CN116535507A - 针对ctla-4的单结构域抗体及其变体 - Google Patents
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Abstract
本申请提供包含特异性识别CTLA‑4的单结构域抗体(sdAb)部分的构建体。也提供制备和使用这些构建体的方法。
Description
本申请是申请号为201780063159.X、申请日为2017年10月10日、发明名称为“针对CTLA-4的单结构域抗体及其变体”的发明申请的分案申请。
相关申请
本申请要求2016年10月11日提交的国际专利申请号PCT/CN2016/101777和2017年7月20日提交的国际专利申请号PCT/CN2017/093644的优先权权益，所述国际专利申请的内容以引用的方式整体并入本文。
发明领域
本发明涉及包含特异性识别CTLA-4的单结构域抗体(sdAb)部分的构建体及其制备和使用方法。
发明背景
T细胞的活化不仅要求通过T细胞受体(TCR)进行刺激，而且也要求通过在T细胞表面上组成性表达的共刺激性表面分子诸如CD28进行额外信号传导。CD28的配体是B7-1(CD80)和B7-2(CD86)，其存在于抗原递呈细胞(APC)诸如树突细胞、活化的B细胞或单核细胞上。B7与CD28之间的相互作用是似乎足以触发抗原特异性T细胞的成熟和增殖的若干共刺激性信号传导路径中的一者。缺乏共刺激，由此伴随IL-2产生不充分，会阻止后续T细胞增殖以及诱导被称为“无反应性”的非反应性状态。
细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4或CD152)是CD28的同源物，并且被称为在活化的T细胞上得以上调的抑制性免疫检查点分子。CTLA-4也结合至B7-1和B7-2，但相比于CD28，具有更大亲和力。B7与CTLA-4之间的相互作用会减弱T细胞活化，此构成肿瘤免疫逃脱的重要机理。抗CTLA-4抗体疗法已在许多癌症诸如黑素瘤的情况下显示前景。
单链抗体(sdAb)由于具有单一单体抗体可变结构域而不同于常规4链抗体。举例来说，骆驼科动物和鲨鱼产生被命名为仅有重链的抗体(HCAb)的单结构域抗体，其天然地缺乏轻链。骆驼科动物HCAb的各臂中的抗原结合片段具有单一重链可变结构域(VHH)，其可在不借助于轻链下展现对抗原的高亲和力。骆驼科动物VHH被称为最小功能性抗原结合片段，具有约15kD的分子量。
本文提及的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的公开内容都据此以引用的方式整体并入本文。
发明内容
本发明涉及包含特异性识别CTLA-4的单结构域抗体(sdAb)部分的构建体及其制备和使用方法。
在一个方面，本发明提供了一种包含特异性识别CTLA-4的单结构域抗体(sdAb)部分的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ IDNO:27、26、220、221、222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:59、58、240、241、242中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:91、90、260、261、262中的任一者的CDR3。
在某些实施方案中，所述sdAb部分包含以下各物：
(1)如氨基酸序列SEQ ID NO:27所示的CDR1，如氨基酸序列SEQ ID NO:59所示的CDR2，和如氨基酸序列SEQ ID NO:91所示的CDR3；
(2)如氨基酸序列SEQ ID NO:26所示的CDR1，如氨基酸序列SEQ ID NO:58所示的CDR2，和如氨基酸序列SEQ ID NO:90所示的CDR3；
(3)如氨基酸序列SEQ ID NO:220所示的CDR1，如氨基酸序列SEQ ID NO:240所示的CDR2，和如氨基酸序列SEQ ID NO:260所示的CDR3；
(4)如氨基酸序列SEQ ID NO:221所示的CDR1，如氨基酸序列SEQ ID NO:241所示的CDR2，和如氨基酸序列SEQ ID NO:261所示的CDR3；或，
(5)如氨基酸序列SEQ ID NO:222所示的CDR1，如氨基酸序列SEQ ID NO:242所示的CDR2，和如氨基酸序列SEQ ID NO:262所示的CDR3。
在某些实施方案中，所述sdAb部分包含如氨基酸序列SEQ ID NO:123、122、353、280、281、282和341中的任一者所示的VHH结构域或与其相比具有至少约80％序列同一性的变体。
在某些实施方案中，特异性识别CTLA-4的所述sdAb部分是骆驼科动物的、嵌合的、人的、部分人源化的或完全人源化的。
在某些实施方案中，所述经分离的抗CTLA-4构建体是仅有重链的抗体(HCAb)。
在某些实施方案中，所述HCAb是单体或二聚体。
在某些实施方案中，所述HCAb包含氨基酸序列SEQ ID NO:367、289、290、291和368中的任一者。
在某些实施方案中，所述经分离的抗CTLA-4构建体进一步包含特异性识别第二表位的第二抗体部分。
在某些实施方案中，所述第二抗体部分是全长抗体、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、scFv-scFv、微型抗体、双体抗体或sdAb。
在某些实施方案中，所述抗CTLA-4构建体具有多特异性。
在某些实施方案中，特异性识别CTLA-4的所述sdAb部分和所述第二抗体部分任选由肽接头连接。
在某些实施方案中，所述肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。
在某些实施方案中，所述第二抗体部分是由两个重链和两个轻链组成的全长抗体。
在某些实施方案中，特异性识别CTLA-4的所述sdAb部分的N末端融合于所述全长抗体的至少一个重链的C末端。
在某些实施方案中，特异性识别CTLA-4的所述sdAb部分的C末端融合于所述全长抗体的至少一个重链的N末端。
在某些实施方案中，特异性识别CTLA-4的所述sdAb部分的N末端融合于所述全长抗体的至少一个轻链的C末端。
在某些实施方案中，特异性识别CTLA-4的所述sdAb部分的C末端融合于所述全长抗体的至少一个轻链的N末端。
在某些实施方案中，所述抗CTLA-4构建体包含四个特异性识别CTLA-4的sdAb部分，并且其中各个特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于所述全长抗体的各链的N末端。
在某些实施方案中，所述全长抗体特异性识别PD-1。
在某些实施方案中，所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链。
在某些实施方案中，所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链。
在某些实施方案中，所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链。
在某些实施方案中，其中：
(1)所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链，其中所述全长抗体的至少一个重链融合于所述抗CTLA-4sdAb，并且其中重链融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:294、296、321和323中的任一者；
(2)所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链，其中所述全长抗体的至少一个重链融合于所述抗CTLA-4sdAb，并且其中重链融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:299、301、326和328中的任一者；或，
(3)所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链，其中所述全长抗体的至少一个重链融合于所述抗CTLA-4sdAb，并且其中重链融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:310、312、318、329、331和337中的任一者。
在某些实施方案中，所述抗CTLA-4构建体包含特异性识别CTLA-4的四个相同sdAb，其中两个特异性识别CTLA-4的sdAb融合在一起，其进一步融合于所述全长抗体的各重链的N末端。
在某些实施方案中，所述全长抗体特异性识别PD-L1。
在某些实施方案中，所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链。
在某些实施方案中，所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链。
在某些实施方案中，所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链，其中所述全长抗体的至少一个重链融合于所述抗CTLA-4sdAb，并且其中重链融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:304、306、347和349中的任一者。
在另一个方面，本发明提供了一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:123、122、353、280、281、282和341中的任一者的CDR1、CDR2和CDR3。
在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的经分离的抗CTLA-4构建体和药物可接受载体。
在另一个方面，本发明涉及本发明的经分离的抗CTLA-4构建体或本发明的药物组合物在制备用于治疗患有CTLA-4相关疾病的个体的药物中的用途。
在某些实施方案中，所述CTLA-4相关疾病是癌症。
在某些实施方案中，所述癌症是实体肿瘤。
在某些实施方案中，所述癌症是结肠癌、黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌或胶质母细胞瘤。
在某些实施方案中，所述用途进一步包括向所述个体施用额外癌症疗法。
在某些实施方案中，所述药物组合物全身施用。
在某些实施方案中，所述药物组合物局部施用。
在另一个方面，本发明提供了一种经分离的核酸，其编码本发明的经分离的抗CTLA-4构建体。
在某些实施方案中，所述经分离的核酸包含核酸序列SEQ ID NO:106-107和271-273中的任一者。
在另一个方面，本发明提供了一种载体，其包含本发明的经分离的核酸。
在另一个方面，本发明提供了一种经分离的宿主细胞，其包含本发明的经分离的核酸或本发明的载体。
附图说明
图1描绘对免疫前血清以及在第4、第5和第6次免疫之后的免疫血清的免疫应答评估。
图2描绘对在第6次免疫之后的重链抗体(IgG2和IgG3)的免疫应答评估(终末放血)。从免疫前血清分级分离的重链抗体用作阴性对照。
图3A-图3B描绘使用B7-1表达性稳定细胞系和经生物素标记的hCTLA-4/Fc蛋白，通过基于FACS的配体竞争测定对sdAb(图3A)和它们的重链抗体(图3B)的功能活性评估。用作阳性抗CTLA-4抗体对照。
图4描绘通过基于CTLA-4的阻断测定对纯化sdAb的功能活性评估。用作阳性抗CTLA-4抗体对照。
图5A-图5F描绘通过基于CTLA-4的阻断测定对纯化最佳HCAb(图5B-图5E)的功能活性评估。充当阳性抗CTLA-4抗体对照(图5A)。来自所有测定的EC50概述于图5F中。
图6描绘A34311(WT)和在人源化之后的最佳3个克隆的sdAb序列比对。在框架区中相对于人接受体(与sdAb A34311共有最高同源性程度的最佳人种系序列)的氨基酸差异用暗灰色加以阴影化。
图7描绘使用B7-1表达性稳定细胞系和经生物素标记的hCTLA-4Fc蛋白，通过基于FACS的配体竞争测定对A34311 sdAb和人源化sdAb AS02640的功能活性评估。
图8描绘通过基于CTLA-4的阻断测定对A34311 sdAb和AS02640 sdAb的功能活性评估。
图9描绘对示例性sdAb A34311和它的人源化形式(AS02640)的亲和力测定。将CTLA-4Fc蛋白固定于芯片上，并且使两种sdAb作为分析物在1、3、9、27和81nM的浓度下流动。
图10描绘通过基于CTLA-4的阻断测定对A34311 HCAb和AS02640 HCAb的功能活性评估。充当阳性抗CTLA-4抗体对照。
图11A-图11C描绘使用MC38同基因小鼠模型对A34311 HCAb和AS02640HCAb的体内功效研究。图11A描绘实验时间安排。图11B显示A34311 HCAb和AS02640 HCAb能够在体内抑制肿瘤生长，与内部产生的Yervoy(易普利单抗(ipilimumab))生物类似抗体(与具有大致上相同的氨基酸序列的4链抗体)具有类似功效。图11C指示经MC38植入的小鼠的体重不受治疗影响。
图12A-图12D描绘对两种示例性双特异性CTLA-4×PD-1抗体关于PD-1结合的亲和力测定。用作抗PD-1抗体的阳性对照。将抗体固定于芯片上，并且使PD-1-His蛋白作为分析物在0.78、1.56、3.15、6.25、12.5、25、50和100nM的浓度下流动。
图13A-图13E描绘对两种示例性双特异性CTLA-4×PD-1抗体关于CTLA-4结合的亲和力测定。A34311 HCAb和充当抗CTLA-4阳性对照。将抗体固定于芯片上，并且使CTLA-4-His蛋白作为分析物在0.78、1.56、3.15、6.25、12.5、25、50和100nM的浓度下流动。
图14描绘使用PD-1表达性稳定细胞系和经生物素标记的hPD-L1 Fc蛋白，通过基于FACS的配体竞争测定对设计的双特异性CTLA-4×PD-1抗体关于PD-1靶向的功能活性评估。
图15描绘使用B7-1表达性稳定细胞系和经生物素标记的hCTLA-4Fc蛋白，通过基于FACS的配体竞争测定对设计的双特异性CTLA-4×PD-1抗体关于CTLA-4靶向的功能活性评估。
图16A-图16F描绘通过基于CTLA-4的阻断测定对设计的双特异性CTLA-4×PD-1抗体关于CTLA-4靶向的功能活性评估。内部表达的Yervoy生物类似物、抗体和A34311HCAb用作阳性抗CTLA-4抗体对照。
图17A-图17D描绘通过混合淋巴细胞反应(MLR)测定对设计的双特异性CTLA-4×PD-1抗体关于PD-1靶向的功能活性评估。用作阳性抗PD-1抗体对照。
图18A-图18J描绘对抗CTLA-4HCAb的基于FACS的配体竞争评估。充当阳性抗CTLA-4抗体对照。来自所有测定的IC50概述于图18J中。
图19A-图19L描绘对示例性双特异性CTLA-4×PD-1或CTLA-4×PD-L1抗体关于与CTLA-4的结合的基于FACS的配体竞争评估。充当阳性抗CTLA-4抗体对照。人IgG充当阴性对照。来自所有测定的IC50概述于图19L中。
图20A-图20J描绘对示例性双特异性CTLA-4×PD-1抗体关于与PD-1的结合的基于FACS的配体竞争评估。和/>充当阳性抗PD-1抗体对照。来自所有测定的IC50概述于图20J中。
图21A-图21G描绘对示例性双特异性CTLA-4×PD-L1抗体关于与PD-L1的结合的基于FACS的配体竞争评估。充当阳性抗PD-L1抗体对照。/>充当抗PD-1抗体对照。人IgG用作阴性对照。来自所有测定的IC50概述于图21G中。
图22A-图22B描绘对AS07014 sdAb和AS07089 sdAb的亲和力测定。将CTLA-4-His蛋白固定于芯片上，并且使两种sdAb作为分析物在5、10、20、40、80和160nM的浓度下流动。动力学数据概述于图22B中。
图23A-图23B描绘对示例性抗CTLA-4HCAb和它们的人源化HCAb的亲和力测定。将CTLA-4-His蛋白固定于芯片上，并且使HCAb作为分析物在5、10、20、40、80和160nM的浓度下流动。动力学数据概述于图23B中。
图24A-图24B描绘对示例性双特异性CTLA-4×PD-1或CTLA-4×PD-L1抗体关于与CTLA-4的结合的亲和力测定。用作抗CTLA-4抗体的阳性对照。将抗体固定于芯片上，并且使CTLA-4-His蛋白作为分析物在12.5、25、50、100和200nM的浓度下流动。动力学数据概述于图24B中。
图25A-图25B描绘对示例性双特异性CTLA-4×PD-1抗体关于与PD-1的结合的亲和力测定。用作抗PD-1抗体的阳性对照。将抗体固定于芯片上，并且使PD-1-His蛋白作为分析物在3.125、6.25、12.5、25、50和100nM的浓度下流动。动力学数据概述于图25B中。
图26A-图26B描绘对示例性双特异性CTLA-4×PD-L1抗体关于与PD-L1的结合的亲和力测定。用作抗PD-L1抗体的阳性对照。将抗体固定于芯片上，并且使PD-L1-His蛋白作为分析物在1.56、3.125、6.25、12.5、25和50nM的浓度下流动。动力学数据概述于图26B中。
图27A-图27C描绘通过基于CTLA-4的阻断测定对纯化sdAb的功能活性评估(图27A)。充当阳性抗CTLA-4抗体对照(图27B)。来自所有测定的EC50概述于图27C中。
图28A-图28B描绘通过基于CTLA-4的阻断测定对纯化HCAb(包括人源化HCAb)的功能活性评估。充当阳性抗CTLA-4抗体对照，而人IgG充当阴性对照(图28A)。来自所有测定的EC50概述于图28B中。
图29A-图29B描绘通过基于CTLA-4的阻断测定对示例性双特异性CTLA-4×PD-1或CTLA-4×PD-L1抗体的功能活性评估。充当阳性抗CTLA-4抗体对照(图29A)。来自所有测定的EC50概述于图29B中。
图30A-图30B描绘通过基于PD-1/PD-L1的阻断测定对示例性双特异性CTLA-4×PD-1或CTLA-4×PD-L1抗体的功能活性评估。和/>充当阳性抗PD-1抗体对照。/>充当阳性抗PD-L1抗体对照(图30A)。来自所有测定的EC50概述于图30B中。
图31A-图31C描绘所选骆驼科动物sdAb序列(A34311、AS07014和AS07189)和它们的相应人源化sdAb以及人接受体。
图32A-图32B描绘对人源化抗CTLA-4HCAb与CTLA-4表达性CHO细胞的基于FACS的细胞结合评估。充当阳性抗CTLA-4抗体对照。来自所有测定的EC50概述于图32B中。
图33A-33B描绘对示例性双特异性CTLA-4×PD-1或CTLA-4×PD-L1抗体与表达人CTLA-4的CHO细胞的基于FACS的细胞结合评估。充当阳性抗CTLA-4抗体对照。来自所有测定的EC50概述于图33B中。
图34A-图34B描绘对示例性双特异性CTLA-4×PD-1抗体与表达人PD-1的CHO细胞的基于FACS的细胞结合评估。和/>充当阳性抗PD-1抗体对照。来自所有测定的EC50概述于图34B中。
图35A-图35B描绘对示例性双特异性CTLA-4×PD-L1抗体与表达PD-L1的CHO细胞的基于FACS的细胞结合评估。充当阳性抗PD-L1抗体对照。来自所有测定的EC50概述于图35B中。
图36A-图36C描绘在CTLA-4KI小鼠中，使用MC38同基因小鼠模型对A34311 HCAb、人源化AS07014VH11 HCAb和人源化AS07189TKDVH11 HCAb的体内功效研究。Yervoy生物类似物用作阳性抗CTLA-4抗体对照。图36A描绘实验时间安排。图36B显示A34311 HCAb、AS07014VH11和AS07189TKDVH11 HCAb能够在体内抑制肿瘤生长，与Yervoy生物类似物具有类似功效。图36C指示经MC38植入的小鼠的体重不受治疗影响。
图37A-图37B描绘在PD-1KI小鼠中，使用MC38同基因小鼠模型对示例性CTLA-4×PD-1双特异性抗体BCP-75、BCP-79和BCP-80的体内功效研究。图37A显示BCP-75、BCP-79和BCP-80双特异性抗体能够在体内抑制肿瘤生长，与内部表达的Keytruda(帕母单抗)生物类似物和Opdivo(尼鲁单抗)生物类似物(4链抗体)具有类似功效。图37B指示经MC38植入的小鼠的体重不受治疗影响。
图38A-图38B描绘在CTLA-4KI小鼠中，使用MC38同基因小鼠模型对示例性CTLA-4×PD-1双特异性抗体BCP-75、BCP-79和BCP-80的体内功效研究。图38A显示BCP-75和BCP-79双特异性抗体能够在体内抑制肿瘤生长。与具有相同Fc区的AS07014VH11HCAb和AS07189TKDVH11 HCAb充当两种双特异性抗体的对照。Yervoy生物类似物充当这个测定的阳性对照。图38B指示经MC38植入的小鼠的体重不受治疗影响。
图39A-图39B描绘在CTLA-4KI小鼠中，使用人PD-L1 KI MC38同基因小鼠模型对示例性CTLA-4×PD-L1双特异性抗体BCP-84和BCP-85的体内功效研究。内部表达的Tecentriq生物类似4链抗体充当PD-L1抗体的阳性对照。图37A显示BCP-84和BCP-85双特异性抗体能够在体内抑制肿瘤生长，与组合疗法组Tecentriq生物类似物加AS07014VH11 HCAb和Tecentriq生物类似物加AS07189TKDVH11 HCAb具有类似功效。图39B指示经MC38植入的小鼠的体重不受治疗影响。
图40描绘包含具有两个相同重链和两个相同轻链的单特异性全长抗体以及两个相同sdAb的示例性BABP的示意结构，其中各sdAb的C末端融合于一个重链的N末端。全长抗体具有两个特异性结合第一表位的抗原结合位点。两个sdAb特异性结合第二表位。举例来说，BABP可由从N末端至C末端具有如下结构的四个多肽链组成：(1)VL-CL；(2)VHH-VH-CH1-CH2-CH3；(3)VHH-VH-CH1-CH2-CH3；和(4)VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一拷贝的第一表位的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第二拷贝的第一表位的抗原结合位点，并且各VHH特异性结合一拷贝的第二表位。在替代性形式中，各sdAb可被省略，或被彼此融合的两个相同或不同sdAb置换。单特异性全长抗体可被双特异性全长抗体置换以进一步扩展结合特异性。
图41描绘包含具有两个相同重链和两个相同轻链的单特异性全长抗体以及两个相同sdAb的示例性BABP的示意结构，其中各sdAb的N末端通过任选肽接头来融合于一个重链的C末端。全长抗体具有两个特异性结合第一表位的抗原结合位点。两个sdAb特异性结合第二表位。举例来说，BABP可由从N末端至C末端具有如下结构的四个多肽链组成：(1)VL-CL；(2)VH-CH1-CH2-CH3-VHH；(3)VH-CH1-CH2-CH3-VHH；和(4)VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一拷贝的第一表位的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第二拷贝的第一表位的抗原结合位点，并且各VHH特异性结合一拷贝的第二表位。在替代性形式中，各sdAb可被省略，或被彼此融合的两个拷贝的sdAb置换。单特异性全长抗体可被双特异性全长抗体置换以进一步扩展结合特异性。
图42描绘包含具有两个相同重链和两个相同轻链的单特异性全长抗体以及两个相同sdAb的示例性BABP的示意结构，其中各sdAb的C末端通过任选肽接头来融合于一个轻链的N末端。全长抗体具有两个特异性结合第一表位的抗原结合位点。两个sdAb特异性结合第二表位。举例来说，BABP可由从N末端至C末端具有如下结构的四个多肽链组成：(1)VHH-VL-CL；(2)VH-CH1-CH2-CH3；(3)VH-CH1-CH2-CH3；和(4)VHH-VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一拷贝的第一表位的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第二拷贝的第一表位的抗原结合位点，并且各VHH特异性结合一拷贝的第二表位。在替代性形式中，各sdAb可被省略，或被彼此融合的两个相同或不同sdAb置换。单特异性全长抗体可被双特异性全长抗体置换以进一步扩展结合特异性。
图43描绘包含具有两个相同重链和两个相同轻链的单特异性全长抗体以及两个相同sdAb的示例性BABP的示意结构，其中各sdAb的N末端通过任选肽接头来融合于一个轻链的C末端。全长抗体具有两个特异性结合第一表位的抗原结合位点。两个sdAb特异性结合第二表位。举例来说，BABP可由从N末端至C末端具有如下结构的四个多肽链组成：(1)VL-CL-VHH；(2)VH-CH1-CH2-CH3；(3)VH-CH1-CH2-CH3；和(4)VL-CL-VHH，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一拷贝的第一表位的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第二拷贝的第一表位的抗原结合位点，并且各VHH特异性结合一拷贝的第二表位。在替代性形式中，各sdAb可被省略，或被彼此融合的两个相同或不同sdAb置换。单特异性全长抗体可被双特异性全长抗体置换以进一步扩展结合特异性。
图44描绘包含具有两个相同重链和两个相同轻链的单特异性全长抗体以及四个相同sdAb的示例性BABP的示意结构，其中各sdAb的C末端通过任选肽接头来融合于单特异性全长抗体的重链或轻链的N末端。全长抗体具有两个各自特异性结合第一表位的抗原结合位点。各sdAb特异性结合第二表位。举例来说，BABP可由从N末端至C末端具有如下结构的四个多肽链组成：(1)VHH-VL-CL；(2)VHH-VH-CH1-CH2-CH3；(3)VHH-VH-CH1-CH2-CH3；和(4)VHH-VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一拷贝的第一表位的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第二拷贝的第一表位的抗原结合位点，并且各VHH特异性结合一拷贝的第二表位。在替代性形式中，各sdAb可被省略，或被彼此融合的两个相同或不同sdAb置换。单特异性全长抗体可被双特异性全长抗体置换以进一步扩展结合特异性。
图45描绘包含具有两个相同重链和两个相同轻链的单特异性全长抗体以及四个相同sdAb的示例性BABP的示意结构，其中融合于各重链的N末端的是两个相同sdAb，所述两个sdAb通过任选肽接头来彼此融合，并且所述两个sdAb通过任选肽接头来融合于各重链的N末端。全长抗体具有两个各自特异性结合第一表位的抗原结合位点。各sdAb特异性结合第二表位。举例来说，BABP可由从N末端至C末端具有如下结构的四个多肽链组成：(1)VL-CL；(2)VHH-VHH-VH-CH1-CH2-CH3；(3)VHH-VHH-VH-CH1-CH2-CH3；和(4)VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一拷贝的第一表位的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第二拷贝的第一表位的抗原结合位点，并且各VHH特异性结合一拷贝的第二表位。在替代性形式中，各sdAb可被省略，或被彼此融合的两个相同或不同sdAb置换。单特异性全长抗体可被双特异性全长抗体置换以进一步扩展结合特异性。
图46描绘包含两个相同抗原结合(Fab)片段、两个相同sdAb以及Fc区的示例性BABP的示意结构，其中各sdAb的N末端通过任选肽接头来融合于CH1区的C末端，并且各sdAb的C末端融合于Fc区的CH2区的N末端。全长抗体具有两个各自特异性结合第一表位的抗原结合位点。各sdAb特异性结合第二表位。举例来说，BABP可由从N末端至C末端具有如下结构的四个多肽链组成：(1)VL-CL；(2)VH-CH1-VHH-CH2-CH3；(3)VH-CH1-VHH-CH2-CH3；和(4)VL-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一拷贝的第一表位的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第二拷贝的第一表位的抗原结合位点，并且各VHH特异性结合一拷贝的第二表位。在替代性形式中，各sdAb可被省略，或被彼此融合的两个相同或不同sdAb置换。单特异性全长抗体可被双特异性全长抗体置换以进一步扩展结合特异性。在替代性形式中，为扩展特异性，两个Fab片段可特异性结合不同表位，和/或VHH片段可特异性结合不同表位。
图47描绘包含两个相同单链可变片段(scFv)、两个相同sdAb以及可结晶片段(Fc)区的示例性BABP的示意结构，其中各sdAb的N末端通过任选肽接头来融合于scFv的C末端，并且各sdAb的C末端融合于Fc区的N末端。各scFv特异性结合第一表位。各sdAb特异性结合第二表位。举例来说，BABP可由各自从N末端至C末端具有如下结构的两个多肽链组成：VL-VH-VHH-CH2-CH3，其中各多肽链的VH和VL形成特异性结合一拷贝的第一表位的scFv结构域，并且各VHH特异性结合一拷贝的第二表位。在替代性形式中，scFv结构域从N末端至C末端可包含以下各物：VH-VL。另外，为扩展特异性，两个scFv可特异性结合不同表位，和/或VHH片段可特异性结合不同表位。
图48描绘包含两个相同抗原结合(Fab)片段、两个各自包含两个VHH片段的相同Fab样片段以及Fc区的示例性BABP的示意结构。在各Fab样结构域中，VH区和VL区各自被sdAb置换。各Fab片段特异性结合第一表位，并且各Fab样片段特异性结合第二表位。举例来说，BABP可由从N末端至C末端具有如下结构的四个多肽链组成：(1)VL-CL-VHH-CL；(2)VH-CH1-VHH-CH1-CH2-CH3；(3)VH-CH1-VHH-CH1-CH2-CH3；和(4)VL-CL-VHH-CL，其中多肽链(1)和(2)的VH和VL形成特异性结合第一拷贝的第一表位的抗原结合位点，多肽链(3)和(4)的VH和VL形成特异性结合第二拷贝的第一表位的抗原结合位点，并且各VHH特异性结合一拷贝的第二表位。在替代性形式中，为扩展特异性，两个Fab片段可特异性结合不同表位，和/或Fab样片段可特异性结合不同表位。
图49描绘包含两个相同scFv、两个各自包含两个VHH片段的相同Fab样片段以及Fc区的示例性BABP的示意结构。在各Fab样结构域中，VH区和VL区各自被sdAb置换。举例来说，BABP可由从N末端至C末端具有如下结构的四个多肽链组成：(1)VHH-CL；(2)VL-VH-VHH-CH1-CH2-CH3；(3)VL-VH-VHH-CH1-CH2-CH3；和(4)VHH-CL，其中多肽链(2)和(3)各自的VH和VL形成特异性结合一拷贝的第一表位的scFv，并且各VHH特异性结合一拷贝的第二表位。在替代性形式中，scFv的C末端可融合于Fab样片段中的包含VHH-CL的链的N末端；和/或scFv结构域从N末端至C末端可包含以下各物：VH-VL。另外，为扩展特异性，两个scFv可特异性结合不同表位，和/或VHH片段可特异性结合不同表位。
具体实施方式
本发明提供特异性识别CTLA-4的新型单结构域抗体(sdAb)(在下文中也被称为“抗CTLA-4sdAb”)和它的抗体变体(例如包含抗CTLA-4sdAb的较大蛋白质或多肽，诸如仅有重链的抗体(HCAb)、融合于全长抗体的抗CTLA-4sdAb、Fab、scFv或包含抗CTLA-4sdAb的多特异性抗原结合蛋白(MABP))、其用于治疗CTLA-4相关疾病诸如癌症的用途。
单链抗体(sdAb)由于具有可在不借助于轻链下展现对抗原的高亲和力的单一单体抗体可变结构域诸如重链可变结构域(VHH)而不同于常规4链抗体。骆驼科动物VHH被称为最小功能性抗原结合片段，具有约15kD的分子量。
因此，本申请的一个方面提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分的经分离的抗CTLA-4构建体。经分离的抗CTLA-4构建体可为例如抗CTLA-4sdAb(例如天然或人源化)、包含多个融合在一起的本文所述的抗CTLA-4sdAb的多肽、包含本文所述的抗CTLA-4sdAb融合于Fc片段(例如人IgG1 Fc)的HCAb、或包含本文所述的抗CTLA-4sdAb融合于包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的全长抗体(诸如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体)或抗原结合片段的MABP。抗CTLA-4构建体可具有单特异性或多特异性(诸如双特异性)、单价或多价(诸如二价)。
也提供包含含有抗CTLA-4sdAb部分的构建体的组合物(诸如药物组合物)、试剂盒和制品，制备含有抗CTLA-4sdAb部分的构建体的方法，以及使用含有抗CTLA-4sdAb部分的构建体来治疗CTLA-4相关疾病(诸如癌症)的方法。
I.定义
术语“细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4”、“CTLA-4”、“CTLA4”、“CTLA-4抗原”和“CD152”(参见例如Murata(1999)Am.J.Pathol.155:453-460)可互换使用，并且包括人CTLA-4的变体、亚型、物种同源物以及与CTLA-4共同具有至少一个表位的类似物(参见例如Balzano(1992)Int.J.Cancer Suppl.7:28-32)。因此，在某些情况下，本发明的抗CTLA-4构建体可与来自除人以外的物种的CTLA-4或在结构上与人CTLA-4相关的其他蛋白质(例如人CTLA-4同源物)交叉反应。在其他情况下，抗CTLA-4构建体可对人CTLA-4具有完全特异性，并且不展现物种交叉反应性或其他类型的交叉反应性。
术语“人CTLA-4”是指人序列CTLA-4，诸如具有Genbank登录号NP_005205的人CTLA-4的完整氨基酸序列。人CTLA-4序列可由于具有例如保守突变或非保守区域中的突变而不同于具有Genbank登录号NP_005205的人CTLA-4，并且CTLA-4与具有Genbank登录号NP_005205的人CTLA-4具有大致上相同的生物功能。举例来说，人CTLA-4的生物功能是在CTLA-4的细胞外结构域中具有由本公开的抗CTLA-4构建体特异性结合的表位，或人CTLA-4的生物功能是调节T细胞活性。
术语“表位”意指能够与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由各组化学活性表面分子诸如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。构象性表位和非构象性表位的区别在于在变性溶剂存在下，与前者而非与后者的结合丧失。
如本文所用的术语“B7配体”意指是CTLA-4的配体的分子的B7家族的成员(即能够结合CTLA-4的分子的B7家族的成员)。B7配体的实例是B7-1和B7-2。人B7-1(CD80)的氨基酸序列和DNA序列分别以Genbank登录号NP_005182和NM_005191公开。人B7-2(CD86)(亚型1)的氨基酸序列和DNA序列分别以Genbank登录号NP_787058和NM_175862公开；人B7-2(CD86)(亚型2)的氨基酸序列和DNA序列分别以Genbank登录号NP_008820和NM_006889公开。
如本文所用，“治疗(treatment/treating)”是用于获得包括临床结果的有益或所需结果的方法。出于本发明的目的，有益或所需临床结果包括但不限于以下中的一者或多者：减轻一种或多种由疾病所致的症状，减弱疾病的程度，使疾病稳定(例如预防或延迟疾病的恶化)，预防或延迟疾病的扩散(例如转移)，预防或延迟疾病的复发，延迟或减缓疾病的进展，改善疾病状态，提供疾病的缓解(部分或总体)，降低一种或多种其他药物的为治疗疾病所需的剂量，延迟疾病的进展，增加生活品质和/或延长存活期。“治疗”也涵盖减轻癌症的病理学后果。本发明方法涵盖这些治疗方面中的任何一者或多者。
术语“预防(prevent)”和类似用词诸如“预防(prevented/preventing)等”指示用于防止、抑制或降低疾病或病状例如癌症的复发可能性的方法。它也指延迟疾病或病状的复发或延迟疾病或病状的症状的复发。如本文所用，“预防”和类似用词也包括在疾病或病状的复发之前使所述疾病或病状的强度、影响、症状和/或负担降低。
如本文所用，“延迟”癌症的发展意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或推延疾病的发展。视病史和/或所治疗的个体而定，这个延迟可具有不同时长。“延迟”癌症的发展的方法是当相较于不使用方法时，在给定时间范围内使疾病发展的概率降低和/或在给定时间范围内使疾病的程度降低的方法。所述比较通常基于使用统计显著个体数目进行的临床研究。癌症发展可为可使用标准方法进行检测的，所述标准方法包括但不限于计算机轴向断层摄影术(CAT扫描)、磁共振成像(MRI)、腹部超声、凝块测试、动脉造影术或活检。发展也可指可在初始不可检测的癌症进展，并且包括发生、复发和发作。
本文所用的术语“有效量”是指药剂或药剂的组合的足以治疗指定病症、病状或疾病，诸如改善、缓和、减轻和/或延迟它的一种或多种症状的量。关于癌症，有效量包括足以导致肿瘤收缩和/或使肿瘤的生长速率降低(诸如抑制肿瘤生长)或预防或延迟其他非所要细胞增殖的量。在一些实施方案中，有效量是足以使发展延迟的量。在一些实施方案中，有效量为足以预防或延迟复发的量。有效量可以一次或多次施用加以施用。有效量的药物或组合物可：(i)降低癌细胞的数目；(ii)降低肿瘤尺寸；(iii)抑制、延缓、在一定程度上减缓，并且优选终止癌细胞浸润至外周器官中；(iv)抑制(即在一定程度上减缓，并且优选终止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度上减轻一种或多种与癌症相关的症状。
如本文所用，“个体”或“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于人、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类动物。在一些实施方案中，个体是人。
术语“抗体”、“抗原结合部分”或“抗体部分”以它们的最广泛意义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、全长抗体及其抗原结合片段，只要它们展现所需抗原结合活性即可。
基本4链抗体单元是一种由两个相同轻(L)链和两个相同重(H)链组成的异四聚糖蛋白。IgM抗体由5个基本异四聚体单元以及称为J链的额外多肽组成，并且含有10个抗原结合位点，而IgA抗体包含2-5个基本4链单元，其可聚合以与J链组合形成多价集合体。在IgG的情况下，4链单元通常是约150,000道尔顿(Dalton)。各L链通过一个共价二硫键连接于H链，而两个H链视H链同种型而定通过一个或多个二硫键彼此连接。各H链和L链也具有规则间隔的链内二硫桥。各H链在N末端具有可变结构域(VH)，继之以三个恒定结构域(CH)(对于α链和γ链各自)和四个CH结构域(对于μ同种型和ε同种型)。各L链在N末端具有可变结构域(VL)，继之以在它的另一末端的恒定结构域。VL与VH对准，并且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对准。特定氨基酸残基据信会形成轻链可变结构域与重链可变结构域之间的界面。VH和VL一起配对形成单一抗原结合位点。对于不同类别的抗体的结构和性质，参见例如Basicand Clinical Immunology,第8版,Daniel P.Sties,Abba I.Terr和Tristram G.Parsolw(编),Appleton&Lange,Norwalk,Conn.,1994,第71页和第6章。来自任何脊椎动物物种的L链都可基于它们的恒定结构域的氨基酸序列来被指定为称为κ和λ的两种明确不同类型中的一者。视免疫球蛋白的重链的恒定结构域(CH)的氨基酸序列而定，免疫球蛋白可被指定为不同类别或同种型。存在五个免疫球蛋白类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有指定为α、δ、ε、γ和μ的重链。γ和α类别基于CH序列和功能的相对微小差异而被进一步分为子类，例如人表达以下子类：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“仅有重链的抗体”或“HCAb”是指包含重链，但缺乏通常见于4链抗体中的轻链的功能性抗体。已知骆驼科动物(诸如骆驼、美洲驼或羊驼)会产生HCAb。
术语“单结构域抗体”或“sdAb”是指具有三个互补决定区(CDR)的单一抗原结合多肽。单独sdAb能够在不与相应含CDR多肽配对下结合抗原。在一些情况下，单结构域抗体从骆驼科动物HCAb工程化，并且它们的重链可变结构域在本文中被称为“VHH”(重链抗体的重链的可变结构域)。骆驼科动物sdAb是一种最小已知抗原结合抗体片段(参见例如Hamers-Casterman等,Nature 363:446-8(1993)；Greenberg等,Nature 374:168-73(1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh等,Nanomedicine(Lond),8:1013-26(2013))。基本VHH从N末端至C末端具有以下结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4分别是指框架区1至4，并且其中CDR1至CDR3是指互补决定区1至3。
“经分离的”抗体(或构建体)是已脱离它的产生环境(例如天然或重组)的组分加以鉴定、分离和/或回收的抗体(或构建体)。优选地，经分离的多肽不与来自它的产生环境的所有其他组分相伴。它的产生环境的诸如由重组经转染细胞产生的污染物组分是将通常干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其他蛋白质溶质或非蛋白质溶质。在优选实施方案中，多肽将被纯化：(1)以获得大于95重量％的抗体，如通过例如洛利(Lowry)方法所测定，并且在一些实施方案中，以达到大于99重量％；(2)以达到足以通过使用旋转杯测序仪来获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)以达到通过使用考马斯蓝(Coomassie Blue)或优选使用银染色在非还原性或还原性条件下进行的SDS-PAGE测定的均质性。经分离的抗体(或构建体)包括重组细胞内的原位抗体，因为将不存在抗体的天然环境的至少一种组分。然而，通常，将通过至少一个纯化步骤来制备经分离的多肽、抗体或构建体。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指所述抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别被称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变部分(相对于相同类别的其他抗体)，并且含有抗原结合位点。来自骆驼科动物物种的仅有重链的抗体具有单一重链可变区，其被称为“VHH”。因此，VHH是一种特殊类型的VH。
术语“可变”是指以下事实：在抗体之间，可变结构域的某些区段在序列方面广泛不同。V结构域介导抗原结合，并且限定特定抗体对它的特定抗原的特异性。然而，跨越可变结构域的整个间距，可变性并非均匀分布。而是在轻链可变结构域与重链可变结构域两者中，它均集中在三个称为互补决定区(CDR)或高变区(HVR)的区段中。可变结构域的更高度保守部分被称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个主要采用β折叠片构型，由三个CDR连接的FR区，所述CDR形成连接β折叠片结构，以及在一些情况下形成β折叠片结构的一部分的环。各链中的CDR通过FR区紧密邻近固持在一起，并且与来自另一链的CDR一起促进形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等,Sequences of ImmunologicalInterest,第5版,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域不直接涉及抗体与抗原的结合，但展现各种效应物功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从大致上同质抗体群体获得的抗体，即构成所述群体的个别抗体是相同的，例外之处是可少量存在的可能天然存在突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)。单克隆抗体具有高度特异性，针对单一抗原位点。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，各单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除它们的特异性之外，单克隆抗体在它们通过杂交瘤培养来合成，未受其他免疫球蛋白污染方面也是有利的。修饰语“单克隆”将抗体的特性指示为从大致上同质抗体群体获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法来产生抗体。举例来说，待根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，所述技术包括例如杂交瘤方法(例如Kohler和Milstein.,Nature,256:495-97(1975)；Hongo等,Hybridoma,14(3):253-260(1995)；Harlow等,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1988)；Hammerling等,Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson等,Nature,352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))以及用于在具有人免疫球蛋白基因座的一部分或全部或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中产生人抗体或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等,Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks等,Bio/Technology10:779-783(1992)；Lonberg等,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)；以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。
术语“裸抗体”是指未缀合于细胞毒性部分或放射性标记的抗体。
与抗体片段相对比，术语“全长抗体”、“完整抗体”或“完全抗体”可互换用于指代呈它的大致上完整形式的抗体。具体来说，全长4链抗体包括具有重链和轻链，包括Fc区的那些。全长仅有重链的抗体包括重链(诸如VHH)和Fc区。恒定结构域可为天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下，完整抗体可具有一种或多种效应物功能。
“抗体片段”或“抗原结合片段”包含完整抗体的一部分，优选包含完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体抗体；线性抗体(参见美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata等,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子；单结构域抗体(诸如VHH)和由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体会产生两个相同抗原结合片段，称为“Fab”片段；以及残余“Fc”片段，标号反映能够易于结晶。Fab片段由整个L链以及H链的可变区结构域(VH)和一个重链的第一恒定结构域(CH1)组成。各Fab片段关于抗原结合是单价的，即它具有单一抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体会产生单一大型F(ab')2片段，其大致对应于两个具有不同抗原结合活性的二硫键连接Fab片段，并且仍然能够交联抗原。Fab'片段由于在CH1结构域的羧基末端具有少许额外残基而不同于Fab片段，所述残基包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab'-SH是在本文中对其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的Fab'的标号。F(ab')2抗体片段最初以在它们之间具有铰链半胱氨酸的各对Fab'片段形式产生。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
Fc片段包含两个H链的通过二硫键固持在一起的羧基末端部分。抗体的效应物功能由Fc区中的序列决定，所述Fc区是也由见于某些类型的细胞上的Fc受体(FcR)识别的区域。
术语“恒定结构域”是指免疫球蛋白分子的相对于免疫球蛋白的含有抗原结合位点的其他部分即可变结构域具有更保守氨基酸序列的部分。恒定结构域含有重链的CH1、CH2和CH3结构域(总称为CH)和轻链的CHL(或CL)结构域。
来自任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”都可基于它们的恒定结构域的氨基酸序列来被指定为称为卡帕(“κ”)和兰姆达(“λ”)的两种明确不同类型中的一者。
“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这个片段由处于紧密非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。由这两个结构域的折叠，发散出贡献用于抗原结合的氨基酸残基以及对抗体赋予抗原结合特异性的六个高变环(各有3个环来自H链和L链)。然而，即使单一可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的CDR的半个Fv)也能够识别和结合抗原，但亲和力低于整个结合位点。
也缩写为“sFv”或“scFv”的“单链Fv”是包含连接成单一多肽链的VH抗体结构域和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽进一步包含在VH结构域与VL结构域之间的使得sFv能够形成为抗原结合所需的结构的多肽接头。对于对sFv的综述，参见Pluckthun,ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
本文所述的抗体的“功能性片段”包含完整抗体的一部分，通常包括完整抗体的抗原结合区或可变区，或抗体的保留FcR结合能力或具有改进的FcR结合能力的Fc区。抗体片段的实例包括线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“双体抗体”是指通过以下方式制备的小型抗体片段：构建在VH结构域与VL结构域之间具有短接头(约5-10个残基)以致实现V结构域的链间而非链内配对的sFv片段(参见先前段落)，由此产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双体抗体是两个“交叉”sFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH结构域和VL结构域存在于不同多肽链上。双体抗体更详细描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等,Proc.NatlAcad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)中。
本文单克隆抗体明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源于特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源，而一个或多个链的其余部分与源于另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源；以及所述抗体的片段，只要它们展现所需生物活性即可(美国专利号4,816,567；Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。“人源化抗体”作为“嵌合抗体”的子组加以使用。
非人(例如美洲驼或骆驼科动物)抗体的“人源化”形式是含有源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一些实施方案中，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的CDR(在下文中定义)的残基被来自诸如小鼠、大鼠、兔、骆驼、美洲驼、羊驼或非人灵长类动物的非人物种(供者抗体)的具有所需特异性、亲和力和/或能力的CDR的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架(“FR”)残基被相应非人残基置换。此外，人源化抗体可包含不见于接受者抗体中或供者抗体中的残基。可进行这些修饰以进一步改善抗体性能，诸如结合亲和力。一般来说，人源化抗体将包含大致上全部至少一个，并且通常两个可变结构域，其中全部或大致上全部高变环对应于非人免疫球蛋白序列的那些，并且全部或大致上全部FR区是人免疫球蛋白序列的那些，但FR区可包括一个或多个使抗体性能诸如结合亲和力、异构化、免疫原性等改进的个别FR残基取代。FR中的这些氨基酸取代的数目通常是在H链中至多6，并且在L链中至多3。人源化抗体任选也将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的至少一部分恒定区。对于其他细节，参见例如Jones等,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。也参见例如Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；以及美国专利号6,982,321和7,087,409。
“人抗体”是具有与由人产生和/或已使用如本文公开的用于制备人抗体的任何技术制备的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。对人抗体的这个定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可使用本领域中已知的各种技术包括噬菌体展示文库来产生人抗体。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。也可用于制备人单克隆抗体的是Cole等,Monoclonal Antibodies andCancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985)；Boerner等,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)中所述的方法。也参见van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。可通过向转基因动物施用抗原来制备人抗体，所述转基因动物已被修饰来应答于抗原激发产生所述抗体，但其内源性基因座已被失能，例如经免疫异种小鼠(关于XENOMOUSETM技术，参见例如美国专利号6,075,181和6,150,584)。关于通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体，也参见例如Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”当在本文中使用时是指抗体可变结构域的在序列方面高变和/或形成结构确定的环的区域。通常，单结构域抗体包含三个HVR(或CDR)：HVR1(或CDR1)、HVR2(或CDR2)和HVR3(或CDR3)。HVR3(或CDR3)显示三个HVR中的最大多样性，并且据信在对抗体赋予精细特异性方面起独特作用。参见例如Hamers-Casterman等,Nature 363:446-448(1993)；Sheriff等,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。
术语“互补决定区”或“CDR”用于指代如通过Kabat系统定义的高变区。参见Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)。
