包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链；(2)两个各自包含SEQ ID NO:57氨基酸序列的重链融合多肽，和两个各自包含SEQ ID NO:41或42氨基酸序列的轻链；(3)两个各自包含SEQ IDNO:59氨基酸序列的重链融合多肽，和两个各自包含SEQ ID NO:45氨基酸序列的轻链；(4)两个各自包含SEQ ID NO:60氨基酸序列的重链融合多肽，和两个各自包含SEQ ID NO:46氨基酸序列的轻链；(5)两个各自包含SEQ ID NO:61氨基酸序列的重链融合多肽，和两个各自包含SEQ ID NO:44氨基酸序列的轻链；(6)两个各自包含SEQ ID NO:75氨基酸序列的重链融合多肽，和两个各自包含SEQ ID NO:47氨基酸序列的轻链；或(7)两个各自包含SEQ IDNO:79氨基酸序列的重链融合多肽，和两个各自包含SEQ ID NO:48氨基酸序列的轻链。在一些实施例中，抗Ang2全长抗体在与Ang2结合后通过抗体结合的Ang2激活Tie2信号传导。
在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，和ii)VEGFR组分(例如，SEQ ID NO:32)，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，并且其中该VEGFR组分通过任选的接头(例如，SEQ ID NO:30或31)融合至该抗Ang2全长抗体的重链的C末端。在一些实施例中，重链融合多肽包含SEQ ID NO:50-55、74和78中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，和ii)VEGFR组分，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，其中该VEGFR组分通过接头融合至该抗Ang2全长抗体的重链的C末端，并且其中该抗体融合蛋白包含以下中任一项：(1)包含SEQ ID NO:50或52的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链；(2)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:41或42的氨基酸序列的轻链；(3)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链；(4)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的轻链；(5)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链；(6)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链；或(7)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链。在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，和ii)VEGFR组分，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，其中该VEGFR组分通过接头融合至该抗Ang2全长抗体的重链的C末端，并且其中该抗体融合蛋白包含以下中任一项：(1)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的重链融合多肽，包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链，以及两个各自包含SEQID NO:42的氨基酸序列的轻链；(2)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链融合多肽，包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链，以及两个各自包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链；(3)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链融合多肽，包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链，以及两个各自包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的轻链；(4)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链融合多肽，包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链，以及两个各自包含SEQID NO:42的氨基酸序列的轻链；(5)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的重链融合多肽，包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重链，以及两个各自包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链；(6)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的重链融合多肽，包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链，以及两个各自包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的轻链；(7)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链融合多肽，包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链，以及两个各自包含SEQID NO:44的氨基酸序列的轻链；(8)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链融合多肽，包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链，以及两个各自包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链；或(9)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的重链融合多肽，包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链，以及两个各自包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链。在一些实施例中，抗Ang2全长抗体在与Ang2结合后通过抗体结合的Ang2激活Tie2信号传导。
在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，ii)第一VEGFR组分(例如，SEQ ID NO:32)，和iii)第二VEGFR组分(例如，SEQ ID NO:32)，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，其中该第一VEGFR组分通过任选的第一接头(例如，SEQ ID NO:30或31)融合至该抗Ang2全长抗体的第一重链的C末端，并且其中该第二VEGFR组分通过任选的第二接头(例如，SEQ ID NO:30或31)融合至该抗Ang2全长抗体的第二重链的C末端。参见例如图6A。在一些实施例中，第一和第二接头相同。在一些实施例中，第一和第二接头不同。在一些实施例中，第一和第二VEGFR组分相同。在一些实施例中，第一和第二VEGFR组分不同。在一些实施例中，两个重链融合多肽相同。在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，ii)第一VEGFR组分，和iii)第二VEGFR组分，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，其中该第一VEGFR组分通过第一接头融合至该抗Ang2全长抗体的第一重链的C末端，其中该第二VEGFR组分通过第二接头融合至该抗Ang2全长抗体的第二重链的C末端，并且其中该抗体融合蛋白包含以下中任一项：(1)两个各自包含SEQ ID NO:50或52的氨基酸序列的重链融合多肽，和两个各自包含SEQID NO:42的氨基酸序列的轻链；(2)两个各自包含SEQ ID NO:51氨基酸序列的重链融合多肽，和两个各自包含SEQ ID NO:41或42氨基酸序列的轻链；(3)两个各自包含SEQ ID NO:59氨基酸序列的重链融合多肽，和两个各自包含SEQ ID NO:45氨基酸序列的轻链；(4)两个各自包含SEQ ID NO:60氨基酸序列的重链融合多肽，和两个各自包含SEQ ID NO:46氨基酸序列的轻链；(5)两个各自包含SEQ ID NO:61氨基酸序列的重链融合多肽，和两个各自包含SEQ ID NO:44氨基酸序列的轻链；(6)两个各自包含SEQ ID NO:75氨基酸序列的重链融合多肽，和两个各自包含SEQ ID NO:47氨基酸序列的轻链；或(7)两个各自包含SEQ ID NO:79氨基酸序列的重链融合多肽，和两个各自包含SEQ ID NO:48氨基酸序列的轻链。在一些实施例中，抗Ang2全长抗体在与Ang2结合后通过抗体结合的Ang2激活Tie2信号传导。
在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，和ii)VEGFR组分(例如，SEQ ID NO:32)，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，并且其中该VEGFR组分通过任选的接头(例如，SEQ ID NO:30或31)融合至该抗Ang2全长抗体的轻链的N末端。在一些实施例中，轻链融合多肽包含SEQ ID NO:67-71、73、77和81中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，和ii)VEGFR组分(例如，SEQ ID NO:32)，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，其中该VEGFR组分通过接头融合至该抗Ang2全长抗体的轻链的N末端，并且其中该抗体融合蛋白包含以下中任一项：(1)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链和包含SEQID NO:67的氨基酸序列的轻链融合多肽；(2)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:67、68和77中任一个的氨基酸序列的轻链融合多肽；(3)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链融合多肽；(4)包含SEQ IDNO:36的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链融合多肽；(5)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链融合多肽；(6)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的轻链融合多肽；(7)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链融合多肽；或(8)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的轻链融合多肽。在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，和ii)VEGFR组分，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，其中该VEGFR组分通过接头融合至该抗Ang2全长抗体的轻链的N末端，并且其中该抗体融合蛋白包含以下中任一项：(1)两个各自包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链，包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链融合多肽；(2)两个各自包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链，包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链，和包含SEQID NO:67的氨基酸序列的轻链融合多肽；(3)两个各自包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链，包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的轻链融合多肽；(4)两个各自包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链，包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的轻链融合多肽；(5)两个各自包含SEQID NO:37的氨基酸序列的重链，包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ IDNO:69的氨基酸序列的轻链融合多肽；(6)两个各自包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链，包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链融合多肽；(7)两个各自包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链，包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链融合多肽；(8)两个各自包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列的重链，包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的轻链融合多肽；(9)两个各自包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链，包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链融合多肽；或(10)两个各自包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链，包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的轻链融合多肽。在一些实施例中，抗Ang2全长抗体在与Ang2结合后通过抗体结合的Ang2激活Tie2信号传导。
在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，ii)第一VEGFR组分(例如，SEQ ID NO:32)，和iii)第二VEGFR组分(例如，SEQ ID NO:32)，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，其中该第一VEGFR组分通过任选的第一接头(例如，SEQ ID NO:30或31)融合至该抗Ang2全长抗体的第一轻链的N末端，并且其中该第二VEGFR组分通过任选的第二接头(例如，SEQ ID NO:30或31)融合至该抗Ang2全长抗体的第二轻链的N末端。参见，例如，图6D。在一些实施例中，第一和第二接头相同。在一些实施例中，第一和第二接头不同。在一些实施例中，第一和第二VEGFR组分相同。在一些实施例中，第一和第二VEGFR组分不同。在一些实施例中，两个轻链融合多肽相同。在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，ii)第一VEGFR组分，和iii)第二VEGFR组分，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，其中该第一VEGFR组分通过第一接头融合至该抗Ang2全长抗体的第一轻链的N末端，其中该第二VEGFR组分通过第二接头融合至该抗Ang2全长抗体的第二轻链的N末端，并且其中该抗体融合蛋白包含以下中任一项：(1)两个各自包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链，和两个各自包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链融合多肽；(2)两个各自包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链，和两个各自包含SEQ ID NO:67、68和77的氨基酸序列的轻链融合多肽；(3)两个各自包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列的重链，和两个各自包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链融合多肽；(4)两个各自包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链，和两个各自包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链融合多肽；(5)两个各自包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链，和两个各自包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链融合多肽；(6)两个各自包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链，和两个各自包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的轻链融合多肽；(7)两个各自包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链，和两个各自包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链融合多肽；或(8)两个各自包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链，和两个各自包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的轻链融合多肽。在一些实施例中，抗Ang2全长抗体在与Ang2结合后通过抗体结合的Ang2激活Tie2信号传导。
在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，和ii)VEGFR组分(例如，SEQ ID NO:32)，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，并且其中该VEGFR组分通过任选的接头(例如，SEQ ID NO:30或31)融合至该抗Ang2全长抗体的轻链的C末端。在一些实施例中，轻链融合多肽包含SEQ ID NO:62-66、72、76和80中任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，和ii)VEGFR组分，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，其中该VEGFR组分通过接头融合至该抗Ang2全长抗体的轻链的C末端，并且其中该抗体融合蛋白包含以下中任一项：(1)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链融合多肽；(2)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:62、63和76中任一个的氨基酸序列的轻链融合多肽；(3)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的轻链融合多肽；(4)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的轻链融合多肽；(5)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的轻链融合多肽；(6)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的轻链融合多肽；(7)包含SEQ IDNO:38的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链融合多肽；或(8)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的轻链融合多肽。在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，和ii)VEGFR组分，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，其中该VEGFR组分通过接头融合至该抗Ang2全长抗体的轻链的C末端，并且其中该抗体融合蛋白包含以下中任一项：(1)两个各自包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链，包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链融合多肽；(2)两个各自包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链，包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链融合多肽；(3)两个各自包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链，包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的轻链融合多肽；(4)两个各自包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链，包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链，和包含SEQID NO:76的氨基酸序列的轻链融合多肽；(5)两个各自包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重链，包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的轻链融合多肽；(6)两个各自包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链，包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的轻链融合多肽；(7)两个各自包含SEQID NO:35的氨基酸序列的重链，包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ IDNO:66的氨基酸序列的轻链融合多肽；(8)两个各自包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链，包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的轻链融合多肽；(9)两个各自包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链，包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链融合多肽；或(10)两个各自包含SEQID NO:40的氨基酸序列的重链，包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ IDNO:80的氨基酸序列的轻链融合多肽。在一些实施例中，抗Ang2全长抗体在与Ang2结合后通过抗体结合的Ang2激活Tie2信号传导。
在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，ii)第一VEGFR组分(例如，SEQ ID NO:32)，和iii)第二VEGFR组分(例如，SEQ ID NO:32)，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，其中该第一VEGFR组分通过任选的第一接头(例如，SEQ ID NO:30或31)融合至该抗Ang2全长抗体的第一轻链的C末端，并且其中该第二VEGFR组分通过任选的第二接头(例如，SEQ ID NO:30或31)融合至该抗Ang2全长抗体的第二轻链的C末端。参见例如，图6B。在一些实施例中，第一和第二接头相同。在一些实施例中，第一和第二接头不同。在一些实施例中，第一和第二VEGFR组分相同。在一些实施例中，第一和第二VEGFR组分不同。在一些实施例中，两个轻链融合多肽相同。在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，ii)第一VEGFR组分，和iii)第二VEGFR组分，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，其中该第一VEGFR组分通过第一接头融合至该抗Ang2全长抗体的第一轻链的C末端，其中该第二VEGFR组分通过第二接头融合至该抗Ang2全长抗体的第二轻链的C末端，并且其中该抗体融合蛋白包含以下中任一项：(1)两个各自包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链，和两个各自包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链融合多肽；(2)两个各自包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链，和两个各自包含SEQ ID NO:62、63和76的氨基酸序列的轻链融合多肽；(3)两个各自包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重链，和两个各自包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的轻链融合多肽；(4)两个各自包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链，和两个各自包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的轻链融合多肽；(5)两个各自包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链，和两个各自包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的轻链融合多肽；(6)两个各自包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链，和两个各自包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的轻链融合多肽；(7)两个各自包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链，和两个各自包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链融合多肽；或(8)两个各自包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链，和两个各自包含SEQ IDNO:80的氨基酸序列的轻链融合多肽。在一些实施例中，抗Ang2全长抗体在与Ang2结合后通过抗体结合的Ang2激活Tie2信号传导。
在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，和ii)四个VEGFR组分(例如，SEQ ID NO:32)，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，其中第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至抗Ang2全长抗体的第一重链的N末端，其中第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至抗Ang2全长抗体的第二重链的N末端，其中第三VEGFR组分通过任选的第三接头融合至抗Ang2全长抗体的第一轻链的N末端，并且其中第四VEGFR组分通过任选的第四接头融合至抗Ang2全长抗体的第二轻链的N末端。参见，例如，图6E。在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，和ii)四个VEGFR组分(例如，SEQ ID NO:32)，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，其中第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至抗Ang2全长抗体的第一重链的C末端，其中第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至抗Ang2全长抗体的第二重链的C末端，其中第三VEGFR组分通过任选的第三接头融合至抗Ang2全长抗体的第一轻链的C末端，并且其中第四VEGFR组分通过任选的第四接头融合至抗Ang2全长抗体的第二轻链的C末端。参见，例如，图6F。在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，和ii)四个VEGFR组分(例如，SEQ ID NO:32)，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，其中第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至抗Ang2全长抗体的第一重链的N末端，其中第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至抗Ang2全长抗体的第二重链的N末端，其中第三VEGFR组分通过任选的第三接头融合至抗Ang2全长抗体的第一重链的C末端，并且其中第四VEGFR组分通过任选的第四接头融合至抗Ang2全长抗体的第二重链的C末端。参见，例如，图6G。在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，和ii)四个VEGFR组分(例如，SEQ ID NO:32)，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，其中第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至抗Ang2全长抗体的第一重链的C末端，其中第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至抗Ang2全长抗体的第二重链的C末端，其中第三VEGFR组分通过任选的第三接头融合至抗Ang2全长抗体的第一轻链的N末端，并且其中第四VEGFR组分通过任选的第四接头融合至抗Ang2全长抗体的第二轻链的N末端。参见，例如，图6H。在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，和ii)四个VEGFR组分(例如，SEQ ID NO:32)，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，其中第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至抗Ang2全长抗体的第一重链的N末端，其中第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至抗Ang2全长抗体的第二重链的N末端，其中第三VEGFR组分通过任选的第三接头融合至抗Ang2全长抗体的第一轻链的C末端，并且其中第四VEGFR组分通过任选的第四接头融合至抗Ang2全长抗体的第二轻链的C末端。参见，例如，图6I。在一些实施例中，提供了一种抗体融合蛋白，其包含：i)抗Ang2全长抗体，和ii)四个VEGFR组分(例如，SEQ ID NO:32)，其中该抗Ang2全长抗体不抑制Ang2和Tie2之间的结合，其中第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至抗Ang2全长抗体的第一轻链的N末端，其中第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至抗Ang2全长抗体的第二轻链的N末端，其中第三VEGFR组分通过任选的第三接头融合至抗Ang2全长抗体的第一轻链的C末端，并且其中第四VEGFR组分通过任选的第四接头融合至抗Ang2全长抗体的第二轻链的C末端。参见，例如，图6J。在一些实施例中，抗Ang2全长抗体在与Ang2结合后通过抗体结合的Ang2激活Tie2信号传导。在一些实施例中，第一、第二、第三和第四接头全部相同。在一些实施例中，第一、第二、第三和第四接头中的至少一个不同于其他接头。在一些实施例中，第一、第二、第三和第四接头都彼此不同。在一些实施例中，第一和第二接头相同。在一些实施例中，第三和第四接头相同。在一些实施例中，第一、第二、第三和第四接头各自包含独立地选自SEQ IDNO:30或31的氨基酸序列。在一些实施例中，第一和第二VEGFR组分相同。在一些实施例中，第三和第四VEGFR组分相同。在一些实施例中，所有四个VEGFR组分相同。在一些实施例中，至少一个VEGFR组分不同于其他组分。在一些实施例中，四个VEGFR组分彼此不同。
多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段
本文所述的多价(例如，二价)抗Ang2抗体或其抗原结合片段(或抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白)具有以下特性中的一种或多种：i)不抑制Ang2和Tie2之间的结合；ii)可以特异性结合Ang2并触发Ang2的聚簇，组装抗体/Ang2复合物；iii)通过抗体结合的Ang2或抗体/Ang2复合物触发Tie2聚簇；iv)通过抗体结合的Ang2或抗体/Ang2复合物激活Tie2信号传导；或v)降低(例如，降低至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％中的任一者)Ang2在防止/减少Ang1/Tie2结合中的竞争/拮抗活性。参见，例如，图7C。
多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段(例如抗体融合蛋白的多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段)对Ang2的结合特异性和/或亲和力可以通过本领域已知的方法实验确定。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA、MSD电化学发光、基于珠的MIA、RIA、SPR、ECL、IRMA、EIA、Biacore测定、Octet分析、肽扫描、FACS等。
在一些实施例中，多价(例如，二价)抗Ang2抗体或其抗原结合片段不抑制Ang2与Tie2之间的结合，例如，在存在多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段(或抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白)的情况下Ang2与Tie2之间的结合亲和力(例如，KD)与在不存在多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段(或抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白)的情况下Ang2与Tie2之间的结合亲和力(例如，KD)相同，或差异在约2倍以内。在一些实施例中，多价(例如，二价)抗Ang2抗体或其抗原结合片段减少但不完全阻断/消除Ang2与Tie2之间的结合，例如，在存在多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段(或抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白)的情况下，Ang2与Tie2之间的结合减少至少约3％，诸如减少至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多中的任一者(但小于100％)。在一些实施例中，多价(例如，二价)抗Ang2抗体或其抗原结合片段在存在多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段(或抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白)的情况下增加(例如，增加至少约2倍)Ang2与Tie2之间的结合。
在一些实施例中，将一个或多个VEGFR组分融合至多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段并不影响多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段对Ang2的结合亲和力和/或特异性，例如，融合了一个或多个VEGFR组分的多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段与Ang2之间的结合的KD与对应的非融合多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段与Ang2之间的结合的KD相同，或差异在约2倍以内。在一些实施例中，将一个或多个VEGFR组分融合至多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段降低多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段对Ang2的结合亲和力和/或特异性，例如，融合了一个或多个VEGFR组分的多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段与Ang2之间的结合的KD是对应的非融合多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段与Ang2之间的结合的KD的约2倍以上。在一些实施例中，将一个或多个VEGFR组分融合至多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段增加多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段对Ang2的结合亲和力和/或特异性，例如，对应的非融合多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段与Ang2之间的结合的KD是融合了一个或多个VEGFR组分的多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段与Ang2之间的结合的KD的约2倍以上。
多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段(诸如抗体融合蛋白的多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段)的生物活性可通过本领域已知的任何方法确定，如Tie2依赖性受体磷酸化测定法(例如，使用HUVEC，检测Ser上的Akt磷酸化)、Tie2依赖性报告基因表达测定法(例如，使用在细胞表面表达Tie2并携带受Tie2激活控制的报告基因的细胞)或血管生成测定法，诸如管或管状结构形成测定法(例如，使用HUVEC或IBE细胞系)或出芽测定法。对于示例性方法还参见实例1。