许多HVR描绘处于使用中，并且被涵盖在本文中。Kabat互补决定区(CDR)基于序列可变性，并且被最通常使用(Kabat等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。Chothia改为涉及结构环的位置(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR与Chothia结构环之间的折中，并且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。“contact”HVR基于对可用复合物晶体结构的分析。以下在表1中指示来自这些HVR各自的残基。
表1.HVR描绘。
HVR可包括如下“延伸HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)，以及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义各自，可变结构域残基根据Kabat等(上文)加以编号。
单结构域抗体(诸如VHH)的氨基酸残基根据由Kabat等人(“Sequence ofproteins of immunological interest”,US Public Health Services,NIH Bethesda,Md.,出版号91)给出的用于VH结构域的一般性编号方式加以编号，所述编号方式如在文章Riechmann和Muyldermans,J.Immunol.Methods 2000年6月23日；240(1-2):185-195中对于来自骆驼科动物的VHH结构域所应用。根据这个编号，VHH的FR1包含在1-30位置处的氨基酸残基，VHH的CDR1包含在位置31-35处的氨基酸残基，VHH的FR2包含在位置36-49处的氨基酸，VHH的CDR2包含在位置50-65处的氨基酸残基，VHH的FR3包含在位置66-94处的氨基酸残基，VHH的CDR3包含在位置95-102处的氨基酸残基，并且VHH的FR4包含在位置103-113处的氨基酸残基。在这个方面，应注意—如本领域中对于VH结构域以及对于VHH结构域所熟知—各CDR中的氨基酸残基的总数可变化，并且可能不对应于由Kabat编号指示的氨基酸残基的总数(也就是说，根据Kabat编号的一个或多个位置可能在实际序列中未被占据，或相比于由Kabat编号所虑及的数目，实际序列可能含有更多氨基酸残基)。
表述“如Kabat中的可变结构域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变化形式是指Kabat等(上文)中汇编抗体时用于重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这个编号系统，实际线性氨基酸序列可含有对应于可变结构域的FR或HVR的缩短或向其中的插入的较少或额外氨基酸。举例来说，重链可变结构域可包括在H2的残基52之后的单一氨基酸插入物(根据Kabat的残基52a)和在重链FR残基82之后的插入残基(例如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。对于给定抗体，可通过在具有同源性的区域处将抗体序列与“标准”Kabat编号序列进行比对来确定残基的Kabat编号。
除非在本文中另外指示，否则免疫球蛋白重链中的残基的编号是如Kabat等(上文)中的EU索引的编号。“如Kabat中的EU索引”是指对人IgG1 EU抗体的残基编号。
“框架”或“FR”残基是除如本文定义的HVR残基以外的那些可变结构域残基。
“人共有框架”或“接受体人框架”是代表在选择人免疫球蛋白VL或VH框架序列时最通常存在的氨基酸残基的框架。通常，从可变结构域序列的子组选择人免疫球蛋白VL或VH序列。通常，序列的子组是如Kabat等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中的子组。实例包括：对于VL，子组可为如Kabat等(上文)中的子组κI、κII、κIII或κIV。另外，对于VH，子组可为如Kabat等中的子组I、子组II或子组III。或者，人共有框架可源于以上其中特定残基，诸如当人框架残基通过将供者框架序列与一批各种人框架序列进行比对来基于它与供者框架的同源性加以选择时。“源于”人免疫球蛋白框架或人共有框架的接受体人框架可包含其相同氨基酸序列，或它可含有预先存在的氨基酸序列变化。在一些实施方案中，预先存在的氨基酸变化的数目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。
“亲和力成熟”抗体是在其一个或多个CDR中具有一个或多个改变的抗体，所述改变导致相较于不具有那些改变的亲本抗体，所述抗体对抗原的亲和力得以改进。在一些实施方案中，亲和力成熟抗体对靶标抗原具有纳体积摩尔浓度或甚至皮体积摩尔浓度亲和力。亲和力成熟抗体通过本领域中已知的程序产生。举例来说，Marks等,Bio/Technology10:779-783(1992)描述通过VH结构域和VL结构域改组进行的亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机诱变由例如：Barbas等Proc Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994)；Schier等Gene 169:147-155(1995)；Yelton等J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson等,J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；以及Hawkins等,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)描述。
如本文所用，术语“特异性结合”、“特异性识别”或“对…具有特异性”是指可测量和可再现相互作用，诸如靶标与抗原结合蛋白(诸如sdAb)之间的结合，所述结合确定在包括生物分子的分子的异质群体存在下存在所述靶标。举例来说，特异性结合靶标(其可为表位)的抗原结合蛋白(诸如sdAb)是相比于它结合其他靶标，以更大亲和力、亲合力、更易于和/或以更久持续时间结合这个靶标的抗原结合蛋白(诸如sdAb)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白(诸如sdAb)与无关靶标的结合程度小于所述抗原结合蛋白(诸如sdAb)与靶标的结合的约10％，如例如通过放射免疫测定(RIA)所测量。在一些实施方案中，特异性结合靶标的抗原结合蛋白(诸如sdAb)具有≤10-5M、≤10-6M、≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、≤10-11M或≤10-12M的解离常数(Kd)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白特异性结合蛋白质上在来自不同物种的所述蛋白质之间保守的表位。在一些实施方案中，特异性结合可包括但不要求排他性结合。
术语“特异性”是指抗原结合蛋白(诸如sdAb)对抗原的特定表位的选择性识别。天然抗体例如具有单特异性。如本文所用的术语“多特异性”表示抗原结合蛋白具有多表位特异性(即能够特异性结合一个生物分子上的两个、三个或更多个不同表位，或能够特异性结合两个、三个或更多个不同生物分子上的表位)。如本文所用的“双特异性”表示抗原结合蛋白具有两种不同抗原结合特异性。除非另外指示，否则抗原由所列双特异性抗体结合所采用的顺序是任意的。也就是说，举例来说，术语“CTLA-4/PD-1抗体”、“PD-1/CTLA-4抗体”、“CTLA-4×PD-1”、“PD-1×CTLA-4”、“PD-1/CTLA-4”、“CTLA-4/PD-1”、“PD-1-CTLA-4”和“CTLA-4-PD-1”可互换用于指代特异性结合CTLA-4与PD-1两者的双特异性抗体。如本文所用的术语“单特异性”表示抗原结合蛋白(诸如sdAb)具有一个或多个结合位点，其各自结合相同抗原的相同表位。
如本文所用的术语“价”表示在抗原结合蛋白中存在指定数目的结合位点。例如天然抗体或全长抗体具有两个结合位点，并且是二价的。因此，术语“三价”、“四价”、“五价”和“六价”分别表示在抗原结合蛋白中存在两个结合位点、三个结合位点、四个结合位点、五个结合位点和六个结合位点。
“抗体效应物功能”是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变异Fc区)的那些生物活性，并且随抗体同种型而变化。抗体效应物功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化。抗体效应物功能“降低或最小化”意指其从野生型或未修饰抗体开始降低至少50％(或者60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)。对抗体效应物功能的测定可易于由本领域普通技术人员测定和测量。在一优选实施方案中，补体结合、补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞毒性抗体效应物功能受影响。在一些实施方案中，通过恒定区中使糖基化消除的突变例如“无效应物突变”来使效应物功能消除。在一个方面，无效应物突变是CH2区中的N297A或DANA突变(D265A+N297A)。Shields等,J.Biol.Chem.276(9):6591-6604(2001)。或者，导致效应物功能降低或消除的额外突变包括：K322A和L234A/L235A(LALA)。或者，可通过产生技术来使效应物功能降低或消除，诸如在不进行糖基化的宿主细胞(例如大肠埃希氏菌)中表达，或在其中产生在促进效应物功能方面无效或有效性较小的改变糖基化样式的宿主细胞中表达(例如Shinkawa等,J.Biol.Chem.278(5):3466-3473(2003))。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指一种形式的细胞毒性，其中结合于某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性白细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶标细胞，并且随后用细胞毒素杀灭所述靶标细胞。抗体对细胞毒性细胞进行“武装”，并且为通过这个机理来杀灭靶标细胞所需。用于介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Fc在造血细胞上的表达概述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)的第464页上的表3中。为评估目标分子的ADCC活性，可进行诸如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的体外ADCC测定。适用于所述测定的效应细胞包括外周血液单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者或另外，可在体内，例如在诸如Clynes等,PNAS USA 95:652-656(1998)中公开的动物模型中评估目标分子的ADCC活性。
本文术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，包括天然序列Fc区和变异Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能变化，但人IgG重链Fc区通常被定义为从在位置Cys226处的氨基酸残基或从Pro230伸展至其羧基末端。Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可被移除，例如在抗体的产生或纯化期间，或通过重组工程化编码抗体的重链的核酸。因此，完整抗体的组合物可包括所有K447残基都被移除的抗体群体、无K447残基被移除的抗体群体、以及具有含K447残基的抗体和不含K447残基的抗体的混合物的抗体群体。适用于本文所述的抗体中的天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
“Fc受体”或‘FcR”描述结合抗体的Fc区的受体。优选FcR是天然序列人FcR。此外，优选FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII子类的受体，包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接形式，FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，其具有主要在其细胞质结构域中有差异的类似氨基酸序列。活化性受体FcγRIIA在它的细胞质结构域中含有基于酪氨酸的免疫受体活化基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在它的细胞质结构域中含有基于酪氨酸的免疫受体抑制基序(ITIM)。(参见M.Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR综述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capel等,Immunomethods 4:25-34(1994)；以及de Haas等,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中。本文术语“FcR”涵盖其他FcR，包括待在未来鉴定的那些。
术语“Fc受体”或“FcR”也包括新生儿受体FcRn，其负责将母亲IgG转移至胎儿中。Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)以及Kim等,J.Immunol.24:249(1994)。测量与FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie和Ward,Immunol.Today 18:(12):592-8(1997)；Ghetie等,Nature Biotechnology 15(7):637-40(1997)；Hinton等,J.Biol.Chem.279(8):6213-6(2004)；WO 2004/92219(Hinton等))。人FcRn高亲和力结合多肽的体内FcRn结合和血清半衰期可例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染人细胞系中，或在向其施用具有变异Fc区的多肽的灵长类动物中加以测定。WO 2004/42072(Presta)描述与FcR的结合得以改进或减弱的抗体变体。也参见例如Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下使靶标细胞溶解。经典补体路径的活化由补体系统的第一组分(C1q)结合抗体(具有适当子类)来引发，所述抗体结合于它们的同源抗原。为评估补体活化，可进行例如如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods202:163(1996)中所述的CDC测定。具有改变的Fc区氨基酸序列和增加或降低的C1q结合能力的抗体变体描述于美国专利号6,194,551B1和WO99/51642中。那些专利公布的内容以引用的方式明确并入本文。也参见Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
“结合亲和力”通常是指分子(例如抗体)的单一结合位点与它的结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指示，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。结合亲和力可由Kd、K解离、K缔合或Ka指示。如本文所用的术语“K解离”意指抗体(或抗原结合结构域)从抗体/抗原复合物解离的解离速率常数，如由动力学选择装置所确定，用单位s-1表示。如本文所用的术语“K缔合”意指抗体(或抗原结合结构域)与抗原缔合以形成抗体/抗原复合物的缔合速率常数，用单位M-1s-1表示。如本文所用的术语平衡解离常数“KD”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离常数，并且描述在平衡时为占据存在于抗体分子的溶液中的所有抗体结合结构域的一半所需的抗原浓度，并且等于K解离/K缔合，用单位M表示。Kd的测量以所有结合剂都处于溶液中为前提。在其中抗体栓系于细胞壁的情况下，例如在酵母表达系统中，将相应平衡速率常数表示为EC50，其给出Kd的良好近似值。亲和常数Ka是解离常数Kd的倒数，用单位M-1表示。
解离常数(KD或Kd)用作显示抗体对抗原的亲和力的指标。举例来说，有可能通过以下方式来进行容易分析：使用以多种标记剂标记的抗体进行斯卡查德(Scatchard)方法，以及根据随试剂盒附带的使用者手册和实验操作方法使用是非处方测量试剂盒的BiacoreX(由Amersham Biosciences制造)或类似试剂盒。可使用这些方法获得的KD值用单位M(Mol)表示。特异性结合靶标的抗体或其抗原结合片段可具有例如≤10-5M、≤10-6M、≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、≤10-11M或≤10-12M的解离常数(Kd)。
抗体或抗原结合结构域的结合特异性可通过本领域中已知的方法以实验方式测定。所述方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA、RIA、ECL、IRMA、EIA、BIAcore测试和肽扫描。
半数最大抑制浓度(IC50)是物质(诸如抗体)抑制特定生物或生物化学功能的有效性的量度。它指示需要多少特定药物或其他物质(抑制剂，诸如抗体)来将给定生物过程(例如CTLA-4与B7-1之间的结合，或过程的组分，即酶、细胞、细胞受体或微生物)抑制一半。通常将值表示为摩尔浓度。对于激动剂药物或其他物质(诸如抗体)，IC50与EC50类似。EC50也代表为获得最大体内效应的50％所需的血浆浓度。如本文所用，“IC50”用于指示为在体外中和50％的抗原生物活性(诸如CTLA-4生物活性)所需的抗体(诸如抗CTLA-4sdAb)有效浓度。IC50或EC50可通过生物测定来测量，诸如通过FACS分析(竞争结合测定)、基于细胞的细胞因子释放测定、或放大发光邻近均质测定(AlphaLISA)来测量对配体结合的抑制。
关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”定义为在将序列对准以及必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比，并且不将任何保守性取代考虑为序列同一性的一部分之后，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以属于本领域中的技能的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适用于测量比对的参数，包括为历经所比较序列的全长实现最大对准所需的任何算法。
编码本文所述的构建体、抗体或其抗原结合片段的“经分离的”核酸分子是脱离至少一种它在它被产生所处的环境中通常与其相伴的污染物核酸分子加以鉴定和分离的核酸分子。优选地，经分离的核酸不与和产生环境相关的所有组分相伴。编码本文所述的多肽和抗体的经分离的核酸分子呈除它见于自然界中所采用的形式或配置以外的形式。因此，经分离的核酸分子不同于细胞中天然存在的编码本文所述的多肽和抗体的核酸。经分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的所述核酸分子，但所述核酸分子存在于染色体外，或在与它的天然染色体位置不同的染色体位置处。
术语“控制序列”是指为在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。适于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选操纵子序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞会利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。
当将核酸与另一核酸序列放置成功能性关系时，所述核酸被“可操作地连接”。举例来说，如果前序列或分泌前导物的DNA被表达为参与多肽的分泌的前蛋白质，那么所述DNA被可操作地连接于所述多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么所述启动子或增强子被可操作地连接于所述编码序列；或如果核糖体结合位点被定位以便有助于翻译，那么所述核糖体结合位点被可操作地连接于编码序列。通常，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是邻接的，并且在分泌前导物的情况下，是邻接的且处于阅读相中。然而，增强子不必是邻接的。连接通过在适宜限制位点处进行连接来实现。如果所述位点不存在，那么根据常规规范使用合成寡核苷酸衔接子或接头。
如本文所用的术语“载体”是指能够使它与其连接的另一核酸增殖的核酸分子。所述术语包括呈自我复制性核酸结构形式的载体以及并入它已被引入其中的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导它们所操作性地连接的核酸的表达。所述载体在本文中被称为“表达载体”。
如本文所用，术语“自体”意指任何物质源于它稍后将被再引入其中的同一个体。
“同种异体”是指移植物源于相同物种的不同个体。
如本文所用的术语“转染”或“转化”或“转导”是指外源性核酸被转移至或引入宿主细胞中所采用的过程。“经转染”或“经转化”或“经转导”细胞是已用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代主题细胞和它的子代。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已向其中引入外源性核酸的细胞，包括所述细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化细胞”，其包括原代经转化细胞和源于其的子代，而不考虑传代次数。子代在核酸内含物方面可能不完全与亲本细胞相同，而是可能含有突变。本文包括具有与在最初转化细胞中筛选或选择的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突变子代。
“辅助环境”是指临床环境，其中个体已具有癌症史，并且通常(但非必定)对包括但不限于手术(例如手术切除)、放射疗法和化学疗法的疗法具有响应性。然而，由于他们的癌症史，所以这些个体被视为处于疾病发展的风险下。在“辅助环境”下的治疗或施用是指后续治疗模式。风险程度(例如当在辅助环境下的个体被视为“高风险”或“低风险”时)取决于若干因素，最通常取决于最初治疗时的疾病程度。
“新辅助环境”是指临床环境，其中在初级/确定性疗法之前执行方法。
术语“药物组合物”的“药物制剂”是指呈使得容许活性成分的生物活性有效的形式，并且不含有对将向其施用制剂的受试者具有不可接受毒性的额外组分的制剂。所述制剂是无菌的。“无菌”制剂是无菌的或不含所有活体微生物和它们的孢子。
应了解本文所述的本发明实施方案包括“由实施方案组成”和/或“基本上由实施方案组成”。
在本文中提及“约”某一值或参数包括(并且描述)涉及那个值或参数本身的变化形式。举例来说，提及“约X”的描述包括对“X”的描述。
如本文所用，提及“非”某一值或参数通常意指并且描述“不同于”某一值或参数。举例来说，方法不用于治疗X类型的癌症意指方法用于治疗不同于X的类型的癌症。
本文所用的术语“约X-Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。
除非上下文另外明确规定，否则如本文和随附权利要求中所用，单数形式“一个(种)”、“或”和“这个(种)”包括复数个(种)指示物。
II.抗CTLA-4构建体
(I)抗CTLA-4单结构域抗体部分
本文所述的经分离的抗CTLA-4构建体包含特异性识别CTLA-4的单结构域抗体(sdAb)部分(或“抗CTLA-4sdAb”)。在一些实施方案中，经分离的抗CTLA-4构建体是抗CTLA-4sdAb。
在一些实施方案中，提供一种包含以下各物的抗CTLA-4sdAb部分：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3，并且氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。
因此，在一些实施方案中，提供一种包含以下各物的抗CTLA-4sdAb部分：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10- 8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
在一些实施方案中，提供一种包含以下各物的抗CTLA-4sdAb部分：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
在一些实施方案中，提供一种包含以下各物的抗CTLA-4sdAb部分：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，其中所述氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
在一些实施方案中，提供一种包含以下各物的抗CTLA-4sdAb部分：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
本文指示的CDR的序列提供在序列表中。
CDR可以各种成对组合方式加以组合以产生许多抗CTLA-4sdAb部分。
举例来说，在一些实施方案中，提供一种包含以下各物的抗CTLA-4sdAb部分：包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:58的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:90的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种包含以下各物的抗CTLA-4sdAb部分：包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:58的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:90的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供一种包含以下各物的抗CTLA-4sdAb部分：包含氨基酸序列SEQID NO:26的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:58的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:90的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
在一些实施方案中，提供一种包含以下各物的抗CTLA-4sdAb部分：包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:59的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:91的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种包含以下各物的抗CTLA-4sdAb部分：包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:59的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:91的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供一种包含以下各物的抗CTLA-4sdAb部分：包含氨基酸序列SEQ IDNO:27的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:59的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:91的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
在一些实施方案中，提供一种包含以下各物的抗CTLA-4sdAb部分：包含氨基酸序列SEQ ID NO:220的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:240的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:260的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种包含以下各物的抗CTLA-4sdAb部分：包含氨基酸序列SEQ ID NO:220的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:240的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:260的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供一种包含以下各物的抗CTLA-4sdAb部分：包含氨基酸序列SEQID NO:220的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:240的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:260的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
在一些实施方案中，提供一种包含以下各物的抗CTLA-4sdAb部分：包含氨基酸序列SEQ ID NO:221的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:241的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:261的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种包含以下各物的抗CTLA-4sdAb部分：包含氨基酸序列SEQ ID NO:221的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:241的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:261的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供一种包含以下各物的抗CTLA-4sdAb部分：包含氨基酸序列SEQID NO:221的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:241的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:261的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
在一些实施方案中，提供一种包含以下各物的抗CTLA-4sdAb部分：包含氨基酸序列SEQ ID NO:222的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:242的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:262的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种包含以下各物的抗CTLA-4sdAb部分：包含氨基酸序列SEQ ID NO:222的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:242的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:262的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供一种包含以下各物的抗CTLA-4sdAb部分：包含氨基酸序列SEQID NO:222的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:242的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:262的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
抗CTLA-4sdAb部分可在一个或多个FR序列中包含一个或多个“标志残基”。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分可包含VHH结构域，所述VHH结构域包含以下中的任一者的氨基酸序列：a-1)在位置37处的氨基酸残基选自由F、Y、V、L、A、H、S、I、W、C、N、G、D、T和P组成的组(诸如F、Y、L、I或V，诸如F或Y，或诸如F)；a-2)在位置44处的氨基酸残基选自由E、Q、G、D、A、K、R、L、P、S、V、H、T、N、W、M和I组成的组(诸如A、G、E、D、Q、R、S或L，或诸如G、E或Q)；a-3)在位置45处的氨基酸残基选自由L、R、P、H、F、G、Q、S、E、T、Y、C、I、D和V组成的组(诸如L、C或R，或诸如L或R)；a-4)在位置103处的氨基酸残基选自由W、R、G、S、K、A、M、Y、I、F、T、N、V、Q、P、E和C组成的组(诸如W、G或R，或诸如W)；和a-5)在位置108处的氨基酸残基选自由Q、L、R、P、E、K、S、T、M、A和H组成的组(诸如Q)；或b-1)在位置37处的氨基酸残基选自由F、Y、L、I和V组成的组(诸如F或Y，或诸如F)；b-2)在位置44处的氨基酸残基选自由E和Q组成的组；b-3)在位置45处的氨基酸残基选自由L和R组成的组(诸如R)；b-4)在位置103处的氨基酸残基选自由G、W、R和S组成的组(诸如W)；和b-5)在位置108处的氨基酸残基选自由Q和L组成的组(诸如Q)；或c-1)在位置37处的氨基酸残基选自由F、Y、L、I和V组成的组(诸如F或Y，或诸如F)；c-2)在位置44处的氨基酸残基选自由A、G、E、D、Q、R、S和L组成的组(诸如G、E或Q)；c-3)在位置45处的氨基酸残基选自由L、R和C组成的组(诸如L或R)；c-4)在位置103处的氨基酸残基选自由P、R和S组成的组(诸如R或S)；和c-5)在位置108处的氨基酸残基选自由Q和L组成的组(诸如Q)；其中氨基酸位置根据Kabat编号。应注意在根据Kabat编号的氨基酸位置37、44、45、103和108处的这些“标志残基”适用于具有天然VHH序列的抗CTLA-4sdAb部分，并且可在人源化期间加以取代。举例来说，在根据Kabat编号的氨基酸位置108处的Q可任选被人源化成L。其他人源化取代对于本领域技术人员来说将是明确的。举例来说，潜在适用的人源化取代可通过将天然存在的VHH的FR序列与一个或多个密切相关的人VH的相应FR序列进行比较来确定，接着使用本领域中已知(也如本文所述)的方法将一个或多个所述潜在适用的人源化取代引入所述VHH中。可测试所得人源化VHH序列的CTLA-4结合亲和力、稳定性、表达容易性和水平、和/或其他所需性质。可能的残基取代也可来自抗体VH结构域，其中VH/VL界面包含一个或多个高度带电荷氨基酸残基。本文所述的抗CTLA-4sdAb部分可为部分或完全人源化sdAb部分。优选地，所得人源化抗CTLA-4sdAb以本文所述的Kd、K缔合、K解离结合CTLA-4。
在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4sdAb部分，其包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其与SEQ IDNO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的变体。在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4sdAb部分，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其在所述VHH结构域中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分在SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR诸如CDR1和/或CDR2和/或CDR3中包含氨基酸取代。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分包含SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR1、CDR2和CDR3，并且氨基酸取代在SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的FR诸如FR1和/或FR2和/或FR3和/或FR4中。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分在CDR与FR两者中包含氨基酸取代。在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4sdAb部分，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分基于包含氨基酸序列SEQ ID:114的抗CTLA-4sdAb部分加以人源化。在一些实施方案中，人源化抗CTLA-4sdAb部分包含氨基酸序列SEQ ID NO:129、201、202、274和342-344中的任一者。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分基于包含氨基酸序列SEQ ID:120的抗CTLA-4sdAb部分加以人源化。在一些实施方案中，人源化抗CTLA-4sdAb部分包含氨基酸序列SEQ ID NO:275-279中的任一者。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分基于包含氨基酸序列SEQ ID:122的抗CTLA-4sdAb部分加以人源化。在一些实施方案中，人源化抗CTLA-4sdAb部分包含氨基酸序列SEQ ID NO:280-282和341。
在一些实施方案中，提供一种以与任一本文所述的抗CTLA-4sdAb部分竞争的方式特异性结合CTLA-4的抗CTLA-4sdAb部分(在下文中被称为“竞争性抗CTLA-4sdAb部分”或“竞争性抗CTLA-4sdAb”)或包含抗CTLA-4sdAb部分的抗CTLA-4构建体(在下文中被称为“竞争性抗CTLA-4构建体”)。在一些实施方案中，竞争性结合可使用ELISA测定来测定。举例来说，在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4sdAb部分(或包含抗CTLA-4sdAb部分的抗CTLA-4构建体)，其以与包含氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的抗CTLA-4sdAb部分竞争的方式特异性结合CTLA-4。再举例来说，在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4sdAb部分(或包含抗CTLA-4sdAb部分的抗CTLA-4构建体)，其以与包含以下各物的抗CTLA-4sdAb部分竞争的方式特异性结合CTLA-4：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，竞争性抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，竞争性抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4sdAb部分，其包含SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
单结构域抗体
示例性sdAb包括但不限于来自仅有重链的抗体的重链可变结构域(例如骆驼科中的VHH(重链抗体的重链的可变结构域)或软骨鱼中的VNAR(鲨鱼新抗原受体的可变结构域))、天然地缺乏轻链的结合分子、源于常规4链抗体的单结构域(诸如VH或VL)、人源化仅有重链的抗体、由表达人重链区段的转基因小鼠或大鼠产生的人单结构域抗体、以及除源于抗体的那些以外的工程化的结构域和单结构域骨架。sdAb可源于任何物种，包括但不限于小鼠、大鼠、人、骆驼、美洲驼、七鳃鳗、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。本文涵盖的单结构域抗体也包括来自除骆驼科和鲨鱼以外的物种的天然存在的单结构域抗体分子。
在一些实施方案中，sdAb源于称为缺乏轻链的重链抗体(在本文中也被称为“仅有重链的抗体”或“HCAb”)的天然存在的单结构域抗原结合分子。所述单结构域分子例如公开于WO 94/04678以及Hamers-Casterman,C.等(1993)Nature363:446-448中。为明晰起见，源于天然地缺乏轻链的重链分子的可变结构域在本文中被称为VHH以将它与4链免疫球蛋白的常规VH进行区分。这种VHH分子可源于在骆驼科物种例如骆驼、美洲驼、小羊驼、单峰驼、羊驼和原驼中产生的抗体。除骆驼科之外，其他物种也可产生天然地缺乏轻链的重链分子，并且所述VHH在本申请的范围内。
在一些实施方案中，sdAb源于见于软骨鱼中的免疫球蛋白的可变区。举例来说，sdAb可源于见于鲨鱼的血清中的称为新抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型。产生源于NAR(“IgNAR”)的可变区的单结构域分子的方法描述于WO 03/014161以及Streltsov(2005)Protein Sci.14:2901-2909中。
在一些实施方案中，sdAb是重组的、CDR移植的、人源化的、骆驼源化的、去免疫化的和/或体外产生的(例如通过噬菌体展示来选择)。在一些实施方案中，框架区的氨基酸序列可通过使框架区中的特定氨基酸残基“骆驼源化”来改变。骆驼源化是指用一个或多个存在于重链抗体的VHH结构域中的相应位置处的氨基酸残基置换或取代一个或多个来自常规4链抗体的(天然存在的)VH结构域的氨基酸序列中的氨基酸残基。这可例如基于本文进一步描述，以对熟练人士来说将是明确的本身已知的方式进行。所述“骆驼源化”取代优选插入在形成VH-VL界面和/或存在于VH-VL界面处的氨基酸位置处，和/或在如本文定义的所谓骆驼科标志残基处(参见例如WO 94/04678；Davies和Riechmann FEBS Letters 339:285-290,1994；Davies和Riechmann Protein Engineering 9(6):531-537,1996；RiechmannJ.Mol.Biol.259:957-969,1996；以及Riechmann和Muyldermans J.Immunol.Meth.231:25-38,1999)。
在一些实施方案中，sdAb是由表达人重链区段的转基因小鼠或大鼠产生的人sdAb。参见例如US20090307787A1、美国专利号8,754,287、US20150289489A1、US20100122358A1和WO2004049794。在一些实施方案中，sdAb是亲和力成熟sdAb。
在一些实施方案中，针对特定抗原或靶标的天然存在的VHH结构域可从骆驼科动物VHH序列的(原初或免疫)文库获得。所述方法可或可不涉及利用一种或多种本身已知的筛选技术，使用所述抗原或靶标或其至少一个部分、片段、抗原决定簇或表位来筛选这种文库。所述文库和技术例如描述于WO 99/37681、WO 01/90190、WO 03/025020和WO 03/035694中。或者，可使用源于(原初或免疫)VHH文库的改进合成或半合成文库，诸如通过诸如随机诱变和/或CDR改组的技术来从(原初或免疫)VHH文库获得的VHH文库，如例如在WO 00/43507中所述。
在一些实施方案中，从常规4链抗体产生sdAb。参见例如EP 0 368 684；Ward等(Nature 1989年10月12日；341(6242):544-6)；Holt等,Trends Biotechnol.,2003,21(11):484-490；WO 06/030220；以及WO 06/003388。
由于sdAb具有独特性质，所以使用VHH结构域作为单一抗原结合蛋白或作为抗原结合结构域(即作为较大蛋白质或多肽的一部分)会提供超过常规VH和VL、scFv和常规抗体片段(诸如Fab或(Fab’)2)的许多显著优势：1)仅单结构域为以高亲和力结合抗原所需，因此不需要具有第二结构域，也不需要确保这两个结构域以正确空间构象和构型存在(例如不需要在折叠期间使重链和轻链配对，不需要使用特别设计的接头诸如用于scFv的接头)；2)VHH结构域和其他sdAb可由单一基因表达，并且不需要翻译后折叠或修饰；3)VHH结构域和其他sdAb可被容易地工程化成多价和/或多特异性形式(诸如本申请中所述的那些)；4)VHH结构域和其他sdAb高度可溶，并且不具有聚集倾向(如同由Ward等,Nature.1989年10月12日；341(6242):544-6描述的小鼠源性“dAb”一样)；5)VHH结构域和其他sdAb对热、pH、蛋白酶和其他变性剂或条件高度稳定；6)VHH结构域和其他sdAb的制备是容易的和相对廉价的(即使在大型生产规模的情况下)，诸如使用微生物发酵，不需要使用哺乳动物表达系统(为生产例如常规抗体片段所需)；7)VHH结构域和其他sdAb相较于常规4链抗体及其抗原结合片段是相对较小的(约15kDa，或是常规IgG的1/10)，因此诸如对实体肿瘤和其他致密组织具有高(更高)组织穿透能力；和8)VHH结构域和其他sdAb可展现所谓“空腔结合性质”(由于相较于常规VH结构域的CDR3环，它们的CDR3环得以延伸)，因此可达到不可为常规4链抗体及其抗原结合片段所达到的靶标和表位，例如已显示VHH结构域和其他sdAb可抑制酶(参见例如WO1997049805；Transue等,Proteins.1998年9月1日；32(4):515-22；Lauwereys等,EMBO J.1998年7月1日；17(13):3512-20)。
CTLA-4
CTLA-4含有细胞外V结构域、跨膜结构域和细胞质尾部。已表征由选择性剪接变体编码的若干亚型。膜结合亚型充当由二硫键相互连接的同二聚体，而可溶性亚型充当单体。CTLA-4具有与CD28的细胞内结构域类似的细胞内结构域，其缺乏固有催化活性，并且含有一个能够结合PI3K、PP2A和SHP-2的YVKM基序和一个能够结合含SH3蛋白的富含脯氨酸的基序。
人CTLA-4的氨基酸序列以Genbank登录号NP_005205公开。具有氨基酸1-37的区域是前导肽；38-161是细胞外V样结构域；162-187是跨膜结构域；并且188-223是细胞质结构域。人CTLA-4mRNA的核苷酸序列以NM_005214公开。已报道核苷酸序列的变体，包括在位置49处G向A转变，在位置272处C向T转变，以及在位置439处A向G转变。
特定人CTLA-4序列将通常在氨基酸序列方面与具有Genbank登录号NP_005205的人CTLA-4至少90％同一，并且含有当相较于其他物种(例如鼠)的CTLA-4氨基酸序列时将氨基酸序列鉴定为人氨基酸序列的氨基酸残基。在一些实施方案中，人CTLA-4可在氨基酸序列方面与具有Genbank登录号NP_005205的CTLA-4至少约95％、96％、97％、98％或99％同一。在一些实施方案中，人CTLA-4序列将显示与具有Genbank登录号NP_005205的CTLA-4的至多10个氨基酸差异。在一些实施方案中，人CTLA-4可显示与具有Genbank登录号NP_005205的CTLA-4的至多5、4、3、2或1个氨基酸差异。同一性百分比可如本文所述加以确定。在一些实施方案中，本文所述的抗CTLA-4sdAb部分特异性识别与具有Genbank登录号NP_005205的CTLA-4具有100％氨基酸序列同一性的CTLA-4多肽。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分特异性识别包含氨基酸序列SEQ ID NO:199的CTLA-4多肽。
在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分可与来自除人以外的物种的CTLA-4或在结构上与人CTLA-4相关的其他蛋白质(例如人CTLA-4同源物)交叉反应。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分对人CTLA-4具有完全特异性，并且不展现物种交叉反应性或其他类型的交叉反应性。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分特异性识别人CTLA-4的可溶性亚型。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分特异性识别人CTLA-4的膜结合亚型。
在一些实施方案中，本文所述的抗CTLA-4sdAb部分特异性识别CTLA-4的细胞外结构域(ECD)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分特异性识别CTLA-4细胞外结构域(ECD)的N末端部分。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分特异性识别CTLA-4细胞外结构域(ECD)的C末端部分。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分特异性识别CTLA-4细胞外结构域(ECD)的中间部分。在一些实施方案中，CTLA-4的由抗CTLA-4sdAb部分特异性识别的细胞外结构域在氨基酸序列方面与具有Genbank登录号NP_005205的CTLA-4的细胞外结构域至少约95％、96％、97％、98％或99％同一。在一些实施方案中，CTLA-4的由抗CTLA-4sdAb部分特异性识别的细胞外结构域在氨基酸序列方面与具有Genbank登录号NP_005205的CTLA-4的细胞外结构域100％同一。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分特异性识别包含氨基酸序列SEQ ID NO:164的CTLA-4多肽。
抗体亲和力
抗体或抗原结合结构域的结合特异性可通过本领域中已知的方法以实验方式测定。所述方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA、RIA、ECL、IRMA、EIA、BIAcore测试和肽扫描。
在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-6M、约10-6M至约10-7M、约10-7M至约10-8M、约10-8M至约10-9M、约10-9M至约10-10M、约10-10M至约10-11M、约10-11M至约10-12M、约10-5M至约10-12M、约10-6M至约10-12M、约10-7M至约10-12M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M、约10-5M至约10-11M、约10-7M至约10-11M、约10-8M至约10-11M、约10-9M至约10-11M、约10-5M至约10-10M、约10-7M至约10-10M、约10- 8M至约10-10M、约10-5M至约10-9M、约10-7M至约10-9M、约10-5M至约10-8M、或约10-6M至约10-8M。
在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的K缔合是约102M-1s-1至约104M-1s-1、约104M-1s-1至约106M-1s-1、约106M-1s-1至约107M-1s-1、约102M-1s-1至约107M-1s-1、约103M-1s-1至约107M-1s-1、约104M-1s-1至约107M-1s-1、约105M-1s-1至约107M-1s-1、约103M-1s-1至约106M-1s-1、或约104M-1s-1至约106M-1s-1。
在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的K解离是约1s-1至约10-2s-1、约10-2s-1至约10-4s-1、约10-4s-1至约10-5s-1、约10-5s-1至约10-6s-1、约1s-1至约10-6s-1、约10-2s-1至约10-6s-1、约10-3s-1至约10-6s-1、约10-4s-1至约10-6s-1、约10-2s-1至约10-5s-1、或约10-3s-1至约10-5s-1。
在一些实施方案中，在用0.12nM B7-1和0.2nM CTLA-4进行的放大发光邻近均质测定(AlphaLISA)中，抗CTLA-4sdAb部分的IC50是小于10nM。在一些实施方案中，根据FACS分析(竞争结合测定)或基于细胞的细胞因子释放测定，抗CTLA-4sdAb部分在抑制配体结合方面的IC50是小于500nM。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分的IC50是小于1nM、约1nM至约10nM、约10nM至约50nM、约50nM至约100nM、约100nM至约200nM、约200nM至约300nM、约300nM至约400nM、或约400nM至约500nM。
嵌合或人源化抗体
在一些实施方案中，本文提供的抗CTLA-4sdAb部分是嵌合抗体。某些嵌合抗体例如描述于美国专利号4,816,567；以及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如源于骆驼科动物物种诸如美洲驼的可变区)和人恒定区。在另一实例中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中类别或子类已从亲本抗体的类别或子类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在一些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，使非人抗体人源化以降低在人中的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个其中HVR例如CDR(或其部分)源于非人抗体，而FR(或其部分)源于人抗体序列的可变结构域。人源化抗体任选也将包含至少一部分人恒定区。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如HVR残基所源于的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改进抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和制备它们的方法例如在Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中综述，并且例如在Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua等,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；以及Osbourn等,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述用以进行FR改组的“引导选择”方法)中进一步描述。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最适匹配”方法选择的框架区(参见例如Sims等J.Immunol.151:2296(1993))；源于具有特定子组的轻链或重链可变区的人抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；以及Presta等J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及由筛选FR文库获得的框架区(参见例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)以及Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
在一些实施方案中，sdAb在不减弱结构域对抗原的天然亲和力，并且同时使它关于异源性物种的免疫原性降低的情况下被修饰，诸如人源化。举例来说，可测定美洲驼抗体的抗体可变结构域(VHH)的氨基酸残基，并且一个或多个例如在框架区中的骆驼科动物氨基酸用它们的如见于人共有序列中的人对应物置换，而不使那个多肽丧失它的典型特性，即人源化不显著影响所得多肽的抗原结合能力。骆驼科动物单结构域抗体的人源化要求单一多肽链中有限量的氨基酸的引入和诱变。这不同于scFv、Fab'、(Fab')2和IgG的要求在两个链即轻链和重链中引入氨基酸变化以及保持两个链的装配的人源化。
可使包含VHH结构域的单结构域抗体人源化以具有人样序列。在一些实施方案中，本文所用的VHH结构域的FR区包含至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多中的任一者的与人VH框架区具有同源性的氨基酸序列。一个示例性类别的人源化VHH结构域的特征在于根据Kabat编号，VHH在位置45处携带来自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺组成的组的氨基酸诸如像L45，以及在位置103处携带色氨酸。因此，属于这个类别的多肽显示与人VH框架区具有高氨基酸序列同源性，并且所述多肽可直接向人施用，而不预期由其产生非所要免疫应答，并且不具有进一步人源化的负担。
另一示例性类别的人源化骆驼科动物单结构域抗体已描述于WO 03/035694中，并且含有通常见于人来源或来自其他物种的常规抗体中的疏水性FR2残基，但用在位置103上的取代存在于来自双链抗体的VH中的保守色氨酸残基的带电荷精氨酸残基对这个亲水性损失进行补偿。因此，属于这两个类别的肽显示与人VH框架区具有高氨基酸序列同源性，并且所述肽可直接向人施用，而不预期由其产生非所要免疫应答，并且不具有进一步人源化的负担。
人抗体
在一些实施方案中，本文提供的抗CTLA-4sdAb部分是人抗体。人抗体可使用本领域中已知的各种技术来产生。人抗体一般地描述于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)以及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。能够产生完全人单结构域抗体的转基因小鼠或大鼠在本领域中是已知的。参见例如US20090307787A1、美国专利号8,754,287、US20150289489A1、US20100122358A1和WO2004049794。
人抗体可通过以下方式来制备：向已被修饰来应答于抗原激发而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体的转基因动物施用免疫原。所述动物通常含有全部或一部分人免疫球蛋白基因座，其置换内源性免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合至动物的染色体中。在所述转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被失活。对于对用于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。也参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述K-M/>技术的美国专利号7,041,870以及描述/>技术的美国专利申请公布号US 2007/0061900。来自由所述动物产生的完整抗体的人可变区可例如通过与不同人恒定区组合来被进一步修饰。
人抗体也可通过基于杂交瘤的方法制备。已描述用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991)。)通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。额外方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)以及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中描述的那些。人杂交瘤技术(三源杂交瘤技术)也描述于Vollmers和Brandlein,Histologyand Histopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods andFindings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中。
人抗体也可通过分离选自人源性噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生。所述可变结构域序列可接着与所需人恒定结构域组合。以下描述用于从抗体文库选择人抗体的技术。
一种用于获得针对特定抗原或靶标的VHH序列的技术涉及以适合方式使能够表达重链抗体的转基因哺乳动物免疫(即以便产生针对所述抗原或靶标的免疫应答和/或重链抗体)，从所述转基因哺乳动物获得含有所述VHH序列(编码所述VHH序列的核酸序列)的适合生物样品(诸如血液样品、血清样品或B细胞样品)，接着使用本身已知的任何适合技术(诸如任何本文所述的方法或杂交瘤技术)，从所述样品开始，产生针对所述抗原或靶标的VHH序列。举例来说，出于这个目的，可使用重链抗体表达性小鼠以及WO 02/085945、WO 04/049794和WO 06/008548以及Janssens等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2006年10月10日；103(41):15130-5中所述的其他方法和技术。举例来说，所述重链抗体表达性小鼠可表达具有任何适合(单一)可变结构域诸如来自天然来源的(单一)可变结构域(例如人(单一)可变结构域、骆驼科动物(单一)可变结构域或鲨鱼(单一)可变结构域)以及例如合成或半合成(单一)可变结构域的重链抗体。
文库源性抗体
本申请的抗体可通过筛选组合文库中具有一种或多种所需活性的抗体来分离。举例来说，用于产生噬菌体展示文库以及筛选所述文库中具有所需结合特征的抗体的多种方法在本领域中是已知的。所述方法例如在Hoogenboom等,Methods in Molecular Biology178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,2001)中综述，并且例如在McCafferty等,Nature 348:552-554；Clackson等,Nature352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)中进一步描述。已描述用于构建单结构域抗体文库的方法，例如参见美国专利号7371849。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)来分别克隆VH和VL基因的谱系，并且随机重组于噬菌体文库中，可接着筛选所述文库中的抗原结合噬菌体，如Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。VHH基因的谱系可类似地通过PCR来克隆，随机重组于噬菌体文库中，并且筛选抗原结合噬菌体。噬菌体通常展示呈单链Fv(scFv)片段形式或呈Fab片段形式的抗体片段。来自经免疫来源的文库提供对免疫原具有高亲和力的抗体而无需构建杂交瘤。或者，可克隆(例如从人克隆)原初谱系以提供单一来源的针对广泛范围的非自身抗原以及自身抗原的抗体而不进行任何免疫，如由Griffiths等,EMBOJ,12:725-734(1993)所述。最后，原初文库也可通过以下方式来合成制备：从干细胞克隆未重排V基因区段，以及使用含有随机序列的PCR引物来编码高变CDR3区并且实现体外重排，如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公布包括例如：美国专利号5,750,373以及美国专利公布号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中被视为人抗体或人抗体片段。
生物活性
本文所述的抗CTLA-4sdAb部分的生物活性可通过测量它的半数最大抑制浓度(IC50)来测定，所述浓度是抗体抑制特定生物或生物化学功能(诸如抑制CTLA-4与它的配体B7-1和/或B7-2之间的结合)的有效性的量度。举例来说，此处IC50可用于指示为在体外中和50％的CTLA-4生物活性所需的抗CTLA-4sdAb的有效浓度。对于激动剂药物或其他物质(诸如抗体)，IC50与EC50类似。EC50也代表为获得最大体内效应的50％所需的血浆浓度。IC50或EC50可通过本领域中已知的测定来测量，诸如通过FACS分析(竞争结合测定)、基于细胞的细胞因子释放测定、或放大发光邻近均质测定(AlphaLISA)来测量对配体结合的抑制。
举例来说，可使用流式细胞术来研究对配体结合的阻断(也参见实施例1)。可使表达人B7-1的CHO细胞从粘附培养烧瓶解离，并且与用于测试的不同浓度的抗CTLA-4sdAb和恒定浓度的经标记CTLA-4蛋白(诸如经生物素标记的hCTLA-4/Fc蛋白)混合。可采用抗CTLA-4抗体阳性对照，诸如在室温下使混合物平衡30分钟，用FACS缓冲液(含有1％ BSA的PBS)洗涤三次。接着，添加特异性识别恒定浓度的经标记CTLA-4蛋白的抗体(诸如PE/Cy5链霉亲和素二级抗体)，并且在室温下孵育15分钟。细胞用FACS缓冲液洗涤，并且通过流式细胞术来分析。数据可用Prism(GraphPad Software,San Diego,CA)，利用非线性回归加以分析以计算IC50。来自竞争测定的结果可显示抗CTLA-4sdAb抑制经标记CTLA4与B7-1之间的相互作用的能力。
抗CTLA-4sdAb部分的生物活性也可通过基于CTLA-4的阻断测定来关于细胞因子释放加以测试(也参见实施例1)。CTLA-4信号传导不调控细胞存活或对IL-2的应答性，但抑制CD28依赖性IL-2产生(Walunas等,J Exp Med183:2541-50(1996))。实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)是一种由针对髓磷脂抗原的Th1细胞诱发的自体免疫病症，其提供一种用于研究B7介导的共刺激在诱导病理性免疫应答方面的作用的体内模型。发现抗CTLA-4抗体使EAE疾病状况恶化，伴有致脑炎性细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-2的产生增强(Perrin等,JImmunol 157:1333-6(1996))。因此，可使用监测T细胞增殖、IFN-γ释放或IL-2分泌的多种生物测定来研究由抗CTLA-4抗体对CTLA-4路径的阻断。
举例来说，在孔中混合CD4+T细胞(可通过分离试剂盒来从PBMC纯化)和CHO-K1/人CD80(稳定表达人CD80的CHO-K1)。将测试抗CTLA-4sdAb在不同浓度下添加至各孔中。无抗体情况可用作本底对照。可采用阴性对照(诸如人IgG4)和阳性对照(诸如)。将CTLA-4蛋白添加至系统中以引发反应。在37℃/5％ CO2孵育器中孵育24小时之后，从各测试孔获取培养基以进行IL-2分泌测量(Cisbio)。测量各测试抗体的EC50值，其将反映测试抗CTLA-4sdAb在阻断CD80与T细胞上的CTLA-4之间的相互作用方面，由此在抑制T细胞IL-2产生方面的能力。
在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分阻断或拮抗由CTLA-4受体转导的信号。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分可结合CTLA-4上的表位，以便抑制CTLA-4与B7配体(诸如B7-1和/或B7-2)相互作用。在一些实施方案中，在其中抗体结合位点与CTLA-4配体结合位点的比率大于1:1，并且抗体的浓度大于10-8M的条件下，抗CTLA-4sdAb部分可使CTLA-4与B7配体(诸如B7-1和/或B7-2)的结合降低至少约5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、99％或99.9％中的任一者。
(II)包含抗CTLA-4sdAb部分的构建体
包含抗CTLA-4sdAb部分的抗CTLA-4构建体可具有任何可能形式。
在一些实施方案中，包含抗CTLA-4sdAb部分的抗CTLA-4构建体可进一步包含额外多肽序列，诸如一个或多个抗体部分或免疫球蛋白的Fc片段。所述额外多肽序列可或可不改变或另外影响sdAb的(生物)性质，并且可或可不向本文所述的sdAb添加其他功能性。在一些实施方案中，额外多肽序列对本发明的sdAb赋予一种或多种所需性质或功能性。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体是包含细胞外抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)，所述细胞外抗原结合结构域包含一个或多个本文所述的抗CTLA-4sdAb部分。
在一些实施方案中，额外多肽序列可为特异性识别第二抗原或第二表位的第二抗体部分(诸如sdAb、scFv、Fab、全长抗体)。在一些实施方案中，第二抗原不是CTLA-4。在一些实施方案中，第二表位来自CTLA-4。在一些实施方案中，第二表位不来自CTLA-4。在一些实施方案中，第二抗体部分特异性识别CTLA-4上与本文所述的抗CTLA-4sdAb识别的表位相同的表位。在一些实施方案中，第二抗体部分特异性识别CTLA-4上与本文所述的抗CTLA-4sdAb识别的表位不同的表位。
在一些实施方案中，相较于本文所述的抗CTLA-4sdAb本身，额外多肽序列可使抗体构建体半衰期、溶解性或吸收增加，使免疫原性或毒性降低，使不合需要的副作用消除或减弱，和/或对本发明的抗CTLA-4构建体赋予其他有利性质和/或使本发明的抗CTLA-4构建体的非所需性质降低。所述额外多肽序列的一些非限制性实例是血清蛋白质诸如人血清白蛋白(参见例如WO 00/27435)或半抗原分子(例如由循环抗体识别的半抗原，参见例如WO98/22141)。显示使免疫球蛋白的片段(诸如VH结构域)连接于血清白蛋白或其片段可使抗体半衰期增加(参见例如WO 00/27435和WO 01/077137)。因此，在一些实施方案中，本发明的抗CTLA-4构建体可包含本文所述的抗CTLA-4sdAb部分任选通过适合接头(诸如肽接头)来连接于血清白蛋白(或其适合片段)。在一些实施方案中，可使本文所述的抗CTLA-4sdAb部分连接于血清白蛋白的至少包含血清白蛋白结构域III的片段。(参见PCT/EP2007/002817)。
仅有重链的抗体(HCAb)
在一些实施方案中，可使本文所述的抗CTLA-4sdAb部分任选通过接头序列来连接于一个或多个(优选是人)CH2和/或CH3结构域例如Fc片段以使它的体内半衰期增加。
因此，在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体是HCAb(在下文中被称为“抗CTLA-4HCAb”)，其包含本文所述的抗CTLA-4sdAb部分融合于免疫球蛋白诸如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的Fc片段。在一些实施方案中，抗CTLA-4HCAb包含IgG诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任一者的Fc序列。在一些实施方案中，Fc片段是人Fc。在一些实施方案中，Fc片段是人IgG1Fc。在一些实施方案中，抗CTLA-4HCAb是单体。在一些实施方案中，抗CTLA-4HCAb是二聚体。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分和Fc片段任选由肽接头连接。在一些实施方案中，肽接头是人IgG1铰链(SEQ ID NO:163)。在一些实施方案中，肽接头是突变人IgG1铰链(SEQID NO:307)。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162(GGGGSGGGS)或SEQID NO:365(GGGGSGGGGSGGGGS)。
因此，在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分的抗CTLA-4HCAb，其中所述sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，并且其中所述sdAb部分融合于免疫球蛋白的Fc片段。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分的抗CTLA-4HCAb，其中所述sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，并且其中所述sdAb部分融合于免疫球蛋白的Fc片段。在一些实施方案中，氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分的抗CTLA-4HCAb，其中所述sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3，并且其中所述sdAb部分融合于免疫球蛋白的Fc片段。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分包含VHH结构域，所述VHH结构域包含以下中的任一者的氨基酸序列：a-1)在位置37处的氨基酸残基选自由F、Y、V、L、A、H、S、I、W、C、N、G、D、T和P组成的组(诸如F、Y、L、I或V，诸如F或Y，或诸如F)；a-2)在位置44处的氨基酸残基选自由E、Q、G、D、A、K、R、L、P、S、V、H、T、N、W、M和I组成的组(诸如A、G、E、D、Q、R、S或L，或诸如G、E或Q)；a-3)在位置45处的氨基酸残基选自由L、R、P、H、F、G、Q、S、E、T、Y、C、I、D和V组成的组(诸如L、C或R，或诸如L或R)；a-4)在位置103处的氨基酸残基选自由W、R、G、S、K、A、M、Y、I、F、T、N、V、Q、P、E和C组成的组(诸如W、G或R，或诸如W)；和a-5)在位置108处的氨基酸残基选自由Q、L、R、P、E、K、S、T、M、A和H组成的组(诸如Q)；或b-1)在位置37处的氨基酸残基选自由F、Y、L、I和V组成的组(诸如F或Y，或诸如F)；b-2)在位置44处的氨基酸残基选自由E和Q组成的组；b-3)在位置45处的氨基酸残基选自由L和R组成的组(诸如R)；b-4)在位置103处的氨基酸残基选自由G、W、R和S组成的组(诸如W)；和b-5)在位置108处的氨基酸残基选自由Q和L组成的组(诸如Q)；或c-1)在位置37处的氨基酸残基选自由F、Y、L、I和V组成的组(诸如F或Y，或诸如F)；c-2)在位置44处的氨基酸残基选自由A、G、E、D、Q、R、S和L组成的组(诸如G、E或Q)；c-3)在位置45处的氨基酸残基选自由L、R和C组成的组(诸如L或R)；c-4)在位置103处的氨基酸残基选自由P、R和S组成的组(诸如R或S)；和c-5)在位置108处的氨基酸残基选自由Q和L组成的组(诸如Q)；其中氨基酸位置根据Kabat编号，并且其中当位置108是Q时，位置108可任选被人源化成L。在一些实施方案中，Fc片段是人IgG1 Fc。在一些实施方案中，抗CTLA-4HCAb是单体。在一些实施方案中，抗CTLA-4HCAb是二聚体。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分和Fc片段任选由肽接头连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分的抗CTLA-4HCAb，其中所述sdAb部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其与SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的变体。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分的抗CTLA-4HCAb，其中所述sdAb部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其在所述VHH结构域中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分在SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR诸如CDR1和/或CDR2和/或CDR3中包含氨基酸取代。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分包含SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR1、CDR2和CDR3，并且氨基酸取代在SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的FR诸如FR1和/或FR2和/或FR3和/或FR4中。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分在CDR与FR两者中包含氨基酸取代。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分的抗CTLA-4HCAb，其中所述sdAb部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分的抗CTLA-4HCAb，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，Fc片段是人IgG1 Fc。在一些实施方案中，抗CTLA-4HCAb是单体。在一些实施方案中，抗CTLA-4HCAb是二聚体。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分和Fc片段任选由肽接头连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ IDNO:162、163、307或365。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4HCAb，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:130-133、283-291和366-371中的任一者。
在一些实施方案中，也提供一种以与本文所述的抗CTLA-4HCAb、抗CTLA-4sdAb或包含抗CTLA-4sdAb部分的抗CTLA-4构建体中的任一者竞争的方式特异性结合CTLA-4的抗CTLA-4HCAb(在下文中被称为“竞争性抗CTLA-4HCAb”)。竞争性结合可使用ELISA测定来测定。举例来说，在一些实施方案中，提供一种以与包含氨基酸序列SEQ ID NO:130-133、283-291和366-371中的任一者的抗CTLA-4HCAb竞争的方式特异性结合CTLA-4的抗CTLA-4HCAb。再举例来说，在一些实施方案中，提供一种以与包含以下各物的抗CTLA-4HCAb竞争的方式特异性结合CTLA-4的抗CTLA-4HCAb：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，提供一种以与包含以下各物的抗CTLA-4sdAb(或包含抗CTLA-4sdAb的抗CTLA-4构建体)竞争的方式特异性结合CTLA-4的抗CTLA-4HCAb：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，竞争性抗CTLA-4HCAb与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，竞争性抗CTLA-4HCAb是骆驼科动物HCAb、嵌合HCAb、人HCAb、部分人源化HCAb或完全人源化HCAb。
多价和/或多特异性抗体
在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含本文所述的抗CTLA-4sdAb部分融合于一个或多个其他抗体部分(诸如特异性识别另一抗原或另一表位的抗体部分)。一个或多个其他抗体部分可具有任何抗体或抗体片段形式，诸如多特异性sdAb(诸如双特异性sdAb)、全长抗体、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、scFv-scFv、微型抗体、双体抗体或sdAb。在一些实施方案中，一个或多个抗体部分包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。对于对某些抗体片段的综述，参见Hudson等Nat.Med.9:129-134(2003)。对于对scFv片段的综述，参见例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)；也参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。对于对包含补救受体结合表位残基以及具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。对于对多特异性抗体的综述，参见Weidle等,Cancer Genomics Proteomics,10(1):1-18,2013；Geering和Fussenegger,Trends Biotechnol.,33(2):65-79,2015；Stamova等,Antibodies,1(2):172-198,2012。双体抗体是可具有二价或双特异性的具有两个抗原结合位点的抗体片段。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)；以及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体也描述于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)中。抗体片段可通过如本文所述的各种技术来制备，包括但不限于对完整抗体进行蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠埃希氏菌或噬菌体)来产生。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于重组共同表达具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983))，WO 93/08829以及Traunecker等,EMBO J.10:3655(1991))和“孔中钮”工程化(参见例如美国专利号5,731,168)。多特异性抗体也可通过以下方式来制备：工程化静电牵引效应以制备抗体Fc异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(参见例如美国专利号4,676,980以及Brennan等,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双体抗体”技术来制备双特异性抗体片段(参见例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994))；和如例如Tutt等J.Immunol.147:60(1991)中所述制备三特异性抗体；以及产生包含串联单结构域抗体的多肽(参见例如美国专利申请号20110028695；以及Conrath等J.Biol.Chem.,2001；276(10):7346-50)。本文也包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US 2006/0025576A1)。
肽接头
在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体内的两个或更多个抗体部分(诸如抗CTLA-4sdAb、全长抗体或包含VH和VL的抗原结合部分)可任选由肽接头连接。抗CTLA-4构建体中使用的肽接头的长度、柔性程度和/或其他性质可对包括但不限于对一种或多种特定抗原或表位的亲和力、特异性或亲合力的性质具有一定影响。举例来说，可选择较长肽接头以确保两个邻近结构域不在空间上彼此干扰。在某一实施方案中，肽接头包含柔性残基(诸如甘氨酸和丝氨酸)，以使邻近结构域相对于彼此自由移动。举例来说，甘氨酸-丝氨酸双联体可为适合肽接头。
肽接头可具有任何适合长度。在一些实施方案中，肽接头的长度是至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100个或更多个氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，肽接头的长度是至多约100、75、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5个或更少个氨基酸中的任一者。在一些实施方案中，肽接头的长度是约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸长、约30个氨基酸至约50个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸、或约1个氨基酸至约100个氨基酸中的任一者。
肽接头可具有天然存在的序列或非天然存在的序列。举例来说，源于仅有重链的抗体的铰链区的序列可用作接头。参见例如WO 1996/34103。在一些实施方案中，肽接头是人IgG1铰链(SEQ ID NO:163)。在一些实施方案中，肽接头是突变人IgG1铰链(SEQ ID NO:307)。在一些实施方案中，肽接头是柔性接头。示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n(SEQID NO:375)、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n(SEQ ID NO:376)、(GSGGS)n(SEQ IDNO:377)、(GGGS)n(SEQ ID NO:378)和(GGGGS)n(SEQ ID NO:379)，其中n是至少是1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域中已知的其他柔性接头。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列GGGGSGGGS(SEQ ID NO:162)。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:365(GGGGSGGGGSGGGGS)。
在一些实施方案中，包含抗CTLA-4sdAb部分和一个或多个其他抗体部分(诸如全长抗体或包含VH和VL的抗原结合部分)的抗CTLA-4构建体具有单特异性。在一些实施方案中，包含抗CTLA-4sdAb部分和一个或多个其他抗体部分(诸如全长抗体或包含VH和VL的抗原结合部分)的抗CTLA-4构建体具有多特异性(诸如双特异性)。多特异性分子是对至少两种不同抗原或表位具有结合特异性的分子(例如对两种抗原或表位具有结合特异性的双特异性抗体)。也涵盖具有大于两价和/或两种特异性的多特异性分子。举例来说，可制备三特异性抗体。Tutt等J.Immunol.147:60(1991)。应了解本领域技术人员可选择本文所述的个别多特异性分子的适当特征以进行彼此组合来形成本发明的多特异性抗CTLA-4分子。
在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体具有多价但单特异性，即抗CTLA-4构建体包含本文所述的抗CTLA-4sdAb部分和特异性识别与所述抗CTLA-4sdAb部分识别的CTLA-4表位相同的CTLA-4表位的至少第二抗体部分(诸如全长抗体或包含VH和VL的抗原结合部分)。在一些实施方案中，一个或多个特异性识别与本文所述的抗CTLA-4sdAb部分识别的CTLA-4表位相同的CTLA-4表位的抗体部分可与所述抗CTLA-4sdAb部分包含相同CDR和/或相同VHH氨基酸序列。举例来说，抗CTLA-4构建体可包含两个或更多个本文所述的抗CTLA-4sdAb部分，其中所述两个或更多个抗CTLA-4sdAb部分是相同的。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分任选由肽接头连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。
在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体具有多价和多特异性，即抗CTLA-4构建体包含本文所述的抗CTLA-4sdAb部分和特异性识别除CTLA-4以外的第二抗原或与由本文所述的所述抗CTLA-4sdAb部分识别的CTLA-4表位不同的CTLA-4表位的至少第二抗体部分(诸如全长抗体或包含VH和VL的抗原结合部分)。在一些实施方案中，第二抗体部分是sdAb。在一些实施方案中，第二抗体部分特异性识别人血清白蛋白(HSA)。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分融合于第二抗体部分的N末端和/或C末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体具有三价和双特异性。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含两个本文所述的抗CTLA-4sdAb和第二抗体部分(诸如抗HSA sdAb)，其中所述第二抗体部分在所述两个抗CTLA-4sdAb之间。在一些实施方案中，抗体部分任选由肽接头连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。
相较于此处所述的单一抗CTLA-4sdAb部分的亲合力，包含两个或更多个特异性识别CTLA-4的sdAb部分的单特异性或多特异性抗CTLA-4构建体可具有增加的亲合力。
包含sdAb融合于全长抗体的双特异性抗体
在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含本文所述的抗CTLA-4sdAb部分融合于第二抗体部分，其中所述第二抗体部分是由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(诸如抗PD-1或抗PD-L1全长抗体)。包含针对CTLA-4和PD-1的双特异性的构建体将在下文中被称为“抗CTLA-4/PD-1抗体”、“抗CTLA-4/PD-1构建体”或“CTLA-4×PD-1抗体”。包含针对CTLA-4和PD-L1的双特异性的构建体将在下文中被称为“抗CTLA-4/PD-L1抗体”、“抗CTLA-4/PD-L1构建体”或“CTLA-4×PD-L1抗体”。
与CTLA-4类似，PD-1和PD-L1是抑制性免疫检查点分子。
PD-1是调控T细胞活化和耐受性的共刺激性分子的B7/CD28家族的一部分，因此，拮抗性抗PD-1抗体可适用于克服耐受性。PD-1已被确定为B7-4的受体。在结合免疫细胞上的抑制性受体后，B7-4可抑制免疫细胞活化。PD-1/PD-L1路径的啮合导致抑制T细胞效应物功能、细胞因子分泌和增殖。(Turnis等,Oncolmmunology 1(7):1172-1174,2012)。高水平的PD-1与耗竭或慢性刺激的T细胞相关联。此外，PD-1表达增加与癌症患者的存活期降低相关联。用于下调PD-1、B7-4以及B7-4与免疫细胞中PD-1抑制性信号之间的相互作用的药剂可导致免疫应答增强。可在本申请中应用的示例性抗PD-1抗体包括但不限于帕母单抗(pembrolizumab)(例如)和尼鲁单抗(nivolumab)(例如/>)。
PD-L1(程序化细胞死亡配体1)也称为分化簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1)。PD-L1充当PD-1的配体以在特定事件诸如妊娠、组织同种异体移植、自体免疫疾病和其他疾病状态诸如肝炎和癌症期间在抑制免疫系统方面起主要作用。PD-1受体/PD-L1配体复合物的形成会传递抑制性信号，其使在淋巴结处的CD8+T细胞的增殖降低。可在本申请中应用的示例性抗PD-L1抗体包括但不限于阿特珠单抗(atezolizumab)(例如)和度伐鲁单抗(Durvalumab)(例如MEDI4736、IMFINZITM)。
在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个重链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个重链的N末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个轻链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个轻链的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，并且抗CTLA-4sdAb的C末端融合于全长抗体的重链与轻链两者的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，其中两个抗CTLA-4sdAb通过第一任选接头来融合在一起，另外两个抗CTLA-4sdAb通过第二任选接头来融合在一起，其中各组双抗CTLA-4sdAb融合物的C末端融合于全长抗体的重链的N末端(如图45所例示)。在一些实施方案中，四个抗CTLA-4sdAb是相同的。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分和全长抗体任选由肽接头连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。在一些实施方案中，抗PD-1全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链。在一些实施方案中，抗PD-1全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ IDNO:161的轻链。在一些实施方案中，抗PD-1全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链，其中全长抗体的至少一个重链融合于抗CTLA-4sdAb，并且其中重链融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:134-145、292-296和319-323中的任一者。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链，其中全长抗体的至少一个重链融合于抗CTLA-4sdAb，并且其中重链融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:146-157、297-301和324-328中的任一者。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链，其中全长抗体的至少一个重链融合于抗CTLA-4sdAb，并且其中重链融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:310-318和329-337中的任一者。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链，其中全长抗体的至少一个轻链融合于抗CTLA-4sdAb，并且其中轻链融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:354或355。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含两个拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:356的重链融合多肽和两个拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:357的轻链融合多肽。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含两个拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:358的重链融合多肽和两个拷贝的包含氨基酸序列SEQ IDNO:159的轻链。
在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其与SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的变体。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其在所述VHH结构域中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分在SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR诸如CDR1和/或CDR2和/或CDR3中包含氨基酸取代。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分包含SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR1、CDR2和CDR3，并且氨基酸取代在SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的FR诸如FR1和/或FR2和/或FR3和/或FR4中。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分在CDR与FR两者中包含氨基酸取代。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个重链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个重链的N末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个轻链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个轻链的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，并且抗CTLA-4sdAb的C末端融合于全长抗体的重链与轻链两者的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，其中两个抗CTLA-4sdAb通过第一任选接头来融合在一起，另外两个抗CTLA-4sdAb通过第二任选接头来融合在一起，其中各组双抗CTLA-4sdAb融合物的C末端融合于全长抗体的重链的N末端(如图45所例示)。在一些实施方案中，四个抗CTLA-4sdAb是相同的。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分和全长抗体任选由肽接头连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10- 8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链。在一些实施方案中，氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个重链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个重链的N末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个轻链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个轻链的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，并且抗CTLA-4sdAb的C末端融合于全长抗体的重链与轻链两者的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，其中两个抗CTLA-4sdAb通过第一任选接头来融合在一起，另外两个抗CTLA-4sdAb通过第二任选接头来融合在一起，其中各组双抗CTLA-4sdAb融合物的C末端融合于全长抗体的重链的N末端(如图45所例示)。在一些实施方案中，四个抗CTLA-4sdAb是相同的。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分和全长抗体任选由肽接头连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其与SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的变体，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其在所述VHH结构域中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分在SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR诸如CDR1和/或CDR2和/或CDR3中包含氨基酸取代。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分包含SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR1、CDR2和CDR3，并且氨基酸取代在SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的FR诸如FR1和/或FR2和/或FR3和/或FR4中。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分在CDR与FR两者中包含氨基酸取代。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR1、CDR2和CDR3，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个重链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个重链的N末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个轻链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个轻链的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，并且抗CTLA-4sdAb的C末端融合于全长抗体的重链与轻链两者的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，其中两个抗CTLA-4sdAb通过第一任选接头来融合在一起，另外两个抗CTLA-4sdAb通过第二任选接头来融合在一起，其中各组双抗CTLA-4sdAb融合物的C末端融合于全长抗体的重链的N末端(如图45所例示)。在一些实施方案中，四个抗CTLA-4sdAb是相同的。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分和全长抗体任选由肽接头连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10- 12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链。在一些实施方案中，氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个重链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个重链的N末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个轻链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个轻链的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，并且抗CTLA-4sdAb的C末端融合于全长抗体的重链与轻链两者的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，其中两个抗CTLA-4sdAb通过第一任选接头来融合在一起，另外两个抗CTLA-4sdAb通过第二任选接头来融合在一起，其中各组双抗CTLA-4sdAb融合物的C末端融合于全长抗体的重链的N末端(如图45所例示)。在一些实施方案中，四个抗CTLA-4sdAb是相同的。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分和全长抗体任选由肽接头连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其与SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的变体，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其在所述VHH结构域中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分在SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR诸如CDR1和/或CDR2和/或CDR3中包含氨基酸取代。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分包含SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR1、CDR2和CDR3，并且氨基酸取代在SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的FR诸如FR1和/或FR2和/或FR3和/或FR4中。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分在CDR与FR两者中包含氨基酸取代。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR1、CDR2和CDR3，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个重链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个重链的N末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个轻链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个轻链的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，并且抗CTLA-4sdAb的C末端融合于全长抗体的重链与轻链两者的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，其中两个抗CTLA-4sdAb通过第一任选接头来融合在一起，另外两个抗CTLA-4sdAb通过第二任选接头来融合在一起，其中各组双抗CTLA-4sdAb融合物的C末端融合于全长抗体的重链的N末端(如图45所例示)。在一些实施方案中，四个抗CTLA-4sdAb是相同的。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分和全长抗体任选由肽接头连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10- 12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链。在一些实施方案中，氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个重链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个重链的N末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个轻链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个轻链的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，并且抗CTLA-4sdAb的C末端融合于全长抗体的重链与轻链两者的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，其中两个抗CTLA-4sdAb通过第一任选接头来融合在一起，另外两个抗CTLA-4sdAb通过第二任选接头来融合在一起，其中各组双抗CTLA-4sdAb融合物的C末端融合于全长抗体的重链的N末端(如图45所例示)。在一些实施方案中，四个抗CTLA-4sdAb是相同的。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分和全长抗体任选由肽接头连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其与SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的变体，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其在所述VHH结构域中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分在SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR诸如CDR1和/或CDR2和/或CDR3中包含氨基酸取代。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分包含SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR1、CDR2和CDR3，并且氨基酸取代在SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的FR诸如FR1和/或FR2和/或FR3和/或FR4中。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分在CDR与FR两者中包含氨基酸取代。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR1、CDR2和CDR3，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个重链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个重链的N末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个轻链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个轻链的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，并且抗CTLA-4sdAb的C末端融合于全长抗体的重链与轻链两者的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，其中两个抗CTLA-4sdAb通过第一任选接头来融合在一起，另外两个抗CTLA-4sdAb通过第二任选接头来融合在一起，其中各组双抗CTLA-4sdAb融合物的C末端融合于全长抗体的重链的N末端(如图45所例示)。在一些实施方案中，四个抗CTLA-4sdAb是相同的。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分和全长抗体任选由肽接头连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10- 12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链，其中所述全长抗体的至少一个重链融合于所述抗CTLA-4sdAb，并且其中重链融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:134-145、292-296和319-323中的任一者。在一些实施方案中，提供一种包含两个特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链，其中所述全长抗体的各重链融合于抗CTLA-4sdAb，并且其中重链融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:134-145、292-296和319-323中的任一者。在一些实施方案中，提供一种包含两个相同拷贝的含有氨基酸序列SEQ ID NO:134-145、292-296和319-323中的任一者的重链融合多肽和两个相同拷贝的含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链的经分离的抗CTLA-4构建体。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体具有如图40和图41中所示的结构。