在一些实施例中，将一个或多个VEGFR组分融合至多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段并不影响多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段的生物活性，例如，融合了一个或多个VEGFR组分的多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段的生物活性(例如，结合至Ang2并通过抗体结合的Ang2激活Tie2)与对应的非融合多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段的生物活性相同，或差异在约2倍以内。在一些实施例中，与对应的非融合多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段相比，将一个或多个VEGFR组分融合至多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段会降低(例如，降低至少约2倍)多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段的生物活性。在一些实施例中，与对应的非融合多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段相比，将一个或多个VEGFR组分融合至多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段会增加(例如，增加至少约2倍)多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段的生物活性。
在一些实施例中，多价(例如，二价)抗Ang2抗体或其抗原结合片段(或抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白)在结合Ang2后通过抗体结合的Ang2激活Tie2信号传导。在一些实施例中，激活的Tie2信号传导可以实现以下中的一项或多项：i)激活促迁移、促存活的PI3K/Akt通路(例如，在内皮细胞中)；ii)稳定脉管系统和/或淋巴管，减弱血管渗漏；iii)加强内皮屏障；iv)保护内皮糖萼；或v)减少炎症。
多价(例如二价)抗Ang2抗体或其抗原结合片段可以是任何可能的形式。在一些实施例中，多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段包含单个多肽链。在一些实施例中，多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段包含多于一个(例如2、3、4个或更多个中的任何)多肽链。在多链抗体或其抗原结合片段的情况下，编码多肽链的核酸序列可以可操作地连接至相同的启动子或不同的启动子。在一些实施例中，多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段包含一个或多个恒定结构域，例如CL、CH1、CH2，CH3，或其任何组合。在一些实施例中，多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段包含Fc结构域或其部分(例如，CH2、CH3、CH2+CH3或其一个或多个部分)。在一些实施例中，多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段不包含Fc结构域或其部分，例如，F(ab’)2。在一些实施例中，多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段是全长抗体(“抗Ang2全长抗体”)。在一些实施例中，抗Ang2全长抗体包含含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CL。在一些实施例中，抗Ang2全长抗体包含含有SEQ ID NO:99的氨基酸序列的Fc结构域。在一些实施例中，多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。在一些实施例中，多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段的一个或多个抗Ang2结合结构域可以独立地选自Fab、Fab'、微型抗体、sdAb、Fv、scFv等中的任何一个。在一些实施例中，多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段是人的、人源化的、嵌合的或来自非人来源(例如，鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、绵羊、马、猪、牛、鸟等)。
多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段可具有2、3、4、5个或更多个抗Ang2价或抗Ang2结合结构域。在一些实施例中，多价(例如，二价)抗Ang2抗体(例如，全长抗体)或其抗原结合片段是单特异性的。在一些实施例中，多价(例如，二价)抗Ang2抗体(例如，全长抗体)或其抗原结合片段是多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施例中，多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段的价数(例如，二价)和特异性数(例如，双特异性)相同。在一些实施例中，价数(例如，三价)大于多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段的特异性数(例如，单特异性)。
在一些实施例中，多价(例如，二价)抗Ang2抗体(例如，全长抗体)或其抗原结合片段包含i)包含SEQ ID NO:1-6中任一个的氨基酸序列的HC-CDR1，或其包含多达约3个(例如，1个、2个或3个)氨基酸取代的变体；ii)包含SEQ ID NO:7-11中任一个的氨基酸序列的HC-CDR2，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；iii)包含SEQ ID NO:12-16中任一个的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；iv)包含SEQ ID NO:17或18的氨基酸序列的LC-CDR1，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；v)包含SEQ ID NO:19-23中任一个的氨基酸序列的LC-CDR2，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；和vi)包含SEQ ID NO:24-28中任一个的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体。在一些实施例中，多价(例如，二价)抗Ang2抗体(例如，全长抗体)或其抗原结合片段包含i)包含SEQ ID NO:1-6中任一个的氨基酸序列的HC-CDR1；ii)包含SEQ ID NO:7-11中任一个的氨基酸序列的HC-CDR2；iii)包含SEQ ID NO:12-16中任一个的氨基酸序列的HC-CDR3；iv)包含SEQ ID NO:17或18的氨基酸序列的LC-CDR1；v)包含SEQ ID NO:19-23中任一个的氨基酸序列的LC-CDR2；和vi)包含SEQ ID NO:24-28中任一个的氨基酸序列的LC-CDR3；或其在任何HC-CDR和LC-CDR中包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体。在一些实施例中，多价(例如，二价)抗Ang2抗体(例如，全长抗体)或其抗原结合片段包含i)包含SEQ IDNO:1-6中任一个的氨基酸序列的HC-CDR1；ii)包含SEQ ID NO:7-11中任一个的氨基酸序列的HC-CDR2；iii)包含SEQ ID NO:12-16中任一个的氨基酸序列的HC-CDR3；iv)包含SEQ IDNO:17或18的氨基酸序列的LC-CDR1；v)包含SEQ ID NO:19-23中任一个的氨基酸序列的LC-CDR2；和vi)包含SEQ ID NO:24-28中任一个的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施例中，多价(例如，二价)抗Ang2抗体(例如，全长抗体)或其抗原结合片段包含以下中的任一项：(1)i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；ii)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR2，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；iii)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；iv)包含SEQ IDNO:17的氨基酸序列的LC-CDR1，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；v)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LC-CDR2，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；和vi)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；(2)i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HC-CDR1，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；ii)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HC-CDR2，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；iii)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；iv)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC-CDR1，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；v)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR2，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；和vi)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；(3)i)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HC-CDR1，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；ii)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR2，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；iii)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；iv)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC-CDR1，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；v)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的LC-CDR2，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；和vi)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；(4)i)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HC-CDR1，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；ii)包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列的HC-CDR2，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；iii)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；iv)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC-CDR1，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；v)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LC-CDR2，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；和vi)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；(5)i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR1，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR2，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；iii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；iv)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR1，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；v)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的LC-CDR2，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；和vi)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；或(6)i)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HC-CDR1，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；ii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HC-CDR2，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；iii)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HC-CDR3，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；iv)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC-CDR1，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；v)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的LC-CDR2，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；和vi)包含SEQ IDNO:28的氨基酸序列的LC-CDR3，或其包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体。在一些实施例中，多价(例如，二价)抗Ang2抗体(例如，全长抗体)或其抗原结合片段包含以下中的任一项：(1)i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1；ii)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR2；iii)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HC-CDR3；iv)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC-CDR1；v)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LC-CDR2；和vi)包含SEQID NO:24的氨基酸序列的LC-CDR3；或其在任何HC-CDR和LC-CDR中包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；(2)i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HC-CDR1；ii)包含SEQID NO:8的氨基酸序列的HC-CDR2；iii)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HC-CDR3；iv)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC-CDR1；v)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LC-CDR2；和vi)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LC-CDR3；或其在任何HC-CDR和LC-CDR中包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；(3)i)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HC-CDR1；ii)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR2；iii)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HC-CDR3；iv)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC-CDR1；v)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的LC-CDR2；和vi)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的LC-CDR3；或其在任何HC-CDR和LC-CDR中包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；(4)i)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HC-CDR1；ii)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR2；iii)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HC-CDR3；iv)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC-CDR1；v)包含SEQ IDNO:19的氨基酸序列的LC-CDR2；和vi)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的LC-CDR3；或其在任何HC-CDR和LC-CDR中包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；(5)i)包含SEQID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR1；ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR2；iii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HC-CDR3；iv)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR1；v)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的LC-CDR2；和vi)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的LC-CDR3；或其在任何HC-CDR和LC-CDR中包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体；或(6)i)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HC-CDR1；ii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HC-CDR2；iii)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HC-CDR3；iv)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC-CDR1；v)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的LC-CDR2；和vi)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的LC-CDR3；或其在任何HC-CDR和LC-CDR中包含多达约3个(例如，1、2或3个)氨基酸取代的变体。在一些实施例中，多价(例如，二价)抗Ang2抗体(例如，全长抗体)或其抗原结合片段包含以下中的任一项：(1)i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC-CDR1；ii)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR2；iii)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HC-CDR3；iv)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC-CDR1；v)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LC-CDR2；和vi)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的LC-CDR3；(2)i)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HC-CDR1；ii)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HC-CDR2；iii)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HC-CDR3；iv)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC-CDR1；v)包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列的LC-CDR2；和vi)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LC-CDR3；(3)i)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HC-CDR1；ii)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR2；iii)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HC-CDR3；iv)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC-CDR1；v)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的LC-CDR2；和vi)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的LC-CDR3；(4)i)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HC-CDR1；ii)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC-CDR2；iii)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HC-CDR3；iv)包含SEQ IDNO:17的氨基酸序列的LC-CDR1；v)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LC-CDR2；和vi)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的LC-CDR3；(5)i)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC-CDR1；ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR2；iii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HC-CDR3；iv)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LC-CDR1；v)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的LC-CDR2；和vi)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的LC-CDR3；或(6)i)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HC-CDR1；ii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HC-CDR2；iii)包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列的HC-CDR3；iv)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LC-CDR1；v)包含SEQID NO:23的氨基酸序列的LC-CDR2；和vi)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施例中，多价(例如，二价)抗Ang2抗体(例如，全长抗体)或其抗原结合片段包含i)包含SEQ ID NO:82、83、87、89、90、93、94和96中任一个的氨基酸序列的VH，或其与SEQ ID NO:82、83、87、89、90、93、94和96中任一个具有至少约85％的序列同一性的变体；和ii)包含SEQ ID NO:84-86、88、91、92、95、97和98中任一个的氨基酸序列的VL，或其与SEQID NO:84-86、88、91、92、95、97和98中任一个具有至少约85％的序列同一性的变体。在一些实施例中，多价(例如，二价)抗Ang2抗体(例如，全长抗体)或其抗原结合片段包含以下中的任一项：(1)包含SEQ ID NO:82或83的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:84-86中任一个的氨基酸序列的VL；(2)包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:88或98的氨基酸序列的VL；(3)包含SEQ ID NO:89或90的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:91或92的氨基酸序列的VL；(4)包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:84-86中任一个的氨基酸序列的VL；(5)包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VL；或(6)包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VL。在一些实施例中，多价(例如，二价)抗Ang2抗体(例如，全长抗体)或其抗原结合片段包含以下中的任一项：(1)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL；(2)包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:84-86中任一个的氨基酸序列的VL；(3)包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL；(4)包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的VL；(5)包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的VL；(6)包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL；(7)包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VL；或(8)包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VL。
在一些实施例中，多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段是抗Ang2全长抗体。在一些实施例中，抗Ang2全长抗体包含i)包含SEQ ID NO:33-40中任一个的氨基酸序列的重链；和ii)包含SEQ ID NO:41-49中任一个的氨基酸序列的轻链。在一些实施例中，多价(例如，二价)抗Ang2抗体(例如，全长抗体)或其抗原结合片段包含以下中的任一项：(1)包含SEQ IDNO:33或34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:41-43中任一个的氨基酸序列的轻链；(2)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:44或49的氨基酸序列的轻链；(3)包含SEQ ID NO:36或37的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:45或46的氨基酸序列的轻链；(4)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:41-43中任一个的氨基酸序列的轻链；(5)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链；或(6)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链。在一些实施例中，抗Ang2全长抗体包含以下中任一项：(1)包含SEQ IDNO:33的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链；(2)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:41-43中任一个的氨基酸序列的轻链；(3)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链；(4)包含SEQID NO:36的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的轻链；(5)包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链；(6)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链；(7)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链；或(8)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链。在一些实施例中，抗Ang2全长抗体是单特异性的。在一些实施例中，抗Ang2全长抗体是双特异性的。
Fc结构域
在一些实施例中，本文所述的抗体融合蛋白或多价(例如，二价)抗Ang2抗体(例如，全长抗体)或其抗原结合片段包含Fc结构域或其部分。Fc结构域包含CH2结构域和CH3结构域。在一些实施例中，Fc结构域部分包含以下(基本上由以下组成或由以下组成)：CH2结构域。在一些实施例中，Fc结构域部分包含以下(基本上由以下组成或由以下组成)：CH3结构域。
在一些实施例中，Fc结构域衍生自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM及其亚型中的任一种。在一些实施例中，Fc结构域衍生自IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。在一些实施例中，Fc结构域衍生自人IgG。在一些实施例中，Fc结构域衍生自人IgG1或人IgG4。在一些实施例中，Fc结构域的两个亚基通过一个或多个(例如，1、2、3、4个或更多个)二硫键二聚化。在一些实施例中，Fc结构域的每个亚基包含全长Fc序列。在一些实施例中，Fc结构域的每个亚基包含N末端截短的Fc序列。在一些实施例中，Fc结构域在N末端被截短，例如缺少完整免疫球蛋白Fc结构域的前1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。
通过Fc结构域，本文所述的抗体融合蛋白或多价(例如，二价)抗Ang2抗体(例如，全长抗体)或其抗原结合片段可以激活补体并与Fc受体(FcR)相互作用。在一些实施例中，这种固有的免疫球蛋白特征被认为是不利的，因为抗体融合蛋白可能靶向表达FcR的细胞而不是优选的抗原携带细胞或表达靶分子的组织。此外，Tie2和FcR信号传导通路的同时激活可能会过度刺激细胞因子的释放，尤其是与免疫球蛋白融合蛋白的长半衰期相组合时，使得它们由于全身毒性在治疗环境中的应用变得困难。尽管Fc结构域的存在对于延长抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白的半衰期至关重要，但在某些情况下，消除与Fc结构域接合FcR相关的效应子功能将是有益的。因此，在一些实施例中，Fc结构域被工程化为具有改变的与FcR的结合，特别是改变的与Fcγ受体的结合，和/或改变的效应子功能，例如改变的(例如，减少或消除的)ADCC、ADCP和/或CDC。在一些实施例中，改变的与FcR的结合和/或效应子功能是减少的结合和/或降低的效应子功能。在一些实施例中，Fc结构域包含一个或多个减少Fc结构域与FcR(特别是Fcγ受体(负责ADCC))结合的氨基酸突变。优选地，这样的氨基酸突变不减少与FcRn受体(负责半衰期)的结合。在一些实施例中，Fc结构域衍生自人IgG1并且包含氨基酸取代N297A。在一些实施例中，Fc结构域衍生自人IgG4并且在铰链区包含氨基酸取代S228P和/或L235E。在一些实施例中，Fc结构域衍生自人IgG4并且在铰链区包含氨基酸取代S228P。在一些实施例中，Fc结构域衍生自人IgG1并且在铰链区包含氨基酸取代L234A和L235A(“LALA”)。在一些实施例中，Fc结构域衍生自人IgG1并且在铰链区包含氨基酸取代L234A和L235A，以及例如在其每个亚基中包含P329G。参见，例如，Lo M.等人JBiol Chem.2017；292(9):3900-3908；Schlothauer T.等人Protein Eng Des Sel.2016；29(10):457-466。
在一些实施例中，Fc结构域(例如，人IgG1)被突变以去除一种或多种效应子功能，例如ADCC、ADCP或CDC，即“无效应子”或“几乎无效应子”的Fc结构域。例如，在一些实施例中，Fc结构域是无效应子IgG1 Fc，其包含一个或多个以下突变(例如在其每个亚基中)：L234A、L235E、G237A、A330S和P331S。在一些实施例中，通过恒定区中消除糖基化的突变(例如“无效应子突变”)消除效应子功能。在一些实施例中，无效应子突变是CH2区中的N297A或DANA突变(D265A+N297A)。Shields等人,J.Biol.Chem.276(9):6591-6604(2001)。IgG1中K322A、L234A和L235A的组合足以几乎完全消除FcγR和C1q的结合(Hezareh等人，J Virol75,12161-12168,2001)。MedImmune确定一组三个突变L234F/L235E/P331S具有非常相似的效果(Oganesyan等人,Acta Crystallographica 64,700-704,2008)。在一些实施例中，Fc结构域包含IgG1 Fc结构域的N297上的糖基化修饰，已知这是最佳FcR相互作用所必需的。Fc结构域修饰可以是以下中提到的任何合适的IgG Fc工程化：Wang等人(“IgG Fcengineering to modulate antibody effector functions,”Protein Cell.2018年1月；9(1):63-73)，其内容通过引用以其整体并入本文。可替代地，效应子功能可以通过生产技术降低或消除，这些生产技术诸如在不会糖基化或导致在促进效应子功能方面无效或低效的改变的糖基化模式的宿主细胞(例如，大肠杆菌(E.coli.))中表达(例如，Shinkawa等人,J.Biol.Chem.278(5):3466-3473(2003))。
在一些实施例中，Fc结构域包含两个相同的多肽链(相同的Fc亚基)。此类Fc结构域在本文中也称为“同二聚体Fc结构域”。
在一些实施例中，Fc结构域包含促进两个不相同的多肽链的异二聚化的修饰。此类Fc结构域在本文中也称为“异二聚体Fc结构域”。在一些实施例中，Fc结构域包含杵臼(knob-into-hole)(KIH)修饰，其包含在Fc结构域的一个亚基中的杵修饰和在Fc结构域的两个亚基中的另一个亚基中的臼修饰。任何合适的杵臼修饰都可以应用于本文所述的多价(例如，二价)抗Ang2抗体或其抗原结合片段(或抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白)，诸如以下氨基酸改变：第一个CH3结构域的B链中的T22>Y(创建杵)和配偶体CH3结构域的E链中的Y86>T(创建臼)。还参见US20200087414，其内容通过引用以其整体并入本文。在一些实施例中，Fc结构域的一个亚基包含相对于野生型人IgG1 Fc的Y349C、T366S、L368A和Y407V突变，并且Fc结构域的另一个亚基包含相对于野生型人IgG1 Fc的S354C和T366W突变。
抗体或抗体融合蛋白变体