在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链，其中所述全长抗体的至少一个重链融合于所述抗CTLA-4sdAb，并且其中重链融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:146-157、297-301和324-328中的任一者。在一些实施方案中，提供一种包含两个特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链，其中所述全长抗体的各重链融合于抗CTLA-4sdAb，并且其中重链融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:146-157、297-301和324-328中的任一者。在一些实施方案中，提供一种包含两个相同拷贝的含有氨基酸序列SEQ ID NO:146-157、297-301和324-328中的任一者的重链融合多肽和两个相同拷贝的含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链的经分离的抗CTLA-4构建体。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体具有如图40和图41中所示的结构。
在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链，其中所述全长抗体的至少一个重链融合于所述抗CTLA-4sdAb，并且其中重链融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:310-318和329-337中的任一者。在一些实施方案中，提供一种包含两个特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链，其中所述全长抗体的各重链融合于抗CTLA-4sdAb，并且其中重链融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:310-318和329-337中的任一者。在一些实施方案中，提供一种包含两个相同拷贝的含有氨基酸序列SEQ ID NO:310-318和329-337中的任一者的重链融合多肽和两个相同拷贝的含有氨基酸序列SEQ IDNO:309的轻链的经分离的抗CTLA-4构建体。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体具有如图40和图41中所示的结构。
在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链，其中所述全长抗体的至少一个轻链融合于所述抗CTLA-4sdAb，并且其中轻链融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:354和355中的任一者。在一些实施方案中，提供一种包含两个特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链，其中所述全长抗体的各轻链融合于抗CTLA-4sdAb，并且其中轻链融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:354和355中的任一者。在一些实施方案中，提供一种包含两个相同拷贝的含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和两个相同拷贝的含有氨基酸序列SEQ ID NO:354和355中的任一者的轻链融合多肽的经分离的抗CTLA-4构建体。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体具有如图42和图43中所示的结构。
在一些实施方案中，提供一种包含四个本文所述的特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中各抗CTLA-4sdAb的C末端融合于所述全长抗体的各链的N末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分和全长抗体任选由肽接头连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。在一些实施方案中，四个抗CTLA-4sdAb是相同的。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链。在一些实施方案中，提供一种包含两个相同拷贝的含有氨基酸序列SEQ ID NO:356的重链融合多肽和两个相同拷贝的含有氨基酸序列SEQ ID NO:357的轻链融合多肽的经分离的抗CTLA-4构建体。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体具有如图44中所示的结构。
在一些实施方案中，提供一种包含四个本文所述的特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中两个抗CTLA-4sdAb融合在一起，另外两个抗CTLA-4sdAb融合在一起，其中所述全长抗体的各重链的N末端融合于各抗CTLA-4sdAb融合物的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分和全长抗体任选由肽接头连接。在一些实施方案中，两个特异性识别CTLA-4的sdAb部分任选由肽接头连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。在一些实施方案中，四个抗CTLA-4sdAb是相同的。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链。在一些实施方案中，提供一种包含两个相同拷贝的含有氨基酸序列SEQ ID NO:358的重链融合多肽和两个相同拷贝的含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链的经分离的抗CTLA-4构建体。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体具有如图45中所示的结构。
在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个重链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个重链的N末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个轻链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个轻链的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，并且抗CTLA-4sdAb的C末端融合于全长抗体的重链与轻链两者的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，其中两个抗CTLA-4sdAb通过第一任选接头来融合在一起，另外两个抗CTLA-4sdAb通过第二任选接头来融合在一起，其中各组双抗CTLA-4sdAb融合物的C末端融合于全长抗体的重链的N末端(如图45所例示)。在一些实施方案中，四个抗CTLA-4sdAb是相同的。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分和全长抗体任选由肽接头连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链，其中全长抗体的至少一个重链融合于抗CTLA-4sdAb，并且其中重链融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:171-182、302-306和345-349中的任一者。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQID NO:198的轻链，其中全长抗体的至少一个重链融合于抗CTLA-4sdAb，并且其中重链融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:183-194中的任一者。
在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其与SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的变体。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其在所述VHH结构域中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分在SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR诸如CDR1和/或CDR2和/或CDR3中包含氨基酸取代。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分包含SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR1、CDR2和CDR3，并且氨基酸取代在SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的FR诸如FR1和/或FR2和/或FR3和/或FR4中。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分在CDR与FR两者中包含氨基酸取代。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个重链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个重链的N末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个轻链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个轻链的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，并且抗CTLA-4sdAb的C末端融合于全长抗体的重链与轻链两者的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，其中两个抗CTLA-4sdAb通过第一任选接头来融合在一起，另外两个抗CTLA-4sdAb通过第二任选接头来融合在一起，其中各组双抗CTLA-4sdAb融合物的C末端融合于全长抗体的重链的N末端(如图45所例示)。在一些实施方案中，四个抗CTLA-4sdAb是相同的。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分和全长抗体任选由肽接头连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10- 12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链。在一些实施方案中，氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ IDNO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个重链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个重链的N末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个轻链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个轻链的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，并且抗CTLA-4sdAb的C末端融合于全长抗体的重链与轻链两者的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，其中两个抗CTLA-4sdAb通过第一任选接头来融合在一起，另外两个抗CTLA-4sdAb通过第二任选接头来融合在一起，其中各组双抗CTLA-4sdAb融合物的C末端融合于全长抗体的重链的N末端(如图45所例示)。在一些实施方案中，四个抗CTLA-4sdAb是相同的。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分和全长抗体任选由肽接头连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其与SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的变体，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其在所述VHH结构域中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分在SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR诸如CDR1和/或CDR2和/或CDR3中包含氨基酸取代。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分包含SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR1、CDR2和CDR3，并且氨基酸取代在SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的FR诸如FR1和/或FR2和/或FR3和/或FR4中。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分在CDR与FR两者中包含氨基酸取代。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR1、CDR2和CDR3，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个重链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个重链的N末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个轻链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个轻链的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，并且抗CTLA-4sdAb的C末端融合于全长抗体的重链与轻链两者的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，其中两个抗CTLA-4sdAb通过第一任选接头来融合在一起，另外两个抗CTLA-4sdAb通过第二任选接头来融合在一起，其中各组双抗CTLA-4sdAb融合物的C末端融合于全长抗体的重链的N末端(如图45所例示)。在一些实施方案中，四个抗CTLA-4sdAb是相同的。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分和全长抗体任选由肽接头连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10- 12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链。在一些实施方案中，氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ IDNO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个重链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个重链的N末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个轻链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个轻链的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，并且抗CTLA-4sdAb的C末端融合于全长抗体的重链与轻链两者的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个本文所述的抗CTLA-4sdAb，其中两个抗CTLA-4sdAb通过第一任选接头来融合在一起，另外两个抗CTLA-4sdAb通过第二任选接头来融合在一起，其中各组双抗CTLA-4sdAb融合物的C末端融合于全长抗体的重链的N末端(如图45所例示)。在一些实施方案中，四个抗CTLA-4sdAb是相同的。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分和全长抗体任选由肽接头连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其与SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的变体，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其在所述VHH结构域中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分在SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR诸如CDR1和/或CDR2和/或CDR3中包含氨基酸取代。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分包含SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR1、CDR2和CDR3，并且氨基酸取代在SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的FR诸如FR1和/或FR2和/或FR3和/或FR4中。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分在CDR与FR两者中包含氨基酸取代。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链。在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR1、CDR2和CDR3，并且其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个重链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个重链的N末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分和全长抗体任选由肽接头连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQID NO:162、163、307或365。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链，其中所述全长抗体的至少一个重链融合于所述抗CTLA-4sdAb，并且其中重链融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:171-182、302-306和345-349中的任一者。在一些实施方案中，提供一种包含两个特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链，其中所述全长抗体的各重链融合于抗CTLA-4sdAb，并且其中重链融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:171-182、302-306和345-349中的任一者。在一些实施方案中，提供一种包含两个相同拷贝的含有氨基酸序列SEQ ID NO:171-182、302-306和345-349中的任一者的重链融合多肽和两个相同拷贝的含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链的经分离的抗CTLA-4构建体。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体具有如图40和图41中所示的结构。
在一些实施方案中，提供一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链，其中所述全长抗体的至少一个重链融合于所述抗CTLA-4sdAb，并且其中重链融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:183-194中的任一者。在一些实施方案中，提供一种包含两个特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链，其中所述全长抗体的各重链融合于抗CTLA-4sdAb，并且其中重链融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:183-194中的任一者。在一些实施方案中，提供一种包含两个相同拷贝的含有氨基酸序列SEQ ID NO:183-194中的任一者的重链融合多肽和两个相同拷贝的含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链的经分离的抗CTLA-4构建体。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体具有如图40和图41中所示的结构。
在一些实施方案中，提供一种包含本文所述的特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述全长抗体的至少一个轻链融合于所述抗CTLA-4sdAb。在一些实施方案中，提供一种包含两个本文所述的特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述全长抗体的各轻链融合于抗CTLA-4sdAb。在一些实施方案中，经分离的抗CTLA-4构建体包含两个相同拷贝的全长抗体重链和两个相同拷贝的包含全长抗体轻链和抗CTLA-4sdAb的轻链融合多肽。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQID NO:196的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体具有如图42和图43中所示的结构。
在一些实施方案中，提供一种包含四个本文所述的特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中各抗CTLA-4sdAb的C末端融合于所述全长抗体的各链的N末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分和全长抗体任选由肽接头连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链。在一些实施方案中，经分离的抗CTLA-4构建体包含两个相同拷贝的包含全长抗体重链和抗CTLA-4sdAb的重链融合多肽和两个相同拷贝的包含全长抗体轻链和抗CTLA-4sdAb的轻链融合多肽。在一些实施方案中，四个抗CTLA-4sdAb是相同的。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体具有如图44中所示的结构。
在一些实施方案中，提供一种包含四个本文所述的特异性识别CTLA-4的sdAb部分和抗PD-L1全长抗体的经分离的抗CTLA-4构建体，其中两个抗CTLA-4sdAb融合在一起，另外两个抗CTLA-4sdAb融合在一起，其中所述全长抗体的各重链的N末端融合于各抗CTLA-4sdAb融合物的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分和全长抗体任选由肽接头连接。在一些实施方案中，两个特异性识别CTLA-4的sdAb部分任选由肽接头连接。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链。在一些实施方案中，经分离的抗CTLA-4构建体包含两个相同拷贝的包含全长抗体重链以及两个抗CTLA-4sdAb的融合物的重链融合多肽和两个相同拷贝的全长抗体轻链。在一些实施方案中，四个抗CTLA-4sdAb是相同的。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体具有如图45中所示的结构。
在一些实施方案中，也提供一种以与任一本文所述的抗CTLA-4构建体(诸如本文所述的抗CTLA-4sdAb、抗CTLA-4HCAb、包含抗CTLA-4sdAb的多特异性或单特异性抗CTLA-4构建体，例如本文所述的抗CTLA-4/PD-1构建体或抗CTLA-4/PD-L1构建体)竞争的方式特异性结合CTLA-4的包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分的抗CTLA-4构建体(在下文中被称为“竞争性抗CTLA-4构建体”)。
抗CTLA-4多特异性抗原结合蛋白(MABP)
在一些实施方案中，提供一种包含本文所述的抗CTLA-4sdAb部分融合于包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的全长抗体或抗原结合片段的抗CTLA-4构建体，其中所述抗CTLA-4构建体具有多特异性(在下文中被称为“多特异性抗CTLA-4构建体”或“抗CTLA-4多特异性抗原结合蛋白(MABP)”)。在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP具有双特异性(在下文中被称为“双特异性抗CTLA-4构建体”或“抗CTLA-4双特异性抗原结合蛋白(BABP)”)。抗CTLA-4sdAb特异性结合与由全长抗体或抗原结合片段识别的靶标不同的CTLA-4，由此赋予增宽靶向能力。由于sdAb的尺寸较小，所以在一些实施方案中，相较于全长抗体或抗原结合片段组分的分子量和药物动力学性质，本文所述的抗CTLA-4MABP可具有类似分子量和药物动力学性质。举例来说，抗CTLA-4MABP可通过以下方式来设计：使一个或多个sdAb融合于具有经证明临床功效和安全性的单克隆抗体以提供增加的临床益处和合乎需要的药物动力学性质，而不阻碍多特异性构建体的可表达性。在一些实施方案中，使一个或多个本文所述的抗CTLA-4sdAb通过任选肽接头来融合于全长抗体或抗原结合片段。可采用本文所述的抗CTLA-4MABP以除CTLA-4之外也靶向多种疾病相关表位或抗原组合，诸如CTLA-4以及免疫检查点分子、细胞表面抗原(诸如肿瘤抗原)或促炎性分子的组合，由此提供适用于治疗多种疾病和病状诸如癌症、炎症和自体免疫疾病的药剂。
因此，在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4构建体(例如MABP或BABP)，其包含：(a)包含抗CTLA-4sdAb部分的第一抗原结合部分，所述抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，和(b)包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的第二抗原结合部分，其中所述VH和所述VL一起形成特异性结合第二表位(例如PD-1、PD-L1)的抗原结合位点，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3；或其在CDR区中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，氨基酸取代在CDR1和/或CDR2中。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其与SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者具有至少约80％(诸如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一者)序列同一性的变体。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其在所述VHH结构域中包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分在SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR诸如CDR1和/或CDR2和/或CDR3中包含氨基酸取代。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分包含SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR1、CDR2和CDR3，并且氨基酸取代在SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的FR诸如FR1和/或FR2和/或FR3和/或FR4中。在一些实施方案中，包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域或其变体的抗CTLA-4sdAb部分在CDR与FR两者中包含氨基酸取代。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分包含含有氨基酸序列SEQID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域。在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4构建体(例如MABP或BABP)，其包含：(a)包含抗CTLA-4sdAb部分的第一抗原结合部分，所述抗CTLA-4sdAb部分包含SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的CDR1、CDR2和CDR3，和(b)包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的第二抗原结合部分，其中所述VH和所述VL一起形成特异性结合第二表位(例如PD-1、PD-L1)的抗原结合位点，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。在一些实施方案中，第二表位是免疫检查点分子(例如PD-1、PD-L1)。在一些实施方案中，第二表位是促炎性分子。在一些实施方案中，第二表位是细胞表面抗原(诸如肿瘤抗原或免疫效应细胞上的细胞表面抗原)。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含含有VH的重链和含有VL的轻链。在一些实施方案中，第一抗原结合部分在重链的N末端、轻链的N末端、Fc区的N末端、重链的C末端或轻链的C末端融合于第二抗原结合部分。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含全长4链抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含抗PD-1全长抗体。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ IDNO:309的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含抗PD-L1全长抗体。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ IDNO:196的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链。在一些实施方案中，第一抗原结合部分以化学方式融合于第二抗原结合部分。在一些实施方案中，第一抗原结合部分通过肽接头来融合于第二抗原结合部分。在一些实施方案中，肽接头的长度是至多约30(诸如至多约25、20或15中的任一者)个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。在一些实施方案中，第二抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc或IgG4 Fc。
在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体(例如MABP或BABP)包含至少两个可特异性结合至少两种不同表位的抗原结合部分。至少两个抗原结合部分中的一些可为相同的，只要MABP具有对两种不同表位的结合位点即可。抗CTLA-4MABP可为对称的或不对称的。举例来说，抗CTLA-4MABP可包含一个至八个拷贝的包含抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分和一个或两个拷贝的第二抗原结合部分。在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含两个不同抗原结合部分，其各自包含一起形成不同抗原结合位点的VH结构域和VL结构域。举例来说，第二抗原结合部分可为双特异性抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分是单特异性全长抗体或其抗原结合片段诸如Fab或scFv。
在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个不同抗原结合部分中的任一者，所述抗原结合部分各自包含本文所述的抗CTLA-4sdAb。在一些实施方案中，两个相同抗CTLA-4sdAb彼此融合，其进一步融合于第二抗原结合部分。在一些实施方案中，两个不同抗CTLA-4sdAb彼此融合，其进一步融合于第二抗原结合部分。
抗CTLA-4构建体(例如MABP)对于CTLA-4和/或第二表位(例如PD-1、PD-L1)可具有任何适合价数以及任何适合数目的特异性。在一些实施方案中，MABP对于CTLA-4具有二价、三价、四价、五价、六价或更高价。在一些实施方案中，MABP对于第二表位(例如PD-1、PD-L1)具有二价、三价、四价、五价、六价或更高价。在一些实施方案中，MABP具有双特异性(例如CTLA-4×PD-1BABP、CTLA-4×PD-L1 BABP)。示例性BABP描绘于图40-图49中。在一些实施方案中，MABP具有三特异性。在一些实施方案中，MABP具有四特异性。在一些实施方案中，MABP具有大于四种特异性。
在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4双特异性抗原结合蛋白(“BABP”)，其包含：(a)一个或多个拷贝(诸如2)的包含抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分，所述抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，和(b)单一拷贝的包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的第二抗原结合部分，其中所述VH和所述VL一起形成特异性结合第二表位(例如PD-1、PD-L1)的抗原结合位点，其中各拷贝的所述第一抗原结合部分融合于所述第二抗原结合部分。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域。在一些实施方案中，一个或多个抗CTLA-4sdAb各自进一步融合于另一相同或不同抗CTLA-4sdAb。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含抗PD-1全长抗体。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含抗PD-L1全长抗体。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链。在一些实施方案中，第一抗原结合部分通过肽接头来融合于第二抗原结合部分。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQID NO:162、163、307或365。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。在一些实施方案中，第二抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc或IgG4 Fc。
在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4MABP，其包含：(a)多个(诸如2、3、4、5、6、7、8个或更多个)相同或不同的包含以下各物的抗CTLA-4sdAb：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，和(b)多个(诸如2、3、4、5、6个或更多个)包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的第二抗原结合部分，其中所述VH和所述VL一起形成特异性结合第二表位(例如PD-1、PD-L1)的抗原结合位点，并且其中所述抗CTLA-4sdAb彼此融合和/或融合于所述第二抗原结合部分。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含抗PD-1全长抗体。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含抗PD-L1全长抗体。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链。在一些实施方案中，第一抗原结合部分通过肽接头来融合于第二抗原结合部分。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb通过肽接头来彼此融合。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10- 8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。在一些实施方案中，第二抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc或IgG4 Fc。
在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)单一拷贝的包含抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分，所述抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，和(b)两个拷贝的各自包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的第二抗原结合部分，其中所述VH和所述VL一起形成特异性结合第二表位(例如PD-1、PD-L1)的抗原结合位点，其中所述第一抗原结合部分融合于所述两个拷贝的所述第二抗原结合部分中的一者。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含抗PD-1全长抗体。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQID NO:161的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含抗PD-L1全长抗体。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链。在一些实施方案中，第一抗原结合部分通过肽接头来融合于第二抗原结合部分。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。在一些实施方案中，第二抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc或IgG4 Fc。
在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)多个(诸如2、3或4个)相同或不同的包含以下各物的抗CTLA-4sdAb：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，和(b)两个拷贝的各自包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的第二抗原结合部分，其中所述VH和所述VL一起形成特异性结合第二表位(例如PD-1、PD-L1)的抗原结合位点，并且其中所述抗CTLA-4sdAb彼此融合和/或融合于所述第二抗原结合部分。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含抗PD-1全长抗体。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ IDNO:309的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含抗PD-L1全长抗体。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ IDNO:196的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链。在一些实施方案中，第一抗原结合部分通过肽接头来融合于第二抗原结合部分。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb通过肽接头来彼此融合。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10- 12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。在一些实施方案中，第二抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc或IgG4 Fc。实例显示于图44、图45、图48和图49中。
在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)两个拷贝的各自包含抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分，所述抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，(b)两个拷贝的各自包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的第二抗原结合部分，其中所述VH和所述VL一起形成特异性结合第二表位(例如PD-1、PD-L1)的抗原结合位点，其中一个拷贝的所述第一抗原结合部分融合于各拷贝的所述第二抗原结合部分。在一些实施方案中，一个或多个抗CTLA-4sdAb各自进一步融合于另一相同或不同抗CTLA-4sdAb。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含抗PD-1全长抗体。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQID NO:161的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含抗PD-L1全长抗体。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链。在一些实施方案中，第一抗原结合部分通过肽接头来融合于第二抗原结合部分。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。在一些实施方案中，第二抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG1 Fc或IgG4 Fc。实例显示于图40-图43、图46和图47中。
a)融合多肽
抗CTLA-4MABP的第一抗原结合部分和第二抗原结合部分彼此融合(即共价连接)。因此，本申请的抗CTLA-4MABP包含一个或多个融合多肽。各融合多肽可包含以下各物：包含本文所述的抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分和来自第二抗原结合部分的多肽。
包含抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分和第二抗原结合部分可由单一化学键(诸如肽键)直接连接或通过肽接头来连接。包含抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分可融合在第二抗原结合部分的任一(包括各个)多肽的N末端或C末端，或可融合在第二抗原结合部分的任一(包括各个)多肽的内部位置处，诸如在第二抗原结合部分的重链中的Fc区的N末端。融合多肽可以重组方式或以化学方式获得。在一些实施方案中，包含抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分的C末端通过化学键(诸如肽键)或肽接头来融合于第二抗原结合部分的任何(包括各个)多肽的N末端。在一些实施方案中，包含抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分的N末端通过化学键(诸如肽键)或肽接头来融合于第二抗原结合部分的任何(包括各个)多肽的C末端。在一些实施方案中，包含抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分通过不是涉及氨基酸的主链化学基团的肽键的化学键来融合于第二抗原结合部分。
在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含含有VH和VL的单链抗体片段。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含scFv。在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含在N末端至C末端方向上包含以下各物的融合多肽：包含本文所述的抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分、任选肽接头、VH结构域和VL结构域。在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含在N末端至C末端方向上包含以下各物的融合多肽：包含本文所述的抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分、任选肽接头、VL结构域和VH结构域。在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含在N末端至C末端方向上包含以下各物的融合多肽：VH结构域、VL结构域、任选肽接头、以及包含本文所述的抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分。在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含在N末端至C末端方向上包含以下各物的融合多肽：VL结构域、VH结构域、任选肽接头、以及包含本文所述的抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分。
在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含含有VH结构域的重链和含有VL结构域的轻链。在一些实施方案中，重链进一步包含一个或多个重链恒定结构域诸如CH1、CH2、CH3和CH4、和/或抗体铰链区(HR)。在一些实施方案中，轻链进一步包含轻链恒定结构域(CL)，诸如λCL结构域或κCL结构域。在一些实施方案中，包含本文所述的抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分的N末端融合于重链的C末端。在一些实施方案中，包含本文所述的抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分的C末端融合于重链的N末端。在一些实施方案中，包含本文所述的抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分的N末端融合于轻链的C末端。在一些实施方案中，包含本文所述的抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分的C末端融合于轻链的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含从N末端至C末端包含以下各物的第一多肽：重链、任选肽接头、以及包含本文所述的抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分；和包含轻链的第二多肽。在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含从N末端至C末端包含以下各物的第一多肽：包含本文所述的抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分、任选肽接头、以及重链；和包含轻链的第二多肽。在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含从N末端至C末端包含以下各物的第一多肽：轻链、任选肽接头、以及包含本文所述的抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分；和包含重链的第二多肽。在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含从N末端至C末端包含以下各物的第一多肽：包含本文所述的抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分、任选肽接头、以及轻链；和包含重链的第二多肽。
在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(例如抗PD-1或抗PD-L1全长抗体)。在一些实施方案中，全长抗体是由两个相同重链和两个相同轻链组成的全长单克隆抗体。在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含两个相同第一多肽，其各自从N末端至C末端包含以下各物：重链、任选肽接头、以及包含本文所述的抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分；和两个第二多肽，其各自包含轻链(参见例如图41)。在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含两个相同第一多肽，其各自从N末端至C末端包含以下各物：包含本文所述的抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分、任选肽接头、以及重链；和两个相同第二多肽，其各自包含轻链(参见例如图40)。在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含两个相同第一多肽，其各自从N末端至C末端包含以下各物：轻链、任选肽接头、以及包含本文所述的抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分；和两个相同第二多肽，其各自包含重链(参见例如图43)。在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含两个相同第一多肽，其各自从N末端至C末端包含以下各物：包含本文所述的抗CTLA-4sdAb的第一抗原结合部分、任选肽接头、以及轻链；和两个包含重链的相同第二多肽(参见例如图42)。
在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含：(a)由第一重链和第二重链以及第一轻链和第二轻链组成的全长抗体，其中所述全长抗体特异性识别第一表位(例如PD-1、PD-L1)；(b)特异性识别第二表位的本文所述的第一抗CTLA-4sdAb；(c)特异性识别第三表位的本文所述的第二抗CTLA-4sdAb；(d)特异性识别第四表位的本文所述的第三抗CTLA-4sdAb；和(e)特异性识别第五表位的本文所述的第四抗CTLA-4sdAb；其中所述第一抗CTLA-4sdAb的C末端融合于所述第一轻链的N末端，其中所述第二抗CTLA-4sdAb的C末端融合于所述第二轻链的N末端，其中所述第三抗CTLA-4sdAb的C末端融合于所述第一重链的N末端，并且其中所述第四抗CTLA-4sdAb的C末端融合于所述第二重链的N末端。在一些实施方案中，四个抗CTLA-4sdAb是不同的。在一些实施方案中，四个抗CTLA-4sdAb是相同的。在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含两个相同第一多肽，其各自从N末端至C末端包含以下各物：第三或第四抗CTLA-4sdAb、任选肽接头、以及重链；和两个相同第二多肽，其各自包含第一或第二抗CTLA-4sdAb、任选肽接头、以及轻链。参见例如图44。
在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含：(a)由两个重链和两个轻链组成的全长抗体，其中所述全长抗体特异性识别第一表位(例如PD-1、PD-L1)；(b)特异性识别第二表位的本文所述的第一抗CTLA-4sdAb；(c)特异性识别第三表位的本文所述的第二抗CTLA-4sdAb；(d)特异性识别第四表位的本文所述的第三抗CTLA-4sdAb；和(e)特异性识别第五表位的本文所述的第四抗CTLA-4sdAb；其中所述第一抗CTLA-4sdAb的C末端融合于所述第二抗CTLA-4sdAb的N末端，并且所述第二抗CTLA-4sdAb的C末端融合于一个重链的N末端，并且其中所述第三抗CTLA-4sdAb的C末端融合于所述第四抗CTLA-4sdAb的N末端，并且所述第四抗CTLA-4sdAb的C末端融合于另一重链的N末端。在一些实施方案中，四个抗CTLA-4sdAb是不同的。在一些实施方案中，四个抗CTLA-4sdAb是相同的。在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含两个相同第一多肽，其各自从N末端至C末端包含以下各物：第一或第三抗CTLA-4sdAb、任选肽接头、第二或第四抗CTLA-4sdAb、任选肽接头、以及重链；和两个相同第二多肽，其各自包含轻链。参见例如图45。
在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含：(a)由两个重链和两个轻链组成的全长抗体，其中所述全长抗体特异性识别第一表位(例如PD-1、PD-L1)；(b)特异性识别第二表位的本文所述的第一抗CTLA-4sdAb；和(c)特异性识别第三表位的本文所述的第二抗CTLA-4sdAb，其中所述第一抗CTLA-4sdAb或所述第二抗CTLA-4sdAb的N末端融合于所述重链的CH1区的C末端，并且所述第一抗CTLA-4sdAb或所述第二抗CTLA-4sdAb的C末端融合于所述重链的CH2区的N末端。在一些实施方案中，两个抗CTLA-4sdAb是相同的。在一些实施方案中，两个抗CTLA-4sdAb是不同的。在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含两个相同第一多肽，其各自从N末端至C末端包含以下各物：VH-CH1-任选肽接头-抗CTLA-4sdAb-CH2-CH3；和两个相同第二多肽，其各自包含轻链。参见例如图46。
在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含：(a)特异性识别第一表位(例如PD-1、PD-L1)的第一scFv；(b)特异性识别第二表位(例如PD-1、PD-L1)的第二scFv；(c)Fc区；(d)特异性识别第三表位的本文所述的第一抗CTLA-4sdAb；和(d)特异性识别第四表位的本文所述的第二抗CTLA-4sdAb，其中各抗CTLA-4sdAb的N末端融合于scFv的C末端，并且所述抗CTLA-4sdAb的C末端融合于所述Fc区的N末端。在一些实施方案中，两个抗CTLA-4sdAb是相同的。在一些实施方案中，两个抗CTLA-4sdAb是不同的。在一些实施方案中，两个scFv是相同的。在一些实施方案中，两个scFv是不同的。在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含两个相同多肽，其各自从N末端至C末端包含以下各物：scFv-任选肽接头-抗CTLA-4sdAb-CH2-CH3。参见例如图47。
在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含：(a)特异性识别第一表位(例如PD-1、PD-L1)的第一Fab；(b)特异性识别第二表位(例如PD-1、PD-L1)的第二Fab；(c)Fc区；(d)包含特异性识别第三表位的本文所述的第一抗CTLA-4sdAb和特异性识别第四表位的本文所述的第二抗CTLA-4sdAb的第一Fab样结构域；(e)包含特异性识别第五表位的本文所述的第三抗CTLA-4sdAb和特异性识别第六表位的本文所述的第四抗CTLA-4sdAb的第二Fab样结构域，其中各Fab样结构域的N末端融合于Fab的C末端，并且所述Fab样结构域的两个C末端中的一者融合于所述Fc区的N末端。在一些实施方案中，四个抗CTLA-4sdAb是相同的。在一些实施方案中，四个抗CTLA-4sdAb是不同的。在一些实施方案中，两个Fab是相同的。在一些实施方案中，两个Fab是不同的。在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含两个相同第一多肽，其各自从N末端至C末端包含以下各物：VH-CH1-任选肽接头-抗CTLA-4sdAb-CH1-CH2-CH3；和两个相同第二多肽，其各自从N末端至C末端包含以下各物：VL-CL-任选肽接头-抗CTLA-4sdAb-CL。参见例如图48。
在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含：(a)特异性识别第一表位(例如PD-1、PD-L1)的第一scFv；(b)特异性识别第二表位9(例如PD-1、PD-L1)的第二scFv；(c)Fc区；(d)包含特异性识别第三表位的本文所述的第一抗CTLA-4sdAb和特异性识别第四表位的本文所述的第二抗CTLA-4sdAb的第一Fab样结构域；(e)包含特异性识别第五表位的本文所述的第三抗CTLA-4sdAb和特异性识别第六表位的本文所述的第四抗CTLA-4sdAb的第二Fab样结构域，其中各Fab样结构域的两个N末端中的一者融合于scFv的C末端，并且所述Fab样结构域的两个C末端中的一者融合于所述Fc区的N末端。在一些实施方案中，四个抗CTLA-4sdAb是相同的。在一些实施方案中，四个抗CTLA-4sdAb是不同的。在一些实施方案中，两个scFv是相同的。在一些实施方案中，两个scFv是不同的。在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP包含两个相同第一多肽，其各自从N末端至C末端包含以下各物：scFv-任选肽接头-抗CTLA-4sdAb-CH1-CH2-CH3；和两个相同第二多肽，其各自从N末端至C末端包含以下各物：抗CTLA-4sdAb-CL。参见例如图49。
本文所述的抗CTLA-4MABP可包含一个或多个位于第一抗原结合部分与第二抗原结合部分之间的肽接头。在一些实施方案中，在第二抗原结合部分的重链多肽与第一抗原结合部分之间的肽接头与在第二抗原结合部分的轻链多肽与第一抗原结合部分之间的肽接头相同。在一些实施方案中，在第二抗原结合部分的重链多肽与第一抗原结合部分之间的肽接头与在第二抗原结合部分的轻链多肽与第一抗原结合部分之间的肽接头不同。在一些实施方案中，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分在其间不安置肽接头下直接彼此融合。两个或更多个抗CTLA-4sdAb之间的肽接头可与抗CTLA-4sdAb和第二抗原结合部分之间的肽接头相同或不同。以上在“肽接头”章节中所述的任何肽接头都可在任何本文所述的抗CTLA-4MABP中采用。
b)包含VH和VL的第二抗原结合部分
抗CTLA-4MABP(例如BABP)包含至少一个包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗原结合部分。所述抗原结合部分可为由两个重链和两个轻链组成的全长常规抗体或由其获得的抗原结合片段。
在一些实施方案中，第二抗原结合部分是包含含有VH结构域的重链和含有VL结构域的轻链的抗原结合片段。本文涵盖的示例性抗原结合片段包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(诸如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含Fc区，诸如人Fc区。在一些实施方案中，Fc区源于IgG分子，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4子类中的任一者。在一些实施方案中，Fc区能够介导抗体效应物功能，诸如ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和/或CDC(补体依赖性细胞毒性)。举例来说，具有野生型Fc序列的子类IgG1、IgG2和IgG3抗体通常显示补体活化，包括CIq和C3结合，而IgG4不使补体系统活化以及不结合CIq和/或C3。在一些实施方案中，Fc区包含使Fc区对Fc受体的结合亲和力降低的修饰。在一些实施方案中，Fc区是IgG1 Fc。在一些实施方案中，IgG1 Fc在位置233-236中包含一个或多个突变，诸如L234A和/或L235A。在一些实施方案中，Fc区是IgG4 Fc。在一些实施方案中，IgG4 Fc在位置327、330和/或331中包含突变。参见例如Armour KL等,Eur J.Immunol.1999；29:2613；以及Shields RL等,J.Biol.Chem.2001；276:6591。在一些实施方案中，Fc区包含P329G突变。
在一些实施方案中，Fc区包含促进两个不相同重链的异二聚化的修饰。所述经修饰Fc区对于具有不对称设计的本文所述的抗CTLA-4MABP可具有特别重要性。在一些实施方案中，所述修饰是钮入孔修饰，包含在一个重链或重链融合多肽中的钮修饰和在两个重链或重链融合多肽中的另一者中的孔修饰。在一个实施方案中，Fc区在CH3结构域中在两个重链之间的界面内包含修饰，其中i)在一个重链的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基置换，由此在一个重链的CH3结构域中在界面内产生突起(“钮”)，所述突起可位于在另一重链的CH3结构域中在界面内的空腔(“孔”)中，并且ii)在另一重链的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基置换，由此在第二CH3结构域中在界面内产生空腔(“孔”)，在第一CH3结构域中在界面内的突起(“钮”)可位于所述空腔内。钮入孔修饰的实例已例如在US 2011/0287009、US2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431以及Zhu等,1997,Protein Science 6:781-788中描述。本文也涵盖对Fc区的促进异二聚化的其他修饰。举例来说，静电牵引效应可被工程化至Fc区中以提供Fc异二聚体分子(参见例如US4676980以及Brennan等,Science,229:81(1985))。
在一些实施方案中，Fc区包含抑制Fab臂交换的修饰。举例来说，IgG4 Fc中的S228P突变会阻止Fab臂交换。
在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含κ轻链恒定区。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含λ轻链恒定区。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含重链恒定区。
在一些实施方案中，第二抗原结合部分是由两个重链和两个轻链组成的全长抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的单克隆抗体(在本文中也被称为“4链抗体”)。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含由两个重链和两个轻链组成的多特异性(诸如双特异性)全长抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含人IgG1子类全长抗体或具有突变L234A和L235A的人IgG1子类全长抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含人IgG2子类全长抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含人IgG3子类全长抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含人IgG4子类全长抗体或具有额外突变S228P的人IgG4子类全长抗体。
本领域中已知的任何全长4链抗体或由其获得的抗原结合片段都可在抗CTLA-4MABP中用作第二抗原结合部分。具有经证明临床功效、安全性和药物动力学概况的抗体或抗体片段具有特别重要性。在一些实施方案中，在与第一抗原结合部分融合以提供抗CTLA-4MABP之前，本领域中已知的抗体或抗体片段被进一步工程化，诸如人源化或诱变，以选择具有适合亲和力的变体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含本领域中已知的单克隆抗体或抗体片段的VH结构域和VL结构域以及经修饰重链恒定区和/或轻链恒定区。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含本领域中已知的单克隆抗体和经修饰Fc区诸如具有S228P突变的IgG4 Fc。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含人全长抗体或抗体片段、人源化全长抗体或抗体片段、或嵌合全长抗体或抗体片段。
在一些实施方案中，第二抗原结合部分是抗PD-1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是帕母单抗(例如)或尼鲁单抗(例如/>)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQID NO:159的轻链。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链。在一些实施方案中，第二抗原结合部分是抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是阿特珠单抗(例如/>)或度伐鲁单抗(例如IMFINZITM)。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链。
c)示例性抗CTLA-4MABP和BABP
在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP(例如BABP)包含(a)包含本文所述的特异性识别CTLA-4的sdAb的第一抗原结合部分，和(b)包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的第二抗原结合部分，其中所述VH和所述VL一起形成特异性结合PD-1的抗原结合位点，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合，在下文中被称为“CTLA-4×PD-1BABP”或“CTLA-4×PD-1BABP”。在一些实施方案中，抗CTLA-4MABP(例如BABP)包含(a)包含本文所述的特异性识别CTLA-4的sdAb的第一抗原结合部分，和(b)包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的第二抗原结合部分，其中所述VH和所述VL一起形成特异性结合PD-L1的抗原结合位点，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合，在下文中被称为“CTLA-4×PD-L1 BABP”或“CTLA-4×PD-L1 BABP”。
在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4多特异性(诸如双特异性)抗原结合蛋白，其包含：(a)包含特异性识别CTLA-4的sdAb的第一抗原结合部分，所述sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，和(b)包含由两个重链和两个轻链组成的全长抗体(诸如帕母单抗或尼鲁单抗)的第二抗原结合部分，其中所述全长抗体特异性结合PD-1；并且其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链。在一些实施方案中，第一抗原结合部分在两个重链中的一者或各者的N末端、两个轻链中的一者或各者的N末端、Fc区的N末端、两个重链中的一者或各者的C末端、或两个轻链中的一者或各者的C末端融合于第二抗原结合部分。在一些实施方案中，第一抗原结合部分以化学方式融合于第二抗原结合部分。在一些实施方案中，第一抗原结合部分通过肽键或肽接头来融合于第二抗原结合部分。在一些实施方案中，肽接头的长度是至多约30(诸如至多约25、20或15中的任一者)个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头包含氨基酸序列SEQ IDNO:162、163、307或365。在一些实施方案中，第二抗原结合片段包含Fc区，诸如IgG4 Fc。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。
在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4双特异性抗原结合蛋白(BABP)，其包含：(a)从N末端至C末端包含以下各物的第一多肽：VH-CH1-CH2-CH3-抗CTLA-4sdAb；和(b)从N末端至C末端包含以下各物的第二多肽：VL-CL，其中VH和VL形成特异性结合PD-1的抗原结合位点，并且其中所述抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于帕母单抗或尼鲁单抗。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ IDNO:161的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，CH3和抗CTLA-4sdAb通过肽接头诸如包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365的肽接头来彼此融合。在一些实施方案中，CH2结构域和CH3结构域源于IgG4 Fc。在一些实施方案中，CH2结构域和CH3结构域源于IgG1 Fc。在一些实施方案中，抗CTLA-4BABP包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:134、136、138、140、142、144和319-323中的任一者的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:159的第二多肽。在一些实施方案中，抗CTLA-4BABP包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:146、148、150、152、154、156和324-328中的任一者的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:161的第二多肽。在一些实施方案中，抗CTLA-4BABP包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:329-337中的任一者的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:309的第二多肽。在一些实施方案中，CTLA-4×PD-1BABP具有如图41中所示的结构。
在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4双特异性抗原结合蛋白(BABP)，其包含：(a)从N末端至C末端包含以下各物的第一多肽：VH-CH1-CH2-CH3-抗CTLA-4sdAb；和(b)从N末端至C末端包含以下各物的第二多肽：VL-CL，其中VH和VL形成特异性结合PD-L1的抗原结合位点，并且其中所述抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于阿特珠单抗或度伐鲁单抗。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQID NO:198的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，CH3和抗CTLA-4sdAb通过肽接头诸如包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365的肽接头来彼此融合。在一些实施方案中，CH2结构域和CH3结构域源于IgG4 Fc。在一些实施方案中，CH2结构域和CH3结构域源于IgG1 Fc。在一些实施方案中，抗CTLA-4BABP包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:171、173、175、177、179、181和345-349中的任一者的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:196的第二多肽。在一些实施方案中，抗CTLA-4BABP包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:183、185、187、189、191和193中的任一者的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:198的第二多肽。在一些实施方案中，CTLA-4×PD-L1BABP具有如图41中所示的结构。
在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4BABP，其包含：(a)从N末端至C末端包含以下各物的第一多肽：抗CTLA-4sdAb-VH-CH1-CH2-CH3；和(b)从N末端至C末端包含以下各物的第二多肽：VL-CL，其中VH和VL形成特异性结合PD-1的抗原结合位点，并且其中所述抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ IDNO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于帕母单抗或尼鲁单抗。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，VH和抗CTLA-4sdAb通过肽接头诸如包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365的肽接头来彼此融合。在一些实施方案中，CH2结构域和CH3结构域源于IgG4 Fc。在一些实施方案中，CH2结构域和CH3结构域源于IgG1 Fc。在一些实施方案中，抗CTLA-4BABP包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:135、137、139、141、143、145和292-296中的任一者的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:159的第二多肽。在一些实施方案中，抗CTLA-4BABP包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:147、149、151、153、155、157和297-301中的任一者的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:161的第二多肽。在一些实施方案中，抗CTLA-4BABP包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:310-318中的任一者的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQID NO:309的第二多肽。在一些实施方案中，CTLA-4×PD-1BABP具有如图40中所示的结构。
在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4BABP，其包含：(a)从N末端至C末端包含以下各物的第一多肽：抗CTLA-4sdAb-VH-CH1-CH2-CH3；和(b)从N末端至C末端包含以下各物的第二多肽：VL-CL，其中VH和VL形成特异性结合PD-L1的抗原结合位点，并且其中所述抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ IDNO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于阿特珠单抗或度伐鲁单抗。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，VH和抗CTLA-4sdAb通过肽接头诸如包含氨基酸序列SEQ IDNO:162、163、307或365的肽接头来彼此融合。在一些实施方案中，CH2结构域和CH3结构域源于IgG4 Fc。在一些实施方案中，CH2结构域和CH3结构域源于IgG1 Fc。在一些实施方案中，抗CTLA-4BABP包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:172、174、176、178、180、182和302-306中的任一者的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:196的第二多肽。在一些实施方案中，抗CTLA-4BABP包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:184、186、188、190、192和194中的任一者的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:198的第二多肽。在一些实施方案中，CTLA-4×PD-L1 BABP具有如图40中所示的结构。
在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4BABP，其包含：(a)从N末端至C末端包含以下各物的第一多肽：VH-CH1-CH2-CH3；和(b)从N末端至C末端包含以下各物的第二多肽：VL-CL-抗CTLA-4sdAb，其中VH和VL形成特异性结合PD-1的抗原结合位点，并且其中所述抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ IDNO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于帕母单抗或尼鲁单抗。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，CL和抗CTLA-4sdAb通过肽接头诸如包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365的肽接头来彼此融合。在一些实施方案中，CH2结构域和CH3结构域源于IgG4 Fc。在一些实施方案中，CH2结构域和CH3结构域源于IgG1 Fc。在一些实施方案中，抗CTLA-4BABP包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:158的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ IDNO:355的第二多肽。在一些实施方案中，CTLA-4×PD-1BABP具有如图43中所示的结构。
在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4双特异性抗原结合蛋白，其包含：(a)从N末端至C末端包含以下各物的第一多肽：VH-CH1-CH2-CH3；和(b)从N末端至C末端包含以下各物的第二多肽：抗CTLA-4sdAb-VL-CL，其中VH和VL形成特异性结合PD-1的抗原结合位点，并且其中所述抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于帕母单抗或尼鲁单抗。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，VL和抗CTLA-4sdAb通过肽接头诸如包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365的肽接头来彼此融合。在一些实施方案中，CH2结构域和CH3结构域源于IgG4 Fc。在一些实施方案中，CH2结构域和CH3结构域源于IgG1 Fc。在一些实施方案中，抗CTLA-4BABP包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:158的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQID NO:354的第二多肽。在一些实施方案中，CTLA-4×PD-1BABP具有如图42中所示的结构。
在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4双特异性抗原结合蛋白，其包含：(a)从N末端至C末端包含以下各物的第一多肽：抗CTLA-4sdAb-VH-CH1-CH2-CH3；和(b)从N末端至C末端包含以下各物的第二多肽：抗CTLA-4sdAb-VL-CL，其中VH和VL形成特异性结合PD-1的抗原结合位点，并且其中所述抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于帕母单抗或尼鲁单抗。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQID NO:161的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，VL和抗CTLA-4sdAb，和/或VL和抗CTLA-4sdAb，通过肽接头诸如包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365的肽接头来彼此融合。在一些实施方案中，CH2结构域和CH3结构域源于IgG4 Fc。在一些实施方案中，CH2结构域和CH3结构域源于IgG1 Fc。在一些实施方案中，抗CTLA-4BABP包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:356的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:357的第二多肽。在一些实施方案中，CTLA-4×PD-1BABP具有如图44中所示的结构。
在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4双特异性抗原结合蛋白，其包含：(a)从N末端至C末端包含以下各物的第一多肽：抗CTLA-4sdAb1-抗CTLA-4sdAb2-VH-CH1-CH2-CH3；和(b)从N末端至C末端包含以下各物的第二多肽：VL-CL，其中VH和VL形成特异性结合PD-1的抗原结合位点，并且其中所述抗CTLA-4sdAb1和所述抗CTLA-4sdAb2包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb1和抗CTLA-4sdAb2包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb1和抗CTLA-4sdAb2包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于帕母单抗或尼鲁单抗。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb1和抗CTLA-4sdAb2，和/或VH和抗CTLA-4sdAb2，通过肽接头诸如包含氨基酸序列SEQID NO:162、163、307或365的肽接头来彼此融合。在一些实施方案中，CH2结构域和CH3结构域源于IgG4 Fc。在一些实施方案中，CH2结构域和CH3结构域源于IgG1 Fc。在一些实施方案中，抗CTLA-4BABP包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:358的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:159的第二多肽。在一些实施方案中，CTLA-4×PD-1BABP具有如图45中所示的结构。
在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4双特异性抗原结合蛋白，其包含：(a)从N末端至C末端包含以下各物的第一多肽：VH-CH1-抗CTLA-4sdAb-CH2-CH3；和(b)从N末端至C末端包含以下各物的第二多肽：VL-CL，其中VH和VL形成特异性结合PD-1的抗原结合位点，并且其中所述抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于帕母单抗或尼鲁单抗。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，CH1和抗CTLA-4sdAb通过肽接头诸如包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365的肽接头来彼此融合。在一些实施方案中，CH2结构域和CH3结构域源于IgG4 Fc。在一些实施方案中，CH2结构域和CH3结构域源于IgG1 Fc。在一些实施方案中，抗CTLA-4BABP包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:359的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQID NO:159的第二多肽。在一些实施方案中，CTLA-4×PD-1BABP具有如图46中所示的结构。
在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4双特异性抗原结合蛋白，其包含从N末端至C末端包含以下各物的多肽：scFv-抗CTLA-4sdAb-CH2-CH3，其中所述scFv特异性结合PD-1，并且其中所述抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域。在一些实施方案中，scFv源于帕母单抗或尼鲁单抗。在一些实施方案中，scFv源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，scFv源于包含含有氨基酸序列SEQID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，scFv源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，scFv和抗CTLA-4sdAb通过肽接头诸如包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365的肽接头来彼此融合。在一些实施方案中，CH2结构域和CH3结构域源于IgG4 Fc。在一些实施方案中，CH2结构域和CH3结构域源于IgG1 Fc。在一些实施方案中，抗CTLA-4BABP包含两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:360的多肽。在一些实施方案中，CTLA-4×PD-1BABP具有如图47中所示的结构。
在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4双特异性抗原结合蛋白，其包含：(a)从N末端至C末端包含以下各物的第一多肽：VH-CH1-抗CTLA-4sdAb-CH1-CH2-CH3；和(b)从N末端至C末端包含以下各物的第二多肽：VL-CL-抗CTLA-4sdAb-CL，其中VH和VL形成特异性结合PD-1的抗原结合位点，并且其中所述抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于帕母单抗或尼鲁单抗。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，CH1和抗CTLA-4sdAb，和/或CL和抗CTLA-4sdAb，通过肽接头诸如包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365的肽接头来彼此融合。在一些实施方案中，CH2结构域和CH3结构域源于IgG4 Fc。在一些实施方案中，CH2结构域和CH3结构域源于IgG1 Fc。在一些实施方案中，抗CTLA-4BABP包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:361的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:362的第二多肽。在一些实施方案中，CTLA-4×PD-1BABP具有如图48中所示的结构。
在一些实施方案中，提供一种抗CTLA-4双特异性抗原结合蛋白，其包含：(a)从N末端至C末端包含以下各物的第一多肽：scFv-抗CTLA-4sdAb-CH2-CH3；和(b)从N末端至C末端包含以下各物的第二多肽：抗CTLA-4sdAb-CL，其中所述scFv特异性结合PD-1，并且其中所述抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域。在一些实施方案中，scFv源于帕母单抗或尼鲁单抗。在一些实施方案中，scFv源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，scFv源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，scFv源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，scFv和抗CTLA-4sdAb通过肽接头诸如包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365的肽接头来彼此融合。在一些实施方案中，CH2结构域和CH3结构域源于IgG4 Fc。在一些实施方案中，CH2结构域和CH3结构域源于IgG1 Fc。在一些实施方案中，抗CTLA-4BABP包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:363的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:364的第二多肽。在一些实施方案中，CTLA-4×PD-1BABP具有如图49中所示的结构。
在一些实施方案中，也提供一种以与任一本文所述的抗CTLA-4构建体(诸如本文所述的抗CTLA-4sdAb、抗CTLA-4HCAb、包含抗CTLA-4sdAb的多特异性或单特异性抗CTLA-4构建体，例如本文所述的抗CTLA-4/PD-1构建体(例如BABP)或抗CTLA-4/PD-L1构建体(例如BABP))竞争的方式特异性结合CTLA-4的包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分的抗CTLA-4MABP(例如BABP)(在下文中被称为“竞争性抗CTLA-4构建体”)。
(III)抗CTLA-4抗体变体
在一些实施方案中，涵盖本文提供的抗体的氨基酸序列变体。举例来说，可合乎需要的是使抗体的结合亲和力和/或其他生物性质改进。抗体的氨基酸序列变体可通过将适当修饰引入编码所述抗体的核酸序列中或通过肽合成来制备。所述修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基缺失和/或插入和/或取代。可进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构建体，条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合性。
a)取代、插入、缺失和变体
在一些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代性诱变的目标位点包括HVR和FR。保守性取代以标题“优选取代”显示于表2中。更实质性变化以标题“示例性取代”提供于表2中，并且如以下关于氨基酸侧链类别进一步所述。可将氨基酸取代引入目标抗体中，并且筛选具有所需活性例如维持/改进的抗原结合性、降低的免疫原性或改进的ADCC或CDC的产物。
表2.氨基酸取代
氨基酸可根据共同侧链性质加以分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链定向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将必然伴有将这些类别中的一者的成员交换成另一类别。
一种类型的取代性变体涉及取代亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，被选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体将在某些生物性质方面具有改变(例如改进)(例如亲和力增加、免疫原性降低)和/或将具有亲本抗体的大致上得以保留的某些生物性质。一示例性取代性变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文所述的那些来便利地产生。简要来说，使一个或多个HVR残基突变，并且使变异抗体展示在噬菌体上并针对特定生物活性(例如结合亲和力)加以筛选。
可在HVR中进行改变(例如取代)例如以使抗体亲和力改进。可在HVR“热点”(即由在体细胞成熟过程期间在高频率下经受突变的密码子编码的残基)(参见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中进行所述改变，并且测试所得变异VH或VL的结合亲和力。通过构建次级文库以及从所述次级文库进行再选择来达成亲和力成熟已例如在Hoogenboom等,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,(2001))中描述。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易出错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一种来将多样性引入被选择用于成熟的可变基因中。接着产生次级文库。接着筛选文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。用以引入多样性的另一方法涉及HVR定向方法，其中使若干HVR残基(例如一次4-6个残基)随机化。可例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定抗原结合中涉及的HVR残基。特定来说，CDR-H3和CDR-L3常常被靶向。
在一些实施方案中，取代、插入或缺失可发生在一个或多个HVR内，只要所述改变不实质上降低抗体结合抗原的能力即可。举例来说，可在HVR中进行不实质上降低结合亲和力的保守性改变(例如如本文提供的保守性取代)。所述改变可在HVR“热点”或CDR外部。在以上提供的变异VHH序列的一些实施方案中，各HVR未被改变，或含有至多一个、两个或三个氨基酸取代。
一种适用于鉴定抗体的可被靶向来诱变的残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在这个方法中，鉴定某一残基或一组靶标残基(例如带电荷残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并且用中性或带负电荷氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)置换以确定抗体与抗原的相互作用是否受影响。可在对初始取代显示功能性敏感性的氨基酸位置处引入进一步取代。或者或另外，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴定抗体与抗原之间的接触点。所述接触残基和邻近残基可作为取代候选物被靶向或消除。可筛选变体以确定它们是否含有所需性质。
氨基酸序列插入物包括长度在一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的范围内的氨基末端和/或羧基末端融合物，以及具有单一或多个氨基酸残基的序列内插入物。末端插入物的实例包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入性变体包括抗体与酶(例如用于ADEPT)或使抗体的血清半衰期增加的多肽的N末端或C末端融合物。
b)糖基化变体
在一些实施方案中，改变本文提供的抗CTLA-4构建体以使构建体的糖基化程度增加或降低。对抗体添加或缺失糖基化位点可通过改变氨基酸序列以产生或移除一个或多个糖基化位点来便利地实现。
当抗CTLA-4构建体包含Fc区时，可改变与其连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支双触角寡糖，其通常通过N键联来与Fc区的CH2结构域的Asn297连接。参见例如Wright等TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸、以及连接于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的海藻糖。在一些实施方案中，可对本申请的抗CTLA-4构建体中的寡糖进行修饰以产生具有某些改进性质的抗体变体。
在一些实施方案中，提供具有缺乏(直接或间接)连接于Fc区的海藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。举例来说，所述抗体中的海藻糖的量可为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过相对于连接于Asn297的所有糖结构(例如复杂、杂合和高甘露糖结构)的总和(如通过MALDI-TOF质谱测定法所测量)计算在Asn297处的糖链内的海藻糖的平均量来测定海藻糖的量，如例如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中约位置297(Fc区残基的Eu编号)处的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可由于抗体中的微小序列变化而位于位置297的上游或下游约±3个氨基酸处，即在位置294与300之间。所述海藻糖基化变体可具有改进的ADCC功能。参见例如美国专利公布号US 2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去海藻糖基化”或“海藻糖缺乏性”抗体变体相关的公布的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去海藻糖基化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质海藻糖基化作用的Lec13 CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108 A1,Presta,L；以及WO 2004/056312 A1,Adams等,尤其在实施例11处)以及剔除细胞系，诸如α-1,6-海藻糖基转移酶基因FUT8剔除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；以及WO 2003/085107)。
进一步提供具有二等分寡糖的抗CTLA-4构建体变体，例如其中连接于抗体的Fc区的双触角寡糖由GlcNAc二等分。所述抗体变体可具有降低的海藻糖基化和/或改进的ADCC功能。所述抗体变体的实例例如在WO 2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利号6,602,684(Umana等)；以及US 2005/0123546(Umana等)中描述。也提供在连接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。所述抗体变体可具有改进的CDC功能。所述抗体变体例如在WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju,S.)；以及WO 1999/22764(Raju,S.)中描述。
c)Fc区变体
在一些实施方案中，可将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗CTLA-4构建体的Fc区中，由此产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
在一些实施方案中，本申请涵盖具有一些而非所有效应物功能的抗CTLA-4构建体变体，此使得所述抗CTLA-4构建体变体成为合乎各种应用需要的候选物，在所述应用中，抗CTLA-4构建体在体内的半衰期是重要的，但某些效应物功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/耗竭。举例来说，可进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合性(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达概述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中。用以评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中。或者，可采用非放射性测定方法，参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox 非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。适用于所述测定的效应细胞包括外周血液单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者或另外，可在体内，例如在诸如Clynes等Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 95:652-656(1998)中公开的动物模型中评估目标分子的ADCC活性。也可进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q，因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为评估补体活化，可进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等,Blood101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.and M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可使用本领域中已知的方法进行FcRn结合和体内清除率/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.等,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
效应物功能降低的抗体包括Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一者或多者被取代的那些(美国专利号6,737,056)。所述Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两者或更多者处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297被取代成丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了与FcR的结合得以改进或减弱的某些抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312；以及Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体变体包含具有一个或多个使ADCC改进的氨基酸取代(例如在Fc区的位置298、333和/或334(EU残基编号)处的取代)的Fc区。
在一些实施方案中，在Fc区中进行导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即改进或减弱)的改变，例如如美国专利号6,194,551、WO 99/51642以及Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
在一些实施方案中，提供一种包含变异Fc区的抗CTLA-4构建体(例如HCAb)变体，所述变异Fc区包含一个或多个使半衰期增加和/或使与新生儿Fc受体(FcRn)的结合改进的氨基酸取代。半衰期增加以及与负责将母亲IgG转移至胎儿中的新生儿Fc受体(FcRn)(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)以及Kim等,J.Immunol.24:249(1994))的结合改进的抗体描述于US 2005/0014934A1(Hinton等)中。那些抗体包含其中具有一个或多个使Fc区与FcRn的结合改进的取代的Fc区。所述Fc变体包括在以下一个或多个Fc区残基处具有取代的那些：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如对Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。
也参见涉及Fc区变体的其他实例的Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及WO 94/29351。
涵盖包含任何本文所述的Fc变体或其组合的抗CTLA-4构建体(诸如本文所述的HCAb、融合于全长抗体的抗CTLA-4sdAb、或抗CTLA-4MABP/BABP)。
d)经半胱氨酸工程化的抗体变体
在一些实施方案中，可合乎需要的是产生经半胱氨酸工程化的抗CTLA-4构建体，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施方案中，经取代残基存在于抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此位于抗体的可及位点处，并且可用于使抗体缀合于其他部分诸如药物部分或接头-药物部分以产生免疫缀合物，如本文进一步所述。在一些实施方案中，任何一个或多个以下残基可被半胱氨酸取代：重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。可如例如在美国专利号7,521,541中所述产生经半胱氨酸工程化的抗CTLA-4构建体。
e)抗体衍生物
在一些实施方案中，本文提供的抗CTLA-4构建体可被进一步修饰来包含本领域中已知以及可易于获得的额外非蛋白质部分。适于使抗体衍生的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧杂环戊烷、聚1,3,6-三噁烷、乙烯/顺丁烯二酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、以及右旋糖酐或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚合物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于它在水中的稳定性而可具有制造优势。聚合物可具有任何分子量，且可为分支的或未分支的。连接于抗体的聚合物的数目可变化，并且如果连接超过一个聚合物，那么它们可为相同或不同分子。一般来说，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可基于包括但不限于以下的考虑事项加以确定：待改进的抗体的特定性质或功能、抗体衍生物是否将在确定条件下用于疗法中，等。
在一些实施方案中，提供抗CTLA-4构建体与可通过暴露于辐射加以选择性加热的非蛋白质部分的缀合物。在一些实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可具有任何波长，并且包括但不限于不伤害普通细胞，但会将非蛋白质部分加热至邻近于抗体-非蛋白质部分的细胞被杀灭所处的温度的波长。
在一些实施方案中，本文提供的抗CTLA-4构建体(诸如抗CTLA-4sdAb、抗CTLA-4HCAb、抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体、抗CTLA-4/PD-L1双特异性抗体、或抗CTLA-4MABP(例如BABP))可被进一步修饰来包含一个或多个生物活性蛋白、多肽或其片段。如本文可互换使用的“生物活性”或“具有生物活性”意指在身体内显示用以执行特定功能的生物活性。举例来说，这可意指与特定生物分子诸如蛋白质、DNA等组合，接着促进或抑制所述生物分子的活性。在一些实施方案中，生物活性蛋白质或其片段包括作为活性药物物质向患者施用以预防或治疗疾病或病状的蛋白质和多肽，以及用于诊断目的的蛋白质和多肽，诸如用于诊断测试或体外测定中的酶，以及向患者施用以预防疾病的蛋白质和多肽，诸如疫苗。在一些实施方案中，生物活性蛋白质或其片段具有免疫刺激/免疫调控活性、膜转运活性或酶活性。在一些实施方案中，生物活性蛋白质、多肽或其片段是酶、激素、生长因子、细胞因子或其混合物。在一些实施方案中，生物活性蛋白质、多肽或片段可特异性识别靶标肽(诸如抗原或其他蛋白质)。
在一些实施方案中，可包含在本文所述的抗CTLA-4构建体内的生物活性蛋白质或其片段是蛋白质结合蛋白。在一些实施方案中，可包含在本文所述的抗CTLA-4构建体内的生物活性蛋白质或其片段是抗体模拟物，其是使人联想起抗体的包含抗原结合结构域的小型工程化蛋白质(Geering和Fussenegger,Trends Biotechnol.,33(2):65-79,2015)。这些分子源于现有人骨架蛋白质，并且包含单一多肽。可包含在本文所述的抗CTLA-4构建体内的示例性抗体模拟物可为但不限于经设计锚蛋白重复蛋白(DARPin；包含3-5个由N末端和C末端帽结构域侧接的完全合成锚蛋白重复)、亲合力多聚体(亲合多聚体(avimer)；包含多个A结构域的高亲和力蛋白质，各结构域对靶标具有低亲和力)或抗运载蛋白(基于载脂蛋白的骨架，具有四个可及环，各自的序列可加以随机化)。在一些实施方案中，可包含在本文所述的抗CTLA-4构建体内的生物活性蛋白质或其片段是犰狳(Armadillo)重复蛋白(例如β-连环蛋白(β-catenin)、α-输入蛋白(α-importin)、盘状球蛋白(plakoglobin)、腺瘤性结肠息肉病(APC)蛋白)，其包含犰狳蛋白重复单元(长度是约40个残基的特征性重复氨基酸序列)。各犰狳蛋白重复由形成发夹结构的一对α螺旋组成。多个拷贝的重复形成称为α螺线管结构的结构。依赖于在不需要特定保守侧链或与肽的游离N末端或C末端的相互作用下结合肽骨架的恒定方式，犰狳重复蛋白能够结合不同类型的肽。逐个残基地对肽进行识别的可能性与重复蛋白的固有模块性组合使得犰狳重复蛋白成为用于设计通用肽结合骨架的有前景的候选物。
在一些实施方案中，可包含在本文所述的抗CTLA-4构建体内的生物活性蛋白质或其片段是与特定细胞受体相互作用的配体，诸如淋巴因子和细胞因子。淋巴因子是在抗原或凝集素刺激T细胞生长时由T细胞分泌的低分子量蛋白质。
III.药物组合物