在一些实施例中，考虑本文所述的多价(例如，二价)抗Ang2抗体或其抗原结合片段(或抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白)的氨基酸序列变体，下文也称为“抗体或抗体融合蛋白变体”。例如，可能期望改善抗体融合蛋白的结合亲和力和/或其他生物学特性。构建体的氨基酸序列变体可以通过向编码构建体的核酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括，例如，构建体的氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终的构建体，条件是最终的构建体具有所希望的特征，例如Ang2结合和Tie2激活。
a)取代、插入、缺失和变体
用于诱变(例如，取代、插入或缺失)的目的位点包括抗体的HVR和FR。通常，选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体在某些生物学特性(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)上具有修饰(例如，改善)和/或将基本上保留了亲本抗体的某些生物学特性。在一些实施例中，取代、插入或缺失可发生在一个或多个HVR内，只要此类改变不会显著降低抗体或其抗原结合片段(或抗体融合蛋白)结合抗原的能力。在表B中显示了保守取代。更多实质性变化在“示例性取代”标题下提供。氨基酸可以根据共同的侧链特性分组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。非保守取代将需要将这些类别中的一个的成员交换为另一个类别。
表B.氨基酸置取代
如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述，用于鉴定可以靶向诱变的抗原的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”。可替代地或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴定抗体和抗原之间的接触点。此类接触残基和邻近残基可以作为取代的候选者被靶向或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有所希望的特性。
b)糖基化变体
在一些实施例中，改变多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段(或抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白)以增加或减少构建体被糖基化的程度。向Fc结构域中添加或缺失糖基化位点可通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点而方便地实现。
由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的双触角寡糖，其通常通过N-键附接至Fc区CH2结构域的Asn297。参见，例如Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括多种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在双触角寡糖结构的“茎”中附接至GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，可以对Fc结构域中的寡糖进行修饰以产生某些改进的特性。
在一些实施例中，提供的多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段(或抗体融合蛋白)具有缺少(直接或间接)附接到Fc结构域的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段(或抗体融合蛋白)中岩藻糖的量可以为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％到40％。岩藻糖的量是通过计算Asn297糖链中岩藻糖的平均量来确定的，相对于通过MALDI-TOF质谱测量的与Asn 297附接的所有糖结构(例如，复合、杂合和高甘露糖结构)的总和，如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc结构域中约297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可位于位置297上游或下游约±3个氨基酸，即在位置294和300之间。这类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见，例如，US2003/0157108；US2004/0093621；等。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体有关的出版物实例包括：US2003/0157108；WO 2005/053742；Okazaki等人J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)；等。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO细胞(例如，WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其是在实例11中)，以及敲除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(参见，例如，Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；或WO 2003/085107)。
c)Fc结构域变体
在一些实施例中，本申请考虑了具有一些但不是所有Fc效应子功能的抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白，这使其成为应用的理想候选者，在这些应用中抗体融合蛋白的体内半衰期很重要，但某些效应子功能(如CDC和ADCC)是不必要的或有害的。上面已经讨论了一些Fc结构域变体。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定确认CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。例如，可以进行FcR结合测定以确保抗体或抗体融合蛋白缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页的表2中。评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见，例如Hellstrom,I.等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。可替代地，可以采用非放射性测定方法(例如，参见用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View，CA)；以及CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI))。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，可以在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型，诸如Clynes等人,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 95:652-656(1998)中披露的动物模型中。还可以进行C1q结合测定确认抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。例如，参见在WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以进行CDC测定(参见,例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见，例如，Petkova,S.B.等人,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应子功能的Fc结构域包括具有对Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的取代的抗体(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个处的取代，包括残基265和297被丙氨酸取代的称为“DANA”的Fc突变体(美国专利号7,332,581)。描述了与FcR的结合得到改善或减弱的某些抗体变体(参见，例如，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，以及Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。在一些实施例中，Fc结构域内发生改变，导致C1q结合和/或CDC发生改变(即，提高或降低)，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所描述。
在一些实施例中，Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，其增加半衰期和/或改善与新生儿Fc受体(FcRn)的结合。具有延长的半衰期和与新生儿Fc受体(FcRn)的结合改善的抗体，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))，描述于US2005/0014934 A1(Hinton等人)中。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc结构域，这些取代改善了Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括在一个或多个Fc区残基上具有取代(例如Fc区残基434的取代)的那些变体(美国专利号7,371,826)。
d)半胱氨酸工程化的变体
在一些实施例中，可能需要创建经半胱氨酸工程化的多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段(或抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白)，例如“thioMAb”，其中抗体或其抗原结合片段(或抗体融合蛋白)的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定的实施例中，取代的残基出现在抗体或其抗原结合片段(或抗体融合蛋白)的可及位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团因此位于抗体或其抗原结合片段(或抗体融合蛋白)的可及位点，并且可用于将抗体或其抗原结合片段(或抗体融合蛋白)缀合到其他部分，如药物部分或接头-药物部分，以产生缀合物(例如，抗体融合蛋白-缀合物)。在一些实施例中，以下任何一个或多个残基可以被半胱氨酸取代：重链的A118(EU编号)；以及重链Fc结构域的S400(EU编号)。半胱氨酸工程化的抗体/其抗原结合片段(或抗体融合蛋白)可以如例如美国专利号7,521,541中所述产生。
e)抗体或抗体融合蛋白衍生物
在一些实施例中，本文提供的多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段(或抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白)可进一步包含另外的治疗性化合物，例如本领域已知的任何治疗性化合物。例如，一些实施例中的亲本抗体可以是抗体药物缀合物(ADC)。参见，例如，以下中描述的任何ADC：Shim H.(Biomolecules.2020年3月；10(3):360)，以及Diamantis N.和Banerji U.Br J Cancer.2016；114(4):362-367，其内容通过引用以其整体并入本文。在一些实施例中，治疗性化合物缀合至Fc结构域或其部分。在一些实施例中，治疗性化合物是细胞毒性剂、化学治疗剂、生长抑制剂或抗生素。
在一些实施例中，多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段(或抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白)进一步包含选自由以下组成的组的标记：发色团、荧光团(例如，香豆素、呫吨、花菁、芘、硼聚氮杂苯并二茚、噁嗪及其衍生物)、荧光蛋白(例如GFP、藻胆蛋白及其衍生物)、磷光染料(例如二氧杂环丁烷、呫吨或羰花菁染料、镧系元素螯合物)、串联染料(例如花菁-藻胆蛋白衍生物和呫吨-藻胆蛋白衍生物)、颗粒(例如金簇、胶体金、微球、量子点)、半抗原、酶(例如过氧化物酶、磷酸酶、糖苷酶，荧光素酶)和放射性同位素(例如，125I、3H、14C、32P)。
VEGFR组分
在哺乳动物中，VEGF家族包括五个成员：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子(PlGF)。此外，VEGF-A、VEGF-B和PlGF的多种同种型通过可变RNA剪接产生(Sullivan等人,MAbs,2002,2(2):165-75)。所有VEGF家族成员都以同二聚体与细胞表面的酪氨酸激酶受体(TKR；VEGFR)结合，导致它们二聚化并通过转磷酸作用被激活。VEGFR具有由7个免疫球蛋白(Ig)样结构域组成的胞外部分、跨膜区域和包含分裂酪氨酸激酶结构域的胞内部分。VEGF-A是参与血管生成的主要因子。它结合VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(KDR/Flk-1)，这两种高亲和力酪氨酸激酶受体(TKR)几乎只在内皮细胞上表达。VEGF-B选择性结合VEGFR-1(Flt-1)。VEGF-C和VEGF-D，但不是VEGF-A，是介导淋巴管生成的VEGFR-3(Flt4)的配体。VEGF-C可以刺激淋巴管生成(通过VEGFR3)和通过VEGFR2刺激血管生成。
在一些实施例中，本发明的VEGFR组分包含一个或多个Ig样结构域，该结构域衍生自Flt1、Flk1或Flt4胞外配体结合区中的一个或多个，其介导与VEGF蛋白的结合。在一些实施例中，VEGFR组分包含衍生自Flt1和Flk1或Flt1和Flt4或其功能等同物的胞外配体结合区的Ig样结构域，形成“嵌合VEGFR”组分。
Flt-1、Flt-4或Flk-1的术语“Ig样结构域”旨在不仅包括完整的野生型结构域，还包括其插入、缺失和/或取代变体，这些变体基本上保留了完整结构域的功能特征。对于本领域的技术人员而言显而易见的是，可以获得Ig样结构域的许多变体，其将保留与野生型结构域基本上相同的功能特征。
术语“功能等同物”当用于提及Ig样结构域“X”时，旨在涵盖具有至少一个改变(例如缺失、添加和/或取代)的Ig样结构域“X”，它保留了与野生型Ig样结构域“X”基本相同的功能特征，即与VEGF的基本等效结合。应当理解，在不脱离本发明关于这些受体组分结合和灭活/中和VEGF的能力的精神的情况下，可以在Ig样结构域“X”中进行各种氨基酸取代。因此，可以在本发明的VEGFR组分的一个或多个Ig样结构域中进行点突变和其他更广泛的变异，以赋予有意义的特性，这些特性不会显著影响VEGFR组分结合和抑制VEGF活性的能力。VEGFR组分的功能特征可以通过本领域已知的用于测量所期望特征的任何合适的筛选测定来确定。其他测定，例如，特异性结合VEGF的能力的变化可以通过竞争型VEGF结合测定来测量。可以通过本领域技术人员已知的方法测量蛋白质特性(例如热稳定性、疏水性、对蛋白水解降解的敏感性或聚集趋势)的修饰。另请参见“V.制备方法”节下的“1.氨基酸序列变体”小节。
在一些实施例中，VEGFR组分包含独立地选自由Flt1、Flk1和Flt4组成的组的一个或多个(例如，1、2、3、4、5个或更多个)VEGFR的一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7或更多个)Ig样结构域。在一些实施例中，VEGFR组分包含Flt-1或Flk-1的Ig样结构域。在一些实施例中，VEGFR组分包含Flt-1的Ig样结构域1(下文称为Flt1d1)、Flt1d2、Flt1d3、Flt1d4、Flt1d5、Flt1d6或Flt1d7中的一个或多个。在一些实施例中，VEGFR组分包含Flk-1的Ig样结构域1(下文称为Flk1d1)、Flk1d2、Flk1d3、Flk1d4、Flk1d5、Flk1d6或Flk1d7中的一个或多个。在一些实施例中，VEGFR组分包含Flt-4的Ig样结构域1(下文称为Flt4d1)、Flt4d2、Flt4d3、Flt4d4、Flt4d5、Flt4d6或Flt4d7中的一个或多个。在一些实施例中，VEGFR组分包含Flt1d2。在一些实施例中，VEGFR组分包含Flk1d3。在一些实施例中，VEGFR组分包含第一VEGFR的Ig样结构域2和第二VEGFR的Ig样结构域3。在一些实施例中，第一VEGFR是Flt1，并且第二VEGFR是Flk1或Flt4。
在一些实施例中，VEGFR组分包含Flt1、Flk1或Flt4的1、2、3、4、5、6或7个Ig样结构域。在一些实施例中，VEGFR组分包含2、3、4、5、6或7个Ig样结构域，其包含来自Flt-1和Flk-1，或Flt1和Flt4的Ig样结构域的混合物。例如，在一些实施例中，VEGFR组分包含一个来自Flk-1的Ig样结构域和两个来自Flt-1的Ig样结构域。在一些实施例中，VEGFR组分包含全部来自Flt-1的2、3、4、5、6或7个Ig样结构域。在一些实施例中，VEGFR组分包含全部来自Flk-1的2、3、4、5、6或7个Ig样结构域。在一些实施例中，VEGFR组分包含全部来自Flt4的2、3、4、5、6或7个Ig样结构域。在一些实施例中，VEGFR组分由Flt1、Flk1、和/或Flt4的1、2、3、4、5、6或7个Ig样结构域组成。在一些实施例中，VEGFR组分基本上由Flt1、Flk1、和/或Flt4的1、2、3、4、5、6或7个Ig样结构域组成。在一些实施例中，VEGFR组分包含不是来自Flt1、Flk1或Flt4的Ig样结构域的部分。
在一些实施例中，VEGFR组分内的两个或更多个Ig样结构域彼此直接融合。在一些实施例中，VEGFR组分内的两个或更多个Ig样结构域通过一个或多个结构域接头(例如来自Flt1、Flk1或Flt4的内源结构域接头，例如连接Flt1d2和Flt1d3的结构域接头)相互融合。在一些实施例中，VEGFR组分内的Ig样结构域通过肽接头连接(参见，例如下面的“肽接头”小节)，例如(GGGGS)n(SEQ ID NO:106)，其中n是至少1的整数，例如(GGGGS)3(SEQ ID NO:30)。在一些实施例中，VEGFR组分内的Ig样结构域通过非肽接头连接(参见，例如下面的“非肽接头”小节)，例如硫酯。可以提供接头序列以减少空间位阻，使得一个或多个VEGFR组分和多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段可以呈现它们的最佳三级结构和/或与其相应的靶分子适当地相互作用。
在一些实施例中，VEGFR组分包含Flt1d2。在一些实施例中，VEGFR组分进一步包含Flk1d3。在一些实施例中，VEGFR组分进一步包含第三VEGFR的Ig样结构域，和任选地第四VEGFR的Ig样结构域，其中第三/第四Ig样结构域选自由Flk1d1、Flk1d4、Flk1d5、Flt1d4和Flt1d5组成的组。在一些实施例中，VEGFR组分进一步包含Flk1d4。在一些实施例中，VEGFR组分包含Flt1d2和Flk1d3。在一些实施例中，VEGFR组分基本上由Flt1d2和Flk1d3组成。在一些实施例中，VEGFR组分由Flt1d2和Flk1d3组成。在一些实施例中，VEGFR组分包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在一些实施例中，VEGFR组分包含Flt1d2、Flk1d3和Flk1d4。在一些实施例中，VEGFR组分基本上由Flt1d2、Flk1d3和Flk1d4组成。在一些实施例中，VEGFR组分由Flt1d2、Flk1d3和Flk1d4组成。
VEGFR组分可以具有任何排列的Ig样结构域。例如，在一些实施例中，包含融合至抗Ang2全长抗体的轻链的C末端的VEGFR组分的抗体融合蛋白包含以下(或由以下组成或基本上由以下组成)：具有以下任何构型(从N末端到C末端)的轻链-VEGFR组分融合多肽，其中L是任选的接头(例如，肽接头)：(1)VL-CL-L-Flk1d3-Flt1d2；(2)VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3；(3)VL-CL-L-Flk1d4-Flk1d3-Flt1d2；或(4)VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4等。在一些实施例中，抗体融合蛋白包含两个或更多个VEGFR组分，其可以相同或不同(例如，包含不同的Ig样结构域，Ig样结构域之间的不同接头、不同数量的Ig样结构域和/或Ig样结构域的不同排列)。例如，在一些实施例中，抗体融合蛋白包含融合至抗Ang2全长抗体的第一轻链的C末端的第一VEGFR组分，以及融合至抗Ang2全长抗体的第二轻链的C末端的第二VEGFR组分，其中两个轻链融合多肽可包含以下(或由以下组成或基本上由以下组成)：任何以下构型(从N末端到C末端)，其中L是任选的接头(例如，肽接头)：(1)i)VL-CL-L-Flk1d3-Flt1d2和ii)VL-CL-L-Flk1d3-Flt1d2；(2)i)VL-CL-L-Flk1d3-Flt1d2和ii)VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3；(3)i)VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3和ii)VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3；(4)i)VL-CL-L-Flk1d4-Flk1d3-Flt1d2和ii)VL-CL-L-Flk1d4-Flk1d3-Flt1d2；(5)i)VL-CL-L-Flk1d4-Flk1d3-Flt1d2和ii)VL-CL-L-Flk1d3-Flt1d2；(6)i)VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4和ii)VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4；(7)i)VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3和ii)VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4；(8)i)VL-CL-L-Flk1d3-Flk1d4和ii)VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4；(9)i)VL-CL-L-Flk1d4-Flk1d3-Flt1d2和ii)VL-CL-L-Flk1d4-Flk1d3；等。
在一些实施例中，Flt1、Flk1和/或Flt4的一个或讴歌Ig样结构域是VEGFR组分的仅有的一个或多个Ig样结构域。在一些实施例中，Flt1d2是VEGFR组分的仅有的Ig样结构域。在一些实施例中，Flt1d2和Flk1d3是VEGFR组分的仅有的Ig样结构域。在一些实施例中，Flt1d2、Flk1d3和Flk1d4是VEGFR组分的仅有的Ig样结构域。在一些实施例中，Flk1d1、Flt1d2和Flk1d3是VEGFR组分的仅有的Ig样结构域。在一些实施例中，Flt1d2、Flk1d3和Flt1d4是VEGFR组分的仅有的Ig样结构域。在一些实施例中，Flt1d2、Flk1d3和Flt1d4是VEGFR组分的仅有的Ig样结构域。在一些实施例中，Flt1d2、Flk1d3、Flk1d4和Flk1d5是VEGFR组分的仅有的Ig样结构域。在一些实施例中，Flt1d2、Flk1d3、Flt1d4和Flt1d5是VEGFR组分的仅有的Ig样结构域。
在一些实施例中，VEGFR组分是至少约4kDa。在一些实施例中，VEGFR组分是约4kDa至约100kDa，例如约4kDa至约15kDa、约10kDa至约30kDa、约10kDa至约70kDa、10kDa至约60kDa、约10kDa至约50kDa、10kDa至约40kDa、约15kDa至约30kDa、约20kDa至约35kDa、约25kDa至约40kDa、约30kDa至约45kDa、约35kDa至约50kDa、约20kDa至约30kDa、约20kDa至约40kDa或约20kDa至约50kDa。在一些实施例中，VEGFR组分是约20kDa至约35kDa，例如约22kDa至约24kDa。
VEGFR组分的长度是至少约为36个氨基酸(aa)。在一些实施例中，VEGFR组分的长度是约36aa至约900aa，例如以下中的任一项：约36aa至约100aa、约50aa至约200aa、约100aa至约750aa、约100aa至约650aa、约100aa至约550aa、约100aa至约450aa、约100aa至约350aa、约100aa至约250aa、约150aa至约300aa、约200aa至约350aa、约250aa至约400aa、约300aa至约450aa、约350aa至约500aa、约400aa至约550aa、约450aa至约600aa、约500aa至约650aa、约150aa至约250aa、约150aa至约400aa、约150aa至约500aa或约150aa至约600aa。在一些实施例中，VEGFR组分是。在一些实施例中，VEGFR组分的长度是约100aa至约250aa，例如约200aa至约250aa(例如，205aa)。
VEGFR组分的活性
在一些实施例中，抗体融合蛋白包含两个或更多个VEGFR组分。在一些实施例中，两个或更多个VEGFR组分具有相同或相似(例如，在约2倍差异内)的结合亲和力。在一些实施例中，两个或更多个VEGFR组分具有不同的结合亲和力。
VEGFR组分(例如抗体融合蛋白的VEGFR组分)与VEGF的结合特异性和/或亲和力可以通过本领域已知的方法通过实验确定。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA、MSD电化学发光、基于珠的MIA、RIA、SPR、ECL、IRMA、EIA、Biacore测定、Octet分析、肽扫描、FACS、或竞争型VEGF结合测定等。
例如，在基于ELISA的结合中，可以用VEGF包被ELISA板，然后将不同浓度的VEGFR或本文所述的抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白添加到每个孔中。孵育和洗涤后，可添加二抗如HRP缀合抗体(例如用于检测包含抗Ang2全长抗体的抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白的抗IgG Fc)以检测与VEGF结合的VEGFR或抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白。将HRP底物添加到每个孔中。可以使用酶标仪在450nm处测量每个孔的光密度(OD)。然后可以计算出EC50。
在一些实施例中，VEGFR组分与VEGF之间结合的KD为约10-5M至约10-15M，例如约10- 7M至约10-15M，或约10-9M至约10-15M。
在一些实施例中，将一个或多个VEGFR组分与多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段融合不影响一个或多个VEGFR组分对VEGF的结合亲和力和/或特异性，例如，融合的一个或多个VEGFR组分和VEGF之间的结合(例如KD)与相应的非融合VEGFR组分(例如，可溶性VEGFR)和VEGF之间的结合(例如，KD)相同或相差约2倍以内。在一些实施例中，将一个或多个VEGFR组分与多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段融合降低一个或多个VEGFR组分对VEGF的结合亲和力和/或特异性，例如，融合的一个或多个VEGFR组分和VEGF之间的结合KD是相应的非融合的VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD的约2倍以上。在一些实施例中，将一个或多个VEGFR组分与多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段融合增加一个或多个VEGFR组分对VEGF的结合亲和力和/或特异性，例如，相应的非融合的VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD是融合的一个或多个VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD的约2倍以上。
VEGFR组分(例如抗体融合蛋白的VEGFR组分)的生物学活性可以通过本领域已知的任何方法来确定，例如竞争型VEGF结合测定、VEGF依赖性受体磷酸化测定(例如，使用原代人内皮细胞(HUVEC))或VEGF依赖性报告基因表达测定(例如，使用在细胞表面表达VEGFR并携带受VEGFR激活控制的报告基因的细胞)，以测量VEGFR组分(或抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白)在测定系统(如表达VEGFR的细胞)中或在体内阻断/减少VEGF结合和/或激活VEGFR的能力。对于示例性方法还参见实例1。
在一些实施例中，将一个或多个VEGFR组分融合至多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段并不影响一个或多个VEGFR组分的生物活性，例如，融合的一个或多个VEGFR组分的生物活性(例如，针对VEGF的阻断/中和活性)与对应的非融合VEGFR组分(例如，可溶性VEGFR)的生物活性相同，或差异在约2倍以内。在一些实施例中，与对应的非融合VEGFR组分相比，将一个或多个VEGFR组分融合至多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段会降低(例如，降低至少约2倍)一个或多个VEGFR组分的生物活性。在一些实施例中，与对应的非融合VEGFR组分相比，将一个或多个VEGFR组分融合至多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段会增加(例如，增加至少约2倍)一个或多个VEGFR组分的生物活性(例如，增强针对VEGF的阻断/中和活性)。
接头
在一些实施例中，抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白可以包含位于VEGFR组分与多价(例如，二价)抗Ang2抗体(例如，全长抗体)或其抗原结合片段之间、位于VEGFR组分的两个或更多个Ig样结构域之间、位于两个或更多个VEGFR组分之间、位于多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段的两个或更多个抗Ang2结合结构域之间或位于多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段的抗Ang2结合结构域与连接部分(例如，Fc结构域或白蛋白)之间的一个或多个接头，该连接部分连接两个或更多个抗Ang2结合结构域。抗体融合蛋白中使用的一个或多个接头的长度、柔性程度和/或其他特性可能会对以下特性产生一些影响，包括但不限于对Ang2以及对VEGFR组分的亲和力、特异性或亲合力，和/或它们对应的生物活性(例如，结合至Ang2和激活Tie2，阻断/中和VEGF)。例如，可以选择更长的接头以确保两个相邻的结构域在空间上不会彼此干扰。在某些实施例中，接头(例如肽接头)包含柔性残基(例如甘氨酸和丝氨酸)，使得相邻的结构域相对于彼此自由移动。例如，甘氨酸-丝氨酸双联体可以是合适的肽接头。在一些实施例中，接头是非肽接头。在一些实施例中，接头是肽接头。在一些实施例中，接头是不可切割的接头。其他接头考虑因素包括对所得抗体融合蛋白的物理或药代动力学特性的影响，例如溶解度、亲脂性、亲水性、疏水性，稳定性(更稳定或更不稳定以及计划的降解)、刚性、柔性、免疫原性，抗体/VEGFR结合的调节、掺入胶束或脂质体的能力等。
在一些实施例中，抗体融合蛋白包含两个或更多个接头。在一些实施例中，两个或更多个接头相同。在一些实施例中，两个或更多个接头不同(例如，彼此不同)。在一些实施例中，一个或多个接头是柔性接头。在一些实施例中，一个或多个接头是稳定的接头。在一些实施例中，一些接头是柔性的，而其他接头是稳定的。通常，接头不影响或不显著影响由抗体融合蛋白构型形成的正确折叠和构象。在一些实施例中，接头为抗体融合蛋白的每个部分赋予灵活性和空间空隙，诸如允许Ang2-抗Ang2结合结构域结合、允许VEGF-VEGFR组分结合、在两个结合结构域或结构域亚基(例如，Ig样结构域)之间提供灵活性和/或足够的空隙以确保适当的结合结构域活性(结合亲和力和/或生物活性)等。
肽接头
肽接头可以是任何长度。在一些实施例中，肽接头的长度是约1个氨基酸(aa)至约10aa、约2aa至约15aa、约3aa至约12aa、约1个氨基酸至约20aa、约20aa至约30aa、约1个氨基酸至约30aa、约10aa至约30aa、约1个氨基酸至约50aa、约2aa至约18aa、约2aa至约10aa、约5aa至约20aa、约10aa至约20aa或约6aa至约30。在一些实施例中，肽接头的长度是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸中的任一者。在一些实施例中，肽接头的长度是约21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸中的任一者。在一些实施例中，肽接头的长度是约31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸中的任一者。在一些实施例中，接头的长度是约12至约15个氨基酸。
在一些实施例中，接头是稳定的接头(例如，不可被蛋白酶，尤其是MMP切割)。
肽接头可具有天然存在的序列或非天然存在的序列。例如，源自仅有重链的抗体的铰链区的序列可以用作接头。参见，例如，WO 1996/34103。在一些实施例中，肽接头是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4铰链或其部分。在一些实施例中，肽接头是突变的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4铰链或其部分。在一些实施例中，接头是柔性接头。示例性柔性接头包括但不限于甘氨酸聚合物(G)n(SEQ ID NO:103)、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括，例如，(GS)n(SEQ IDNO:104)、(GSGGS)n(SEQ ID NO:105)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:106)、和(GGGS)n(SEQ ID NO:107)，其中n是至少是一的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、和本领域已知的其他柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化，并且因此可能能够作为组分之间的中性系链。甘氨酸比丙氨酸可到达显著更多的phi-psi空间，并且比具有较长侧链的残基所受限制小得多(Scheraga,Rev.Computational Chem.11:173-142(1992))。本领域普通技术人员将认识到，抗体融合蛋白的设计可以包括全部或部分为柔性的接头，使得该接头可以包括柔性接头部分以及赋予较小的柔性结构以提供所希望的抗体融合蛋白结构的一个或多个部分。在一些实施例中，接头包含SEQ ID NO:30或31的氨基酸序列。
非肽接头
本文所述的任何一个或所有接头都可以通过将两个分子连接的任何化学反应来实现，只要多价抗Ang2抗体(例如，全长抗体)或其抗原结合片段和VEGFR组分保留它们各自的活性(结合活性和/或生物活性和/或Fc效应子活性)。该联接可以包括许多化学机制，例如共价结合、亲和力结合、插入、配位结合和络合。在一些实施例中，结合是共价结合。共价结合可以通过现有侧链的直接缩合或通过外部桥接分子的并入来实现。许多二价或多价连接剂可用于偶联蛋白质分子。例如，代表性的偶联剂可包括有机化合物，例如硫酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和六亚甲基二胺。该清单并非旨在穷尽本领域中已知的各种偶联剂，而是更常见的偶联剂的示例(参见Killen和Lindstrom,Jour.Immun.133:1335-2549(1984)；Jansen等人,Immunological Reviews 62:185-216(1982)；和Vitetta等人,Science 238:1098(1987))。
可以在本申请中应用的接头在文献中有所描述(参见例如Ramakrishnan,S.等人,Cancer Res.44:201-208(1984)，其描述MBS(M-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯))的用途。在一些实施例中，本文使用的非肽接头包括：(i)EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基-丙基)碳二亚胺盐酸盐)(ii)SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)-甲苯(Pierce Chem.Co.,目录号(21558G)))；(iii)SPDP(琥珀酰亚胺基-6[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸酯(Pierce Chem.Co.,目录号21651G))；(iv)磺基-LC-SPDP(磺基琥珀酰亚胺基6[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺]己酸酯(Pierce Chem.Co.目录号2165-G))；以及(v)缀合至EDC的磺基-NHS(N-羟基磺基-琥珀酰亚胺:Pierce Chem.Co.,目录号24510)。
上述接头可以包含具有不同属性的组分，从而导致具有不同理化特性的抗体融合蛋白。例如，烷基羧酸盐的磺基-NHS酯比芳香族羧酸盐的磺基-NHS酯更稳定。含NHS酯的接头的可溶性不如磺基-NHS酯。此外，接头SMPT含有空间受阻的二硫键，并且可以形成具有增强的稳定性的融合蛋白。二硫键通常比其他键不稳定，因为二硫键在体外被切割，导致可用的融合蛋白更少。特别地，磺基-NHS可以增强碳二亚胺偶联的稳定性。当与磺基-NHS配合使用时，碳二亚胺偶联(例如EDC)形成比单独的碳二亚胺偶联反应对水解的抵抗力更大的酯。
III.药物组合物
进一步提供了组合物(例如，药物组合物)，其包含本文所述的任何一种抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白，以及任选的药学上可接受的载剂。药物组合物可通过将具有所希望的纯度的抗体融合蛋白与任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂混合来制备(Remington's Pharmaceutical Sciences第16th版,Osol,A.Ed.(1980))，呈冻干配制品或水溶液的形式。
重构配制品可通过将冻干抗体融合蛋白溶解在稀释剂中使得蛋白质分散于其中来制备。适合用于本申请的示例性的药学上可接受的(对于向人施用是安全且无毒的)稀释剂包括但不限于无菌水、抑菌注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或葡萄糖溶液，或盐和/或缓冲剂的水溶液。
在一些实施例中，药物组合物包含本文所述的抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白的均质群体。均质群体是指抗体融合蛋白彼此完全相同，例如，相同的抗体融合蛋白构型、相同的VEGFR组分、相同的多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段，以及相同的接头(如果有的话)。在一些实施例中，药物组合物中至少约70％(如至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)的抗体融合蛋白是均质的。
药物组合物优选是稳定的，其中抗体融合蛋白在储存后基本上保持其物理和化学稳定性和完整性。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本领域中是可获得的，并且在Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee编,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)中有综述。稳定性可以在选定的温度下测量选定的时间段。对于快速筛选，可将配制品在40℃下保持2周至1个月，此时测量稳定性。在配制品要在2-8℃下储存的情况下，通常配制品应在30℃或40℃下稳定至少1个月，和/或在2-8℃下稳定至少2年。在配制品要在30℃下储存的情况下，通常配制品应在30℃下稳定至少2年，和/或在40℃下稳定至少6个月。例如，储存期间的聚集程度可用作蛋白质稳定性的指标。在一些实施例中，本文所述的抗体融合蛋白的稳定配制品可包含少于约10％(优选少于约5％)的作为配制品中的聚集体存在的抗体融合蛋白。
生理上可接受的载剂的实例包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子诸如钠离子；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂诸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
缓冲剂用于将pH控制在优化治疗有效性的范围内，特别是如果稳定性是pH依赖性的。缓冲剂优选以约50mM至约250mM的浓度存在。适合用于本申请的缓冲剂包括有机酸和无机酸以及它们的盐。例如，柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、乙酸盐。另外，缓冲剂可包含组氨酸盐和三甲胺盐，诸如Tris。
添加防腐剂以延缓微生物生长，并且防腐剂通常以0.2％-1.0％(w/v)的范围存在。防腐剂的添加可以例如促进多次用(多剂量)配制品的生产。适合用于本申请的防腐剂包括十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎卤化铵(例如、苯扎氯铵、苯扎溴铵、苯扎碘铵)、苄索氯铵；硫柳汞、苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇、3-戊醇和间甲酚。
存在张度剂(有时称为“稳定剂”)以调节或维持组合物中液体的张力。当与大的带电荷的生物分子诸如蛋白质和抗体一起使用时，它们常常称为“稳定剂”，因为它们可以与氨基酸侧链的带电荷的基团相互作用，从而降低分子间和分子内相互作用的潜力。考虑到其他成分的相对量，张度剂可以以0.1重量％至25重量％，优选1重量％至5重量％的任何量存在。优选的张度剂包括多羟基糖醇，优选三羟基或更高级的糖醇，诸如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
另外的赋形剂包括可用作以下的一种或多种的药剂：(1)填充剂，(2)增溶剂，(3)稳定剂和(4)防止变性或粘附至容器壁的药剂。
存在非离子表面活性剂或洗涤剂(也称为“润湿剂”)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白质免于搅动引起的聚集，从而允许配制品暴露于剪切表面应力而不会引起活性治疗性蛋白质或抗体的变性。非离子表面活性剂以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml，优选约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。
合适的非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)、泊洛沙姆(184、188等)、多元醇、聚氧乙烯脱水山梨醇单醚(等)、聚桂醇400、硬脂酸聚烃氧40酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。可以使用的阴离子洗涤剂包括月桂基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠和二辛基磺酸钠。阳离子洗涤剂包括苯扎氯铵或苄索氯铵。
为了使药物组合物用于体内施用，它们必须是无菌的。可通过无菌滤膜过滤而使药物组合物无菌。本文的药物组合物通常置于具有无菌入口的容器中，例如具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
可以制备持续释放配制品。持续释放配制品的合适实例包括含有拮抗剂的固体疏水性聚合物的半渗透性基质，这些基质为成形制品的形式，例如膜或微胶囊。
本文的药物组合物还可以含有一种以上的所治疗的特定适应症所必需的活性化合物，优选具有彼此没有不利影响的互补活性的那些活性化合物。可替代地或另外地，该组合物可包含细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂或生长抑制剂。此类分子适当地以对预期目的有效的量组合存在。
也可以将活性成分包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊，分别例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中，包埋在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或包埋在粗乳液中。此类技术披露于Remington’s Pharmaceutical Sciences第18版中。
本文公开的抗体融合蛋白可以配制成免疫脂质体。含有抗体融合蛋白的脂质体通过本领域已知的方法制备，例如描述于以下：Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688(1985)；Hwang等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA,77:4030(1980)；以及美国专利号4,485,045和4,544,545。美国专利号5,013,556中公开了具有延长的循环时间的脂质体。特别有用的脂质体可以通过反相蒸发法使用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物生成。脂质体通过确定孔径的过滤器挤出，以产生具有所期望直径的脂质体。
在一些实施例中，药物组合物容纳在一次性小瓶，诸如一次性密封小瓶中。在一些实施例中，药物组合物容纳在多次用小瓶中。在一些实施例中，药物组合物散装容纳在容器中。在一些实施例中，药物组合物是冷冻保存的。
用于治疗眼部新生血管障碍的药物组合物
为了治疗眼部新生血管障碍例如糖尿病性视网膜病变和AMD，包含本文描述的抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白的药物组合物的施用将直接施用于眼睛，例如局部施用。局部施用方法包括但不限于滴眼剂、结膜下注射、结膜下植入、玻璃体内注射、玻璃体内植入、眼球筋膜下注射或眼球筋膜下植入。在一些实施例中，本文所述的抗-Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白或其药物组合物通过玻璃体内注射施用。
适用于局部施用的组合物是本领域已知的(参见例如美国专利申请2005/0059639)。在各种实施例中，本发明的组合物可包含液体，该液体包含溶液、悬浮液或两者中的活性剂。如本文所用，液体组合物包括凝胶。优选液体组合物是水性的。可替代地，该组合物可以采用软膏的形式。在优选的实施例中，该组合物是原位可胶凝的水性组合物，更优选原位可胶凝的水性溶液。这样的组合物可以包含一定浓度的胶凝剂，该浓度足以在与眼睛或眼睛外部的泪液接触时有效地促进胶凝。本发明的水性组合物具有眼科相容的pH和渗透压重量摩尔浓度。该组合物可以包含眼用储库配制品，该配制品包含用于结膜下施用的活性剂。包含活性剂的微粒可以包埋在生物相容的药学上可接受的聚合物或脂质包封剂中。储库配制品可适于在延长的时间段内释放所有或基本上所有的活性材料。聚合物或脂质基质，如果存在的话，可以适应于充分降解以在所有或基本上所有活性剂释放后从施用部位运输。储库配制品可以是液体配制品，其包含药学上可接受的聚合物和溶解或分散的活性剂。注射后，聚合物在注射部位形成储库，例如通过凝胶化或沉淀。该组合物可以包含固体制品，该固体制品可以被插入眼中合适的位置(诸如眼睛和眼睑之间或结膜囊中)、插入眼的腔室(诸如前室或后室)中，或者可以被植入在巩膜、脉络膜间隙或玻璃体外部的无血管区域之中或之上，制品在该处释放活性剂。适合以这种方式植入眼中的固体制品通常包含聚合物并且可以是可生物蚀解的或非生物蚀解的。植入物对于活性剂可以是可渗透的或不可渗透的。在一些实施例中，植入物可以定位在无血管区域上，例如在巩膜上，以允许药物经巩膜扩散到期望的治疗部位，例如眼内间隙和眼睛的黄斑。此外，经巩膜扩散的部位可能靠近新血管形成部位，例如靠近黄斑的部位。
许多用于提供持续释放的聚合物递送媒剂已用于眼部环境中并且可用于施用本发明的组合物。可以使用各种聚合物，例如生物可降解的生物相容性聚合物。聚合物可以是均聚物、共聚物(包括嵌段共聚物)、直链、支链或交联的。有用的聚合物包括但不限于聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、聚(膦嗪)、聚(磷酸酯)、聚己内酯、聚酐、乙烯醋酸乙烯酯、聚原酸酯、聚醚和聚(β氨基酯)。
聚(原酸酯)已被引入眼中并显示出对持续释放眼部药物递送有利的特性(Einmahl,S.,Invest.Opthalmol.Vis.Sci.,43(5),2002)。聚丙交酯颗粒已被用于在玻璃体内注射这种颗粒的悬浮液后将药剂靶向视网膜和RPE(Bourges,J-L,et al,Invest.Opthalmol.Vis.Sci.,44(8),2003)。
制备持续释放配制品的方法包括将本文所述的抗体融合蛋白与聚合物组分组合或混合以形成混合物。然后可将混合物挤出、压缩、模塑等以形成单一组合物。任选地，可以使用热和/或压力。然后可以处理单一组合物以形成适合放置在患者眼睛中的单个植入物或颗粒。将治疗性活性剂掺入聚合物基质中的其他方法是本领域已知的。聚合物基质可以形成各种形状，例如棒、盘、圆片等，它们可以具有一定范围的不同尺寸(例如，长度、宽度等)和体积。示例性的形状包括球形、圆柱形、螺旋形、线圈形或螺旋形、旋转形、立方形、圆锥形、椭圆形、双凸形、半球形或近半球形等。
IV.治疗疾病的方法
血管内皮增殖和血管生成是多种疾病和障碍的重要组分，该多种疾病和障碍包括肿瘤生长和转移、类风湿性关节炎、银屑病、动脉粥样硬化、血管瘤、糖尿病性视网膜病变、晶状体后纤维增生症、新生血管性青光眼、黄斑变性和相关病症(例如AMD)、血管瘤、移植的角膜组织和其他组织的免疫排斥、感染、和慢性炎症。本文所述的抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白可用于多种应用，例如诊断、分子测定和疗法。在一些实施例中，提供了治疗个体(例如，人)的疾病或病症(例如，癌症或非肿瘤性障碍)的方法，该方法包括向个体施用有效量的(1)抗体融合蛋白，其包含：i)多价(例如，二价)抗Ang2抗体(例如，全长抗体)或其抗原结合片段，和ii)VEGFR组分，其中该多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段不抑制Ang2和Tie2之间的结合；和(2)任选的药学上可接受的载剂。在一些实施例中，提供了治疗个体(例如，人)的疾病或病症(例如，癌症或非肿瘤性障碍)的方法，该方法包括向个体施用有效量的本文所述的任何抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白或其药物组合物。施用途径根据已知的和接受的方法，诸如通过单次或多次推注或以合适的方式在长时间段内输注，例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、病灶内或关节内途径注射或输注，局部施用，吸入或通过持续释放或延长释放方式。在一些实施例中，药物组合物局部施用，诸如肿瘤内施用或玻璃体内施用。
非肿瘤性障碍
在一些实施例中，可由本发明治疗的非肿瘤性障碍与VEGF表达无关。在一些实施例中，可由本发明治疗的非肿瘤性障碍与VEGF表达(例如VEGF过表达)有关。VEGF过度表达可导致非肿瘤性病症，例如类风湿性关节炎、银屑病、动脉粥样硬化、血管瘤、移植的角膜组织和其他组织的免疫排斥、慢性炎症、和眼部新生血管障碍(例如糖尿病性视网膜病变、晶状体后纤维增生症、新生血管性青光眼、以及黄斑变性和相关病症，例如AMD)。在一些实施例中，可由本发明治疗的非肿瘤性障碍与异常的Ang2表达有关，诸如Ang2过表达或Ang2表达不足(在这种情况下，本文所述的抗体融合蛋白可帮助聚簇Ang2以促进Tie2结合)。在一些实施例中，可由本发明治疗的非肿瘤性障碍与异常的Tie2活性有关，诸如Tie2激活不足(在这种情况下，本文所述的抗体融合蛋白可帮助聚簇Ang2以促进Tie2结合、Tie2受体聚簇和激活)。
在一些实施例中，提供了一种治疗个体(例如，人)的非肿瘤性障碍(诸如眼部新生血管障碍，例如糖尿病性视网膜病变和AMD)的方法，该方法包括向个体施用有效量的本文所述的任何抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白，或其药物组合物。在一些实施例中，非肿瘤性障碍与VEGF过表达相关。在一些实施例中，非肿瘤性障碍与Ang2过表达相关。在一些实施例中，非肿瘤性障碍与减少或不足的Tie2激活有关。在一些实施例中，该非肿瘤性障碍选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、银屑病、动脉粥样硬化、血管瘤、移植排斥(例如移植的角膜组织或其他组织的排斥)、慢性炎症、感染、和眼部新生血管障碍(例如糖尿病性视网膜病变、晶状体后纤维增生症、新生血管性青光眼、黄斑变性及相关病症(例如AMD))。在一些实施例中，本文所述的抗体融合蛋白或其药物组合物被全身施用(例如，静脉内)。
类风湿性关节炎是一种慢性疾病，可表现出多种全身表现。这种疾病的病因不明，其特征是表现为持续性炎性滑膜炎，通常以对称分布累及外周关节。导致软骨破坏、骨侵蚀和最终关节畸形的补体介导的炎症是该疾病的最重要特征。因此，本文提供的方法可用于治疗类风湿性关节炎。
银屑病(寻常型银屑病)是一种慢性炎症性皮肤病，其特征是红色、鳞状、凸起的斑块。疾病过程由T细胞浸润和相关的细胞因子水平升高驱动，导致细胞分裂和异常分化增加，从而导致银屑病表型。斑块状银屑病在世界范围内的患病率为2-3％，是一种严重程度不同的慢性、复发性皮肤病。银屑病可严重影响患者的生活质量，导致与其他主要医学疾病可比的身体和精神功能残疾，该医学疾病例如二型糖尿病、高血压、心肌梗死、沮丧、和关节炎、它还与严重的合并症有关，该合并症包括银屑病关节炎、沮丧、恶性肿瘤、代谢综合征、心血管发病和死亡以及自身免疫性疾病，例如炎性肠病(iBD)。
动脉粥样硬化是动脉壁的疾病，其中的层变厚，导致通道变窄，从而有碍血流。动脉粥样硬化可能发生在身体的任何部位，但当它发生在心脏、脑或通向脑干的血管时，对受试者的伤害最大。动脉粥样硬化包括动脉壁增厚和硬化，或脂肪、胆固醇和其他物质的积累，形成动脉粥样硬化或斑块。动脉粥样硬化也可能由钙化、出血、溃疡、血栓形成和/或外伤引起。
血管瘤是由于血管异常聚集而形成的非癌性生长物。它们通常存在于皮肤或内脏器官上，尤其是肝，并且通常是先天性的。
在一些实施例中，本发明所治疗的疾病为慢性炎症，包括但不限于哮喘、慢性消化性溃疡、肺结核、类风湿性关节炎、慢性牙周炎、溃疡性结肠炎和克罗恩病、慢性鼻窦炎和慢性活动性肝炎。慢性炎症可能是由于未能消除引起急性炎症的任何因素、对自身抗原的自身免疫应答或持续存在的低强度慢性刺激物所致。
眼部新生血管障碍
在一些实施例中，非肿瘤性障碍是眼部新生血管障碍。因此，在一些实施例中，提供了治疗个体(例如人)的眼部新生血管障碍(例如，糖尿病性视网膜病变或AMD，例如湿性AMD)的方法，该方法包括向个体施用有效量的本文所述的任何抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白或其药物组合物。在一些实施例中，眼部新生血管障碍与脉络膜新血管形成、血管渗漏和视网膜水肿中的一种或多种相关。在一些实施例中，本文所述的抗体融合蛋白或其药物组合物的施用选自由以下组成的组：滴眼剂、结膜下注射、结膜下植入、玻璃体内注射、玻璃体内植入、眼球筋膜下注射和眼球筋膜下植入。在一些实施例中，本文所述的抗体融合蛋白或其药物组合物通过玻璃体内注射施用。在一些实施例中，该方法进一步包括使个体接受另外的眼部疗法。在一些实施例中，治疗眼部新生血管障碍的方法具有以下生物活性中的一种或多种：(1)抑制或预防玻璃膜疣的形成；(2)导致玻璃膜疣数量和/或大小减小(玻璃膜疣消退)；(3)减少或预防脂褐素沉积；(4)抑制或预防视力丧失或减缓视力丧失的速度；(5)抑制脉络膜新血管形成或减缓脉络膜新血管形成速率；(6)引起以脉络膜新血管形成为特征的病变的大小和/或数量减小；(7)抑制脉络膜新血管形成或减缓视网膜新血管形成速率；(8)引起以视网膜新血管形成为特征的病变的大小和/或数量减小；(9)改善视力和/或对比敏感度；(10)减少黄斑水肿和/或减少异常黄斑厚度；(11)抑制或预防感光细胞或RPE细胞萎缩或凋亡，或降低感光细胞或RPE细胞萎缩或凋亡的速率；(12)抑制或预防非渗出性黄斑变性向渗出性黄斑变性的进展；以及(13)预防或治疗眼纤维化的发展，例如，通过在存在抗体融合蛋白的情况下将非聚簇的Ang2转化为聚簇的形式，然后激活Tie2信号传导。
几种眼部障碍涉及血管生成的改变。可以根据本发明的方法治疗的眼部新生血管障碍的非限制性实例包括黄斑变性和相关病症(例如渗出性AMD，例如渗出性湿性AMD)、糖尿病性视网膜病变、血管样条纹症、病理性近视、眼部组织胞浆菌病综合征、布鲁赫膜破裂、黄斑水肿(包括糖尿病性黄斑水肿)、结节病和葡萄膜炎。可以通过所披露的方法治疗的病症的其他实例包括萎缩性AMD、圆锥角膜、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、近视、眼部肿瘤、角膜移植排斥、角膜损伤、新生血管性青光眼、角膜溃疡、角膜瘢痕、增生性玻璃体视网膜病变、早产儿视网膜病变、视网膜变性、慢性青光眼、视网膜脱离、和镰状细胞视网膜病变。
糖尿病性视网膜病变是成人失明的第三大主要原因(在美国占失明的近7％)，与广泛的血管生成事件有关。非增生性视网膜病变伴有视网膜内周细胞的选择性丢失，它们的丢失导致相关毛细血管扩张并导致血流量增加。在扩张的毛细血管中，内皮细胞增殖并形成外囊，成为微动脉瘤，并且相邻的毛细血管被阻塞，使得这些微动脉瘤周围的视网膜区域没有灌注。最终，分流血管出现在微动脉瘤的相邻区域之间，并且可以看到早期糖尿病性视网膜病变的临床图像，其具有微动脉瘤和未灌注的视网膜区域。微动脉瘤渗漏，毛细血管可能出血，导致渗出物和出血。一旦确定了背景糖尿病性视网膜病变的初始阶段，病情会在数年内发展，在大约5％的病例中发展为增生性糖尿病性视网膜病变和失明。当视网膜的某些区域继续失去其毛细血管并变得无灌注时，就会发生增生性糖尿病性视网膜病变，从而导致视盘和视网膜其他部位出现新血管。这些新血管长入玻璃体并容易出血，导致视网膜前出血。在晚期增生性糖尿病性视网膜病变中，大量玻璃体出血可能会充满玻璃体腔的主要部分。此外，新生血管伴有纤维组织增生，可导致牵拉性视网膜脱离。
糖尿病性视网膜病变主要与糖尿病病程有关；因此，随着人口老龄化和糖尿病患者寿命的延长，糖尿病性视网膜病变的患病率将会增加。激光疗法目前用于非增生性和增生性糖尿病性视网膜病变。黄斑区周围渗漏性微动脉瘤的局部激光治疗可减少50％临床显著黄斑水肿患者的视力丧失。在增生性糖尿病性视网膜病变中，全视网膜光凝术导致数千处散布在整个视网膜上的微小灼伤(黄斑区除外)；这种治疗可将失明率降低60％。黄斑水肿和增生性糖尿病性视网膜病变的早期治疗可使95％的患者在5年内避免失明，而晚期治疗仅能使50％的患者避免失明。因此，早期诊断和治疗至关重要。
AMD影响了大约十分之一的65岁以上的美国人。AMD的特征是黄斑(视网膜中央区域)发生一系列病理变化，并伴有视力下降，特别是影响中央视力。AMD涉及位于感觉视网膜的正下方的称为视网膜色素上皮细胞的单层细胞。这些细胞滋养和支持与它们接触的视网膜部分，即含有视觉色素的感光细胞。视网膜色素上皮细胞位于布鲁赫(Bruch)膜上，这是一种基底膜复合体，在AMD中会变厚并硬化。新血管可能从下面的脉络膜突破布鲁赫膜，脉络膜含有丰富的血管床。这些血管可能依次在视网膜色素上皮下以及视网膜色素上皮和感觉视网膜之间漏液或出血。随后的纤维疤痕会破坏感光细胞的营养并导致其死亡，从而导致中央视力丧失。由于血管渗漏和视网膜下水肿或血液，这种与年龄相关的黄斑病变被称为“湿”型。湿型仅占年龄相关性黄斑病病例的10％，但导致90％的老年人因黄斑变性而致盲。“干”型的年龄相关性黄斑病涉及视网膜色素上皮细胞的崩解以及上覆感光细胞的丢失。干型会降低视力，但通常只会降低到20/50到20/100的水平。
AMD伴有中央视觉失真，物体看起来更大或更小，或者直线看起来扭曲、弯曲或没有中央部分。在湿型AMD中，在黄斑区可能会注意到感觉性视网膜的小脱离，但视网膜下新生血管膜的明确诊断需要荧光素血管造影术。在干型中，玻璃膜疣可能会扰乱黄斑区的色素沉着模式。玻璃膜疣是视网膜色素上皮细胞基底膜的赘生物，其突入细胞内，导致细胞向前隆起；它们作为年龄相关性黄斑病危险因素的作用尚不清楚。激光治疗用于湿型年龄相关性黄斑病变，最初会消除新生血管膜，并防止约50％的患者在18个月时进一步视力丧失。然而，到60个月时，只有20％的人仍然有实质性的益处。
黄斑水肿与多种眼部障碍有关，包括AMD、糖尿病性视网膜病变、前葡萄膜炎或后葡萄膜炎等炎症。黄斑变厚是由于从变弱的或异常的血管渗漏到附近组织的液体积聚的结果。血液或其他流体的渗漏以及由此导致的黄斑厚度增加会导致视力、色觉等的急剧改变。因此，黄斑水肿会导致患有AMD和其他各种眼部障碍的个体经历视力障碍和丧失。
在一些实施例中，提供了一种通过向个体(例如，人)施用有效量的本文所述的抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白或其药物组合物来治疗或预防该个体的AMD或糖尿病性视网膜病变的一个或多个方面或症状的方法，这些方面或症状包括但不限于新血管形成(诸如脉络膜新血管形成或CNV)、血管渗漏、和/或视网膜水肿、眼玻璃膜疣的形成、眼睛或眼组织的炎症、光感受器细胞的丧失、视力丧失(包括例如视力和视野)以及视网膜脱离。还考虑了AMD的其他方面的治疗，比如光感受器变性、RPE变性、视网膜变性、脉络膜视网膜变性、锥体变性、视网膜功能障碍、对光线暴露(如持续光线暴露)有应答的视网膜损伤、布鲁赫膜损伤、RPE功能丧失、正常黄斑的细胞和/或胞外基质的组织结构完整性丧失、黄斑中细胞的功能丧失、光感受器营养不良、粘多糖贮积症、杆-锥营养不良、锥-杆营养不良、前葡萄膜炎和后葡萄膜炎、和糖尿病神经病变。
可以通过任何公认的测量血管生成是否减慢或减少的方法来评价新生血管障碍的抑制。这包括直接观察和间接评估，例如通过评估主观症状或客观生理指标。例如，可以基于新血管形成、微血管病、内皮糖萼脱落、血管渗漏或血管水肿或其任何组合的预防或逆转来评估治疗功效。还可以根据稳定或改善视力来定义用于评价抑制眼部新生血管障碍的治疗功效。例如，临床症状的改善通过例如间接检眼镜、眼底照相、荧光素血管病、视网膜电图、外眼检查、裂隙灯生物显微镜、压平眼压测量、角膜厚度测量和自反射来监测。
癌症
在一些实施例中，提供了治疗个体(例如人)的癌症(例如实体瘤，或具有异常VEGF表达、活性和/或信号传导的癌症)的方法，该方法包括向个体施用有效量的本文所述的任何抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白或其药物组合物。在一些实施例中，癌症是实体瘤(例如肺癌、肝癌、皮肤癌(例如黑色素瘤)、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、结直肠癌、肾癌或膀胱癌)。在一些实施例中，抗体融合蛋白或其药物组合物被全身施用(例如，静脉内)。在一些实施例中，局部(例如，肿瘤内)施用抗体融合蛋白或其药物组合物。在一些实施例中，该方法进一步包括使个体接受另外的癌症疗法(诸如手术、辐射、化学疗法、免疫疗法、激素疗法或它们的组合)。在一些实施例中，治疗癌症的方法具有以下的一种或多种生物学活性：(1)杀伤癌细胞；(2)抑制癌细胞增殖；(3)在肿瘤中诱导免疫应答(例如，诱导免疫效应细胞向肿瘤部位浸润，诱导免疫细胞增殖、分化和/或激活，和/或诱导免疫细胞分泌促炎细胞因子)；(4)减小肿瘤大小；(5)缓解患有癌症的个体的一种或多种症状；(6)抑制肿瘤转移；(7)延长存活期；(8)延长癌症进展的时间；(9)预防、抑制或降低癌症复发的可能性；以及(10)减少或抑制肿瘤血管生成。在一些实施例中，由本文所述的抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白或药物组合物介导的杀伤癌细胞的方法可实现至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高百分比中的任一者的肿瘤细胞死亡率。在一些实施例中，由本文所述的抗体融合蛋白或药物组合物介导减小肿瘤大小的方法可减小肿瘤大小的至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者)。在一些实施例中，由本文所述的抗体融合蛋白或药物组合物介导抑制肿瘤转移的方法可抑制至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者)的转移。在一些实施例中，由本文所述的抗体融合蛋白或药物组合物介导延长个体(例如人)的存活的方法可将个体的存活延长1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月中的至少任一种。在一些实施例中，由本文所述的抗体融合蛋白或药物组合物介导延长癌症进展的时间的方法可将癌症进展的时间延长1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周中的至少任一种。在一些实施例中，诱导对肿瘤的免疫应答的方法可以增加、增强或刺激受试者的免疫应答或功能。在一些实施例中，通过激活受试者中的效应细胞(例如，T细胞，例如，CD8+和/或CD4+T细胞)、扩增(增加)效应细胞群和/或杀伤靶细胞(例如，靶肿瘤细胞)来增加、增强和/或刺激免疫应答或功能。在一些实施例中，相对于施用本文所述的抗体融合蛋白或药物组合物之前，个体中的CD4和/或CD8 T细胞具有增加或增强的引发、激活、增殖、细胞因子释放和/或细胞溶解活性。
本文所述的方法适合治疗多种癌症，包括实体癌和液体癌两种。这些方法适用于所有分期的癌症，包括早期癌症、非转移性癌症、原发性癌症、晚期癌症、局部晚期癌症、转移性癌症或缓解期癌症。本文所述的方法可在辅助设置(即，该方法可以在主要/根治性疗法之后进行)或新辅助设置(即，该方法可在主要/确定性疗法之前进行)中用作第一疗法、第二疗法、第三疗法或与本领域已知的其他类型的癌症疗法的组合疗法，其他类型的癌症疗法诸如化学疗法、手术、激素疗法、辐射、基因疗法、免疫疗法(诸如T细胞疗法)、骨髓移植、干细胞移植、靶向疗法、冷冻疗法、超声疗法、光动力疗法、射频消融等。在一些实施例中，该方法用于治疗先前已经治疗的个体。在一些实施例中，癌症对先前的疗法已经是难治性的。在一些实施例中，该方法用于治疗先前尚未治疗的个体。在一些实施例中，癌症对免疫检查点抑制剂单一疗法具有部分抗性(例如，对抗PD-1或抗PD-L1抗体单一疗法治疗具有部分抗性)。
在一些实施例中，本文描述的方法适用于治疗选自下组的实体癌，该组由以下组成：结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食道癌、黑色素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌症、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域的癌症、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症、所述癌症的组合、和所述癌症的转移性病变。
在一些实施例中，本文描述的方法适用于治疗选自以下中一种或多种的血液癌症：急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性白血病、急性淋巴性白血病(ALL)、B细胞急性淋巴性白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴性白血病(T-ALL)、慢性粒细胞白血病(CML)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴增殖性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、华氏巨球蛋白血症、或白血病前期。
在一些实施例中，该方法适用于治疗具有异常VEGF表达、活性和/或信号传导的癌症，这些的癌症包括，作为非限制性实例，乳腺癌、肺癌、食管癌、胃解剖癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵泡膜细胞瘤、肾母细胞瘤、子宫内膜增生、子宫内膜异位症、纤维肉瘤、绒毛膜癌、头颈癌、鼻咽癌、喉癌、肝母细胞瘤、卡波氏肉瘤、黑色素瘤、皮肤癌、血管瘤、海绵状血管瘤、血管母细胞瘤、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、神经鞘瘤、少突胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、成骨肉瘤、平滑肌肉瘤、尿路癌、甲状腺癌、威尔姆斯瘤、肾细胞癌、前列腺癌、与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增生、水肿(如与脑肿瘤相关)、和梅格斯综合征(Meigs’syndrome)。在一些实施例中，该方法适用于治疗肺癌、肝癌、皮肤癌(例如黑色素瘤)、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、结直肠癌、肾癌或膀胱癌。
在一些实施例中，该方法适用于治疗具有异常Ang2表达(例如，过度表达、表达不足、缺乏表达、等)、活性和/或信号传导的癌症，包括，通过非限制性实例，肝细胞癌、胃癌和鳞状细胞癌(参见例如C.Li等人Cancer Gene Therapy(2016)23；295-302)。
本文所述的抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白或其药物组合物的施用可以任何方便的方式进行，包括通过注射或输注。施用途径根据已知和公认的方法，例如以合适的方式经长时间段通过单次或多次推注或输注。本文所述的抗体融合蛋白或其药物组合物可以经动脉、皮下、皮内、肿瘤内、结内、髓内、肌内、静脉内或腹膜内施用于患者。在一些实施例中，本文所述的抗体融合蛋白或其药物组合物被全身施用。在一些实施例中，本文所述的抗体融合蛋白或其药物组合物通过输注例如静脉内输注施用于个体。用于免疫疗法的输注技术是本领域已知的(参见，例如，Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.319:1676(1988))。在一些实施例中，本文所述的抗体融合蛋白或其药物组合物通过皮内或皮下(即，皮肤之下)注射施用于个体。对于皮下注射，可以使用注射器注射本文所述的抗体融合蛋白或其药物组合物。但是，也可以使用其他施用装置，例如注射装置；注射笔；自动注射器装置、无针装置；以及皮下贴剂递送系统。在一些实施例中，本文所述的抗体融合蛋白或其药物组合物通过静脉内注射施用。在一些实施例中，将本文所述的抗体融合蛋白或其药物组合物直接注射到肿瘤或淋巴结中。在一些实施例中，将本文所述的抗体融合蛋白或其药物组合物局部施用至肿瘤部位，例如直接施用至肿瘤细胞，或施用至具有肿瘤细胞的组织。在一些实施例中，本文所述的抗体融合蛋白或其药物组合物通过持续释放或延长释放方式施用。
本文所述的抗体融合蛋白或其药物组合物的剂量和所期望药物浓度可根据预期的特定用途而变化。适当剂量或施用途径的确定完全在普通技术人员的技术范围内。动物实验为确定用于人类治疗的有效剂量提供了可靠的指导。可以按照Mordenti,J.和Chappell,W.“The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics,”InToxicokinetics and New Drug Development,Yacobi等人编,Pergamon Press,NewYork1989,第42-46页制定的原理来进行有效剂量的种间类推。在本申请的范围内，不同的配制品将对不同的治疗和不同的病症有效，并且旨在治疗特定器官或组织的施用可能需要以不同于递送至另一器官或组织的方式递送。
当使用体内施用本文所述的抗体融合蛋白或其药物组合物时，正常剂量可在约1mg/kg至约50mg/kg哺乳动物体重之间变化，这取决于施用途径和哺乳动物类型。在本申请的范围内，不同的配制品将对不同的治疗和不同的病症有效，并且旨在治疗特定器官或组织的施用可能需要以不同于递送至另一器官或组织的方式递送。而且，剂量可通过一次或多次分开施用或通过连续输注施用。对于几天或更长时间的重复施用，根据病状，持续治疗直到出现对疾病症状所希望的阻抑。然而，其他剂量方案也可以是有用的。这种疗法的进展容易通过常规技术和测定来监测。在一些实施例中，本文所述的抗体融合蛋白或其药物组合物以约1mg/kg至约50mg/kg的量施用，例如约10mg/kg至约50mg/kg、约10mg/kg至约40mg/kg，约10mg/kg至约30mg/kg或约20mg/kg中的任一者。
在一些实施例中，本文所述的抗体融合蛋白或其药物组合物在不超过约24小时、20小时、15小时、10小时、8小时、6小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更少的时间段内施用(例如输注)给个体(例如人)。在一些实施例中，单次(例如推注)施用本文所述的抗体融合蛋白或其药物组合物。在一些实施例中，多次(例如2、3、4、5、6或更多次中的任一者)施用本文所述的抗体融合蛋白或其药物组合物。如果多次给药，它们可以通过相同或不同的途径进行，并且可以在相同部位或在替代部位进行。本文所述的抗体融合蛋白或其药物组合物可以施用每天一次至每年一次。施用之间的间隔可以是大约24小时至一年中的任一者。间隔也可以是不规则的(例如，在肿瘤进展之后)。在一些实施例中，给药计划没有中断。对于特定患者的最佳剂量和治疗方案可以由医学领域的技术人员通过监测患者的疾病体征并相应地调整治疗而容易地确定。在一些实施例中，本文所述的抗体融合蛋白或其药物组合物每天(每日)一次、每2天一次、每3天一次、每4天一次、每5天一次、每6天一次、每周一次、每10天一次、每2周一次、每3周一次、每4周一次、每月一次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次、每6个月一次、每7个月一次、每8个月一次、每9个月一次或每年一次进行施用。在一些实施例中，施用之间的间隔为约1周至2周、2周至1个月、2周至2个月、1个月至2个月、1个月至3个月、3个月至6个月或6个月至一年中的任一数值。
在一些实施例中，本文所述的抗体融合蛋白或其药物组合物以分次剂量施用，例如约2、3、4、5或更多个剂量中的任一者。在一些实施例中，分次剂量经约一周、一个月、2个月、3个月或更长时间施用。在一些实施例中，剂量被等分。在一些实施例中，分次剂量为总剂量的约20％、约30％和约50％。在一些实施例中，连续分次剂量之间的间隔为约1天、2天、3天、1周、2周、3周、一个月或更长。对于几天或更长时间的重复施用，根据病状，持续治疗直到出现对疾病症状所希望的阻抑。然而，其他剂量方案也可以是有用的。这种疗法的进展容易通过常规技术和测定来监测。
V.编码抗体融合蛋白的载体
本发明还提供了编码本文所述的任何抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白的分离的核酸，以及包含此类核酸的载体。还提供了分离的宿主细胞(例如，CHO细胞、HEK 293细胞、Hela细胞、COS细胞)，其包含：编码本文所述的任何抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白的核酸，或含有编码本文所述的任何抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白的核酸的载体。在一些实施例中，包含编码本文所述的任何一种抗体融合蛋白的核酸的载体适合于在真核细胞例如哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)中复制和整合。
在一些实施例中，载体是病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体以及它们的衍生物。病毒载体技术是本领域熟知的并且描述于例如Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)，以及其他病毒学和分子生物学手册中。已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可使用本领域已知的技术将异源核酸插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可在体外或离体分离重组病毒并将其递送至工程化的哺乳细胞。在一些实施例中，使用腺病毒载体。许多逆转录病毒系统和腺病毒载体是本领域已知的。在一些实施例中，使用慢病毒载体。在一些实施例中，使用自灭活慢病毒载体。例如，携带一个或多个抗体融合蛋白编码序列的自灭活慢病毒载体可以用本领域已知的方案包装。使用本领域已知的方法，所得的慢病毒载体可用于转导哺乳动物细胞。源自逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合及其在子代细胞中的繁殖。慢病毒载体还具有低免疫原性，并且可以转导非增殖细胞。
在一些实施例中，载体是非病毒载体。在一些实施例中，载体是pTT5载体。在一些实施例中，载体是转座子，例如Sleeping Beauty(SB)转座子系统或PiggyBac转座子系统。在一些实施例中，载体是基于聚合物的非病毒载体，包括例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)和聚乳酸(PLA)、聚(乙烯亚胺)(PEI)和树枝状聚合物。在一些实施例中，载体是基于阳离子脂质的非病毒载体，例如阳离子脂质体、脂质纳米乳剂和固体脂质纳米颗粒(SLN)。在一些实施例中，载体是基于肽的基因非病毒载体，例如聚-L-赖氨酸。适用于基因组编辑的任何已知非病毒载体均可用于将一个或多个编码抗体融合蛋白的核酸引入宿主细胞。参见，例如，Yin H.等人Nature Rev.Genetics(2014)15:521-555；Aronovich EL等人Hum.Mol.Genet.(2011)R1:R14-20；和Zhao S.等人Transl.Lung Cancer Res.(2016)5(1):120-125，其通过引用并入本文。在一些实施例中，编码本文所述抗体融合蛋白的任何一个或多个核酸或载体通过物理方法引入宿主细胞，物理方法包括但不限于电穿孔、超声穿孔、光穿孔、磁转染、水穿孔。
在一些实施例中，载体含有选择标记基因或报告基因以从通过载体转染的宿主细胞群中选择表达本文所述的抗体融合蛋白的细胞。选择性标记和报告基因都可侧接有合适的调控序列，以便能够在宿主细胞中表达。例如，载体可包含转录和翻译终止子、起始序列和可用于调节核酸序列表达的启动子。
在一些实施例中，载体(例如，病毒载体)包含编码本文所述的抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白的任何一种核酸。可以使用本领域任何已知的分子克隆方法将核酸克隆到载体中，包括例如使用限制性核酸内切酶位点和一个或多个选择标记。在一些实施例中，核酸可操作地连接至启动子。已经探索了多种启动子用于哺乳动物细胞中的基因表达，并且本领域已知的任何启动子都可以用于本发明。启动子可大致分为组成型启动子或调节型启动子，例如诱导型启动子。