本申请进一步提供药物组合物，其包含任一包含如本文所述的特异性识别CTLA-4的sdAb的抗CTLA-4构建体(诸如抗CTLA-4sdAb、抗CTLA-4HCAb、抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体(例如CTLA-4×PD-1BABP)或抗CTLA-4/PD-L1双特异性抗体(例如CTLA-4×PD-L1BABP))，并且任选包含药学上可接受的载体。药物组合物可通过使具有所需纯度的本文所述的抗CTLA-4构建体与任选药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington'sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))混合来以冻干制剂或水溶液形式制备。
药物组合物优选将是稳定的，其中包含此处所述的抗CTLA-4sdAb的抗CTLA-4构建体在储存后基本上保留它的物理和化学稳定性以及完整性。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本领域中是可用的，并且综述于Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee编,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)以及Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)中。可在所选温度下持续所选时期测量稳定性。对于快速筛选，可使制剂在40℃下保持2周至1个月，此时测量稳定性。当制剂将在2-8℃下储存时，通常制剂应在30℃或40℃下稳定至少1个月，和/或在2-8℃下稳定至少2年。当制剂将在30℃下储存时，通常制剂应在30℃下稳定至少2年，和/或在40℃下稳定至少6个月。举例来说，在储存期间的聚集程度可用作蛋白质稳定性的指标。在一些实施方案中，本文所述的抗CTLA-4构建体的稳定制剂可包含小于约10％(优选小于约5％)的以聚集物形式存在于制剂中的抗CTLA-4构建体。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下应对接受者无毒，并且包括缓冲剂、抗氧化剂，包括抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E、焦亚硫酸钠；防腐剂、等张调节剂(例如氯化钠)、稳定剂、金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；螯合剂诸如EDTA和/或非离子表面活性剂。
生理上可接受的载体的实例包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六羟季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，诸如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
缓冲剂用于将pH控制在使治疗有效性最优化的范围内，尤其是如果稳定性依赖于pH。缓冲剂优选在约50mM至约250mM的范围内的浓度下存在。适用于本申请中的缓冲剂包括有机酸与无机酸两者及其盐。举例来说，柠檬酸盐、磷酸盐、丁二酸盐、酒石酸盐、反丁烯二酸盐、葡萄糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、乙酸盐。另外，缓冲剂可包括组氨酸和三甲胺盐诸如Tris。
防腐剂被添加来延缓微生物生长，并且通常在0.2％-1.0％(w/v)的范围内存在。添加防腐剂可例如有助于产生多次使用(多次剂量)制剂。适用于本申请中的防腐剂包括十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六羟季铵；苯扎卤铵(例如苯扎氯铵、苯扎溴铵、苯扎碘铵)、苄索氯铵；硫柳汞、苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇、3-戊醇和间甲酚。
存在张力剂(有时称为“稳定剂”)以调整或维持组合物中的液体张力。当与大型带电荷生物分子诸如蛋白质和抗体一起使用时，它们常常被称为“稳定剂”，因为它们可与氨基酸侧链的带电荷基团相互作用，由此使分子间和分子内相互作用的潜力减小。在考虑其他成分的相对量的情况下，以重量计，张力剂可以在0.1％至25％，优选在1％至5％之间的任何量存在。优选张力剂包括多羟基糖醇，优选是三羟基或更高级糖醇，诸如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
额外赋形剂包括可充当以下中的一者或多者的试剂：(1)增积剂，(2)溶解增强剂，(3)稳定剂和(4)防止变性或粘附于容器壁的试剂。所述赋形剂包括：多羟基糖醇(以上列举)；氨基酸，诸如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，诸如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌肉肌糖、肌肉肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环醇(例如肌醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，诸如脲、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，诸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其他免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；单糖(例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖)；二糖(例如乳糖、麦芽糖、蔗糖)；三糖，诸如棉子糖；以及多糖，诸如糊精或右旋糖酐。
存在非离子表面活性剂或清洁剂(也称为“湿润剂”)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白质对抗搅拌诱导的聚集，其也容许制剂暴露于剪切表面应力而不导致活性治疗性蛋白质或抗体的变性。非离子表面活性剂在约0.05mg/ml至约1.0mg/ml，优选在约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围内存在。
适合非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)、泊洛沙姆(184、188等)、多元醇、/>聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(/>-20、-80等)、聚桂醇400、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、甘油单硬脂酸酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。可使用的阴离子清洁剂包括月桂基硫酸钠、丁二酸二辛酯磺酸钠和磺酸钠二辛酯。阳离子清洁剂包括苯扎氯铵或苄索氯铵。
为使药物组合物用于体内施用，它们必须是无菌的。药物组合物可通过经无菌过滤膜过滤来致使无菌。本文药物组合物通常被放置至具有无菌入口的容器中，所述容器例如是具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
施用途径根据已知和接受的方法，诸如通过以适合方式进行单次或多次团注或历经长久时期输注，例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、病变内或关节内途径来注射或输注；经表面施用、吸入或采用持续释放或延长释放手段。在一些实施方案中，药物组合物局部施用，诸如在肿瘤内施用。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合实例包括固体疏水性聚合物的半渗透性基质含有拮抗剂，所述基质呈成形物品例如薄膜或微囊形式。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、非可降解乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)组成的可注射微球体)、以及聚D-(-)-3-羟基丁酸。
本文药物组合物也可含有超过一种如为所治疗的特定适应症所必需的活性化合物，优选是不不利地影响彼此的具有补充活性的那些。或者或此外，组合物可包含细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂或生长抑制剂。所述分子适合以对于预定目的有效的量存在于组合中。
活性成分也可被包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中，胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中，或巨乳液中。所述技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第18版中。
在一些实施方案中，药物组合物含于单次使用小瓶诸如单次使用密封小瓶中。在一些实施方案中，药物组合物含于多次使用小瓶中。在一些实施方案中，药物组合物以散装含于容器中。在一些实施方案中，药物组合物被低温保存。
IV.治疗CTLA-4相关疾病的方法
包含如本文所述的特异性识别CTLA-4的sdAb的抗CTLA-4构建体(诸如抗CTLA-4sdAb、抗CTLA-4HCAb、抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体(例如CTLA-4×PD-1BABP)或抗CTLA-4/PD-L1双特异性抗体(例如CTLA-4×PD-L1BABP))及其组合物(诸如药物组合物)适用于多种应用，诸如适用于诊断、分子测定和疗法中。
本发明的一个方面提供一种治疗有需要的个体的CTLA-4相关疾病或病状的方法，其包括向所述个体施用有效量的包含本文所述的抗CTLA-4构建体的药物组合物。在一些实施方案中，CTLA-4相关疾病是癌症。在一些实施方案中，CTLA-4相关疾病是病原性感染，诸如病毒性感染。
本发明部分地涵盖可单独或以与另一疗法的任何组合，以及在至少一些方面连同药学上可接受的载体或赋形剂一起施用的蛋白质构建体(诸如抗CTLA-4sdAb、抗CTLA-4HCAb、抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体(例如CTLA-4×PD-1BABP)或抗CTLA-4/PD-L1双特异性抗体(例如CTLA-4×PD-L1 BABP))、编码其的核酸分子和/或载体、包含编码其的核酸分子和/或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，在施用抗CTLA-4构建体之前，它们可与本领域中熟知的适合药物载体和赋形剂组合。根据本公开制备的组合物可用于治疗癌症或延迟癌症的恶化。
在一些实施方案中，提供一种治疗癌症的方法，其包括向个体施用有效量的包含以下各物的药物组合物：包含特异性识别CTLA-4的单结构域抗体(sdAb)部分的经分离的抗CTLA-4构建体(诸如抗CTLA-4sdAb、抗CTLA-4HCAb、抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体(例如CTLA-4×PD-1BABP)或抗CTLA-4/PD-L1双特异性抗体(例如CTLA-4×PD-L1 BABP))，其中所述sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；以及任选地，药物可接受载体。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。在一些实施方案中，癌症是实体肿瘤(诸如结肠癌)。在一些实施方案中，药物组合物全身(诸如静脉内或腹膜内)施用。在一些实施方案中，药物组合物局部(诸如肿瘤内)施用。在一些实施方案中，方法进一步包括向个体施用额外癌症疗法(诸如手术、放射、化学疗法、免疫疗法、激素疗法或其组合)。在一些实施方案中，个体是人。在一些实施方案中，治疗癌症的方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀灭癌细胞(包括旁邻杀灭)；(2)抑制癌细胞的增殖；(3)在肿瘤中诱导免疫应答；(4)降低肿瘤尺寸；(5)减轻患有癌症的个体的一种或多种症状；(6)抑制肿瘤转移；(7)延长存活期；(8)延长达到癌症进展的时间；和(9)预防、抑制或降低癌症复发的可能性。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的杀灭癌细胞的方法可实现至少约40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更大中的任一者的肿瘤细胞死亡率。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的杀灭癌细胞的方法可实现至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更大中的任一者的旁邻肿瘤细胞(未由溶瘤性VV感染)死亡率。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的降低肿瘤尺寸的方法可使肿瘤尺寸降低至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者)。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的抑制肿瘤转移的方法可使转移抑制至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者)。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的延长个体(诸如人)的存活期的方法可使所述个体的存活期延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月中的任一者。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的延长达到癌症进展的时间的方法可使达到癌症进展的时间延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周中的任一者。
本文所述的方法适于治疗多种癌症，包括实体癌症与液体癌症两者。方法可应用于所有时期的癌症，包括早期癌症、非转移性癌症、原发性癌症、晚期癌症、局部晚期癌症、转移性癌症或处于缓解状态下的癌症。本文所述的方法可在辅助环境或新辅助环境(即方法可在初级/确定性疗法之前执行)下用作第一疗法、第二疗法、第三疗法或与本领域中已知的其他类型的癌症疗法的组合疗法，所述其他类型的癌症疗法诸如化学疗法、手术、激素疗法、放射、基因疗法、免疫疗法(诸如T细胞疗法)、骨髓移植、干细胞移植、靶向疗法、冷冻疗法、超声疗法、光动力疗法、射频消除等。在一些实施方案中，方法用于治疗先前已被治疗的个体。在一些实施方案中，癌症已为先前疗法所难治。在一些实施方案中，方法用于治疗先前尚未被治疗的个体。
在一些实施方案中，方法适于治疗具有异常CTLA-4表达、活性和/或信号传导的癌症，非限制性地举例来说包括黑素瘤、前列腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌和胶质母细胞瘤。
因此，在一些实施方案中，提供一种治疗免疫疗法响应性实体肿瘤(诸如癌瘤或腺癌，诸如具有异常CTLA-4表达、活性和/或信号传导的癌症)的方法，其包括向个体施用有效量的包含以下各物的药物组合物：包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分的经分离的抗CTLA-4构建体(诸如抗CTLA-4sdAb、抗CTLA-4HCAb、抗CTLA-4/PD-1双特异性抗体(例如CTLA-4×PD-1BABP)或抗CTLA-4/PD-L1双特异性抗体(例如CTLA-4×PD-L1 BABP))，其中所述sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；以及任选地，药物可接受载体。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。在一些实施方案中，癌症是实体肿瘤(诸如结肠癌)。在一些实施方案中，药物组合物全身(诸如静脉内或腹膜内)施用。在一些实施方案中，药物组合物局部(诸如肿瘤内)施用。在一些实施方案中，方法进一步包括向个体施用额外癌症疗法(诸如手术、放射、化学疗法、免疫疗法、激素疗法或其组合)。在一些实施方案中，个体是人。在一些实施方案中，治疗癌症的方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀灭癌细胞(包括旁邻杀灭)；(2)抑制癌细胞的增殖；(3)在肿瘤中诱导免疫应答；(4)降低肿瘤尺寸；(5)减轻患有癌症的个体的一种或多种症状；(6)抑制肿瘤转移；(7)延长存活期；(8)延长达到癌症进展的时间；和(9)预防、抑制或降低癌症复发的可能性。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的杀灭癌细胞的方法可实现至少约40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更大中的任一者的肿瘤细胞死亡率。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的杀灭癌细胞的方法可实现至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更大中的任一者的旁邻肿瘤细胞(未由溶瘤性VV感染)死亡率。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的降低肿瘤尺寸的方法可使肿瘤尺寸降低至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者)。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的抑制肿瘤转移的方法可使转移抑制至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者)。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的延长个体(诸如人)的存活期的方法可使所述个体的存活期延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月中的任一者。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的延长达到癌症进展的时间的方法可使达到癌症进展的时间延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周中的任一者。
在一些实施方案中，方法适于治疗具有异常PD-1或PD-L1/PD-L2表达、活性和/或信号传导的癌症，非限制性地举例来说包括血液癌症和/或实体肿瘤。其生长可使用本发明抗体来抑制的一些癌症包括通常对免疫疗法起响应的癌症。用于治疗的其他癌症的非限制性实例包括黑素瘤(例如转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、乳腺癌、结肠癌和肺癌(例如非小细胞肺癌)。另外，本发明包括其生长可使用本发明抗体来抑制的难治性或复发性恶性肿瘤。可使用本发明抗体来治疗的其他癌症的实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童期实体肿瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的那些)以及所述癌症的组合。本发明也适用于治疗转移性癌症，尤其是表达PD-L1的转移性癌症(Iwai等(2005)Int.Immunol.17:133-144)。
因此，在一些实施方案中，提供一种治疗免疫疗法响应性实体肿瘤(诸如癌瘤或腺癌，诸如具有异常CTLA-4表达、活性和/或信号传导和/或异常PD-1/PD-L1表达、活性和/或信号传导的癌症)的方法，其包括向个体施用有效量的包含抗CTLA-4构建体(例如MABP或BABP)的药物组合物，所述抗CTLA-4构建体包含：(a)包含抗CTLA-4sdAb部分的第一抗原结合部分，所述抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，和(b)包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的第二抗原结合部分，其中所述VH和所述VL一起形成特异性结合PD-1的抗原结合位点，其中所述第一抗原结合部分在重链的N末端、轻链的N末端、Fc区的N末端、重链的C末端或轻链的C末端融合于所述第二抗原结合部分。在一些实施方案中，第二抗原结合部分是抗PD-1全长4链抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于帕母单抗或尼鲁单抗。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ IDNO:159的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含Fab。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含scFv。在一些实施方案中，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分通过肽接头诸如包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365的肽接头来融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含Fc片段(例如源于IgG4或IgG1)。在一些实施方案中，提供一种治疗免疫疗法响应性实体肿瘤(诸如癌瘤或腺癌，诸如具有异常CTLA-4表达、活性和/或信号传导和/或异常PD-1/PD-L1表达、活性和/或信号传导的癌症)的方法，其包括向个体施用有效量的包含以下各物的药物组合物：包含特异性识别CTLA-4的单结构域抗体(sdAb)部分的经分离的抗CTLA-4构建体融合于PD-1全长抗体，其中所述sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ IDNO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；以及任选地，药物可接受载体。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10-8M至约10-12M)。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个重链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个重链的N末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个轻链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个轻链的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个抗CTLA-4sdAb，其中各抗CTLA-4sdAb的C末端融合于全长抗体的各链的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个抗CTLA-4sdAb，其中两个抗CTLA-4sdAb融合在一起，其进一步融合于全长抗体的各重链的N末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分和第二抗体部分(例如全长抗体)任选由肽接头(诸如包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365的肽接头)连接。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQID NO:134-145、292-296、319-323、358和359中的任一者的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:159的第二多肽。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:158的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:354或355的第二多肽。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:356的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:357的第二多肽。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:361的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:362的第二多肽。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:363的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:364的第二多肽。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:360的多肽。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:146-157、297-301和324-328中的任一者的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:161的第二多肽。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:310-318和329-337中的任一者的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:309的第二多肽。在一些实施方案中，癌症是实体肿瘤(诸如结肠癌)。在一些实施方案中，药物组合物全身(诸如静脉内或腹膜内)施用。在一些实施方案中，药物组合物局部(诸如肿瘤内)施用。在一些实施方案中，方法进一步包括向个体施用额外癌症疗法(诸如手术、放射、化学疗法、免疫疗法、激素疗法或其组合)。在一些实施方案中，个体是人。在一些实施方案中，治疗癌症的方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀灭癌细胞(包括旁邻杀灭)；(2)抑制癌细胞的增殖；(3)在肿瘤中诱导免疫应答；(4)降低肿瘤尺寸；(5)减轻患有癌症的个体的一种或多种症状；(6)抑制肿瘤转移；(7)延长存活期；(8)延长达到癌症进展的时间；和(9)预防、抑制或降低癌症复发的可能性。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的杀灭癌细胞的方法可实现至少约40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更大中的任一者的肿瘤细胞死亡率。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的杀灭癌细胞的方法可实现至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更大中的任一者的旁邻肿瘤细胞(未由溶瘤性VV感染)死亡率。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的降低肿瘤尺寸的方法可使肿瘤尺寸降低至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者)。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的抑制肿瘤转移的方法可使转移抑制至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者)。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的延长个体(诸如人)的存活期的方法可使所述个体的存活期延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月中的任一者。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的延长达到癌症进展的时间的方法可使达到癌症进展的时间延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周中的任一者。
在一些实施方案中，提供一种治疗免疫疗法响应性实体肿瘤(诸如癌瘤或腺癌，诸如具有异常CTLA-4表达、活性和/或信号传导和/或异常PD-1/PD-L1表达、活性和/或信号传导的癌症)的方法，其包括向个体施用有效量的包含抗CTLA-4构建体(例如MABP或BABP)的药物组合物，所述抗CTLA-4构建体包含：(a)包含抗CTLA-4sdAb部分的第一抗原结合部分，所述抗CTLA-4sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体，和(b)包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的第二抗原结合部分，其中所述VH和所述VL一起形成特异性结合PD-L1的抗原结合位点，其中所述第一抗原结合部分在重链的N末端、轻链的N末端、Fc区的N末端、重链的C末端或轻链的C末端融合于所述第二抗原结合部分。在一些实施方案中，第二抗原结合部分是抗PD-L1全长4链抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于阿特珠单抗或度伐鲁单抗。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域源于包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链的全长抗体。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含Fab。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含scFv。在一些实施方案中，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分(例如全长抗体)通过肽接头诸如包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365的肽接头来融合。在一些实施方案中，第二抗原结合部分包含Fc片段(例如源于IgG4或IgG1)。在一些实施方案中，提供一种治疗免疫疗法响应性实体肿瘤(诸如癌瘤或腺癌，诸如具有异常CTLA-4表达、活性和/或信号传导和/或异常PD-1/PD-L1表达、活性和/或信号传导的癌症)的方法，其包括向个体施用有效量的包含以下各物的药物组合物：包含特异性识别CTLA-4的单结构域抗体(sdAb)部分的经分离的抗CTLA-4构建体融合于PD-L1全长抗体，其中所述sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17-32和213-222中的任一者的CDR1或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；包含氨基酸序列SEQ ID NO:49-64、233-242和339中的任一者的CDR2或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:81-96和253-262中的任一者的CDR3或其包含多达约3(诸如约1、2或3中的任一者)个氨基酸取代的变体；以及任选地，药物可接受载体。在一些实施方案中，抗CTLA-4sdAb部分与CTLA-4之间的结合的Kd是约10-5M至约10-12M(诸如约10-7M至约10-12M、或约10- 8M至约10-12M)。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链。在一些实施方案中，全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分是骆驼科动物sdAb部分、嵌合sdAb部分、人sdAb部分、部分人源化sdAb部分或完全人源化sdAb部分。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个重链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个重链的N末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的N末端融合于全长抗体的至少一个轻链的C末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于全长抗体的至少一个轻链的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个抗CTLA-4sdAb，其中各抗CTLA-4sdAb的C末端融合于全长抗体的各链的N末端。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含四个抗CTLA-4sdAb，其中两个抗CTLA-4sdAb融合在一起，其进一步融合于全长抗体的各重链的N末端。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:113-129、200-202、274-282、341-344、352和353中的任一者的VHH结构域。在一些实施方案中，特异性识别CTLA-4的sdAb部分和第二抗体部分(例如全长抗体)任选由肽接头(诸如包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365的肽接头)连接。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:171-182、302-306和345-349中的任一者的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:196的第二多肽。在一些实施方案中，抗CTLA-4构建体包含(a)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:183-194中的任一者的第一多肽，和(b)两个相同拷贝的包含氨基酸序列SEQ ID NO:198的第二多肽。在一些实施方案中，癌症是实体肿瘤(诸如结肠癌)。在一些实施方案中，药物组合物全身(诸如静脉内或腹膜内)施用。在一些实施方案中，药物组合物局部(诸如肿瘤内)施用。在一些实施方案中，方法进一步包括向个体施用额外癌症疗法(诸如手术、放射、化学疗法、免疫疗法、激素疗法或其组合)。在一些实施方案中，个体是人。在一些实施方案中，治疗癌症的方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀灭癌细胞(包括旁邻杀灭)；(2)抑制癌细胞的增殖；(3)在肿瘤中诱导免疫应答；(4)降低肿瘤尺寸；(5)减轻患有癌症的个体的一种或多种症状；(6)抑制肿瘤转移；(7)延长存活期；(8)延长达到癌症进展的时间；和(9)预防、抑制或降低癌症复发的可能性。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的杀灭癌细胞的方法可实现至少约40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更大中的任一者的肿瘤细胞死亡率。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的杀灭癌细胞的方法可实现至少约10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,95％或更大中的任一者的旁邻肿瘤细胞(未由溶瘤性VV感染)死亡率。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的降低肿瘤尺寸的方法可使肿瘤尺寸降低至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者)。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的抑制肿瘤转移的方法可使转移抑制至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者)。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的延长个体(诸如人)的存活期的方法可使所述个体的存活期延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月中的任一者。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的延长达到癌症进展的时间的方法可使达到癌症进展的时间延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周中的任一者。
在一些实施方案中，本文所述的方法适于治疗结肠直肠癌诸如腺癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠基质肿瘤、平滑肌肉瘤、黑素瘤或鳞状细胞癌。
本申请的药物组合物的剂量和所需药物浓度可视设想的特定用途而变化。确定适当剂量或施用途径完全属于普通技术人员的技能。动物实验为确定用于人疗法的有效剂量提供可靠指导。物种间缩放有效剂量可遵循由Mordenti,J.和Chappell,W.“The Use ofInterspecies Scaling in Toxicokinetics,”Toxicokinetics and New DrugDevelopment,Yacobi等编,Pergamon Press,New York 1989,第42-46页制定的原则来进行。
当使用体内施用包含本文所述的抗CTLA-4sdAb部分的抗CTLA-4构建体时，视施用途径而定，正常剂量可从每天每kg哺乳动物体重约10ng直至约100mg或更大，优选从约1mg/kg/天至10mg/kg/天变化，诸如约1-3mg/kg/天、约2-4mg/kg/天、约3-5mg/kg/天、约4-6mg/kg/天、约5-7mg/kg/天、约6-8mg/kg/天、约6-6.5mg/kg/天、约6.5-7mg/kg/天、约7-9mg/kg/天、或约8-10mg/kg/天。在本申请的范围内的是不同制剂将有效用于不同治疗和不同病症，并且意图治疗特定器官或组织的施用可能使得必须以与针对另一器官或组织的方式不同的方式进行递送。此外，剂量可通过一次或多次单独施用或通过连续输注来施用。对于历经数天或更久的重复施用，视情况而定，持续治疗直至发生对疾病症状的所需抑制。然而，其他剂量方案可能适用。这个疗法的进展易于通过常规技术和测定来监测。
在一些实施方案中，单次(例如团式注射)施用药物组合物。在一些实施方案中，多次(诸如2、3、4、5、6次或更多次中的任一者)施用药物组合物。如果多次施用，那么它们可通过相同或不同途径来进行，并且可发生在相同部位处或在替代性部位处。药物组合物可每周两次、每周3次、每周4次、每周5次、每日、每日不间断、每周一次、每周不间断、每2周一次、每3周一次、每个月一次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次、每6个月一次、每7个月一次、每8个月一次、每9个月一次、每10个月一次、每11个月一次、或每年一次加以施用。施用之间的间隔可为约24小时至48小时、2天至3天、3天至5天、5天至1周、1周至2周、2周至1个月、1个月至2个月、2个月至3个月、3个月至6个月、或6个月至1年中的任一者。间隔也可为不定期的(例如在肿瘤进展之后)。在一些实施方案中，在给药时程中不存在间断。在一些实施方案中，每4天施用药物组合物，持续4次。用于特定患者的最优剂量和治疗方案可易于由医学领域技术人员通过监测所述患者的疾病征象以及相应地调整治疗来确定。
根据已知方法，诸如以团注形式静脉内施用或通过历经一段时期连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、静脉内(i.v.)、关节内、滑膜内、鞘内、口服、经表面或吸入途径，向需要用本文所述的抗CTLA-4构建体治疗的个体(优选是人)施用本申请的药物组合物，包括但不限于复原制剂和液体制剂。复原制剂可通过将本文所述的冻干抗CTLA-4构建体溶解于稀释剂中以使蛋白质彻底分散来制备。适用于本申请中的示例性药学上可接受的(对于向人施用是安全的和无毒的)稀释剂包括但不限于无菌水、抑菌性注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液、或盐和/或缓冲剂的水溶液。
在一些实施方案中，通过皮下(即在皮肤下)施用来向个体施用药物组合物。出于所述目的，可使用注射器注射药物组合物。然而，用于施用药物组合物的其他装置是可用的，诸如注射装置；注射笔；自动注射器装置、无针装置；和皮下贴片递送系统。
在一些实施方案中，以静脉内方式向个体施用药物组合物。在一些实施方案中，通过输注诸如静脉内输注来向个体施用药物组合物。用于免疫疗法的输注技术在本领域中是已知的(参见例如Rosenberg等,New Eng.J.of Med.319:1676(1988))。
V.制备方法
本文所述的抗CTLA-4构建体(诸如抗CTLA-4单结构域抗体)可使用本领域中已知或如本文所述的任何方法来制备。也参见实施例1-4、6和8。
已描述制备单结构域抗体的方法。参见例如Els Pardon等,Nature Protocol,2014；9(3):674。单结构域抗体(诸如VHH)可使用本领域中已知的方法来获得，诸如通过使骆驼科动物物种(诸如骆驼或美洲驼)免疫以及由其获得杂交瘤，或通过使用本领域中已知的分子生物学技术来克隆单结构域抗体的文库以及随后通过用未经选择文库的个别克隆进行ELISA或通过使用噬菌体展示加以选择。
对于重组产生单结构域抗体，分离编码单结构域抗体的核酸，并且将其插入可复制载体中以进行进一步克隆(扩增DNA)或以进行表达。使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，易于分离和测序编码单结构域抗体的DNA。许多载体是可用的。对载体的选择部分地取决于待使用的宿主细胞。通常，优选宿主细胞具有原核或真核(通常是哺乳动物)来源。
1.在原核细胞中重组产生
a)载体构建
编码本申请的抗体的多核酸序列可使用标准重组技术来获得。可从抗体产生性细胞诸如杂交瘤细胞分离和测序所需多核酸序列。或者，可使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦获得，就将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制以及表达异源性多核苷酸的重组载体中。本领域中可用和已知的许多载体可出于本发明的目的加以使用。对适当载体的选择将主要取决于待插入所述载体中的核酸的大小和待用所述载体转化的特定宿主细胞。视它的功能(扩增异源性多核苷酸或表达异源性多核苷酸或两者)以及它与它所驻留于其中的特定宿主细胞的相容性而定，各载体含有各种组分。载体组分通常包括但不限于：复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源性核酸插入物和转录终止序列。
一般来说，含有源于可与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主关联使用。载体通常携带复制位点以及能够提供在经转化细胞中进行表型选择的标记序列。举例来说，通常使用源于大肠埃希氏菌物种的质粒pBR322转化大肠埃希氏菌。pBR322含有编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，因此提供用于鉴定经转化细胞的容易手段。pBR322、它的衍生物或其他微生物质粒或噬菌体也可含有或被修饰来含有可由微生物生物体用于表达内源性蛋白质的启动子。用于表达特定抗体的pBR322衍生物的实例详细描述于Carter等,美国专利号5,648,237中。
此外，含有可与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可作为转化载体与这些宿主关联使用。举例来说，诸如GEMTM-11的噬菌体可用于制备可用于转化易感性宿主细胞诸如大肠埃希氏菌LE392的重组载体。
本申请的表达载体可包含两对或更多对编码各多肽组分的启动子-顺反子。启动子是位于顺反子的上游(5')的调节它的表达的非翻译调控序列。原核启动子通常属于两个类别，即诱导型和组成型。诱导型启动子是应答于培养条件变化例如存在或不存在营养物或温度变化来引发在它的控制下的顺反子的转录水平增加的启动子。
许多由多种潜在宿主细胞识别的启动子是熟知的。所选启动子可通过以下方式来可操作地连接于编码轻链或重链的顺反子DNA：通过限制酶消化来从来源DNA移除启动子，以及将经分离的启动子序列插入本申请的载体中。天然启动子序列与许多异源性启动子两者均可用于指导靶标基因的扩增和/或表达。在一些实施方案中，利用异源性启动子，因为相较于天然靶标多肽启动子，它们通常容许所表达靶标基因达成更大转录和更高产率。
适于与原核宿主一起使用的启动子包括PhoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子诸如tac或trc启动子。然而，在细菌中具有功能性的其他启动子(诸如其他已知细菌或噬菌体启动子)也是适合的。它们的核酸序列已被公布，由此使得熟练工作者能够使用用以提供任何所需限制位点的接头或衔接子来可操作地使它们连接于编码靶标轻链和重链的顺反子(Siebenlist等(1980)Cell 20:269)。
在一个方面，重组载体内的各顺反子包含引导所表达多肽跨膜进行易位的分泌信号序列组分。一般来说，信号序列可为载体的组分，或它可为插入载体中的靶标多肽DNA的一部分。出于本发明的目的加以选择的信号序列应是由宿主细胞识别和加工(即由信号肽酶裂解)的信号序列。对于不识别和加工为异源性多肽所天然具有的信号序列的原核宿主细胞，信号序列用例如选自由碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定肠毒素II(STII)前导物、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP组成的组的原核信号序列取代。在本申请的一些实施方案中，用于表达系统的两个顺反子中的信号序列是STII信号序列或其变体。
在一些实施方案中，本申请的抗体的产生可发生在宿主细胞的细胞质中，因此不需要在各顺反子内存在分泌信号序列。在一些实施方案中，多肽组分，诸如编码第二抗原结合部分的任选融合于第一抗原结合部分的VH结构域的多肽和编码第二抗原结合部分的任选融合于第一抗原结合部分的VL结构域的多肽在细胞质内表达、折叠以及装配以形成功能性抗体。某些宿主菌株(例如大肠埃希氏菌trxB-菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，由此容许所表达蛋白质亚单位进行适当折叠和装配。Proba和Pluckthun Gene,159:203(1995)。
本发明提供一种表达系统，其中所表达多肽组分的定量比率可被调节以使本申请的分泌和适当装配抗体的产率最大化。所述调节至少部分地通过同时调节多肽组分的翻译强度来实现。一种用于调节翻译强度的技术公开于Simmons等,美国专利号5,840,523中。它利用顺反子内的翻译起始区(TIR)的变体。对于给定TIR，可产生具有一定范围的翻译强度的一系列氨基酸或核酸序列变体，由此提供调整这个因素以获得特定链的所需表达水平所采用的适宜手段。TIR变体可通过导致可改变氨基酸序列的密码子变化的常规诱变技术来产生，但核酸序列中的沉默变化是优选的。TIR中的改变可包括例如Shine-Dalgarno序列的数目或间隔的改变，以及信号序列中的改变。一种用于产生突变信号序列的方法是在编码序列的开始处产生不改变信号序列的氨基酸序列(即变化是沉默的)的“密码子库”。这可通过改变各密码子的第三核苷酸位置来实现；另外，一些氨基酸诸如亮氨酸、丝氨酸和精氨酸具有多个第一位置和第二位置，其可在制备库时增添复杂性。这个诱变方法详细描述于Yansura等(1992)METHODS:A Companion to Methods in Enzymol.4:151-158中。
优选地，产生一组对于其中各顺反子具有一定范围的TIR强度的载体。这个有限组提供各链的表达水平以及在各种TIR强度组合下所需蛋白质产物的产率的比较。TIR强度可如Simmons等,美国专利号5,840,523中所详述通过对报道基因的表达水平定量来确定。基于翻译强度比较，选择所需个别TIR以在本申请的表达载体构建体中组合。
b)原核宿主细胞
适于表达本申请的抗体的原核宿主细胞包括古细菌和真细菌，诸如革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体。适用细菌的实例包括埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠埃希氏菌)、芽孢杆菌属(Bacilli)(例如枯草芽孢杆菌)、肠杆菌属(Enterobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)物种(例如绿脓假单胞菌)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、志贺氏菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)或副球菌属(Paracoccus)。在一些实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一些实施方案中，大肠埃希氏菌细胞作为宿主用于本发明。大肠埃希氏菌菌株的实例包括菌株W3110(Bachmann,Cellular and Molecular Biology,第2卷(Washington,D.C.:AmericanSociety for Microbiology,1987),第1190-1219页；ATCC寄存号27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110 AfhuA(AtonA)ptr3 lac Iq lacL8 AompT A(nmpc-fepE)degP41kanR的菌株33D3(美国专利号5,639,635)。其他菌株及其衍生物，诸如大肠埃希氏菌294(ATCC 31,446)、大肠埃希氏菌B、大肠埃希氏菌1776(ATCC 31,537)和大肠埃希氏菌RV308(ATCC 31,608)，也是适合的。这些实例是说明性的而非限制性的。用于构建任何以上提及的细菌的具有确定基因型的衍生物的方法在本领域中是已知的，并且描述于例如Bass等,Proteins,8:309-314(1990)中。通常必须在考虑复制子在细菌的细胞中的可复制性的情况下选择适当细菌。举例来说，当熟知质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410用于提供复制子时，大肠埃希氏菌、沙雷氏菌属(Serratia)或沙门氏菌属(Salmonella)物种可适合地用作宿主。
通常，宿主细胞应分泌最小量的蛋白水解酶，并且额外蛋白酶抑制剂可合乎需要地并入细胞培养中。
c)蛋白质产生
用上述表达载体转化宿主细胞，并且在被改良为适于诱导启动子，选择转化体，或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养。转化意指将DNA引入原核宿主中以使DNA可以染色体外元件形式或通过染色体整合进行复制。视所用宿主细胞而定，使用适合于所述细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙进行的钙处理通常用于含有实质性细胞壁屏障的细菌细胞。用于转化的另一方法采用聚乙二醇/DMSO。使用的另一技术是电穿孔。
用上述表达载体转化宿主细胞，并且在被改良为适于诱导启动子，选择转化体，或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养。转化意指将DNA引入原核宿主中以使DNA可以染色体外元件形式或通过染色体整合进行复制。视所用宿主细胞而定，使用适合于所述细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙进行的钙处理通常用于含有实质性细胞壁屏障的细菌细胞。用于转化的另一方法采用聚乙二醇/DMSO。使用的另一技术是电穿孔。
使用于产生本申请的抗体的原核细胞在本领域中已知以及适于培养所选宿主细胞的培养基中生长。适合培养基的实例包括外加必要营养补充物的鲁里亚(luria)培养液(LB)。在一些实施方案中，培养基也含有基于表达载体的构建加以选择的选择剂以选择性容许含有表达载体的原核细胞的生长。举例来说，将氨苄青霉素添加至培养基中以达成表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的生长。
除碳源、氮源和无机磷酸盐来源之外，也可在适当浓度下包括单独引入或以与另一补充物或培养基的混合物形式引入的任何必要补充物，诸如复合氮源。任选地，培养基可含有一种或多种选自由谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、硫代乙醇酸盐、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇组成的组的还原剂。在适合温度下培养原核宿主细胞。对于大肠埃希氏菌生长，举例来说，优选温度在约20℃至约39℃，更优选在约25℃至约37℃的范围内，甚至更优选在约30℃下。主要视宿主生物体而定，培养基的pH可为在约5至约9的范围内的任何pH。对于大肠埃希氏菌，pH优选是约6.8至约7.4，并且更优选是约7.0。
如果诱导型启动子用于本申请的表达载体中，那么在适于启动子的活化的条件下诱导蛋白质表达。在本申请的一个方面，PhoA启动子用于控制多肽的转录。因此，在磷酸盐限制培养基中培养经转化宿主细胞以进行诱导。优选地，磷酸盐限制培养基是C.R.A.P培养基(参见例如Simmons等,J.Immunol.Methods(2002),263:133-147)。根据采用的载体构建体，可使用多种其他诱导剂，如本领域中所知。
本申请的所表达抗体被分泌至宿主细胞的周质中，并且从所述周质加以回收。蛋白质回收通常涉及通常通过诸如渗透性冲击、声波处理或溶解的手段来破坏微生物。一旦细胞被破坏，即可通过离心或过滤来移除细胞碎片或完整细胞。蛋白质可例如通过亲和树脂色谱法来进一步纯化。或者，蛋白质可被运送至培养基中，并且在其中加以分离。可从培养物移除细胞，并且过滤和浓缩培养上清液以进一步纯化产生的蛋白质。所表达多肽可使用通常已知方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和蛋白质印迹测定来进一步分离和鉴定。
或者，通过发酵方法大量进行蛋白质产生。各种大规模补料分批发酵程序可用于产生重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量，优选是约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分布氧气和营养物，尤其是葡萄糖(优选碳源/能量来源)。小规模发酵通常是指在体积容量是至多约100升，并且可在约1升至约100升的范围内的发酵罐中进行的发酵。
在发酵过程期间，通常在细胞已在适合条件下生长达到所需密度例如约180-220的OD550之后启动对蛋白质表达的诱导，在所述阶段时，细胞处于早期静止期。根据采用的载体构建体，可使用多种诱导剂，如本领域中所知以及以上所述。可在诱导之前使细胞生长较短时期。通常将细胞诱导约12-50小时，但可使用更久或更短诱导时间。
为使本申请的抗体的产率和品质改进，可改变各种发酵条件。举例来说，为使所分泌多肽的适当装配和折叠改进，过度表达伴侣蛋白诸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侣蛋白活性的肽基脯氨酰基顺,反异构酶)的额外载体可用于共同转化宿主原核细胞。已显示伴侣蛋白有助于在细菌宿主细胞中产生的异源性蛋白质的适当折叠和溶解性。Chen等(1999)J Bio Chem 274:19601-19605；Georgiou等,美国专利号6,083,715；Georgiou等,美国专利号6,027,888；Bothmann和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275:17100-17105；Ramm和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275:17106-17113；Arie等(2001)Mol.Microbiol 39:199-210。