在一些实施例中，编码本文所述的抗体融合蛋白的核酸可操作地连接至组成型启动子。组成型启动子允许异源基因(也称为转基因)在宿主细胞中组成型表达。本文考虑的示例性启动子包括但不限于巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)、人延伸因子-1α(hEF1α)、泛素C启动子(UbiC)、磷酸甘油激酶启动子(PGK)、猿猴病毒40早期启动子(SV40)、鸡β-肌动蛋白启动子与CMV早期增强子偶联(CAGG)、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、多瘤增强子/单纯疱疹胸苷激酶(MC1)启动子、β肌动蛋白(β-ACT)启动子、“骨髓增生性肉瘤病毒增强子、阴性对照区缺失、d1587rev引物结合位点取代(MND)”启动子。在大量研究中已经广泛比较了此类组成型启动子驱动转基因表达的效率。
在一些实施例中，编码本文所述的抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白的核酸可操作地连接至诱导型启动子。诱导型启动子属于调节型启动子类别。诱导型启动子可由一种或多种条件诸如物理条件、宿主细胞的微环境、或宿主细胞的生理状态、诱导物(即诱导剂)或它们的组合诱导。在一些实施例中，诱导条件不诱导宿主细胞中内源基因的表达。在一些实施例中，诱导条件选自由以下组成的组：诱导剂、辐照(如电离辐照、光)、温度(如热)、氧化还原状态和宿主细胞的激活状态。在一些实施例中，诱导型启动子可以是NFAT启动子、启动子或NFκB启动子。在一些实施例中，诱导型启动子是tet-诱导型启动子。
在一些实施例中，载体包含多于一个编码本文所述的抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白的核酸，例如抗体融合蛋白的不同多肽。在一些实施例中，每个载体包含编码本文所述的抗体融合蛋白的2个多肽的2个核酸。
在一些实施例中，编码本文所述的抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白的两个或更多个核酸在载体中的相同启动子下可操作地调节。在一些实施例中，两个或更多个核酸通过连接序列(例如，IRES)或编码自切割2A肽(例如P2A、T2A、E2A、F2A、BmCPV 2A、BmIFV 2A)的核酸序列串联连接。在一些实施例中，编码抗体融合蛋白的两个或更多个多肽的核酸在多肽编码序列之间包含一个或多个连接序列(例如IRES)或编码一个或多个自切割2A肽(例如P2A、T2A、E2A、F2A、BmCPV 2A、BmIFV 2A)的一个或多个核酸序列。在一些实施例中，编码本文所述的抗体融合蛋白的两个或更多个核酸在载体中的单独启动子下可操作地调节。在一些实施例中，可操作地连接到每个核酸的启动子是不同的。在一些实施例中，可操作地连接到每个核酸的启动子是相同的。在一些实施例中，本文所述的抗体融合蛋白由两个或更多个载体编码。
VI.制备方法
还提供了产生本文所述的任何抗-Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白的方法。因此，在一些实施例中，提供了一种产生抗体融合蛋白的方法，该方法包括：(a)在有效表达所编码的抗体融合蛋白的条件下培养包含编码本文所述的抗体融合蛋白的任何核酸或载体的宿主细胞(例如，CHO细胞)；以及(b)从所述宿主细胞获得表达的抗体融合蛋白。在一些实施例中，步骤(a)的方法进一步包括产生包含编码本文所述抗体融合蛋白的核酸或载体的宿主细胞。可以使用本领域已知的或如本文所述的任何方法制备本文所述的抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白。对于示例性方法还参见实例1。在一些实施例中，用真核细胞，例如哺乳动物细胞表达抗体融合蛋白。在一些实施例中，用原核细胞表达抗体融合蛋白。
1.载体构建
可以使用标准重组技术获得编码本申请的抗体融合蛋白的多核酸序列。所期望的多核酸序列可从产生抗体的细胞如杂交瘤细胞中分离和测序。可替代地，可使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦获得，编码多肽的序列被插入到能够在合适的宿主中复制和表达异源多核苷酸的重组载体中。许多可用的和本领域已知的载体可用于本发明的目的。合适载体的选择将主要取决于待插入载体中的核酸的大小和待用载体转化的特定宿主细胞。每个载体包含不同的组分，这取决于它的功能(异源多核苷酸的扩增或表达，或两者)及其与它所在的特定宿主细胞的相容性。载体组分一般包括但不限于：任选的增强子、复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入片段和转录终止序列。哺乳动物表达载体可能不需要复制起点组分(通常仅使用SV40起点，因为它包含早期启动子)。通常，包含复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主组合使用，这些复制子和控制序列衍生自与宿主细胞相容的物种。在一些实施例中，使用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常允许表达的靶基因的更高转录和更高产量。本申请的表达载体可包含两个或更多个启动子-顺反子对，其编码多肽组分中的每个。许多增强子序列已知来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)，可以剪接到载体中多肽编码序列的5’或3’位置，但优选位于启动子的5’位点。典型的选择基因编码的蛋白质(a)赋予对抗生素(例如，氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)或其他毒素的抗性，(b)补充营养缺陷型，(c)提供从复杂培养基中得不到的关键营养素，或(d)作为鉴定标记(例如GFP)。
适用于在原核和真核细胞中表达的载体和启动子是本领域众所周知的。例如，适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、β-半乳糖酶和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子，例如tac或trc启动子等。另见上述“V.编码抗体融合蛋白的载体”节。
在一些实施例中，重组载体内的每个顺反子包含指导表达的多肽跨膜易位的分泌信号序列组分。通常，信号序列可以是载体的组分，或者它可以是插入载体中的靶多肽DNA的一部分。为本发明的目的选择的信号序列应该是被宿主细胞识别和加工(即，被信号肽酶切割)的信号序列。对于不识别和加工异源多肽的原生信号序列的原核宿主细胞，将信号序列用例如选自由以下组成的组的原核信号序列取代：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定肠毒素II(STII)引导物、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹病毒的gD信号，都是可用的。此类前体区域的DNA在阅读框中连接到编码本申请的抗体融合蛋白的DNA。
在一些实施例中，蛋白质的产生可以发生在宿主细胞的细胞质中，因此不需要每个顺反子内存在分泌信号序列。在一些实施例中，多肽组分被表达、折叠和组装以在细胞质内形成蛋白质。某些原核宿主菌株(例如大肠杆菌trxB-菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而允许正确折叠和组装表达的蛋白质亚基。参见Proba和Pluckthun,Gene,159:203(1995)。
在一些实施例中，可以调节表达的多肽组分的数量比率以使分泌的和正确组装的抗体融合蛋白的产量最大化。这种调节至少部分是通过同时调节多肽组分的翻译强度来实现的。Simmons等人的美国专利号5,840,523公开了一种调节翻译强度的技术。
2.宿主细胞
适用于表达本申请的抗体融合蛋白的原核宿主细胞包括古细菌和真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用的细菌的实例包括埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如，大肠杆菌)、杆菌纲(例如，枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、肠道菌(Enterobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)物种(例如，铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、志贺氏杆菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)或副球菌属(Paracoccus)。在一些实施例中，使用大肠杆菌细胞。合适的大肠杆菌菌株是本领域众所周知的。为各种质粒选择合适的细菌宿主的方法在本领域中是众所周知的。
合适的真核宿主细胞包括脊椎动物宿主细胞。在培养物(组织培养物)中繁殖脊椎动物细胞已经成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是通过SV40(COS-7，ATCCCRL 1651)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾系(293细胞或亚克隆用于在悬浮培养中生长的293细胞Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠塞托利细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗(buffalo)大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCCCCL51)；TR1细胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。
通常，宿主细胞应分泌最少量的蛋白水解酶，并且可能需要将另外的蛋白酶抑制剂掺入细胞培养物中。
3.蛋白质生产
用上述表达载体转化或转染宿主细胞，并将所述宿主细胞在常规营养培养基或为诱导启动子、选择转化体或扩增编码所期望序列的基因而适当地修改的任何培养基中培养。使用氯化钙的钙处理通常用于含有大量细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法使用聚乙二醇/DMSO。其他技术如电穿孔、脂质体介导的转染等也是合适的。
适合原核细胞的培养基的实例包括luria液体培养基(LB)加上必要的营养补充剂。诸如Ham's F10(Sigma)、最小必需培养基((MEM)，(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和杜尔贝科修饰型伊戈尔(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)培养基((DMEM)，Sigma))的市售培养基适用于培养宿主细胞。在一些实施例中，培养基还包含基于表达载体的构建选择的选择剂，以选择性地允许包含表达载体的宿主细胞生长。例如，将氨苄青霉素添加到培养基中用于表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的生长。在一些实施例中，培养基可以视需要补充有激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量来源。任何其他必需的补充剂也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包含在内。培养条件，例如温度、pH等，是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的条件，并且对于普通技术人员来说是显而易见的。
表达的抗体融合蛋白可以存在于细胞质中，也可以分泌到原核细胞的周质中并从中回收。蛋白质回收通常涉及破坏宿主细胞，一般通过渗透休克、超声处理或裂解等方式进行。一旦细胞被破坏，可以通过离心或过滤去除细胞碎片或整个细胞。可以例如通过亲和树脂层析进一步纯化蛋白质。可替代地，可以将蛋白质转运到培养基中并在其中分离。可以从培养物中取出细胞，过滤和浓缩培养物上清液以进一步纯化产生的蛋白质。蛋白酶抑制剂例如PMSF可包括在任何前述步骤中以抑制蛋白水解，并可包含抗生素以防止外来污染物的生长。为了最大限度地减少表达的异源蛋白(尤其是那些对蛋白水解敏感的蛋白)的蛋白水解，可以使用某些蛋白水解酶缺陷型宿主菌株。可以使用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和蛋白质印迹测定的公知方法进一步分离和鉴定表达的多肽。
可替代地，蛋白质生产是通过使用原核宿主细胞的发酵过程大量进行的。各种大规模补料分批发酵程序可用于生产重组蛋白。在发酵过程中，蛋白质表达的诱导通常在细胞已经在合适的条件下生长至所期望密度后开始，例如，OD550为约180-220，在该阶段细胞处于早期稳定期。
4.蛋白纯化
进一步纯化本文产生的抗体融合蛋白以获得基本上均质的制剂以供进一步测定和使用。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。以下程序是合适的纯化程序的示例：在免疫亲和力或离子交换柱上进行的分级分离、乙醇沉淀、逆相HPLC、在二氧化硅或阳离子交换树脂(诸如DEAE)上进行的色谱、在阴离子交换树脂上进行的色谱、羟基磷灰石色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、透析和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。
在一些实施例中，固定在固相上的蛋白A用于免疫亲和纯化包含Fc结构域的抗体融合蛋白。固定有蛋白A的固相优选为包含玻璃或二氧化硅表面的柱，更优选为可控孔玻璃柱或硅酸柱。在一些应用中，柱涂包被有甘油等试剂，以试图防止污染物的非特异性粘附。然后洗涤固相以去除非特异性结合到固相上的污染物。最后，通过洗脱从固相中回收目的抗体融合蛋白。在任何一个或多个初步纯化步骤之后，可以使用pH介于约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液使包括目的蛋白质构建体和污染物的混合物经受低pH疏水相互作用色谱，优选地在低盐浓度(例如，约0-0.25M盐)下进行。
VII.制品和套件
进一步提供了包含本文所述的任何抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白的套件、单位剂量和制品。在一些实施例中，提供了套件，其包含本文所述的任何一种药物组合物并且优选地提供其使用说明，例如用于治疗本文所述的障碍(例如，癌症或非肿瘤性障碍)。
本发明的套件包括一个或多个容器，该容器包含本文描述的用于治疗疾病的抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白。例如，说明书包括施用抗体融合蛋白以治疗疾病如癌症的说明。该套件进一步可以包括关于基于鉴定个体是否患有疾病和疾病的阶段来选择适合治疗的个体(例如，人)的说明。与抗体融合蛋白的使用有关的说明通常包括有关预期治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。在本发明的套件中提供的说明书通常是标签或包装插页(例如，包含在套件中的纸片)上的书面说明书，但机器可读说明书(例如，在磁或光存储盘上携带的说明书)也是可接受的。本申请的套件在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐子、柔性包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。还设想了与特定装置(例如输注装置，例如微型泵)组合使用的包装。套件可以具有无菌进入口(例如，该容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是如本文所述的抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白。容器可以进一步包含第二药物活性剂。套件可以任选地提供另外的组分，例如缓冲液和解释信息。通常，套件包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或一个或多个包装插页。在一些实施例中，套件提供了用于以滴眼液、结膜下注射、结膜下植入、玻璃体内注射、玻璃体内植入、眼球筋膜下注射或眼球筋膜下植入形式施用本文所述的抗体融合蛋白或其药物组合物的一个或多个说明书和/或一个或多个工具。
因此，本申请还提供了制品，其包括小瓶(例如密封小瓶)、瓶、罐子、柔性包装等。该制品可以包括容器和该容器上或与该容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由多种材料诸如玻璃或塑料形成。通常，容器容纳有效治疗本文所述的疾病或障碍(例如癌症)的组合物，并且可以具有无菌进入口(例如，该容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。标签或包装插页表明该组合物用于治疗个体的特定病症。标签或包装插页将进一步包含向个体施用组合物的说明书。标签可以指示重构和/或使用的指导。容纳药物组合物的容器可以是多次使用的小瓶，其允许重构的配制品的重复施用(例如2-6次施用)。包装插页是指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，这些说明书含有关于使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。此外，该制品可进一步包括第二容器，该第二容器包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。套件可以进一步包括从商业和用户的角度所期望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器或一个或多个工具，用于以滴眼液、结膜下注射、结膜下植入、玻璃体内注射、玻璃体内植入、眼球筋膜下注射或眼球筋膜下植入形式施用。
套件或制品可包括多个单位剂量的药物组合物和使用说明，其包装量足以在药房(例如，医院药房和配药药房)中储存和使用。
实例
以下实例旨在仅是本发明的示例，并且因此不应视为以任何方式限制本发明。以下实例和详细描述是作为说明而并不是作为限制而提供的。
实例1：抗Ang2/VEGF-trap抗体融合蛋白的构建与表达
基于抗Ang2单克隆抗体(mAb)和包含VEGFR-1的Ig样结构域2-VEGFR-2的Ig样结构域3(Flt1d2-Flk1d3)嵌合融合物的VEGF-trap(SEQ ID NO:32)，设计了一系列抗Ang2/VEGF-trap双特异性抗体融合蛋白(BsFp)。对于每个BsFp，VEGF-trap通过“E4”接头(SEQ IDNO:31)融合至抗Ang2 mAb的轻链，或通过(G4S)3接头(SEQ ID NO:30)融合至抗Ang2 mAb的重链。每个BsFp构建体具有两个相同的重链融合多肽和两个相同的抗体轻链，或两个相同的抗体重链和两个相同的轻链融合多肽。将编码每个多肽的DNA序列插入到pTT5载体中的EcoRI和HindIII限制性位点之间。每个质粒还含有编码信号肽的序列，用于多肽分泌到生长培养基中。将用表达质粒转染的CHO-3E7细胞在37℃和100rpm下培养6天。通过离心收集上清液部分，并在蛋白A柱上纯化BsFp蛋白。BsFp构建体如表1所示。
表1.抗Ang2/VEGF-trap BsFp构建体
通过phos-AKT生物测定进行体外功能分析
1.HUVEC培养和准备用于未来实验
人原代脐静脉内皮细胞(HUVEC；)表达Tie2细胞表面受体。HUVEC在10cm培养皿中用人内皮细胞完全培养基(ECM；ScienCell)在37℃和5％CO2培养。当HUVEC达到80％-90％汇合时，添加2mL细胞解离试剂以从培养皿中解离细胞。然后用ECM完全培养基重悬浮HUVEC至最终浓度为约1×106个细胞/mL。在96孔平底板的每个孔中加入50μL细胞悬浮液，然后在37℃、5％ CO2培养箱中孵育过夜。弃去孔中的所有细胞培养基后，每孔添加50μL新鲜无血清培养基，然后将细胞在37℃、5％ CO2培养箱中孵育16小时。
2.单剂量功能性先导物筛选
每个单剂量BsFp用于功能先导物筛选，并制备4μg/mL(4×原液)Ang2蛋白(R&Dsystem)和40μg/mL(4×原液)BsFp(或对照)用于功能筛选。hATBAA抗Ang2抗体作为通过Ang2结合激活Tie2信号传导方面的阳性对照。在将25μL的40μg/mL BsFp(或对照)加入到含有50μL无血清培养基(如上文第1小节所述制备)中的HUVEC的96孔板的每个孔中后，立即将25μL的4μg/mL Ang2蛋白(R&D system)加入到每个孔中，随后在37℃在5％ CO2培养箱中孵育10分钟。HUVEC在缓冲液中与Ang2一起孵育，但不添加BsFp作为阴性对照。
磷酸化Akt(Ser473)生物测定
磷酸化-Akt(Ser473)套件(Cisbio)用于检测Ser473上的泛Akt磷酸化，作为Tie2激活的读出。弃去含有样品处理过的HUVEC的每个孔的上清液。向每个孔中加入50μL补充裂解缓冲液(Cisbio)，然后在室温振荡孵育35分钟。之后，将每个孔中的16μL细胞裂解物转移到小体积检测板中。在每个检测孔中加入4μL预混抗体(Ciobio)并密封板后，将板在室温孵育4小时。通过在(读板器)上读取665nm和620nm波长的荧光发射来测量Akt的磷酸化水平。空白孔作为阴性检测对照。
磷酸化-AKT生物测定结果显示在图1中。与阴性对照(仅Ang2)相比，所有测试的BsFp都显著激活Tie2信号传导，表明VEGF-trap融合位置不会显著影响BsFp在Ang2结合和/或Tie2信号传导激活方面的能力。对于基于42C3A4的BsFp，融合至重链(vegfr-42C3A4-VH1-VL1)或轻链(vegfr-42C3A4-VL1-VH1)N末端的VEGF-trap略微降低了BsFp在Ang2结合和/或Tie2信号传导激活方面的能力，但仍显著高于阴性对照。
3.通过剂量-应答曲线进行功能性先导物生物测定
4μg/mL(4×原液)Ang2蛋白(R&D system)和200μg/mL(4×原液)BsFp(或对照)用于剂量曲线测定。hATBAA抗Ang2抗体用作阳性对照。第一浓度是200μg/mL(4×原液)，然后对其他7个数据点进行5倍稀释。在将25μL不同浓度的BsFp(或对照)稀释液加入到含有50μL无血清培养基(如上文第1小节所述制备)中的HUVEC的96孔板的每个孔中后，立即将25μL的4μg/mL Ang2蛋白(R&D system)加入到每个孔中，随后在37℃在5％ CO2培养箱中孵育10分钟。
磷酸化-AKT生物测定如上文“磷酸化-Akt(Ser473)生物测定”小节所述进行从图3可以看出，除42C3A4-VH1-vegfr-VL1(EC50不可检测)和hABTAA-VHvegfr-VL外，所有测试的BsFp均有效导致Tie2激活。更重要的是，一些BsFp，包括5F7D7-VH3-vegfr-VL5、7F10B2-VL3-vegfr-VH3、7F10B2-VH3-vegfr-VL3、vegfr-5A7B9-VL1.1-VH3和31E2D4-VH4-vegfr-VL1，显示出比hABTAA mAb更好的Tie2激活功能，具有更高的跨度值和相当的EC50值。
通过VEGF阻断性生物测定进行体外功能分析
1.GS-E3/VEGFR2细胞培养和准备用于未来实验
在细胞表面表达VEGFR2的GS-E3/VEGFR2细胞和在NFAT应答元件控制下的萤火虫萤光素酶报告基因是内部生成的(GenScript)。GS-E3/VEGFR2细胞在10cm培养皿中用DMEM完全培养基(Gibco)在37℃、5％ CO2培养。当GS-E3/VEGFR2细胞达到80％-90％汇合时，添加2mL细胞解离试剂以从培养皿中解离细胞。离心后，用DMEM完全培养基重悬浮GS-E3/VEGFR2细胞至终浓度约1×106个细胞/mL。将20μL细胞悬浮液添加到384孔平底板的每个孔中，然后在37℃的5％ CO2培养箱中孵育过夜。
2.单剂量功能性先导物筛选
每个单剂量BsFp用于功能先导物筛选，并制备0.016μg/mL(4×原液)VEGF165蛋白(GenScript)和20μg/mL(4×原液)BsFp(或对照)用于功能筛选。抗VEGF抗体作为阳性对照以阻断VEGF与VEGFR的结合。在将10μL的20μg/mL BsFp(或对照)加入到含有20μL培养基(如上述第1小节中制备)中的GS-E3/VEGFR2细胞的384孔板的每个孔中后，立即将10μL的0.016μg/mL VEGF165蛋白(GenScript)加入每个孔中，然后在37℃在5％ CO2培养箱中孵育6小时。GS-E3/VEGFR2细胞与VEGF165蛋白孵育但不添加任何BsFp作为阴性对照。
用于评估VEGF中和的Bio-GloTM萤光素酶测定
Bio-GloTM萤光素酶检测系统用于评估VEGF和VEGFR结合后GS-E3/VEGFR2细胞的萤火虫萤光素酶报告基因表达。将40μl Bio-GloTM(Promega)添加到含有样品处理的GS-E3/VEGFR2细胞的384孔板的每个孔中，然后在室温避光孵育5分钟。在酶标仪上读取化学发光值(相对发光单位，“RLU”)，记录数据。空白孔作为检测对照。
从图2可以看出，在没有中和性抗VEGF抗体或VEGF-trap的情况下，VEGF(VEGF165)能够在GS-E3/VEGFR2细胞中触发大量VEGFR信号传导，如报告基因的发光所示。阳性对照抗VEGF抗体显著阻断VEGF和VEGFR相互作用，从而抑制报告基因表达。所有测试的BsFp都显著阻断了VEGF和VEGFR相互作用，导致报告基因表达仅有背景水平(与“空白”孔相比)。此外，VEGF-trap融合位置不会显著影响BsFp中和VEGF的能力。BsFp的这种VEGF中和活性甚至强于抗VEGF抗体。
3.通过剂量-应答曲线进行功能性先导物生物测定
0.016μg/mL(4×原液)VEGF165蛋白(GenScript)和20μg/mL(4×原液)BsFp(或对照)用于剂量曲线测定。与测试的BsFp共享相同的VEGF-trap序列的阿柏西普用作阳性对照。第一浓度是20μg/mL(4×原液)，然后对其他7个数据点进行2.5倍稀释。在将10μL不同浓度的BsFp(或对照)稀释液加入到含有20μL培养基(如上述第1小节中制备)中的GS-E3/VEGFR2细胞的384孔板的每个孔中后，立即将10μL的0.016μg/mL VEGF165蛋白(GenScript)加入每个孔中，然后在37℃在5％ CO2培养箱中孵育6小时。
体外VEGF中和生物测定是使用Bio-GloTM萤光素酶测定系统如上所述进行的。从图4可以看出，所有测试的BsFp都显示出与亲本VEGF-trap组分相当的强大VEGF中和效果，无论VEGF-trap融合位置在哪里。
序列表
SEQ ID NO:29(信号肽氨基酸序列)
MGWSCIILFLVATATGVHS
SEQ ID NO:30((G4S)3接头氨基酸序列)
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:31(E4-接头氨基酸序列)
ESKYGPPSPPSP
SEQ ID NO:32(VEGF-trap序列；Flk1d3序列加下划线)
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQ HKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK
SEQ ID NO:33(5A7B9-VH3.2重链序列；CDR加下划线；Fc片段加阴影)
SEQ ID NO:34(5A7B9-VH3重链序列；CDR加下划线；Fc片段加阴影)
SEQ ID NO:50(5A7B9-VH3.2-vegfr重链融合多肽序列；CDR加下划线；Fc片段加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:51(5A7B9-VH3-vegfr重链融合多肽序列；CDR加下划线；Fc片段加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:41(5A7B9-VL1.1轻链序列；CDR加下划线；CL加阴影)
SEQ ID NO:42(5A7B9-VL1轻链序列；CDR加下划线；CL加阴影)
SEQ ID NO:43(5A7B9-VL2轻链序列；CDR加下划线；CL加阴影)
SEQ ID NO:63(5A7B9-VL1.1-vegfr轻链融合多肽序列；CDR加下划线；CL加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:62(5A7B9-VL1-vegfr轻链融合多肽序列；CDR加下划线；CL加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:76(5A7B9-VL2-vegfr轻链融合多肽序列；CDR加下划线；CL加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:35(5F7D7-VH3重链序列；CDR加下划线；Fc片段加阴影)
SEQ ID NO:44(5F7D7-VL5轻链序列；CDR加下划线；CL加阴影)
SEQ ID NO:49(5F7D7-VL2轻链序列；CDR加下划线；CL加阴影)
SEQ ID NO:55(5F7D7-VH3-vegfr重链融合多肽序列；CDR加下划线；Fc片段加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:66(5F7D7-VL5-vegfr轻链融合多肽序列；CDR加下划线；CL加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:36(7F10B2-VH3重链序列；CDR加下划线；Fc片段加阴影)
SEQ ID NO:37(7F10B2-VH5重链序列；CDR加下划线；Fc片段加阴影)
SEQ ID NO:54(7F10B2-VH3-vegfr重链融合多肽序列；CDR加下划线；Fc片段加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:53(7F10B2-VH5-vegfr重链融合多肽序列；CDR加下划线；Fc片段加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:45(7F10B2-VL1轻链序列；CDR加下划线；CL加阴影)
SEQ ID NO:46(7F10B2-VL3轻链序列；CDR加下划线；CL加阴影)
SEQ ID NO:64(7F10B2-VL1-vegfr轻链融合多肽序列；CDR加下划线；CL加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:65(7F10B2-VL3-vegfr轻链融合多肽序列；CDR加下划线；CL加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:38(31E2D4-VH4重链序列；CDR加下划线；Fc片段加阴影)
SEQ ID NO:52(31E2D4-VH4-vegfr重链融合多肽序列；CDR加下划线；Fc片段加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:39(42C3A4-VH1重链序列；CDR加下划线；Fc片段加阴影)
SEQ ID NO:74(42C3A4-VH1-vegfr重链融合多肽序列；CDR加下划线；Fc片段加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:47(42C3A4-VL1轻链序列；CDR加下划线；CL加阴影)
SEQ ID NO:72(42C3A4-VL1-vegfr轻链融合多肽序列；CDR加下划线；CL加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:40(hABTAA-VH重链序列；CDR加下划线；Fc片段加阴影)
SEQ ID NO:78(hABTAA-VH-vegfr重链融合多肽序列；CDR加下划线；Fc片段加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:48(hABTAA-VL轻链序列；CDR加下划线；CL加阴影)
SEQ ID NO:80(hABTAA-VL-vegfr轻链融合多肽序列；CDR加下划线；CL加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:56(vegfr-5A7B9-VH3.2重链融合多肽序列；CDR加下划线；Fc片段加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:57(vegfr-5A7B9-VH3重链融合多肽序列；CDR加下划线；Fc片段加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:68(vegfr-5A7B9-VL1.1轻链融合多肽序列；CDR加下划线；CL加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:67(vegfr-5A7B9-VL1轻链融合多肽序列；CDR加下划线；CL加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:77(vegfr-5A7B9-VL2轻链融合多肽序列；CDR加下划线；CL加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:61(vegfr-5F7D7-VH3重链融合多肽序列；CDR加下划线；Fc片段加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:71(vegfr-5F7D7-VL5轻链融合多肽序列；CDR加下划线；CL加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:60(vegfr-7F10B2-VH3重链融合多肽序列；CDR加下划线；Fc片段加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:59(vegfr-7F10B2-VH5重链融合多肽序列；CDR加下划线；Fc片段加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:69(vegfr-7F10B2-VL1轻链融合多肽序列；CDR加下划线；CL加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:70(vegfr-7F10B2-VL3轻链融合多肽序列；CDR加下划线；CL加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:58(vegfr-31E2D4-VH4重链融合多肽序列；CDR加下划线；Fc片段加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:75(vegfr-42C3A4-VH1重链融合多肽序列；CDR加下划线；Fc片段加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:73(vegfr-42C3A4-VL1轻链融合多肽序列；CDR加下划线；CL加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:79(vegfr-hABTAA-VH重链融合多肽序列；CDR加下划线；Fc片段加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:81(vegfr-hABTAA-VL轻链融合多肽序列；CDR加下划线；CL加阴影；接头加粗体；VEGF-trap加斜体)
SEQ ID NO:82(5A7B9-VH3.2 VH序列；CDR加下划线)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGVNWVRQAPGQRLEWMGWINSYSGVPTYADDFKGRFTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGENNYYGGSYDWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:83(5A7B9-VH3 VH序列；CDR加下划线)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGVNWVRQAPGQRLEWMGWINSYSGVPTYADDFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGENNYYGGSYDWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:84(5A7B9-VL1.1 VL序列；CDR加下划线)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQDYSSPLTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:85(5A7B9-VL1 VL序列；CDR加下划线)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPLTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:86(5A7B9-VL2 VL序列；CDR加下划线)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPLTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:87(5F7D7-VH3 VH序列；CDR加下划线)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQRLEWIGYIYPNNGDTSYNQKFKGRVTITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAVVSYSNYVAGAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:88(5F7D7-VL5 VL序列；CDR加下划线)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYFASNRYTGVPSRFSGSGYGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQQDYSSPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:89(7F10B2-VH3 VH序列；CDR加下划线)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGTINPKNGETSDNQKFKARVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARNVDYSNYLFFPMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:90(7F10B2-VH5 VH序列；CDR加下划线)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMDWVRQAPGQGLEWMGTINPKNGETSDNQKFKARVTVTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARNVDYSNYLFFPMDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:91(7F10B2-VL1 VL序列；CDR加下划线)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRFTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQDYSSRTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:92(7F10B2-VL3 VL序列；CDR加下划线)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRFTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSRTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:93(31E2D4-VH4 VH序列；CDR加下划线)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTNYGMNWVRQATGQGLEWMGWINSYSGVPTYADDFKGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGENNYYGGSYDWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:94(42C3A4-VH1 VH序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLKVSCAASGITFSNYWMDWVRQASGKGLEWVGEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRGAPLFGGYYKGVYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:95(42C3A4-VL1 VL序列；CDR加下划线)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSVSNEVAWYQQKPGKAPKLLIYYASSRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQDYNSPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:96(hABTAA-VH VH序列；CDR加下划线)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGKISYSGKTDYNPSLKSRSTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGNFEGAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:97(hABTAA-VL VL序列；CDR加下划线)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPWTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:98(5F7D7-VL2 VL序列；CDR加下划线)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYFASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYCQQDYSSPYTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:99(Fc片段序列)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:100(CL序列)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:101(Flt1d2序列)
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTII
SEQ ID NO:102(Flk1d3序列)
DVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK
SEQ ID NO:103(接头氨基酸序列，n是至少1的整数)
(G)n
SEQ ID NO:104(接头氨基酸序列，n是至少1的整数)
(GS)n
SEQ ID NO:105(接头氨基酸序列，n是至少1的整数)
(GSGGS)n
SEQ ID NO:106(接头氨基酸序列，n是至少1的整数)
(GGGGS)n
SEQ ID NO:107(接头氨基酸序列，n是至少1的整数)
(GGGS)n。
序列表
<110> 南京金斯瑞生物科技有限公司（Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd.）
<120> 抗体融合蛋白及其用途
<130> 75989-20009.40
<140> 尚未指定
<141> 一并同时提交
<150> PCT/CN2021/083093
<151> 2021-03-25
<160> 107
<170> 适用于Windows 4.0版的FastSEQ
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 1
Asn Tyr Gly Val Asn
1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 2
Asn Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 3
Asp Tyr Asn Met Asp
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 4
Asn Tyr Gly Met Asn
1 5
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 5
Asn Tyr Trp Met Asp
1 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 6
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn
1 5
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 7
Trp Ile Asn Ser Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 8
Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 9
Thr Ile Asn Pro Lys Asn Gly Glu Thr Ser Asp Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ala
<210> 10
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 10
Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 11
Lys Ile Ser Tyr Ser Gly Lys Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 12
Gly Glu Asn Asn Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Asp
1 5 10
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 13
Val Ser Tyr Ser Asn Tyr Val Ala Gly Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 14
Asn Val Asp Tyr Ser Asn Tyr Leu Phe Phe Pro Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 15
Gly Ala Pro Leu Phe Gly Gly Tyr Tyr Lys Gly Val Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 16
Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 17
Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala
1 5 10
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 18
Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Glu Val Ala
1 5 10
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 19
Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 20
Phe Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 21
Tyr Ala Ser Asn Arg Phe Thr
1 5
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 22
Tyr Ala Ser Ser Arg Tyr Thr
1 5
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 23
Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Pro
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 24
Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Leu Thr
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 25
Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 26
Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Arg Thr
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 27
Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 28
Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 29
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 29
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 30
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 31
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ser Pro Pro Ser Pro
1 5 10
<210> 32
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 32
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
195 200 205
<210> 33
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 33
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Ser Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Asn Asn Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Asp Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
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165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 34
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1 5 10 15
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245 250 255
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<223> 合成的构建体
<400> 35
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Lys
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<213> 人工序列
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<223> 合成的构建体
<400> 36
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<213> 人工序列
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<223> 合成的构建体
<400> 37
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
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Gly Lys
450
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 38
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asn Tyr
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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<220>
<223> 合成的构建体
<400> 39
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<220>
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<400> 40
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20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 42
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 43
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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165 170 175
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 44
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
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50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr
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165 170 175
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<210> 45
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Arg Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
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Asn Arg Gly Glu Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 46
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Arg Thr
85 90 95
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100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
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195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Glu
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
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<211> 214
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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195 200 205
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 49
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Phe Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 50
<211> 667
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 50
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Asn Ser Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
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195 200 205
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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450 455 460
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465 470 475 480
His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser
485 490 495
Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile
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Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr
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Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln
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Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys
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Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
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<210> 51
<211> 667
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Gly Trp Ile Asn Ser Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
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Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
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Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
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Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
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Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
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435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp
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485 490 495
Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile
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530 535 540
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Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu
580 585 590
Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln
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645 650 655
Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
660 665
<210> 52
<211> 667
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 52
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
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465 470 475 480
His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser
485 490 495
Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile
500 505 510
Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile
515 520 525
Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr
530 535 540
Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr
545 550 555 560
Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu
565 570 575
Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu
580 585 590
Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln
595 600 605
His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu
610 615 620
Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser
625 630 635 640
Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys
645 650 655
Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
660 665
<210> 53
<211> 670
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Asn Pro Lys Asn Gly Glu Thr Ser Asp Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Ala Arg Val Thr Val Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Asp Tyr Ser Asn Tyr Leu Phe Phe Pro Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro
465 470 475 480
Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg
485 490 495
Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp
500 505 510
Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly
515 520 525
Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys
530 535 540
Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His
545 550 555 560
Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly
565 570 575
Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg
580 585 590
Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser
595 600 605
Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser
610 615 620
Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val
625 630 635 640
Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu
645 650 655
Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
660 665 670
<210> 54
<211> 670
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 54
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Asn Pro Lys Asn Gly Glu Thr Ser Asp Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Ala Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Asp Tyr Ser Asn Tyr Leu Phe Phe Pro Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro
465 470 475 480
Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg
485 490 495
Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp
500 505 510
Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly
515 520 525
Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys
530 535 540
Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His
545 550 555 560
Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly
565 570 575
Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg
580 585 590
Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser
595 600 605
Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser
610 615 620
Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val
625 630 635 640
Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu
645 650 655
Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
660 665 670
<210> 55
<211> 669
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Val Ser Tyr Ser Asn Tyr Val Ala Gly Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr
210 215 220
Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
465 470 475 480
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
485 490 495
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
500 505 510
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
515 520 525
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
530 535 540
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
545 550 555 560
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
565 570 575
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
580 585 590
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
595 600 605
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
610 615 620
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
625 630 635 640
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
645 650 655
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
660 665
<210> 56
<211> 667
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 56
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
210 215 220
Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val
225 230 235 240
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Val Asn Trp
245 250 255
Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn
260 265 270
Ser Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe
275 280 285
Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser
290 295 300
Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Glu
305 310 315 320
Asn Asn Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
325 330 335
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
340 345 350
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
355 360 365
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
370 375 380
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
385 390 395 400
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
405 410 415
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
420 425 430
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
435 440 445
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
450 455 460
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
465 470 475 480
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
485 490 495
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
500 505 510
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
515 520 525
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
530 535 540
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
545 550 555 560
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
565 570 575
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
580 585 590
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
595 600 605
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
610 615 620
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
625 630 635 640
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
645 650 655
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
660 665
<210> 57
<211> 667
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 57
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
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Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
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Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
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Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
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Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
210 215 220
Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val
225 230 235 240
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Val Asn Trp
245 250 255
Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn
260 265 270
Ser Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Val
275 280 285
Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser
290 295 300
Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Glu
305 310 315 320