为使所表达异源性蛋白质(尤其是具有蛋白水解敏感性的那些)的蛋白水解最小化，缺乏蛋白水解酶的某些宿主菌株可用于本发明。举例来说，宿主细胞菌株可被修饰来在编码已知细菌蛋白酶诸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合的基因中实现遗传突变。一些大肠埃希氏菌蛋白酶缺乏性菌株是可用的，并且描述于例如Joly等(1998),上文；Georgiou等,美国专利号5,264,365；Georgiou等,美国专利号5,508,192；Hara等,Microbial Drug Resistance,2:63-72(1996)中。
缺乏蛋白水解酶，并且用过度表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠埃希氏菌菌株可在编码本申请的抗体的表达系统的情况下用作宿主细胞。
d)蛋白质纯化
进一步纯化本文产生的抗体以获得大致上同质以用于进一步测定和使用的制剂。可采用本领域中已知的标准蛋白质纯化方法。以下程序例示适合纯化程序：在免疫亲和柱或离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅上或在阳离子交换树脂诸如DEAE上进行的色谱法、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、以及使用例如Sephadex G-75进行的凝胶过滤。
在一个方面，固定在固相上的蛋白A用于免疫亲和纯化本申请的包含Fc区的抗体。蛋白A是一种来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的411(D细胞壁蛋白，其以高亲和力结合抗体的Fc区。Lindmark等(1983)J.Immunol.Meth.62:1-13。蛋白A所固定于的固相优选是包含玻璃或二氧化硅表面的柱，更优选是可控孔度玻璃柱或硅酸柱。在一些应用中，柱已用诸如甘油的试剂涂布以试图预防污染物的非特异性粘附。接着洗涤固相以移除非特异性结合于固相的污染物。最后，通过洗脱来从固相回收目标抗体。
2.在真核细胞中重组产生
对于真核表达，载体组分通常包括但不限于以下中的一者或多者：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、以及增强子元件、启动子和转录终止序列。
a)信号序列组分
用于真核宿主中的载体也可包含编码信号序列或在成熟蛋白质或多肽的N末端具有特定裂解位点的其他多肽的插入物。所选异源性信号序列优选是由宿主细胞识别和加工(即由信号肽酶裂解)的异源性信号序列。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列以及病毒性分泌前导物例如单纯性疱疹gD信号是可用的。
所述前体区的DNA在阅读框中连接于编码本申请的抗体的DNA。
b)复制起点
通常，复制起点组分不为哺乳动物表达载体所需(SV40起点只是因为它含有早期启动子而可通常加以使用)。
c)选择基因组分
表达载体和克隆载体可含有选择基因，也被称为可选择标记。典型选择基因编码以下蛋白质：所述蛋白质(a)赋予对抗生素或其他毒素例如氨苄青霉素、新霉素(neomycin)、甲氨蝶呤(methotrexate)或四环素(tetracycline)的抗性；(b)弥补营养缺陷性缺陷；或(c)提供不可从复合培养基获得的关键营养物，例如芽孢杆菌的编码D-丙氨酸外消旋酶的基因。
选择流程的一个实例利用药物来遏止宿主细胞的生长。用异源性基因成功转化的那些细胞产生赋予药物抗性的蛋白质，因此在选择方案的情况下存活。所述显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸(mycophenolic acid)和潮霉素(hygromycin)。
适于哺乳动物细胞的可选择标记的另一实例是使得能够鉴定有能力摄取编码本申请的抗体的核酸的细胞的那些可选择标记，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和金属硫蛋白-II，优选是灵长类动物金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
举例来说，首先通过在含有作为DHFR的竞争性拮抗剂的甲氨蝶呤(Mtx)的培养基中培养所有转化体来鉴定用DHFR选择基因转化的细胞。当采用野生型DHFR时，适当宿主细胞是缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如ATCC CRL-9096)。
或者，用多肽编码DNA序列、野生型DHFR蛋白和另一可选择标记诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH)转化或共同转化的宿主细胞(特别是含有内源性DHFR的野生型宿主)可根据在含有可选择标记的选择剂的培养基中的细胞生长来选择，所述选择剂诸如氨基糖苷抗生素，例如卡那霉素、新霉素或G418。参见美国专利号4,965,199。
d)启动子组分
表达载体和克隆载体通常含有由宿主生物体识别，并且可操作地连接于编码所需多肽序列的核酸的启动子。实际上所有真核基因都具有富含AT的区域，其位于转录被起始所处的位点的上游约25至30个碱基处。见于许多基因的转录开始处的上游70至80个碱基处的另一序列是CNCAAT区域，其中N可为任何核苷酸。在大多数真核基因的3'末端处是AATAAA序列，其可为将多腺苷酸尾部添加至编码序列的3'末端的信号。所有这些序列都可插入真核表达载体中。
适于与原核宿主一起使用的其他启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子诸如tac启动子。然而，其他已知细菌启动子是适合的。用于细菌系统中的启动子也将含有可操作地连接于编码抗体的DNA的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
在哺乳动物宿主细胞中多肽从载体的转录例如由从病毒(诸如多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒，并且最优选是猿猴病毒40(SV40))的基因组、异源性哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子、热击启动子获得的启动子控制，条件是所述启动子可与宿主细胞系统相容。
SV40病毒的早期启动子和晚期启动子以也含有SV40病毒复制起点的SV40限制片段形式便利地获得。人巨细胞病毒的立即早期启动子以HindIII E限制片段形式便利地获得。用于使用牛乳头状瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统公开于美国专利号4,419,446中。这个系统的改进形式描述于美国专利号4,601,978中。关于在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下在小鼠细胞中表达人干扰素cDNA，也参见Reyes等,Nature 297:598-601(1982)。或者，劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)长末端重复序列可用作启动子。
e)增强子元件组分
由高等真核生物达成的对编码本申请的抗体的DNA的转录常常通过将增强子序列插入载体中来增加。来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列是现时已知的。然而，通常将使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括在复制起点的晚期侧上的SV40增强子(100-270bp)、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点的晚期侧上的多瘤增强子、以及腺病毒增强子。关于用于真核启动子的活化的增强元件，也参见Yaniv,Nature297:17-18(1982)。增强子可在多肽编码序列的5'或3'位置处剪接至载体中，但优选位于启动子的5'位点处。
f)转录终止组分
用于真核宿主细胞(酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、动物细胞、人细胞或来自其他多细胞生物体的有核细胞)中的表达载体也将含有为转录终止以及使mRNA稳定所必需的序列。所述序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5'非翻译区获得，以及有时可从3'非翻译区获得。这些区域含有被转录为多肽编码mRNA的非翻译部分中的多腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种适用转录终止组分是牛生长激素多腺苷酸化区域。参见WO 94/11026以及其中公开的表达载体。
g)宿主细胞的选择和转化
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括本文所述的高等真核生物细胞，包括脊椎动物宿主细胞。以培养(组织培养)方式使脊椎动物细胞增殖已成为一种常规程序。适用哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40转化的猴肾CV1株系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚肾株系(293细胞或被亚克隆来达成悬浮培养生长的293细胞，Graham等,J.GenVirol.36:59(1977))；幼小仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠塞尔托利细胞(sertolicell)(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCCCCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TR1细胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝细胞瘤株系(Hep G2)。
用上述用于产生抗体的表达载体或克隆载体转化宿主细胞，并且在被改良为适于诱导启动子，选择转化体，或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养。
h)培养宿主细胞
可在多种培养基中培养用于产生本申请的抗体的宿主细胞。可商购获得的培养基诸如汉姆氏F10(Ham's F10)(Sigma)、最低必需培养基((MEM)，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和杜尔贝科氏改良伊戈尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)((DMEM)，Sigma)适于培养宿主细胞。此外，Ham等,Meth.Enz.58:44(1979)；Barnes等,Anal.Biochem.102:255(1980)；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或再颁美国专利30,985中所述的任何培养基都可用作用于宿主细胞的培养基。任何这些培养基在必要时都可补充以激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙盐、镁盐和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常在微体积摩尔浓度范围内的最终浓度下存在的无机化合物)以及葡萄糖或等效能量来源。任何其他必要补充剂也可在将为本领域技术人员所知的适当浓度下加以包括。诸如温度、pH等的培养条件是先前在被选择用于表达的宿主细胞的情况下使用的那些，并且将为普通熟练技术人员显而易知。
i)蛋白质纯化
当使用重组技术时，抗体可在细胞内，在周质间隙中产生，或直接分泌至培养基中。如果抗体在细胞内产生，那么作为第一步骤，例如通过离心或超滤来移除颗粒碎片，即宿主细胞或经溶解片段。Carter等,Bio/Technology 10:163-167(1992)描述用于分离分泌至大肠埃希氏菌的周质间隙中的抗体的程序。简要来说，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯基甲基磺酰氟(PMSF)存在下历经约30分钟使细胞糊状物解冻。可通过离心来移除细胞碎片。当抗体被分泌至培养基中时，通常首先使用可商购获得的蛋白质浓缩过滤器例如Amicon或Millipore Pellicon超滤装置来浓缩来自所述表达系统的上清液。可将蛋白酶抑制剂诸如PMSF包括在任何先前步骤中以抑制蛋白水解，并且可包括抗生素以防止不定污染物的生长。
由细胞制备的蛋白质组合物可使用例如羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析和亲和色谱法来纯化，其中亲和色谱法是优选纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于含有1、2或4个重链的人免疫球蛋白的抗体(Lindmark等,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G被推荐用于所有小鼠同种型以及人3(Guss等,EMBO J.5:15671575(1986))。亲和配体所连接的基质最常是琼脂糖，但其他基质是可用的。相比于可用琼脂糖实现的流速和处理时间，机械稳定基质诸如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯基)苯允许流速更快以及处理时间更短。当抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)适用于纯化。视待回收的抗体而定，其他蛋白质纯化技术诸如在离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅色谱法、肝素SEPHAROSETM色谱法、阴离子或阳离子交换树脂色谱法(诸如聚天冬氨酸柱)、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀也是可用的。
在任何初级纯化步骤之后，可使包含目标抗体和污染物的混合物经受使用在约2.5-4.5之间的pH下的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)下进行的低pH疏水性相互作用色谱法。
3.多克隆抗体
多克隆抗体通常通过多次皮下(s.c.)或腹膜内(i.p.)注射相关抗原和佐剂来在动物中产生。可适用的是使用双官能试剂或衍生化试剂例如顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基磺基丁二酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基来缀合)、N-羟基丁二酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、丁二酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(其中R和R1独立地是低级烷基)来使相关抗原缀合于在待免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质，例如钥孔虫戚血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin，KLH)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。可采用的佐剂的实例包括弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant)和MPL-TDM佐剂(单磷酰基脂质A、合成海藻糖二棒杆菌分枝菌酸酯)。免疫方案可由本领域技术人员在不进行过度实验下选择。
通过使例如100μg或5μg蛋白质或缀合物(分别用于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂组合以及在多个部位处在真皮内注射溶液来使动物针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物免疫。1个月后，通过在多个部位处皮下注射来用含1/5至1/10原始量的肽或缀合物的弗氏完全佐剂使动物加强免疫。7至14天后，将动物放血，并且测定血清的抗体滴度。使动物加强免疫直至滴度平稳。也可在重组细胞培养中以蛋白质融合物形式制备缀合物。此外，诸如明矾的聚集剂适于使免疫应答增强。
4.单克隆抗体
单克隆抗体从大致上同质抗体群体获得，即构成所述群体的个别抗体是相同的，例外之处是可少量存在的可能天然存在突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)。因此，修饰语“单克隆”将抗体的特性指示为不是个别抗体的混合物。
举例来说，单克隆抗体可使用首先由Kohler等,Nature,256:495(1975)所述的杂交瘤方法制备，或可通过重组DNA方法(美国专利号4,816,567)制备。
在杂交瘤方法中，如上文所述使小鼠或其他适当宿主动物诸如仓鼠或美洲驼免疫以引发产生或能够产生将特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。或者，可在体外使淋巴细胞免疫。接着使用适合融合剂诸如聚乙二醇使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第59-103页(Academic Press,1986))。
免疫剂将通常包括抗原性蛋白质或其融合变体。通常，如果需要人来源的细胞，那么使用外周血液淋巴细胞(“PBL”)，或如果需要非人哺乳动物来源，那么使用脾细胞或淋巴结细胞。接着使用适合融合剂诸如聚乙二醇使淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞。Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press(1986),第59-103页。
永生化细胞系通常是经转化哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。将由此制备的杂交瘤细胞接种，并且使其在优选含有一种或多种抑制未融合亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的物质的适合培养基中生长。举例来说，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，其是会阻止HGPRT缺陷性细胞的生长的物质。
优选永生化骨髓瘤细胞是高效融合，支持由所选抗体产生性细胞稳定高水平产生抗体，并且对诸如HAT培养基的培养基敏感的那些。在这些之中，优选的是鼠骨髓瘤株系，诸如可从索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center,SanDiego,Calif.USA)获得的源于MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，以及可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,Va.USA)获得的SP-2细胞(及其衍生物，例如X63-Ag8-653)。也已描述用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
测定杂交瘤细胞于其中生长的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。优选地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定。
可测定在其中培养杂交瘤细胞的培养基中针对所需抗原的单克隆抗体的存在性。优选地，单克隆抗体的结合亲和力和特异性可通过免疫沉淀或通过体外结合测定诸如放射免疫测定(RIA)或酶联测定(ELISA)来测定。所述技术和测定在本领域中是已知的。举例来说，结合亲和力可通过Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的斯卡查德分析来测定。
在鉴定产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，克隆可通过有限稀释程序来亚克隆，并且通过标准方法来加以生长(Goding,上文)。适于这个目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，可使杂交瘤细胞在体内以肿瘤形式在哺乳动物中生长。
通过常规免疫球蛋白纯化程序诸如像蛋白A-琼脂糖、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法，以适合方式使由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水液或血清分离。
单克隆抗体也可通过重组DNA方法诸如美国专利号4,816,567中所述以及如上所述的那些加以制备。使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，易于分离和测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞充当所述DNA的优选来源。一旦分离，即可将DNA放置至表达载体中，接着将所述表达载体转染至宿主细胞诸如大肠埃希氏菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中以在所述重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述文章包括Skerra等,Curr.Opinion in Immunol.,5:256-262(1993)以及Pliickthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
在另一实施方案中，抗体可从使用McCafferty等,Nature,348:552-554(1990)中所述的技术产生的抗体噬菌体文库分离。Clackson等,Nature,352:624-628(1991)以及Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)分别描述使用噬菌体文库分离鼠抗体和人抗体。后续出版物描述通过链改组(Marks等,Bio/Technology,10:779-783(1992))以及组合感染和体内重组作为用于构建极其大型噬菌体文库的策略(Waterhouse等,Nucl.AcidsRes.,21:2265-2266(1993))来产生高亲和力(nM范围)人抗体。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方案。
DNA也可例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源性鼠序列(美国专利号4,816,567；Morrison,等,Proc.Natl Acad.Sci.USA,81:6851(1984))，或通过使非免疫球蛋白多肽的全部或一部分编码序列共价接合于免疫球蛋白编码序列来加以修饰。通常，所述非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定结构域，或它们取代抗体的具有一个抗原结合位点的可变结构域以产生嵌合二价抗体。
本文所述的单克隆抗体可具有单价，所述单克隆抗体的制备在本领域中是熟知的。举例来说，一种方法涉及重组表达免疫球蛋白轻链和经修饰重链。重链通常在Fc区中的任一点处被截短以便防止重链交联。或者，相关半胱氨酸残基可被另一氨基酸残基取代或被缺失以便防止交联。体外方法也适于制备单价抗体。对抗体进行消化以产生其片段，特别是Fab片段，可使用本领域中已知的常规技术来实现。
嵌合或杂合抗体也可使用合成蛋白质化学中的已知方法(包括涉及交联剂的那些)来在体外制备。举例来说，可使用二硫交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。适于这个目的的试剂的实例包括亚氨基硫醇化物和4-巯基丁亚胺酸甲酯。
对于单克隆sdAb产生，也参见实施例1。
5.人源化抗体和人抗体
人源化抗体包括人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的CDR的残基被来自诸如小鼠、大鼠、兔、骆驼科动物或美洲驼的非人物种(供者抗体)的具有所需特异性、亲和力和能力的CDR的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应非人残基置换。人源化抗体也可包含既不见于接受者抗体中也不见于输入CDR或框架序列中的残基。一般来说，人源化抗体可包含大致上全部至少一个，并且通常两个可变结构域，其中全部或大致上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些，并且全部或大致上全部FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。在一些实施方案中，人源化抗体将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的至少一部分恒定区。参见例如Jones等,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature,332:323-329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)。
通常，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入它之中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。根据一些实施方案，人源化可基本上遵循Winter和同事(Jones等,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等,Science,239:1534-1536(1988))的方法，通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列来进行。因此，所述“人源化”抗体是其中大致上不及完整人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代的抗体(美国专利号4,816,567)。实际上，人源化抗体通常是其中一些CDR残基以及有可能一些FR残基被来自非人抗体(诸如美洲驼VHH结构域)中类似位点的残基取代的人抗体。
作为人源化的替代方案，可产生人抗体。举例来说，现时有可能产生在免疫后能够在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体的完全谱系的转基因动物(例如小鼠)。举例来说，已描述嵌合和种系突变小鼠中抗体重链接合区(JH)基因的纯合性缺失会导致完全抑制内源性抗体产生。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移至所述种系突变小鼠中将导致在抗原激发后产生人抗体。参见例如Jakobovits等,PNAS USA,90:2551(1993)；Jakobovits等,Nature,362:255-258(1993)；Bruggemann等,Year in Immunol.,7:33(1993)；美国专利号5,545,806；5,569,825；5,591,669；5,545,807；以及WO 97/17852。或者，人抗体可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物中来制备，所述转基因动物例如是其中内源性免疫球蛋白基因已被部分或完全失活的小鼠。在激发后，观察到人抗体产生，此在包括基因重排、装配和抗体谱系的所有方面都紧密类似于在人中所见的抗体产生。这个方法例如在美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；以及Marks等,Bio/Technology,10:779-783(1992)；Lonberg等,Nature,368:856-859(1994)；Morrison,Nature,368:812-813(1994)；Fishwild等,Nature Biotechnology,14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology,14:826(1996)；Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.,13:65-93(1995)中描述。
人抗体也可通过体外活化的B细胞(参见美国专利5,567,610和5,229,275)或通过使用本领域中已知的各种技术(包括噬菌体展示文库)来产生。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体。Cole等,Monoclonal Antibodies and CancerTherapy,Alan R.Liss,第77页(1985)以及Boerner等,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)。
VI.制品和试剂盒
进一步提供试剂盒和制品，其包含经分离的抗CTLA-4构建体(诸如抗CTLA-4sdAb、抗CTLA-4HCAb、CTLA-4×PD-1双特异性构建体(例如BABP)、CTLA-4×PD-L1双特异性构建体(例如BABP))、编码其的经分离的核酸或载体、或包含编码抗CTLA-4构建体的经分离的核酸或载体的经分离的宿主细胞中的任一者。在一些实施方案中，提供一种试剂盒，其包括任一本文所述的药物组合物，并且优选提供它的使用说明书。
本申请的试剂盒处于适合包装中。适合包装包括但不限于小瓶、瓶、罐、柔性包装(例如密封聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。试剂盒可任选提供额外组分诸如缓冲剂和解释信息。因此，本申请也提供制品，其包括小瓶(诸如密封小瓶)、瓶、罐、柔性包装等。
制品可包括容器和在所述容器上或与所述容器相伴的标签或包装插页。适合容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由多种材料诸如玻璃或塑料形成。通常，容器容纳本文所述的有效治疗疾病或病症(诸如癌症)的组合物，并且可具有无菌入口(例如容器可为具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。标签或包装插页指示组合物用于治疗个体的特定病状。标签或包装插页将进一步包括向个体施用组合物的说明书。标签可指示复原和/或使用指导。容纳药物组合物的容器可为多次使用小瓶，其允许重复施用(例如2-6次施用)复原制剂。包装插页是指惯常包括在治疗性产品的商业包装中的说明书，其含有关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或涉及使用所述治疗性产品的警告的信息。另外，制品可进一步包括第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它可进一步包括从商业和使用者观点来看可合乎需要的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
试剂盒或制品可包括多次单位剂量的药物组合物和使用说明书，以足以在药房例如医院药房和混配药房中储存和使用的数量加以包装。
实施例
以下实施例仅意图例示本发明，并因此不应被视为以任何方式限制本发明。以下实施例和详细描述通过说明的方式而非通过限制的方式来提供。
实施例1：产生抗CTLA-4sdAb
免疫
根据所有当前动物福利法规，用重组CTLA-4ECD蛋白使两个美洲驼免疫。对于免疫，将抗原与CFA(初级免疫)或IFA(加强免疫)一起配制成乳液。通过在颈部在肌肉内进行两点注射来施用抗原。在每周间隔下，各动物接受两次含有100μg CTLA-4ECD的乳液注射以及4次含有50μg抗原的后续注射。在免疫期间的不同时间点，从动物收集10ml血液样品，并且制备血清。在用固定化CTLA-4ECD蛋白进行的基于ELISA的实验中，使用血清样品验证对抗原特异性体液免疫应答的诱导(图1和图2)。在末次免疫之后5天，收集300ml的血液样品。使用Ficoll-Paque梯度(Amersham Biosciences)从300ml血液样品分离作为美洲驼重链免疫球蛋白(HCAb)的遗传来源的外周血液淋巴细胞(PBL)，从而产生1×109个PBL。预期抗体的最大多样性等于取样B淋巴细胞的数目，其是PBL的数目的约10％(1×108)。美洲驼中重链抗体的分数多达B淋巴细胞的数目的20％。因此，将300ml血液样品中HCAb的最大多样性计算为2×107个不同分子。
文库构建
从PBL和淋巴结提取的RNA作为起始材料用于RT-PCR以扩增sdAb编码基因片段。将这些片段克隆至内部噬菌粒载体中。与sdAb编码序列同框，载体编码C末端(His)6标签。文库大小超过1×109。根据标准方案制备文库噬菌体，并且在过滤灭菌之后在4℃下储存以供进一步使用。
选择和高通量筛选
使用固体淘选以及基于细胞的淘选，用以上文库进行选择。对于两种情况均仅进行单轮选择。分析各选择输出物的CTLA-4阳性克隆的富集因子(相对于对照，存在于洗脱物中的噬菌体的数目)、多样性和百分比(ELISA)。基于这些参数，选择最佳选择物用于进一步分析。为此，将来自各选择的输出物以汇合物形式再克隆至可溶性表达载体中以进行高通量筛选。与sdAb编码序列同框，载体编码C末端(His)6标签。挑选菌落，并且使其在96深孔板(1ml体积)中生长并通过添加IPTG和0.1％曲通(Triton)来诱导以达成sdAb在上清液中表达。
分析上清液结合至CTLA-4ECD蛋白(通过ELISA)和CTLA-4稳定细胞系(通过FACS)的能力。对阳性结合剂测序，并且选择独特克隆用于进一步表征(CDR序列见序列表)。
使独特克隆在2XYT培养基中生长，并且通过IPTG来诱导以达成sdAb在上清液中表达。分析独特结合剂的上清液抑制CTLA-4-B7-1相互作用的能力。为此，使上清液与CTLA-4ECD蛋白一起孵育，接着将复合物添加至B7-1稳定细胞系中以进行结合评价。关于B7-1细胞系具有负性信号的sdAb被视为CTLA-4抑制剂。
选择所有潜在抑制剂用于通过在BIAcore T200仪器上进行表面等离子体共振(SPR)来分析解离速率。解离时期用于计算各个别sdAb的k解离值。
sdAb产生
通过来从周质提取物纯化His6标签化的sdAb。根据制造商说明书处理NTA树脂。使制备的周质提取物与树脂一起在旋转器上在室温下孵育30分钟。树脂用PBS洗涤并转移至柱中。压紧的树脂用15mM咪唑洗涤。使用150mM咪唑从柱洗脱sdAb。将洗脱的级分通过在Hybond膜上点样来分析，并且用丽春红(Ponceau)可视化。将含有蛋白质的级分汇合，并且相对于PBS加以透析。将经透析的蛋白质收集，过滤灭菌，测定浓度，并且在-20℃下储存。
为测定纯度，在12％ SDS-PAGE凝胶上分析蛋白质样品。将10μl Laemmli样品缓冲液添加至10μl(2μg)纯化蛋白质中，接着在95℃下加热样品10分钟，冷却并上样于12％SDS-PAGE凝胶上。根据一般性程序处理凝胶，并且用考马斯亮蓝(Coomassie BrilliantBlue，CBB)染色。
通过FACS分析获得的对配体结合的抑制
使用流式细胞术研究对配体结合的阻断。对于抗CTLA-4sdAb评估，使表达人B7-1的CHO细胞从粘附培养烧瓶解离，并且与不同浓度的抗体和恒定浓度的经生物素标记的hCTLA-4/Fc蛋白(两者均在96孔板中)混合。用作抗CTLA-4抗体阳性对照。在室温下使混合物平衡30分钟，用FACS缓冲液(含有1％ BSA的PBS)洗涤三次。接着添加PE/Cy5链霉亲和素二级抗体，并且在室温下孵育15分钟。将细胞再次用FACS缓冲液洗涤，并且通过流式细胞术来分析。将数据用Prism(GraphPad Software,San Diego,CA)，利用非线性回归加以分析，并且计算IC50值。如可由图3A所见，竞争测定显示抗CTLA-4sdAb(A34311、A36566和A36922)能够在低浓度(1-10μg/ml)下高效抑制CTLA4-B7-1相互作用，其中A34311作为最强力者具有约14.52nM的EC50。
sdAb亲和力测定
各sdAb的亲和常数(Kd)通过在BIAcore T200仪器上进行表面等离子体共振(SPR)来测定。
对于测定一些抗CTLA-4sdAb的亲和力，使CTLA-4ECD(CTLA-4-Fc)在约50RU的密度下胺-偶联于CM5传感器芯片。在1与81nM之间的4个不同浓度下注射抗CTLA-4sdAb。在所有实验中，流速都是30μl/min。缔合时期和解离时期分别是3分钟和10分钟。芯片使用甘氨酸/HCl(pH 1.5)再生。在不同sdAb浓度下的结合曲线用于计算动力学参数k缔合、k解离和Kd(对于A34311 sdAb亲和力数据，参见图9)。
其余抗CTLA-4sdAb的亲和力通过使CTLA-4-His蛋白在约50RU的密度下胺-偶联于CM5传感器芯片来测定。在5与160nM之间的6个不同浓度下注射抗CTLA-4sdAb。在所有实验中，流速都是30μl/min。缔合时期和解离时期分别是3分钟和10分钟。芯片使用甘氨酸/HCl(pH 1.5)再生。在不同sdAb浓度下的结合曲线用于计算动力学参数k缔合、k解离和Kd(对于AS07014 sdAb和AS07189 sdAb亲和力数据，参见图22A-图22B)。
基于CTLA-4的阻断测定
通过分离试剂盒(Miltenyl Biotec)来从PBMC纯化人CD4+T细胞。各孔含有105个CD4+T细胞和104个CHO-K1/人CD80(稳定表达人CD80的CHO-K1)，最终工作体积是200μl。将8种测试纯化的sdAb在不同浓度下添加至各孔中。无抗体用作本底对照。人IgG4用作阴性对照，并且用作阳性抗CTLA4抗体对照。将CTLA-4-Fc(GenScript，Z03373-50)添加至系统中以引发反应。在37℃/5％ CO2孵育器中孵育24小时之后，从各测试孔获取100μl培养基以进行IL-2测量(Cisbio)。在CTLA-4阻断生物测定中由T细胞达成的抗体浓度依赖性IL-2分泌用于求取各测试抗体以及阳性对照全长抗CTLA-4抗体/>的EC50值。如可由图4和图27A-图27C所见，9种sdAb(A37067、A34625、A34311、A34313、A36566、A36922、AS07014、AS07189和AS07745)抑制CTLA-4与B7-1之间的结合，其中A34311、A36566、A36922、AS07014、AS07189和AS07745 sdAb展现较强功能活性。
实施例2：抗CTLA-4sdAb人源化
将sdAb A34311的蛋白质序列与5个共有最高同源性程度的最密切人种系序列比对。最佳人种系序列被选作人接受体。在框架区中相对于人接受体的氨基酸差异用暗灰色加以阴影化(图6和图31A)。制作同源性模型。根据模型分析数据，对于抗原结合或抗体骨架形成潜在至关重要的残基被保持未触及，而其余部分被选择用于转换成人对应物。初始，产生一组4-6个序列优化变体(第1阶段)。分析这些变体的许多参数，并且所得结果用于设计第二组sdAb(第2阶段)。基于结合、稳定性和功能活性数据选择最佳4种人源化sdAb(AS02636、AS02626、AS02640和A34311VH11)，并且它们的序列比对显示于图6和图31A中(也显示其他人源化sdAb)。
AS07014的最佳人源化sdAb(AS07014VH11、AS07014VH11G54、AS07014VH11SGA、AS07014VH11SGQ和AS07014VH11SGS)和AS07189的最佳人源化sdAb(AS07189TKDVH11、AS07189TKDVH11F27和AS07189TKDVH11FY)以类似方式产生，筛选和选择。它们的序列比对显示于图31B和图31C中(也显示其他人源化sdAb)。
人源化sdAb产生
通过来从周质提取物纯化人源化His6-标签化sdAb。sdAb产生和纯度测定方案根据实施例1中的方案。
通过FACS分析获得的对配体结合的抑制
如实施例1中所述，通过FACS分析来测试经纯化的人源化sdAb抑制CTLA-4-B7-1结合的能力。竞争测定结果指示人源化sdAb可在低浓度(1-10μg/ml；参见图7，例如AS02640sdAb)下高效抑制CTLA-4-B7-1相互作用。
人源化sdAb的亲和力测定
如实施例1中所述，各人源化sdAb的亲和常数(Kd)通过在BIAcore T200仪器上进行表面等离子体共振(SPR)来测定。在不同sdAb浓度下的结合曲线用于计算动力学参数k缔合、k解离和Kd(图9)。如可由图9所见，人源化克隆AS02640的结合亲和力与野生型sdAbA34311的结合亲和力类似。
基于CTLA-4的阻断测定
如实施例1中所述进行基于CTLA-4的阻断测定。发现人源化sdAb AS02640有效抑制CTLA-4与B7-1之间的结合，如由T细胞达成的IL-2产生所反映(图8、图27A-图27C)。
实施例3：HCAb构建、产生和表征
选择来自以上研究的具有功能活性和缓慢解离速率的sdAb(A34311、A36566、A34313和A36922 sdAb)用于HCAb构建和产生。使所选sdAb的DNA序列与人IgG1 Fc的DNA序列融合以制备HCAb构建体。将HCAb构建体转染至哺乳动物细胞系中以进行HCAb表达。在条件培养基中分泌的HCAb通过蛋白A柱加以纯化。
通过FACS分析获得的对配体结合的抑制
如实施例1中所述，通过FACS分析来测试纯化的抗CTLA-4HCAb(A34311HCAb、A36566 HCAb和A36922 HCAb)抑制CTLA-4/B7-1结合的能力。如可由图3B所见，竞争测定显示抗CTLA-4HCAb能够在低浓度(1-10μg/ml)下高效抑制CTLA-4/B7-1相互作用。并且根据FACS数据的EC50，A34311 HCAb、A36566 HCAb和A36922 HCAb与市场药物显示类似功能活性(图3B)。
基于CTLA-4的阻断测定
如实施例1中所述进行基于CTLA-4的阻断测定。如可由图5A-5F和图10所见，A34311 HCAb、A36566 HCAb、A36922 HCAb和A34313 HCAb在抑制CTLA-4与B7-1之间的结合方面显示出与市场药物相当的功能活性，这与基于FACS的配体竞争测定结果(图3B)一致。A34311 HCAb和AS02640HCAb的功能活性极其接近(图10)，从而表明在sdAb人源化之后，抗体亲和力和活性不受影响。
抗CTLA-4HCAb的亲和力测定
在纯化之后，如实施例1中所述用类似方法测量A34311 HCAb的结合亲和力参数。用作抗CTLA-4抗体的阳性对照。简要来说，将抗体固定于CM5传感器芯片上，并且使CTLA-4-His蛋白作为分析物在0.78、1.56、3.15、6.25、12.5、25、50和100nM的浓度下流动。如可由图13C-13E所见，A34311 HCAb对CTLA-4的结合亲和力极其接近于/>
实施例4：包含抗CTLA-4sdAb的多价构建体或双特异性抗体的产生和表征
本文所述的抗CTLA-4sdAb也可表达为包含C末端抗HSA sdAb、9氨基酸Gly/Ser(9GS)接头和N末端抗CTLA-4sdAb的双特异性构建体。此外，可构建三价和双特异性抗体，其包含本文所述的C末端抗CTLA-4sdAb和N末端抗CTLA-4sdAb以及在中间的抗HSA sdAb，任选全都通过9氨基酸Gly/Ser接头加以连接。C末端抗CTLA-4sdAb或N末端抗CTLA-4sdAb可被抗PD-1sdAb或抗PD-L1 sdAb取代。
双特异性抗体可用融合于全长抗体的抗CTLA-4sdAb来构建，所述全长抗体诸如抗PD-1抗体，例如(帕母单抗)、/>(尼鲁单抗)，或抗PD-L1抗体，例如(阿特珠单抗)、IMFINZITM(度伐鲁单抗)。抗CTLA-4sdAb可通过接头(诸如9氨基酸Gly/Ser接头(9GS接头)、人IgG1(hIgG1)铰链或突变hIgG1铰链)或在无接头下连接于全长抗体。抗CTLA-4sdAb可融合于至少一个重链的N末端或C末端。
双特异性CTLA-4×PD-1和CTLA-4×PD-L1抗体产生
构建包含抗CTLA-4sdAb(A34311或AS02640)以或不以接头(9氨基酸Gly/Ser接头或人IgG1铰链)融合于抗PD-1全长抗体((帕母单抗)或/>(尼鲁单抗))的重链的N末端或C末端的双特异性抗体(对于产生的所有CTLA-4×PD-1构建体，参见序列表)。也构建包含抗CTLA-4sdAb(A34311或AS02640)以或不以接头(9氨基酸Gly/Ser接头或人IgG1铰链)融合于抗PD-L1全长抗体(/>(阿特珠单抗)或IMFINZITM(度伐鲁单抗))的重链的N末端或C末端的双特异性抗体(对于产生的所有CTLA-4×PD-L1构建体，参见序列表)。在CTLA-4×PD-L1构建体之中，A34311-9GS-Tecentriq、A34311-hIgG1铰链-Tecentriq、A34311-Tecentriq、AS02640-9GS-Tecentriq、AS02640-hIgG1铰链-Tecentriq、AS02640-Tecentriq、A34311-9GS-度伐鲁单抗、A34311-hIgG1铰链-度伐鲁单抗、A34311-度伐鲁单抗、AS02640-9GS-度伐鲁单抗、AS02640-hIgG1铰链-度伐鲁单抗和AS02640-度伐鲁单抗被构建、表达以及随后纯化；Tecentriq-9GS-A34311、Tecentriq-hIgG1铰链-A34311、Tecentriq-A34311、Tecentriq-9GS-AS02640、Tecentriq-hIgG1铰链-AS02640、Tecentriq-AS02640、度伐鲁单抗-9GS-A34311、度伐鲁单抗-hIgG1铰链-A34311、度伐鲁单抗-A34311、度伐鲁单抗-9GS-AS02640、度伐鲁单抗-hIgG1铰链-AS02640和度伐鲁单抗-AS02640被构建和表达，以及随后纯化。
在CHO细胞中表达双特异性构建体，并且随后通过亲和色谱法和尺寸排阻色谱法(SEC)来从培养基纯化。
双特异性CTLA-4×PD-1抗体的亲和力测定
在纯化之后，如实施例1中所述用类似方法测量双特异性抗体的结合亲和力参数，并且与它们的单体抗体(抗CTLA-4Ab或抗PD-1Ab)进行比较。简要来说，将抗体固定于CM5传感器芯片上，并且使CTLA-4-His或PD-1-His蛋白作为分析物在0.78、1.56、3.15、6.25、12.5、25、50和100nM的浓度下流动。
两种示例性CTLA-4×PD-1双特异性抗体BCP-311K和BCP-K311的结合动力学数据显示于图12A-12D和图13A-13E中。结果指示构建的CTLA-4×PD-1双特异性抗体针对PD-1和CTLA-4的亲和力分别极其接近于它们的单克隆抗体抗PD-1(图12A-图12D)以及A34311HCAb和抗CTLA-4Ab/>(图13A-13E)。
通过FACS分析获得的对配体结合的抑制
为评估构建的CTLA-4×PD-1双特异性抗体的抗PD-1活性，使表达人PD-1的CHO细胞从粘附培养烧瓶解离，并且与不同浓度的双特异性抗体和恒定浓度的经生物素标记的hPD-L1-Fc融合蛋白(两者均在96孔板中)混合。在室温下使混合物平衡30分钟，用FACS缓冲液(含有1％ BSA的PBS)洗涤三次。接着添加PE/Cy5链霉亲和素二级抗体，并且在室温下孵育15分钟。细胞再次用FACS缓冲液洗涤，并且通过流式细胞术来分析。数据用Prism(GraphPad Software,San Diego,CA)，利用非线性回归加以分析，并且计算IC50值。如可由图14所见，竞争测定显示构建的双特异性抗体能够在低浓度(1-10μg/ml)下高效抑制PD-1/PD-L1相互作用。与抗体亲和力数据(图12A-12D)一致，BCP-311K和BCP-K311的功能活性与它们的单克隆抗PD-1抗体相当(图14)。
为评估构建的CTLA-4×PD-1双特异性抗体的抗CTLA-4活性，使表达人B7-1的CHO细胞从粘附培养烧瓶解离，并且与不同浓度的双特异性抗体和恒定浓度的经生物素标记的hCTLA-4-Fc蛋白(两者均在96孔板中)混合。如上所述以类似方式进行流式细胞术测定。如可由图15所见，竞争测定显示构建的双特异性抗体能够在低浓度(1-10μg/ml)下高效抑制CTLA-4/B7-1相互作用。与抗体亲和力数据(图13A-图13E)一致，BCP-311K和BCP-K311的功能活性与A34311 HCAb和抗CTLA-4相当(图15)。
体外功能性测定
可使用监测T细胞增殖、IFN-γ释放、IL-2分泌或由PD-1或CTLA-4路径中的信号传导分子驱动的报道基因的表达的多种生物测定来研究由双特异性抗体对PD-1路径和CTLA-4路径的阻断。
举例来说，可通过在包含表达PD-L1的靶标细胞和活化的T细胞的混合淋巴细胞反应(MLR)中测定IL-2分泌水平来研究由双特异性抗体达成的PD-1抑制，其中在各种浓度下提供双特异性抗体。
使用分离试剂盒(Miltenyl Biotec)从PBMC纯化人CD4+T细胞和同种异体单核细胞。将单核细胞诱导成树突细胞。各孔含有105个CD4+T细胞和104个同种异体树突细胞，最终工作体积是200μl。将CTLA-4×PD-1双特异性抗体在不同浓度下添加至各孔中。无抗体情况用作本底对照。人IgG4用作阴性对照，并且用作阳性抗PD-1抗体对照。在37℃/5％ CO2孵育器中孵育72小时之后，从各测试孔获取100μl培养基以进行IL-2分泌测量(Cisbio)。MLR中的抗体浓度依赖性IL-2分泌用于求取双特异性抗体的抗PD-1活性的EC50值，并且与全长抗PD-1抗体/>的EC50值进行比较。与基于FACS的配体竞争测定结果(图14)一致，BCP-311K和BCP-K311在靶向PD-1方面的功能活性与它们的单克隆抗体相当(图17A-17D)。
使用分离试剂盒(Miltenyl Biotec)从PBMC纯化人CD4+T细胞。各孔含有105个CD4+T细胞和104个CHO-K1/人CD80(稳定表达人CD80(B7-1)的CHO-K1)，最终工作体积是200μl。将CTLA-4×PD-1双特异性抗体在不同浓度下添加至各孔中。无抗体情况用作本底对照。人IgG4用作阴性对照，并且用作阳性抗CTLA-4抗体对照。将hCTLA-4-Fc(GenScript，Z03373-50)添加至系统中以引发反应。在37℃/5％ CO2孵育器中孵育24小时之后，从各测试孔获取100μl培养基以进行IL-2分泌测量(Cisbio)。在CTLA-4阻断生物测定中由T细胞达成的抗体浓度依赖性IL-2分泌用于求取双特异性抗体的抗CTLA-4活性的EC50值，并且与全长抗CTLA-4/>的内部表达生物类似物(“Yervoy生物类似物”)、/>抗体和HCAbA34311的EC50值进行比较(图16A-16F)。与基于FACS的配体竞争测定结果(图15)一致，BCP-311K和BCP-K311在靶向CTLA-4方面的功能活性与Yervoy生物类似物、/>抗体和A34311 HCAb相当(图16A-16F)。
实施例5：抗CTLA-4HCAb的体内功效研究
将6-8周龄人CTLA-4KI(敲入)雌性C57/BL6小鼠在它们的下背部上剃毛，并且用含1×106个结肠癌细胞系MC38的50μL 75％(vol/vol)RPMI(Life Technologies)和25％(vol/vol)中等密度基质胶(Corning)混悬液皮下注射。将根据目视检查在7天内肿瘤未能植入的小鼠从进一步研究排除。在MC38植入之后在第7天开始，每日测量肿瘤。将小鼠分别地分选至治疗群组中，并且仅当肿瘤达到150mm3的阈值时(在所有情况下在植入后约10天)才开始接受治疗。治疗的持续时间内每三天获取数字测径规测量结果和体重测量结果(图11A)。在实验中，用10mg/kg内部制备的Yervoy生物类似抗体或相当量的抗CTLA-4HCAb(A34311 HCAb或AS02640 HCAb)持续16天对小鼠静脉内给予治疗。每4天进行治疗。用PBS注射的小鼠充当阴性对照。如可由图11B所见，在MC38同基因小鼠模型中，A34311 HCAb与它的人源化克隆AS02640两者均有效控制肿瘤生长，与市场药物的生物类似物具有相当的功能活性。相较于模拟对照，所有这些治疗都不影响经MC38植入的小鼠的体重(图11C)。
实施例6：抗CTLA-4HCAb构建、产生和表征
选择来自以上研究的具有功能活性和缓慢解离速率的sdAb(A34311、A36566、A36922、AS07014、AS07189和AS07745)以及人源化抗CTLA-4变体(AS02636、AS02626、AS02640、A34311VH11、AS07014VH11、AS07014VH11G54、AS07014VH11SGA、AS07014VH11SGQ、AS07014VH11SGS、AS07189TKDVH11、AS07189TKDVH11F27和AS07189TKDVH11FY)用于HCAb构建和产生。使所选sdAb的DNA序列与人IgG1 Fc的DNA序列融合以制备HCAb构建体。将HCAb构建体转染至哺乳动物细胞系中以进行HCAb表达。在条件培养基中分泌的HCAb通过蛋白A柱加以纯化。
HCAb的亲和力测定
使用表面等离子体共振(SPR)生物传感器Biacore T200(GE Healthcare)测定抗CTLA-4HCAb的结合动力学。将抗原CTLA-4-His融合蛋白固定在传感器芯片上。使HCAb作为分析物在5、10、20、40、80和160nM的浓度下流动。使用Biacore T200评估软件获得解离(kd)和缔合(ka)速率常数的数据。表观平衡解离常数(KD)由kd/ka的比率计算。如可在图23A-23B中所见(对于A34311HCAb，也参见图13D和图13E)，大多数人源化HCAb(A34311VH11、AS07014VH11、AS07014VH11G54、AS07014VH11SGA、AS07014VH11SGQ、AS07014VH11SGS、AS07189TKDVH11、AS07189TKDVH11F27和AS07189TKDVH11FY)的结合亲和力极其接近于相应亲本HCAb(A34311HCAb、AS07014 HCAb和AS07189 HCAb)的结合亲和力，从而表明在sdAb人源化之后，抗体亲和力不受影响。
通过FACS分析获得的CTLA-4-CHO结合
使用基于荧光激活的细胞分选(FACS)的测定来测定HCAb与在CHO细胞上表达的人CTLA-4的结合。使表达人CTLA-4的CHO细胞从粘附培养烧瓶解离，并且与不同浓度的抗体(在96孔板中)混合。用作抗CTLA-4抗体阳性对照。在室温下使混合物平衡30分钟，接着用FACS缓冲液(含有1％BSA的PBS)洗涤三次。接着添加异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的抗人κ抗体(Jackson ImmunoResearch)，并且在室温下孵育15分钟，从而充当二级抗体。将细胞再次用FACS缓冲液洗涤，并且通过流式细胞术来分析。数据用Prism(GraphPadSoftware,San Diego,CA)，利用非线性回归加以分析，并且计算EC50值。如图32A-32B中所示，FACS结合测定显示各种HCAb与/>展现相当的结合能力。
通过FACS分析获得的对配体结合的抑制
如实施例1中所述以类似方式，通过FACS分析来测试纯化的抗CTLA-4HCAb(A34311HCAb、A36566 HCAb、A36922 HCAb、AS07014 HCAb和AS07189HCAb)和人源化抗CTLA-4HCAb(A34311VH11 HCAb、AS07014VH11 HCAb、AS07189TKDVH11 HCAb、AS02636 HCAb、AS02626HCAb、AS02640 HCAb、AS07014VH11G54 HCAb、AS07014VH11SGA HCAb、AS07014VH11SGQHCAb、AS07014VH11SGS HCAb、AS07189TKDVH11F27 HCAb和AS07189TKDVH11FY HCAb)抑制CTLA-4-B7-1结合的能力。用作阳性对照。如可由图18A-18J(未显示其他构建体的结果)所见，竞争测定显示抗CTLA-4HCAb能够在低浓度(1-10μg/ml)下高效抑制CTLA4-B7-1相互作用。并且根据FACS数据的IC50，A34311 HCAb、A36566 HCAb、A36922 HCAb和大多数人源化抗CTLA-4HCAb(A34311VH11 HCAb、AS07014VH11 HCAb、AS07189TKDVH11 HCAb、AS02640HCAb、AS07014VH11G54 HCAb、AS07014VH11SGA HCAb、AS07014VH11SGQ HCAb、AS07014VH11SGS HCAb、AS07189TKDVH11F27 HCAb和AS07189TKDVH11FY HCAb)与市场药物显示相当的功能活性(图18J；未显示其他构建体的结果)。