Asn Asn Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
325 330 335
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
340 345 350
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
355 360 365
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
370 375 380
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
385 390 395 400
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
405 410 415
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
420 425 430
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
435 440 445
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
450 455 460
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
465 470 475 480
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
485 490 495
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
500 505 510
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
515 520 525
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
530 535 540
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
545 550 555 560
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
565 570 575
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
580 585 590
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
595 600 605
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
610 615 620
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
625 630 635 640
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
645 650 655
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
660 665
<210> 58
<211> 667
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 58
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
210 215 220
Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val
225 230 235 240
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp
245 250 255
Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn
260 265 270
Ser Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Val
275 280 285
Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser
290 295 300
Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Glu
305 310 315 320
Asn Asn Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
325 330 335
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
340 345 350
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
355 360 365
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
370 375 380
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
385 390 395 400
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
405 410 415
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
420 425 430
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
435 440 445
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
450 455 460
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
465 470 475 480
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
485 490 495
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
500 505 510
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
515 520 525
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
530 535 540
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
545 550 555 560
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
565 570 575
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
580 585 590
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
595 600 605
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
660 665
<210> 59
<211> 670
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 59
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1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
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145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
210 215 220
Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val
225 230 235 240
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp
245 250 255
Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Asn
260 265 270
Pro Lys Asn Gly Glu Thr Ser Asp Asn Gln Lys Phe Lys Ala Arg Val
275 280 285
Thr Val Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg
290 295 300
Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Val
305 310 315 320
Asp Tyr Ser Asn Tyr Leu Phe Phe Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
325 330 335
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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<210> 60
<211> 670
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 60
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Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Val
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
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660 665 670
<210> 61
<211> 669
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 61
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195 200 205
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Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val
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245 250 255
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Pro Asn Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val
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Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser
290 295 300
Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Val Val Ser
305 310 315 320
Tyr Ser Asn Tyr Val Ala Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
325 330 335
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
340 345 350
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
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Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
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Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
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Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
405 410 415
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
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Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
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Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
450 455 460
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
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Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
485 490 495
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
500 505 510
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
515 520 525
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
530 535 540
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
545 550 555 560
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
565 570 575
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
580 585 590
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
595 600 605
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610 615 620
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
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Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
645 650 655
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
660 665
<210> 62
<211> 431
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 62
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
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260 265 270
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275 280 285
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Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala
340 345 350
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405 410 415
Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
420 425 430
<210> 63
<211> 431
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 63
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
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Ser Pro Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile
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Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys
245 250 255
Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu
260 265 270
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<210> 64
<211> 430
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 64
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165 170 175
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser
370 375 380
Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val
385 390 395 400
Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu
405 410 415
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420 425 430
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<211> 430
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 65
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
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Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
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Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
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Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
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Pro Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro
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Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg
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Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp
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Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly
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Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys
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340 345 350
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 66
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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<220>
<223> 合成的构建体
<400> 67
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<220>
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<400> 73
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Gly Ala Pro Leu Phe Gly Gly Tyr Tyr Lys Gly Val
100 105 110
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser
130 135 140
Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
165 170 175
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
180 185 190
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr
195 200 205
Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
210 215 220
Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
325 330 335
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr
465 470 475 480
Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val
485 490 495
Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys
500 505 510
Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp
515 520 525
Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly
530 535 540
Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn
545 550 555 560
Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser
565 570 575
Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn
580 585 590
Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu
595 600 605
Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu
610 615 620
Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr
625 630 635 640
Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala
645 650 655
Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His
660 665 670
Glu Lys
<210> 75
<211> 674
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 75
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
210 215 220
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Val
225 230 235 240
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asp Trp
245 250 255
Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Glu Ile Arg
260 265 270
Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly
275 280 285
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
290 295 300
Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg
305 310 315 320
Gly Ala Pro Leu Phe Gly Gly Tyr Tyr Lys Gly Val Tyr Phe Asp Tyr
325 330 335
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
340 345 350
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
355 360 365
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
370 375 380
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
385 390 395 400
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
405 410 415
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
420 425 430
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
435 440 445
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
450 455 460
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
465 470 475 480
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
485 490 495
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
500 505 510
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
515 520 525
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
530 535 540
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
545 550 555 560
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
565 570 575
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
580 585 590
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
595 600 605
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
610 615 620
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
625 630 635 640
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
645 650 655
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
660 665 670
Gly Lys
<210> 76
<211> 431
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 76
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ser Pro Pro
210 215 220
Ser Pro Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile
225 230 235 240
Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys
245 250 255
Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu
260 265 270
Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys
275 280 285
Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr
290 295 300
Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr
305 310 315 320
His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His
325 330 335
Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala
340 345 350
Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser
355 360 365
Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln
370 375 380
Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly
385 390 395 400
Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly
405 410 415
Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
420 425 430
<210> 77
<211> 434
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 77
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu
210 215 220
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
225 230 235 240
Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr
245 250 255
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser
260 265 270
Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
275 280 285
Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
290 295 300
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln
305 310 315 320
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
325 330 335
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
340 345 350
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
355 360 365
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
370 375 380
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
385 390 395 400
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
405 410 415
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
420 425 430
Glu Cys
<210> 78
<211> 665
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 78
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Lys Ile Ser Tyr Ser Gly Lys Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Thr Gly
450 455 460
Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met
465 470 475 480
Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn
485 490 495
Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp
500 505 510
Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn
515 520 525
Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn
530 535 540
Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr
545 550 555 560
Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val
565 570 575
Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val
580 585 590
Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys
595 600 605
Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys
610 615 620
Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln
625 630 635 640
Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn
645 650 655
Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
660 665
<210> 79
<211> 665
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 79
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
210 215 220
Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu
225 230 235 240
Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn
245 250 255
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Lys Ile
260 265 270
Ser Tyr Ser Gly Lys Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ser
275 280 285
Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser
290 295 300
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn
305 310 315 320
Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
325 330 335
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys
340 345 350
Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
355 360 365
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
370 375 380
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
385 390 395 400
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
405 410 415
Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
420 425 430
Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
435 440 445
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
450 455 460
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
465 470 475 480
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
485 490 495
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
500 505 510
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
515 520 525
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
530 535 540
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
545 550 555 560
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
565 570 575
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
580 585 590
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
595 600 605
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
610 615 620
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
625 630 635 640
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
645 650 655
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
660 665
<210> 80
<211> 431
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 80
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ser Pro Pro
210 215 220
Ser Pro Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile
225 230 235 240
Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys
245 250 255
Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu
260 265 270
Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys
275 280 285
Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr
290 295 300
Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr
305 310 315 320
His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His
325 330 335
Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala
340 345 350
Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser
355 360 365
Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln
370 375 380
Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly
385 390 395 400
Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly
405 410 415
Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
420 425 430
<210> 81
<211> 434
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 81
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
210 215 220
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
225 230 235 240
Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr
245 250 255
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser
260 265 270
Asn Arg Tyr Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
275 280 285
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
290 295 300
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln
305 310 315 320
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
325 330 335
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
340 345 350
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
355 360 365
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
370 375 380
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
385 390 395 400
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
405 410 415
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
420 425 430
Glu Cys
<210> 82
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 82
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Ser Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Asn Asn Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Asp Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 83
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 83
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Ser Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Asn Asn Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Asp Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 84
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 84
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 85
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 85
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 86
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 86
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 87
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 87
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Val Ser Tyr Ser Asn Tyr Val Ala Gly Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 88
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 88
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 89
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 89
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Asn Pro Lys Asn Gly Glu Thr Ser Asp Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Ala Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Asp Tyr Ser Asn Tyr Leu Phe Phe Pro Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 90
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 90
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Asn Pro Lys Asn Gly Glu Thr Ser Asp Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Ala Arg Val Thr Val Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Asp Tyr Ser Asn Tyr Leu Phe Phe Pro Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 91
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 91
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Arg Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 92
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 92
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Arg Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 93
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 93
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Ser Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Asn Asn Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Asp Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 94
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 94
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Gly Ala Pro Leu Phe Gly Gly Tyr Tyr Lys Gly Val
100 105 110
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 95
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 95
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Glu
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 96
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 96
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Lys Ile Ser Tyr Ser Gly Lys Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 97
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 97
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 98
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 98
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 99
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 99
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 100
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 100
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 101
<211> 102
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 101
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile
100
<210> 102
<211> 103
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 102
Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu
1 5 10 15
Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile
20 25 30
Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu
35 40 45
Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe
50 55 60
Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr
85 90 95
Phe Val Arg Val His Glu Lys
100
<210> 103
<211> 1
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> 可以以任何整数的重复出现
<400> 103
Gly
1
<210> 104
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<220>
<221> 变体
<222> (1)...(2)
<223> 可以以任何整数的重复出现
<400> 104
Gly Ser
1
<210> 105
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<220>
<221> 变体
<222> (1)...(5)
<223> 可以以任何整数的重复出现
<400> 105
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 106
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<220>
<221> 变体
<222> (1)...(5)
<223> 可以以任何整数的重复出现
<400> 106
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 107
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<220>
<221> 变体
<222> (1)...(4)
<223> 可以以任何整数的重复出现
<400> 107
Gly Gly Gly Ser
1

Claims (61)

1.一种抗体融合蛋白，其包含：i)特异性识别血管生成素-2(Ang2)的多价抗体或其抗原结合片段(“多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段”)，和ii)血管内皮生长因子受体(VEGFR)组分，其中所述多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段不抑制Ang2与TEK受体酪氨酸激酶(TIE2)之间的结合。
2.如权利要求1所述的抗体融合蛋白，其中所述VEGFR组分包含独立地选自由Flt1、Flk1和Flt4组成的组的一种或多种VEGFR的免疫球蛋白(Ig)样结构域。
3.如权利要求1或2所述的抗体融合蛋白，其中所述VEGFR组分包含第一VEGFR的Ig样结构域2和第二VEGFR的Ig样结构域3。
4.如权利要求3所述的抗体融合蛋白，其中所述第一VEGFR是Flt1，并且所述第二VEGFR是Flk1或Flt4。
5.如权利要求1-4中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述VEGFR组分包含Flt1的Ig样结构域2(Flt1d2)和Flk1的Ig样结构域3(Flk1d3)。
6.如权利要求1-5中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述VEGFR组分包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述VEGFR组分通过任选的接头融合至所述多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段。
8.如权利要求7所述的抗体融合蛋白，其中所述接头包含SEQ ID NO:30或31的氨基酸序列。
9.如权利要求1-8中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段在结合Ang2后通过所述抗体结合的Ang2激活TIE2信号传导。
10.如权利要求1-9中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述多价抗Ang2抗体或其抗原结合片段是全长抗体(“抗Ang2全长抗体”)。
11.如权利要求10所述的抗体融合蛋白，其中所述抗Ang2全长抗体包含以下中任一项：
(1)包含SEQ ID NO:33或34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:41-43中任一个的氨基酸序列的轻链；
(2)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:44或49的氨基酸序列的轻链；
(3)包含SEQ ID NO:36或37的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:45或46的氨基酸序列的轻链；
(4)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:41-43中任一个的氨基酸序列的轻链；
(5)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链；或者
(6)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链。
12.如权利要求10或11所述的抗体融合蛋白，其中所述抗Ang2全长抗体包含以下中任一项：
(1)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链；
(2)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:41-43中任一个的氨基酸序列的轻链；
(3)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链；
(4)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的轻链；
(5)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链；
(6)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链；
(7)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链；或者
(8)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链。
13.如权利要求10-12中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述抗Ang2全长抗体是单特异性的。
14.如权利要求10-12中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述抗Ang2全长抗体是双特异性的。
15.如权利要求10-14中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述VEGFR组分通过任选的接头融合至所述抗Ang2全长抗体的重链的N末端。
16.如权利要求15所述的抗体融合蛋白，其中所述重链融合多肽包含SEQ ID NO:56-61、75和79中任一个的氨基酸序列。
17.如权利要求15或16所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体融合蛋白包含以下中任一项：
(1)包含SEQ ID NO:56或58的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链；
(2)包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:41或42的氨基酸序列的轻链；
(3)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链；
(4)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的轻链；
(5)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链；
(6)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链；或者
(7)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链。
18.如权利要求15-17中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体融合蛋白包含第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第一重链的N末端，并且其中所述第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第二重链的N末端。
19.如权利要求18所述的抗体融合蛋白，其中所述两个重链融合多肽相同。
20.如权利要求10-14中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述VEGFR组分通过任选的接头融合至所述抗Ang2全长抗体的重链的C末端。
21.如权利要求20所述的抗体融合蛋白，其中所述重链融合多肽包含SEQ ID NO:50-55、74和78中任一个的氨基酸序列。
22.如权利要求20或21所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体融合蛋白包含以下中任一项：
(1)包含SEQ ID NO:50或52的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链；
(2)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:41或42的氨基酸序列的轻链；
(3)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链；
(4)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的轻链；
(5)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链；
(6)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链；或者
(7)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的重链融合多肽和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链。
23.如权利要求20-22中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体融合蛋白包含第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第一重链的C末端，并且其中所述第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第二重链的C末端。
24.如权利要求23所述的抗体融合蛋白，其中所述两个重链融合多肽相同。
25.如权利要求10-14中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述VEGFR组分通过任选的接头融合至所述抗Ang2全长抗体的轻链的N末端。
26.如权利要求25所述的抗体融合蛋白，其中所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:67-71、73、77和81中任一个的氨基酸序列。
27.如权利要求25或26所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体融合蛋白包含以下中任一项：
(1)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链融合多肽；
(2)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:67、68和77中任一个的氨基酸序列的轻链融合多肽；
(3)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链融合多肽；
(4)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链融合多肽；
(5)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链融合多肽；
(6)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的轻链融合多肽；
(7)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链融合多肽；或者
(8)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的轻链融合多肽。
28.如权利要求25-27中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体融合蛋白包含第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第一轻链的N末端，并且其中所述第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第二轻链的N末端。
29.如权利要求28所述的抗体融合蛋白，其中所述两个轻链融合多肽相同。
30.如权利要求10-14中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述VEGFR组分通过任选的接头融合至所述抗Ang2全长抗体的轻链的C末端。
31.如权利要求30所述的抗体融合蛋白，其中所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:62-66、72、76和80中任一个的氨基酸序列。
32.如权利要求30或31所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体融合蛋白包含以下中任一项：
(1)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链融合多肽；
(2)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:62、63和76中任一个的氨基酸序列的轻链融合多肽；
(3)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的轻链融合多肽；
(4)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的轻链融合多肽；
(5)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的轻链融合多肽；
(6)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的轻链融合多肽；
(7)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链融合多肽；或者
(8)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的轻链融合多肽。
33.如权利要求30-32中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体融合蛋白包含第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第一轻链的C末端，并且其中所述第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第二轻链的C末端。
34.如权利要求33所述的抗体融合蛋白，其中所述两个轻链融合多肽相同。
35.如权利要求10-14中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体融合蛋白包含四个VEGFR组分，其中所述抗体融合蛋白包含以下中任一项：
(1)其中第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第一重链的N末端，其中第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第二重链的N末端，其中第三VEGFR组分通过任选的第三接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第一轻链的N末端，并且其中第四VEGFR组分通过任选的第四接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第二轻链的N末端；
(2)其中第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第一重链的C末端，其中第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第二重链的C末端，其中第三VEGFR组分通过任选的第三接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第一轻链的C末端，并且其中第四VEGFR组分通过任选的第四接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第二轻链的C末端；
(3)其中第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第一重链的N末端，其中第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第二重链的N末端，其中第三VEGFR组分通过任选的第三接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第一重链的C末端，并且其中第四VEGFR组分通过任选的第四接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第二重链的C末端；
(4)其中第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第一重链的C末端，其中第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第二重链的C末端，其中第三VEGFR组分通过任选的第三接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第一轻链的N末端，并且其中第四VEGFR组分通过任选的第四接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第二轻链的N末端；
(5)其中第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第一重链的N末端，其中第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第二重链的N末端，其中第三VEGFR组分通过任选的第三接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第一轻链的C末端，并且其中第四VEGFR组分通过任选的第四接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第二轻链的C末端；或者
(6)其中第一VEGFR组分通过任选的第一接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第一轻链的N末端，其中第二VEGFR组分通过任选的第二接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第二轻链的N末端，其中第三VEGFR组分通过任选的第三接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第一轻链的C末端，并且其中第四VEGFR组分通过任选的第四接头融合至所述抗Ang2全长抗体的第二轻链的C末端。
36.如权利要求35所述的抗体融合蛋白，其中所述第一、第二、第三和第四接头各自包含独立地选自SEQ ID NO:30或31的氨基酸序列。
37.如权利要求35或36所述的抗体融合蛋白，其中所述第一和第二VEGFR组分相同。
38.如权利要求35-37中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述第三和第四VEGFR组分相同。
39.如权利要求35-38中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述四个VEGFR组分相同。
40.如权利要求35-38中任一项所述的抗体融合蛋白，其中至少一个VEGFR组分不同于其他组分。
41.一种分离的核酸，其编码如权利要求1-40中任一项所述的抗体融合蛋白。
42.一种载体，其包含如权利要求41所述的分离的核酸。
43.一种分离的宿主细胞，其包含如权利要求41所述的分离的核酸或如权利要求42所述的载体。
44.一种套件，其包含如权利要求1-40中任一项所述的抗体融合蛋白、如权利要求41所述的分离的核酸、如权利要求42所述的载体或如权利要求43所述的分离的宿主细胞。
45.一种产生抗体融合蛋白的方法，所述方法包括：(a)在有效表达所述抗体融合蛋白的条件下培养包含如权利要求41所述的分离的核酸或如权利要求42所述的载体的宿主细胞，或如权利要求43所述的分离的宿主细胞；以及(b)从所述宿主细胞获得表达的抗体融合蛋白。
46.如权利要求45所述的方法，其中步骤(a)进一步包括产生包含如权利要求41所述的分离的核酸或如权利要求42所述的载体的宿主细胞。
47.一种药物组合物，其包含如权利要求1-40中任一项所述的抗体融合蛋白和药学上可接受的载剂。
48.一种治疗个体的癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如权利要求1-40中任一项所述的抗体融合蛋白，或如权利要求47所述的药物组合物。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。
50.如权利要求48或49所述的方法，其中所述癌症是肺癌、肝癌、皮肤癌如黑色素瘤、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、结直肠癌、肾癌或膀胱癌。
51.如权利要求48-50中任一项所述的方法，其中将所述抗体融合蛋白或所述药物组合物静脉内或肿瘤内施用。
52.一种治疗个体的非肿瘤性障碍的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如权利要求1-40中任一项所述的抗体融合蛋白，或如权利要求47所述的药物组合物。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述非肿瘤性障碍与VEGF过表达相关。
54.如权利要求52或53所述的方法，其中所述非肿瘤性障碍选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、银屑病、动脉粥样硬化、血管瘤、移植排斥、慢性炎症、感染和眼部新生血管障碍。
55.如权利要求52-54中任一项所述的方法，其中将所述抗体融合蛋白或所述药物组合物静脉内施用。
56.如权利要求52-54中任一项所述的方法，其中所述移植排斥是移植的角膜组织的排斥。
57.如权利要求52-54中任一项所述的方法，其中所述非肿瘤性障碍是眼部新生血管障碍。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述眼部新生血管障碍是年龄相关性黄斑变性(AMD)或糖尿病性视网膜病变。
59.如权利要求57或58所述的方法，其中所述眼部新生血管障碍与脉络膜新血管形成、血管渗漏和视网膜水肿中的一种或多种相关。
60.如权利要求57-59中任一项所述的方法，其中所述抗体融合蛋白或所述药物组合物的施用选自由以下组成的组：滴眼剂、结膜下注射、结膜下植入、玻璃体内注射、玻璃体内植入、眼球筋膜下注射和眼球筋膜下植入。
61.如权利要求57-60中任一项所述的方法，其中将所述抗体融合蛋白或所述药物组合物通过玻璃体内注射施用。
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