基于CTLA-4的阻断测定
如实施例1中所述以类似方式进行基于CTLA-4的阻断测定。人IgG用作阴性对照。如可由图28A-28B(未显示其他构建的HCAb的测试结果)所见，A34311HCAb、AS07014 HCAb、AS07189 HCAb和大多数人源化HCAb(A34311VH11HCAb、AS07014VH11 HCAb、AS07189TKDVH11HCAb、AS07014VH11G54HCAb、AS07014VH11SGQ HCAb和AS07189TKDVH11FY HCAb)在抑制CTLA-4与B7-1之间的结合方面与市场药物显示相当的功能活性，这与上述基于FACS的配体竞争测定结果(图18A-18J)一致。
实施例7：抗CTLA-4HCAb的体内功效研究
测试A34311 HCAb、人源化AS07014VH11 HCAb和人源化AS07189TKDVH11 HCAb的体内功效。将6-8周龄人CTLA-4KI(敲入)雌性C57/BL6小鼠在它们的下背部上剃毛，并且用含1×106个结肠癌细胞系MC38的50μL 75％(vol/vol)RPMI(Life Technologies)和25％(vol/vol)中等密度基质胶(Corning)混悬液皮下注射。将根据目视检查在7天内肿瘤未能植入的小鼠从进一步研究排除。在MC38植入之后在第7天开始，每日测量肿瘤。将小鼠分别地分选至治疗群组中，并且仅当肿瘤达到150mm3的阈值时(在所有情况下在植入后约10天)才开始接受治疗。治疗的持续时间内每三天获取数字测径规测量结果和体重测量结果(图36A)。在实验中，用10mg/kg内部制备的Yervoy生物类似抗体或相当量的抗CTLA-4HCAb持续16天对小鼠静脉内给予治疗。每4天进行治疗。用PBS注射的小鼠充当阴性对照。如可由图36B所见，在MC38同基因小鼠模型中，A34311 HCAb、AS07014VH11 HCAb和AS07189TKDVH11HCAb有效控制肿瘤生长，与市场药物的生物类似物具有相当的功能活性。相较于模拟对照(注射PBS；图36C)，所有这些治疗都不影响经MC38植入的小鼠的体重。
实施例8：包含抗CTLA-4sdAb的双特异性抗体的产生和表征
CTLA-4×PD-1和CTLA-4×PD-L1双特异性抗原结合蛋白(BABP)的构建
双特异性抗体可用融合于全长抗体或全长抗体的在C末端中具有Fc区的scFv或Fab区的抗CTLA-4sdAb来构建，所述全长抗体诸如抗PD-1抗体，例如(帕母单抗)、(尼鲁单抗)、PD1BMmin，或抗PD-L1抗体，例如/>(阿特珠单抗)、IMFINZITM(度伐鲁单抗)。抗CTLA-4sdAb可通过接头(诸如9氨基酸Gly/Ser接头(9GS接头)、人IgG1(hIgG1)铰链或突变hIgG1铰链)或在无接头下连接于全长抗体(或全长抗体的在C末端中具有Fc区的scFv或Fab区)。抗CTLA-4sdAb可融合于至少一个重链、至少一个轻链、或重链与轻链两者。
这个实施例描述示例性CTLA-4×PD-1和CTLA-4×PD-L1双特异性抗原结合蛋白(BABP)的构建和表达。设计104个构建体。表达了68个构建体(构建体1-43、63-74、87-94和95-99)，并且表达36个构建体(构建体44-62、75-86和100-104)，所述构建体各自包含两组如下所述的多肽链(对于CTLA-4×PD-1BABP序列，也参见序列表，对于CTLA-4×PD-L1 BABP序列，也参见序列表)。简要来说，构建了(构建体1-43、63-74、87-94和95-99)或构建了(构建体44-62、75-86和100-104)包含抗CTLA-4sdAb(A34311、AS02640、A34311VH11、A34311VH2、A34311VH2F53、A34311VH11F53、AS07014VH11、AS07189TKDVH11、AS07014VH11SGQ、AS07189TKDVH11FY或AS07189TKDVH21FY)以或不以接头(9氨基酸Gly/Ser接头、人IgG1铰链接头或突变的hIgG1铰链接头)融合于抗PD-1全长抗体(例如(帕母单抗)、/>(尼鲁单抗)、PD1BMmin)或抗PD-L1全长抗体(例如/>(阿特珠单抗)、IMFINZITM(度伐鲁单抗))或全长抗体的scFv或Fab区的BABP。
构建体1-5(BCP-73、BCP-74、BCP-75、BCP-90、BCP-91)：第一多肽从N末端至C末端包含：抗CTLA-4sdAb(对于BCP-73是A34311VH11，对于BCP-74是AS07014VH11，对于BCP-75是AS07189TKDVH11，对于BCP-90是AS07014VH11SGQ，并且对于BCP-91是AS07189TKDVH11FY)的VHH结构域、肽接头(突变的人IgG1(hIgG1)铰链区，例如SEQ ID NO:307)、帕母单抗的重链可变结构域VH和IgG4的重链恒定结构域。第二多肽从N末端至C末端包含：帕母单抗的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域。这5种BABP具有图40的形式。
构建体6-10(BCP-78、BCP-79、BCP-80、BCP-94、BCP-95)：第一多肽从N末端至C末端包含：抗CTLA-4sdAb(对于BCP-78是A34311VH11，对于BCP-79是AS07014VH11，对于BCP-80是AS07189TKDVH11，对于BCP-94是AS07014VH11SGQ，并且对于BCP-95是AS07189TKDVH11FY)的VHH结构域、肽接头(突变的hIgG1铰链区，例如SEQ ID NO:307)、尼鲁单抗的重链可变结构域VH和IgG4的重链恒定结构域。第二多肽从N末端至C末端包含：尼鲁单抗的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域。这5种BABP具有图40的形式。
构建体11-19(BCP-100、BCP-101、BCP-103/104/105/106/107/108/109)：第一多肽从N末端至C末端包含：抗CTLA-4sdAb(对于BCP-100是AS07189TKDVH11FY，对于BCP-101是AS07014VH11SGQ，对于BCP-103是AS07189TKDVH21FY，对于BCP-104是A34311VH2，对于BCP-105是A34311VH2F53，对于BCP-106是A34311VH11，对于BCP-107是A34311VH11F53，对于BCP-108是AS07014VH11，并且对于BCP-109是AS07189TKDVH11)的VHH结构域、肽接头(突变的hIgG1铰链区，例如SEQ ID NO:307)、PD1BMmin的重链可变结构域VH和IgG4的重链恒定结构域(对于PD1BMmin重链氨基酸序列，参见SEQ ID NO:308)。第二多肽从N末端至C末端包含：PD1BMmin的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域(对于PD1BMmin轻链氨基酸序列，参见SEQ ID NO:309)。这9种BABP具有图40的形式。
构建体20-25(BCP-311K、A34311-hIgG1铰链-Keytruda、A34311-Keytruda、 AS02640-9GS-Keytruda、AS02640-hIgG1铰链-Keytruda、AS02640-Keytruda)：第一多肽从N末端至C末端包含：抗CTLA-4sdAb(对于BCP-311K、A34311-hIgG1铰链-Keytruda和A34311-Keytruda是A34311，对于AS02640-9GS-Keytruda、AS02640-hIgG1铰链-Keytruda和AS02640-Keytruda是AS02640)的VHH结构域、任选肽接头(对于BCP-311K和AS02640-9GS-Keytruda是SEQ ID NO:162，对于A34311-hIgG1铰链-Keytruda和AS02640-hIgG1铰链-Keytruda是SEQ ID NO:163，对于A34311-Keytruda和AS02640-Keytruda无接头)、帕母单抗的重链可变结构域VH和IgG4的重链恒定结构域。第二多肽从N末端至C末端包含：帕母单抗的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域。这6种BABP具有图40的形式。
构建体26-31(A34311-9GS-Opdivo、A34311-hIgG1铰链-Opdivo、A34311-Opdivo、 AS02640-9GS-Opdivo、AS02640-hIgG1铰链-Opdivo、AS02640-Opdivo)：第一多肽从N末端至C末端包含：抗CTLA-4sdAb(对于A34311-9GS-Opdivo、A34311-hIgG1铰链-Opdivo和A34311-Opdivo是A34311，对于AS02640-9GS-Opdivo、AS02640-hIgG1铰链-Opdivo和AS02640-Opdivo是AS02640)的VHH结构域、任选肽接头(对于A34311-9GS-Opdivo和AS02640-9GS-Opdivo是SEQ ID NO:162，对于A34311-hIgG1铰链-Opdivo和AS02640-hIgG1铰链-Opdivo是SEQ ID NO:163，对于A34311-Opdivo和AS02640-Opdivo无接头)、尼鲁单抗的重链可变结构域VH和IgG4的重链恒定结构域。第二多肽从N末端至C末端包含：尼鲁单抗的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域。这6种BABP具有图40的形式。
构建体32-37(A34311-9GS-Tecentriq、A34311-hIgG1铰链-Tecentriq、A34311- Tecentriq、AS02640-9GS-Tecentriq、AS02640-hIgG1铰链-Tecentriq、AS02640- Tecentriq)：第一多肽从N末端至C末端包含：抗CTLA-4sdAb(对于A34311-9GS-Tecentriq、A34311-hIgG1铰链-Tecentriq和A34311-Tecentriq是A34311，对于AS02640-9GS-Tecentriq、AS02640-hIgG1铰链-Tecentriq和AS02640-Tecentriq是AS02640)的VHH结构域、任选肽接头(对于A34311-9GS-Tecentriq和AS02640-9GS-Tecentriq是SEQ ID NO:162，对于A34311-hIgG1铰链-Tecentriq和AS02640-hIgG1铰链-Tecentriq是SEQ ID NO:163，对于A34311-Tecentriq和AS02640-Tecentriq无接头)、阿特珠单抗的重链可变结构域VH和非糖基化IgG1的重链恒定结构域。第二多肽从N末端至C末端包含：阿特珠单抗的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域。这6种BABP具有图40的形式。
构建体38-43(A34311-9GS-度伐鲁单抗、A34311-hIgG1铰链-度伐鲁单抗、A34311- 度伐鲁单抗、AS02640-9GS-度伐鲁单抗、AS02640-hIgG1铰链-度伐鲁单抗、AS02640-度伐鲁 单抗)：第一多肽从N末端至C末端包含：抗CTLA-4sdAb(对于A34311-9GS-度伐鲁单抗、A34311-hIgG1铰链-度伐鲁单抗和A34311-度伐鲁单抗是A34311，对于AS02640-9GS-度伐鲁单抗、AS02640-hIgG1铰链-度伐鲁单抗和AS02640-度伐鲁单抗是AS02640)的VHH结构域、任选肽接头(对于A34311-9GS-度伐鲁单抗和AS02640-9GS-度伐鲁单抗是SEQ ID NO:162，对于A34311-hIgG1铰链-度伐鲁单抗和AS02640-hIgG1铰链-度伐鲁单抗是SEQ ID NO:163，对于A34311-度伐鲁单抗和AS02640-度伐鲁单抗无接头)、度伐鲁单抗的重链可变结构域VH和IgG1(不具有ADCC和CDC活性的经工程化的IgG1)的无效重链恒定结构域。第二多肽从N末端至C末端包含：度伐鲁单抗的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域。这6种BABP具有图40的形式。
构建体44-48(BCP-73C、BCP-74C、BCP-75C、BCP-90C、BCP-91C)：第一多肽从N末端至C末端包含：帕母单抗的重链可变结构域VH、IgG4的重链恒定结构域、肽接头(突变的hIgG1铰链区，例如SEQ ID NO:307)和抗CTLA-4sdAb(对于BCP-73C是A34311VH11，对于BCP-74C是AS07014VH11，对于BCP-75C是AS07189TKDVH11，对于BCP-90C是AS07014VH11SGQ，并且对于BCP-91C是AS07189TKDVH11FY)的VHH结构域。第二多肽从N末端至C末端包含：帕母单抗的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域。这5种BABP具有图41的形式。
构建体49-53(BCP-78C、BCP-79C、BCP-80C、BCP-94C、BCP-95C)：第一多肽从N末端至C末端包含：尼鲁单抗的重链可变结构域VH、IgG4的重链恒定结构域、肽接头(突变的hIgG1铰链区，例如SEQ ID NO:307)和抗CTLA-4sdAb(对于BCP-78C是A34311VH11，对于BCP-79C是AS07014VH11，对于BCP-80C是AS07189TKDVH11，对于BCP-94C是AS07014VH11SGQ，并且对于BCP-95C是AS07189TKDVH11FY)的VHH结构域。第二多肽从N末端至C末端包含：尼鲁单抗的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域。这5种BABP具有图41的形式。
构建体54-62(BCP-100C、BCP-101C、BCP-103C/104C/105C/106C/107C/108C/ 109C)：第一多肽从N末端至C末端包含：PD1BMmin的重链可变结构域VH、IgG4的重链恒定结构域(对于PD1BMmin重链氨基酸序列，参见SEQ ID NO:308)、肽接头(突变的hIgG1铰链区，例如SEQ ID NO:307)和抗CTLA-4sdAb(对于BCP-100C是AS07189TKDVH11FY，对于BCP-101C是AS07014VH11SGQ，对于BCP-103C是AS07189TKDVH21FY，对于BCP-104C是A34311VH2，对于BCP-105C是A34311VH2F53，对于BCP-106C是A34311VH11，对于BCP-107C是A34311VH11F53，对于BCP-108C是AS07014VH11，并且对于BCP-109C是AS07189TKDVH11)的VHH结构域。第二多肽从N末端至C末端包含：PD1BMmin的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域(对于PD1BMmin轻链氨基酸序列，参见SEQ ID NO:309)。这9种BABP具有图41的形式。
构建体63-68(BCP-K311(BCP-2)、Keytruda-hIgG1铰链-A34311、Keytruda- A34311、Keytruda-9GS-AS02640、Keytruda-hIgG1铰链-AS02640、Keytruda-AS02640)：第一多肽从N末端至C末端包含：帕母单抗的重链可变结构域VH、IgG4的重链恒定结构域、任选肽接头(对于BCP-K311和Keytruda-9GS-AS02640是SEQ ID NO:162，对于Keytruda-hIgG1铰链-A34311和Keytruda-hIgG1铰链-AS02640是SEQ ID NO:163，对于Keytruda-A34311和Keytruda-AS02640无接头)和抗CTLA-4sdAb(对于BCP-K311、Keytruda-hIgG1铰链-A34311和Keytruda-A34311是A34311，对于Keytruda-9GS-AS02640、Keytruda-hIgG1铰链-AS02640和Keytruda-AS02640是AS02640)的VHH结构域。第二多肽从N末端至C末端包含：帕母单抗的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域。这六种BABP具有图41的形式。
构建体69-74(Opdivo-9GS-A34311、Opdivo-hIgG1铰链-A34311、Opdivo-A34311、 Opdivo-9GS-AS02640、Opdivo-hIgG1铰链-AS02640、Opdivo-AS02640)：第一多肽从N末端至C末端包含：尼鲁单抗的重链可变结构域VH、IgG4的重链恒定结构域、任选肽接头(对于Opdivo-9GS-A34311和Opdivo-9GS-AS02640是SEQ ID NO:162，对于Opdivo-hIgG1铰链-A34311和Opdivo-hIgG1铰链-AS02640是SEQ ID NO:163，对于Opdivo-A34311和Opdivo-AS02640无接头)和抗CTLA-4sdAb(对于Opdivo-9GS-A34311、Opdivo-hIgG1铰链-A34311和Opdivo-A34311是A34311，对于Opdivo-9GS-AS02640、Opdivo-hIgG1铰链-AS02640和Opdivo-AS02640是AS02640)的VHH结构域。第二多肽从N末端至C末端包含：尼鲁单抗的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域。这六种BABP具有图41的形式。
构建体75-80(Tecentriq-9GS-A34311、Tecentriq-hIgG1铰链-A34311、 Tecentriq-A34311、Tecentriq-9GS-AS02640、Tecentriq-hIgG1铰链-AS02640、Tecentriq- AS02640)：第一多肽从N末端至C末端包含：阿特珠单抗的重链可变结构域VH、非糖基化IgG1的重链恒定结构域、任选肽接头(对于Tecentriq-9GS-A34311和Tecentriq-9GS-AS02640是SEQ ID NO:162，对于Tecentriq-hIgG1铰链-A34311和Tecentriq-hIgG1铰链-AS02640是SEQ ID NO:163，对于Tecentriq-A34311和Tecentriq-AS02640无接头)和抗CTLA-4sdAb(对于Tecentriq-9GS-A34311、Tecentriq-hIgG1铰链-A34311和Tecentriq-A34311是A34311，对于Tecentriq-9GS-AS02640、Tecentriq-hIgG1铰链-AS02640和Tecentriq-AS02640是AS02640)的VHH结构域。第二多肽从N末端至C末端包含：阿特珠单抗的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域。这六种BABP具有图41的形式。
构建体81-86(度伐鲁单抗-9GS-A34311、度伐鲁单抗-hIgG1铰链-A34311、度伐鲁 单抗-A34311、度伐鲁单抗-9GS-AS02640、度伐鲁单抗-hIgG1铰链-AS02640、度伐鲁单抗- AS02640)：第一多肽从N末端至C末端包含：度伐鲁单抗的重链可变结构域VH、IgG1(不具有ADCC和CDC活性的工程化的IgG1)的无效重链恒定结构域、任选肽接头(对于度伐鲁单抗-9GS-A34311和度伐鲁单抗-9GS-AS02640是SEQ ID NO:162，对于度伐鲁单抗-hIgG1铰链-A34311和度伐鲁单抗-hIgG1铰链-AS02640是SEQ ID NO:163，对于度伐鲁单抗-A34311和度伐鲁单抗-AS02640无接头)和抗CTLA-4sdAb(对于度伐鲁单抗-9GS-A34311、度伐鲁单抗-hIgG1铰链-A34311和度伐鲁单抗-A34311是A34311，对于度伐鲁单抗-9GS-AS02640、度伐鲁单抗-hIgG1铰链-AS02640和度伐鲁单抗-AS02640是AS02640)的VHH结构域。第二多肽从N末端至C末端包含：度伐鲁单抗的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域。这六种BABP具有图41的形式。
构建体87(BCP-16)：第一多肽从N末端至C末端包含：帕母单抗的重链可变结构域VH和IgG4的重链恒定结构域。第二多肽从N末端至C末端包含：抗CTLA-4sdAb(A34311)的VHH结构域、肽接头(人IgG1铰链区，例如SEQ ID NO:163)、帕母单抗的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域。BCP-16具有图42的形式。
构建体88(BCP-17)：第一多肽从N末端至C末端包含：帕母单抗的重链可变结构域VH和IgG4的重链恒定结构域。第二多肽从N末端至C末端包含：帕母单抗的轻链可变结构域VL、抗体κ轻链CL结构域、肽接头(SEQ ID NO:163)、抗CTLA-4sdAb(A34311)的VHH结构域。BCP-17具有图43的形式。
构建体89(BCP-31)：第一多肽从N末端至C末端包含：抗CTLA-4sdAb(A34311)的VHH结构域、肽接头(9GS接头，例如SEQ ID NO:162)、帕母单抗的重链可变结构域VH和IgG4的重链恒定结构域。第二多肽从N末端至C末端包含：抗CTLA-4sdAb(A34311)的VHH结构域、肽接头(9GS接头，例如SEQ ID NO:162)、帕母单抗的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域。BCP-31具有图44的形式。
构建体90(BCP-32)：第一多肽从N末端至C末端包含：抗CTLA-4sdAb(A34311)的VHH结构域、肽接头(9GS接头，例如SEQ ID NO:162)、抗CTLA-4sdAb(A34311)的VHH结构域、肽接头(SEQ ID NO:162)、帕母单抗的重链可变结构域VH和IgG4的重链恒定结构域。第二多肽从N末端至C末端包含：帕母单抗的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域。BCP-32具有图45的形式。
构建体91(BCP-33)：第一多肽从N末端至C末端包含：帕母单抗的重链可变结构域VH、IgG1的恒定CH1区、肽接头(SEQ ID NO:163)、抗CTLA-4sdAb(A34311)的VHH结构域和IgG1的Fc区。第二多肽从N末端至C末端包含：帕母单抗的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域。BCP-33具有图46的形式。
构建体92(BCP-34)：多肽从N末端至C末端包含：帕母单抗的轻链可变结构域VL、肽接头(GGGGSGGGGSGGGGS，SEQ ID NO:365)、帕母单抗的重链可变结构域VH、肽接头(SEQ IDNO:163)、抗CTLA-4sdAb(A34311)的VHH结构域和IgG1的Fc区。BCP-34具有图47的形式。
构建体93(BCP-35)：第一多肽从N末端至C末端包含：帕母单抗的重链可变结构域VH、IgG4的恒定CH1区、肽接头(SEQ ID NO:163)、抗CTLA-4sdAb(A34311)的VHH结构域、IgG4的恒定CH1区和IgG4的Fc区。第二多肽从N末端至C末端包含：帕母单抗的轻链可变结构域VL、抗体κ轻链CL结构域、肽接头(SEQ ID NO:163)、抗CTLA-4sdAb(A34311)的VHH结构域和抗体κ轻链CL结构域。BCP-35具有图48的形式。
构建体94(BCP-36)：第一多肽从N末端至C末端包含：帕母单抗的轻链可变结构域VL、肽接头(SEQ ID NO:365)、帕母单抗的重链可变结构域VH、肽接头(SEQ ID NO:163)、抗CTLA-4sdAb(A34311)的VHH结构域、IgG1的恒定CH1区和IgG1的Fc区。第二多肽从N末端至C末端包含：抗CTLA-4sdAb(A34311)的VHH结构域和抗体κ轻链CL结构域。BCP-36具有图49的形式。
构建体95-99(BCP-83、BCP-84、BCP-85、BCP-92、BCP-93)：第一多肽从N末端至C末端包含：抗CTLA-4sdAb(对于BCP-83是A34311VH11，对于BCP-84是AS07014VH11，对于BCP-85是AS07189TKDVH11，对于BCP-92是AS07014VH11SGQ，并且对于BCP-93是AS07189TKDVH11FY)的VHH结构域、肽接头(突变的hIgG1铰链区，例如SEQ ID NO:307)、阿特珠单抗的重链可变结构域VH和非糖基化IgG1的重链恒定结构域。第二多肽从N末端至C末端包含：阿特珠单抗的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域。这5种BABP具有图40的形式。
构建体100-104(BCP-83C、BCP-84C、BCP-85C、BCP-92C、BCP-93C)：第一多肽从N末端至C末端包含：阿特珠单抗的重链可变结构域VH、非糖基化IgG1的重链恒定结构域、肽接头(突变的hIgG1铰链区，例如SEQ ID NO:307)和抗CTLA-4sdAb(对于BCP-83C是A34311VH11，对于BCP-84C是AS07014VH11，对于BCP-85C是AS07189TKDVH11，对于BCP-92C是AS07014VH11SGQ，并且对于BCP-93C是AS07189TKDVH11FY)的VHH结构域。第二多肽从N末端至C末端包含：阿特珠单抗的轻链可变结构域VL和抗体κ轻链CL结构域。这5种BABP具有图41的形式。
上述各BABP(除构建体92(BCP-34)之外)都由两个拷贝的第一多肽和两个拷贝的第二多肽组成。构建体92(BCP-34)由两个拷贝的多肽组成。可将S228P突变引入IgG4 Fc区中以抑制Fab臂交换。此外，可使BABP的Fc区与不同同种型例如IgG1同种型或IgG4同种型的IgG Fc交换。IgG4同种型的Fc区对FcγR具有低结合亲和力，因此可在一些实施方案中用于避免ADCC介导的PD-1/PD-L1或CTLA-4阳性细胞耗竭。在一些实施方案中，BABP包含有ADCC的野生型IgG1。
BABP产生
制备了68个BABP构建体(构建体1-43、63-74、87-94和95-99)的质粒，并且在CHO-3E7细胞中短暂表达。其中，19个示例性BABP构建体(BCP-311K、BCP-K311(BCP-2)、BCP-73、BCP-74、BCP-75、BCP-78、BCP-79、BCP-80、BCP-16、BCP-17、BCP-31、BCP-32、BCP-33、BCP-34、BCP-35、BCP-36、BCP-83、BCP-84和BCP-85)通过一步蛋白A色谱法纯化，并且储存在PBS缓冲液(pH7.2)中。纯化BABP的组成和纯度通过SDS-PAGE在还原条件与非还原条件两者下加以分析。多肽链以及全长BABP分子的大小与它们的基于氨基酸序列计算的分子质量一致。为进一步研究BABP在溶液中的物理性质，尺寸排阻色谱法用于分析各蛋白质。所有BABP都展现单一主峰，从而显示作为单体分子的物理同质性，所述单体分子即非聚集BABP分子，各自是由4条多肽链组成的二聚体蛋白质，包括2个拷贝的第一多肽链和2个拷贝的第二多肽链(BCP-34是由2个拷贝的多肽链组成的二聚体蛋白质)。一些数据的概述显示于表3中。表3中的数据显示大多数BABP的产生水平与常规单克隆抗体的产生水平类似，从而指示BABP可在哺乳动物细胞中高效表达。
制备36个BABP构建体(构建体44-62、75-86和100-104)的质粒，并且在CHO-3E7细胞中短暂表达，随后用一步蛋白A色谱法纯化。
表3.示例性CTLA-4×PD-1和CTLA-4×PD-L1 BABP的产生
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稳定性分析
使用MICROCALTMVP-Capillary差示扫描量热法(DSC，Microcal,Northampton,MA,USA,Malvern Instruments)探究各种BABP的热稳定性。根据MICROCALTMVP-Capillary DSC使用者手册，将约370μl的各BABP(1mg/ml)和它的相应缓冲液添加至96孔板中。在各次样品操作之间包括清洁剂清洁程序以保持参照细胞和样品细胞清洁。所有样品都以被动模式以90℃/h(1.5℃/min)的扫描速率从20℃至100℃加以扫描。使用基于ORGINTM7.0(Northampton,MA,USA)的VP-Capillary DSC软件分析收集的数据。所有热分析图都加以对照和基线减除以获得蛋白质展开的表观中点(Tm)和表观焓(ΔH)。各种BABP的展开中点温度(Tm)显示于表4(DSC)中。
使用动态光散射(DLS)追踪较大蛋白质聚集物在加热期间的形成。使用板读取器(Wyatt,Santa Barbara,California)对在1.5mg/ml下的样品进行从25℃至75℃的温度匀变，采用约0.75℃的温度间隔。将20μl的各BABP样品添加至/>一次性比色皿中，随后用10μl的矿物油(Sigma 8410)覆盖样品以防止蒸发。对各BABP样品的一式三份测量结果(5次获取/每次测量)进行平均化。在用所选温度间隔进行的实验的持续时间中，热扫描速率被计算为1.5℃/min。在连续加热温度直至靶标温度达到75℃(约40分钟)的同时测量各样品。在DYNAMICSTM7.6.0.48软件(Wyatt,SantaBarbara,California)中用起始分析方法分析聚集温度(Tagg)。各种BABP的测量聚集起始温度(Tagg)显示于表4中。
表4.示例性CTLA-4×PD-1和CTLA-4×PD-L1 BABP的DSC和DLS分析
如表4中所示，BCP-73、BCP-74和BCP-75的Tm和Tagg与生物类似帕母单抗(例如相较于)的Tm和Tagg相当，BCP-78、BCP-79和BCP-80的Tm和Tagg与生物类似尼鲁单抗(例如相较于/>)的Tm和Tagg相当，并且BCP-84和BCP-85的Tm和Tagg与生物类似阿特珠单抗(例如相较于/>)的Tm和Tagg相当。
在4℃、25℃和37℃的恒定温度下，在组氨酸缓冲液(pH 6.0)中，在>50mg/ml的浓度下孵育BABP样品7天。也使一组类似样品冷冻-解冻5次。所有样品的完整完全单体分子的级分都通过SEC-HPLC来评估，并且使用由制造商提供的CHROMELEONTM软件记录和分析数据。表5显示示例性BABP在热激发条件下保留大于90％完整性。
表5.示例性CTLA-4×PD-1BABP的稳定性分析
溶解性分析
为表征纯化的BABP的溶解性，将10mg在1mg/ml下的各BABP以约2.5ml的体积添加至-30kDa离心浓缩器(EMD Millipore)中，并且在4000×g(4℃)下离心。定期检查体积，并且将蛋白质添加至浓缩器中直至剩余蛋白质溶液已被消耗。进行浓缩2小时直至体积达到约20μl或停止降低。通过对由将1μl浓缩BABP稀释至199μl各相应缓冲液中获得的样品进行紫外测量来测定浓度。在将BABP于它们的相应缓冲液中稀释至1mg/ml之后，使用分析型SEC-HPLC评估样品的聚集。表6显示BABP在这些应激条件下保留完全完整性。/>
也使用交叉-相互反应色谱(CIC)柱测量纯化的BABP的溶解性。从汇合的小鼠血清纯化的鼠多克隆抗体购自Sigma-Aldrich(15381)。使鼠多克隆抗体在约30mg/mL下偶联于树脂基质。将纯化的BABP于PBS缓冲液中以在0.05至0.20mg/mL的范围内的浓度分别注射至鼠IgG偶联柱和对照柱中。保留时间用于计算表6中报道的保留因子k’值：k'＝(Vr-Vo)/Vo＝(Tr-Tm)/Tm。Vr代表蛋白质偶联柱上的样品洗脱体积，Vo代表来自对照柱的洗脱体积，Tr代表蛋白质偶联柱上的保留时间，并且Tm代表对照柱上的保留时间。许多样品在同一柱上操作两次。k’值>0.6的抗体的溶解性通常显著较小。根据表6，所有BABP都展现卓越溶解性。
表6.示例性CTLA-4×PD-1 BABP的溶解性分析
双特异性抗体的亲和力测定
在纯化之后，如实施例1中所述用类似方法测量双特异性抗体的结合亲和力参数，并且与它们的单体抗体(例如抗CTLA-4Ab、抗PD-L1 Ab或抗PD-1Ab)进行比较。充当阳性抗CTLA-4Ab对照，/>和/>充当阳性抗PD-1Ab对照，/>充当抗PD-L1抗体的阳性对照。简要来说，对于测定对CTLA-4的结合亲和力，将抗体固定于芯片上，并且使CTLA-4-His蛋白作为分析物在12.5、25、50、100和200nM的浓度下流动；对于测定对PD-1的结合亲和力，将抗体固定于芯片上，并且使PD-1-His蛋白作为分析物在3.125、6.25、12.5、25、50和100nM的浓度下流动；对于测定对PD-L1的结合亲和力，将抗体固定于芯片上，并且使PD-L1-His蛋白作为分析物在1.56、3.125、6.25、12.5、25和50nM的浓度下流动。
八种示例性CTLA-4×PD-1双特异性抗体(BCP-311K、BCP-K311(BCP-2)、BCP-73、BCP-74、BCP-75、BCP-78、BCP-79和BCP-80)的结合动力学数据显示于图12A-12D、图13A-13E、图24A-24B以及图25A-25B中。结果指示构建的CTLA-4×PD-1双特异性抗体针对PD-1和CTLA-4的结合亲和力分别极其接近于抗PD-1单克隆抗体和/>(图12A-12D、图25A-25B)和抗CTLA-4单克隆抗体/>(图13A-13E、图24A-24B)。
三种示例性CTLA-4×PD-L1双特异性抗体(BCP-83、BCP-84和BCP-85)的结合动力学数据显示于图24A-24B和图26A-26B中。结果指示构建的CTLA-4×PD-L1双特异性抗体针对PD-L1和CTLA-4的结合亲和力分别极其接近于抗PD-L1单克隆抗体(图26A-26B)和抗CTLA-4单克隆抗体/>(图24A-24B)。
使用表面等离子体共振(SPR)生物传感器T200(GE Healthcare)测定BCP-2、BCP-16、BCP-17、BCP-31、BCP-32、BCP-33、BCP-34、BCP-35、BCP-36与PD-1的结合动力学。以50nM起始，以3倍连续稀释制备不同浓度的BABP样品。将各BABP样品通过Fc捕集方法来固定在传感器芯片上。抗原PD-1-His用作分析物。使用/>T200评估软件获得解离(kd)和缔合(ka)速率常数。表观平衡解离常数(KD)由kd/ka的比率计算。如表7中所示，BABP保留与帕母单抗(例如/>)和尼鲁单抗(例如/>)相当的与PD-1的结合动力学。
使用表面等离子体共振(SPR)生物传感器T200(GE Healthcare)测定A34311 HCAb和BABP BCP-2、BCP-16、BCP-17、BCP-31、BCP-32、BCP-33、BCP-34、BCP-35、BCP-36与CTLA-4的结合动力学。以200nM起始，以3倍连续稀释制备不同浓度的BABP样品。将各BABP样品通过Fc捕集方法来固定在传感器芯片上。抗原CTLA-4-His用作分析物。使用T200评估软件获得解离(kd)和缔合(ka)速率常数。表观平衡解离常数(KD)由kd/ka的比率计算。如表7中所示，结合动力学显示这些BABP与它们的融合于Fc的相应抗CTLA-4sdAb(对于A34311 HCAb，参见数据)展现相当的与CTLA-4的结合动力学。此外，这些BABP与易普利单抗(例如/>)具有相当的与CTLA-4的结合动力学。
表7.示例性CTLA-4×PD-1BABP的结合数据
通过FACS测定评估的与在细胞上表达的CTLA-4、PD-1或PD-L1的结合
如实施例6中在子章节“通过FACS分析获得的CTLA-4-CHO结合”下所述，使用类似的基于FACS的测定来测定CTLA-4×PD-1双特异性抗体(BCP-73、BCP-74、BCP-75、BCP-78、BCP-79和BCP-80)或CTLA-4×PD-L1双特异性抗体(BCP-83、BCP-84和BCP-85)与在CHO细胞上表达的人CTLA-4的结合。如图33A-33B中所示，FACS结合测定显示纯化的BABP与展现相当的CTLA-4结合能力。
使用基于FACS的测定来测定CTLA-4×PD-1双特异性抗体(BCP-73、BCP-74、BCP-75、BCP-78、BCP-79和BCP-80)与在CHO细胞上表达的人PD-1的结合。使表达人PD-1的CHO细胞从粘附培养烧瓶解离，并且与不同浓度的抗体(两者均在96孔板中)混合。和/>用作抗PD-1抗体阳性对照。人IgG用作阴性结合对照。在室温下使混合物平衡30分钟，用FACS缓冲液(含有1％ BSA的PBS)洗涤三次。接着添加用作二级抗体的FITC缀合的抗人κ抗体(Jackson ImmunoResearch)，并且在室温下孵育15分钟。细胞再次用FACS缓冲液洗涤，并且通过流式细胞术来分析。数据用Prism(GraphPad Software,San Diego,CA)，利用非线性回归加以分析，并且计算EC50值。如图34A-34B中所示，FACS结合测定显示这些CTLA-4×PD-1双特异性抗体与/>和/>展现相当的PD-1结合能力。
以类似方式测定CTLA-4×PD-L1双特异性抗体(BCP-83、BCP-84和BCP-85)与在CHO细胞上表达的人PD-L1的结合。用作抗PD-L1抗体阳性对照。如图35A-35B中所示，FACS结合测定显示这些CTLA-4×PD-L1双特异性抗体与/>展现相当的PD-L1结合能力。
如上所述使用类似的基于FACS的测定来测定BABP BCP-2、BCP-16、BCP-17、BCP-31、BCP-32、BCP-33、BCP-34、BCP-35、BCP-36对在CHO细胞上表达的PD-1的结合亲和力。制备BABP样品(以1μM起始，3倍连续稀释，具有10个浓度)作为一级抗体用于FACS分析。如表7中所示，FACS结合测定显示这些BABP保留与帕母单抗(例如)和尼鲁单抗(例如)相当的PD-1结合亲和力。
以类似方式测定BABP BCP-2、BCP-16、BCP-17、BCP-31、BCP-32、BCP-33、BCP-34、BCP-35、BCP-36对在CHO细胞上表达的CTLA-4的结合亲和力。制备BABP样品(以1μM起始，3倍连续稀释，具有10个浓度)作为一级抗体用于FACS分析。A34311 HCAb和易普利单抗(例如)用作抗CTLA-4抗体阳性对照。如表7中所示，FACS结合测定显示这些BABP与它们的融合于Fc的相应sdAb(对于A34311 HCAb，参见数据)展现相当的对CTLA-4的结合亲和力。此外，这些BABP与易普利单抗(例如/>)显示相当的对CTLA-4的结合亲和力。
通过FACS分析获得的对配体结合的抑制
使用FACS测定评估BABP对配体结合的抑制。
为评估BABP BCP-73、BCP-74、BCP-75、BCP-78、BCP-79、BCP-80、BCP-2、BCP-16、BCP-17、BCP-31、BCP-32、BCP-33、BCP-34、BCP-35和BCP-36对PD-1的抑制，制备BABP样品(以1μM起始，3倍连续稀释，具有10个浓度)。使表达人PD-1的CHO细胞从粘附培养烧瓶解离，并且与不同浓度的各BABP和0.5μM具有生物素标记的hPD-L1-Fc融合蛋白混合。帕母单抗(例如)或尼鲁单抗(例如/>)用作抗PD-1抗体阳性对照。在室温下使混合物平衡30分钟，并且用FACS缓冲液(含有1％ BSA的PBS)洗涤三次。接着将PE/Cy5链霉亲和素二级抗体添加至混合物中，并且在室温下孵育15分钟。随后，细胞用FACS缓冲液洗涤，并且通过流式细胞术来分析。数据用PRISMTM(GraphPad Software,San Diego,CA)，利用非线性回归加以分析，并且计算IC50值(表7、图20A-20J)。竞争测定显示BABP能够在低浓度(1-10μg/ml)下高效抑制PD-1/PD-L1相互作用。表7和图20J中的结合数据指示示例性CTLA-4×PD-1BABP的功能活性极其类似于帕母单抗(例如/>)和尼鲁单抗(例如/>)。
为评估CTLA-4×PD-1BABP BCP-73、BCP-74、BCP-75、BCP-78、BCP-79、BCP-80、BCP-2、BCP-16、BCP-17、BCP-31、BCP-32、BCP-33、BCP-34、BCP-35、BCP-36以及CTLA-4×PD-L1BABP BCP-83、BCP-84、BCP-85对B7-1(一种CTLA-4配体)的抑制，制备BABP样品(以1μM起始，3倍连续稀释，具有10个浓度)。使表达人B7-1的CHO细胞从粘附培养烧瓶解离，并且与不同浓度的各BABP和0.5μM具有生物素标记的hCTLA-4-Fc融合蛋白混合。A34311HCAb和易普利单抗(例如)用作抗CTLA-4抗体阳性对照。在室温下使混合物平衡30分钟，并且用FACS缓冲液(含有1％ BSA的PBS)洗涤三次。接着将PE/Cy5链霉亲和素二级抗体添加至混合物中，并且在室温下孵育15分钟。随后，细胞再次用FACS缓冲液洗涤，并且通过流式细胞术来分析。数据用PRISMTM(GraphPad Software,San Diego,CA)，利用非线性回归加以分析，并且计算IC50值(表7、图19A-19L)。竞争测定显示BABP能够在低浓度(1-10μg/ml)下高效抑制CTLA4-B7-1相互作用。表7和图19L中的结合数据指示示例性CTLA-4×PD-1和CTLA-4×PD-L1 BABP的功能活性类似于它们的融合于Fc的相应抗CTLA-4sdAb(对于A34311 HCAb，参见数据)和易普利单抗(例如/>)。
为评估CTLA-4×PD-L1 BABP BCP-83、BCP-84、BCP-85对PD-L1的抑制，使表达人PD-L1的CHO细胞从粘附培养烧瓶解离，并且与不同浓度的各BABP(以1μM起始，以3倍连续稀释获得10个浓度)和0.1μM的具有生物素标记的hPD-1-Fc融合蛋白混合。阿特珠单抗(例如)用作PD-L1抗体的阳性抗体对照。人IgG用作阴性对照。帕母单抗(例如)用作抗PD-1抗体的对照，其将结合至hPD-1-Fc融合蛋白，并且阻断PD-L1-PD-1相互作用。在室温下使混合物平衡30分钟，并且用FACS缓冲液(含有1％ BSA的PBS)洗涤三次。接着将PE/Cy5链霉亲和素二级抗体添加至混合物中，并且在室温下孵育15分钟。随后，细胞用FACS缓冲液洗涤，并且通过流式细胞术来分析。数据用PRISMTM(GraphPad Software,San Diego,CA)，利用非线性回归加以分析，并且计算IC50值并显示于图21A-21G中。竞争测定显示这些CTLA-4×PD-L1BABP类似于阿特珠单抗(例如/>)和帕母单抗(例如)，能够高效抑制PD-1/PD-L1相互作用。
BABP的表达概况和双重结合性质明确显示BABP具有双特异性，所述BABP具有由通过4链抗体(对于BCP-34是2链)的VH和VL的正确配对形成的抗原结合位点提供的第一特异性和由VHH提供的第二特异性。
体外功能性测定
可使用监测T细胞增殖、IFN-γ释放、IL-2分泌或由PD-1、PD-L1或CTLA-4路径中的信号传导分子驱动的报道基因的表达的多种生物测定来研究BABP CTLA-4×PD-1对PD-1和CTLA-4路径的阻断或BABP CTLA-4×PD-L1对PD-L1和CTLA-4路径的阻断。
举例来说，可通过在包含表达PD-L1的靶标细胞和活化的T细胞(在表面上表达PD-1、CTLA-4)的混合淋巴细胞反应(MLR)中测定IL-2分泌水平来研究由CTLA-4×PD-1双特异性抗体达成的PD-1抑制，其中在各种浓度下提供CTLA-4×PD-1双特异性抗体。
使用分离试剂盒(Miltenyl Biotec)从PBMC纯化人CD4+T细胞和同种异体单核细胞。将单核细胞诱导成树突细胞。各孔含有105个CD4+T细胞和104个同种异体树突细胞，最终工作体积是200μl。将CTLA-4×PD-1BABP(BCP-73、BCP-74、BCP-75、BCP-78、BCP-79、BCP-80)或CTLA-4×PD-L1 BABP(BCP-83、BCP-84、BCP-85)在不同浓度下添加至各孔中。无抗体情况用作本底对照。人IgG4用作阴性对照。用作阳性抗CTLA-4抗体对照。在37℃/5％CO2孵育器中孵育72小时之后，从各测试孔获取100μl培养基以进行IL-2分泌测量(Cisbio)。MLR中的抗体浓度依赖性IL-2分泌用于求取CTLA-4×PD-1BABP或CTLA-4×PD-L1BABP的抗CTLA-4活性的EC50值(图29B)，并且与/>的EC50值进行比较。与基于FACS的配体竞争测定结果(参见图19L)一致，CTLA-4×PD-1BABP或CTLA-4×PD-L1 BABP在结合至CTLA-4方面的功能活性与它们的单克隆抗体/>相当(图29A-29B)。
使用PD-1/NFAT报道子-Jurkat T细胞(表达在NFAT应答元件的控制下的萤火虫荧光素酶基因以及组成性表达人PD-1的重组Jurkat T细胞)，在PD-1/PD-L1细胞-基测定中对CTLA-4×PD-1和CTLA-4×PD-L1 BABP的生物活性的表征显示于图30A-30B中。在这个情况下，使CHO-K1细胞稳定表达人PD-L1和经工程化的T细胞受体(TCR)活化子。在与经工程化的CHO-K1细胞共培养之前，使效应细胞PD-1/NFAT报道子-Jurkat T细胞与连续稀释的CTLA-4×PD-1BABP一起预孵育30分钟；或在与效应细胞PD-1/NFAT报道子-Jurkat T细胞共培养之前，使经工程化的CHO-K1细胞与连续稀释的CTLA-4×PD-L1 BABP一起预孵育30分钟。在约6小时刺激之后，将ONE-STEPTM荧光素酶试剂添加至细胞中以测量NFAT活性。数据用PRISMTM(GraphPad Software,San Diego,CA)，利用非线性回归加以分析，并且计算EC50值(图30B)。报道子测定显示所有CTLA-4×PD-1BABP(BCP-73、BCP-74、BCP-75、BCP-78、BCP-79、BCP-80)都能够以与它们的单特异性亲本抗体或/>类似的方式高效阻断PD-1/PD-L1信号传导以及使NFAT信号活化；并且所有CTLA-4×PD-L1 BABP(BCP-83、BCP-84、BCP-85)都以与它们的单特异性亲本抗体/>类似的方式高效阻断PD-1/PD-L1信号传导以达成NFAT信号活化。
实施例9：双特异性抗体的体内功效研究
将针对PD-1的示例性CTLA-4×PD-1双特异性抗体对肿瘤生长的影响与抗PD-1抗体(内部产生的Opdivo生物类似和Keytruda生物类似4链抗体)的影响进行比较。将6-8周龄人PD-1KI(敲入)雌性C57/BL6小鼠在它们的下背部上剃毛，并且用含1×106个结肠癌细胞系MC38的50μL 75％(vol/vol)RPMI(Life Technologies)和25％(vol/vol)中等密度基质胶(Corning)混悬液皮下注射。将根据目视检查在7天内肿瘤未能植入的小鼠从进一步研究排除。在MC38植入之后在第7天开始，每日测量肿瘤。将小鼠单独地分选至治疗群组中，并且仅当肿瘤达到150mm3的阈值时(在所有情况下在植入后约10天)才开始接受治疗。治疗的持续时间内每三天获取数字测径规测量结果和体重测量结果(图37A-37B)。在实验中，用10mg/kg Keytruda生物类似抗体(帕母单抗)或Opdivo生物类似抗体(尼鲁单抗)或12.3mg/kg CTLA-4×PD-1双特异性抗体(BCP-75、BCP-79和BCP-80)持续16天对小鼠腹膜内(i.p.)给予治疗。每4天进行治疗。用PBS注射的小鼠充当阴性对照。如可由图37A所见，在MC38同基因小鼠模型中，所有双特异性抗体都有效控制肿瘤生长，与Keytruda生物类似物和Opdivo生物类似物具有相当的功能活性。相较于模拟对照，所有治疗都不影响经MC38植入的小鼠的体重(图37B)。
将针对CTLA-4的示例性CTLA-4×PD-1双特异性抗体对肿瘤生长的影响与抗CTLA-4抗体(Yervoy生物类似物)的影响进行比较。将6-8周龄人CTLA-4KI(敲入)雌性C57/BL6小鼠在它们的下背部上剃毛，并且用含1×106个结肠癌细胞系MC38的50μL 75％(vol/vol)RPMI(Life Technologies)和25％(vol/vol)中等密度基质胶(Corning)混悬液皮下注射。将根据目视检查在7天内肿瘤未能植入的小鼠从进一步研究排除。在MC38植入之后在第7天开始，每日测量肿瘤。将小鼠分别地分选至治疗群组中，并且仅当肿瘤达到150mm3的阈值时(在所有情况下在植入后约10天)才开始接受治疗。治疗的持续时间内每三天获取数字测径规测量结果和体重测量结果(图38A-38B)。在实验中，用10mg/kg Yervoy生物类似抗体、12.3mg/kg CTLA-4×PD-1双特异性抗体(BCP-75、BCP-79或BCP-80)或6.7mg/kg的它们相应的抗CTLA-4HCAb(AS07014VH11 HCAb或AS07189TKDVH11 HCAb)持续16天对小鼠腹膜内(i.p.)给予治疗。用PBS注射的小鼠充当模拟对照。每4天进行治疗。如可由图38A所见，在MC38同基因小鼠模型中，所有CTLA-4×PD-1双特异性抗体都有效控制肿瘤生长，与Yervoy生物类似物具有相当的功能活性。相较于模拟对照，所有治疗都不影响经MC38植入的小鼠的体重(图38B)。
在通过将PD-L1表达性肿瘤细胞植入C57BL/6CTLA-4KI小鼠中制备的小鼠异种移植模型的情况下测试针对CTLA-4和PD-L1的示例性CTLA-4×PD-L1双特异性抗体(BCP-84、BCP-85)对肿瘤生长的影响。稳定表达人PD-L1的鼠结肠腺癌细胞系MC38用于这个测定中。将8周龄C57BL/6CTLA-4KI小鼠在它们的下背部上剃毛，并且用1×107个MC38-hPD-L1 KI细胞皮下注射。将根据目视检查在7天内肿瘤未能植入的小鼠从进一步研究排除。在MC38植入之后在第7天开始，每日测量肿瘤。肿瘤尺寸用测径规测量，并且肿瘤体积根据修改的椭圆体公式：长度×(宽度)2/2计算。当肿瘤达到约90-130mm3的体积时，将小鼠随机分配至不同治疗组中，所述治疗组被维持2或6周。在治疗的持续时间内每三天获取数字测径规测量结果和体重测量结果(图39A-39B)。用3mg/kg内部表达的Tecentriq生物类似抗体、相当量(3.7mg/kg)的CTLA-4×PD-L1双特异性抗体(BCP-84或BCP-85)、相当量(1.6mg/kg)的相应抗CTLA-4HCAb(AS07014VH11 HCAb或AS07189VH11 HCAb)或组合疗法(Tecentriq生物类似物加AS07014VH11 HCAb、或Tecentriq生物类似物加AS07189TKDVH11HCAb)持续16天对小鼠腹膜内(i.p.)给予治疗。用PBS注射的小鼠充当阴性对照。每4天进行治疗。如可由图39A所见，在小鼠肿瘤模型中，所有CTLA-4×PD-L1双特异性抗体组和组合疗法组都超过任一单药疗法(相应抗CTLA-4HCAb或Tecentriq生物类似物)显示更高肿瘤抑制功效(图39A)。值得注意的是，BCP-84和BCP-85的抗肿瘤功效与组合疗法相当。相较于模拟对照，所有治疗都不影响经MC38植入的小鼠的体重(图39B)。
序列表
SEQ ID NO:106(AS07189 sdAb核酸序列)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGAGACAGTCCTAGTGTGAACTACATGGGCTGGTTCCGCCGGGCTC
CAGAAAAACAGCGCGAGCAGCGCGAGGAGGTCGCAAGTATTTATCCCACAGGTGGCACGT
TTTACACAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCGAGACAACGCCAAGAACACTCT
GTATCTCCAAATGACCGCCCTGAAACCTGAGGATACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAGGA
AAATGGGGGACTGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCATCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:107(AS07392 sdAb核酸序列)
CAGGTGAAGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGAGACAGTTATAGTGTGAAGTACATGGGCTGGTTCCGCCGGGCTC
CAGGGAAACAGCGCGACCAGCGCGAGGAGGTCGCAAGTATTTATCCCACAGGTGGCACGT
TTTACACAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCGAGACAACGCCAAGAGCACTCT
GTATCTCCAAATGACCGCCCTGAAACCTGAGGATACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAGGC
AAATGGGGGACTGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:122(AS07189 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGDSPSVNYMGWFRRAPEKQREQREEVASIYPTGGTFY
TDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMTALKPEDTAMYYCAAGKWGTDYWGQGTQVIVSS
SEQ ID NO:123(AS07392 sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
QVKLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGDSYSVKYMGWFRRAPGKQRDQREEVASIYPTGGTFY
TDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMTALKPEDTAMYYCAAGKWGTDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:158(重链氨基酸序列)
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNF
NEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSA
STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL
SSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKD
TLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQ
DWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYP
SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHY
TQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:160(重链氨基酸序列)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYA
DSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFP
LAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS
SLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE
VTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE
YKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE
SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL
GK
SEQ ID NO:162(接头肽(9GS)氨基酸序列)
GGGGSGGGS
SEQ ID NO:163(人IgG1(hIgG1)铰链氨基酸序列)
EPKSCDKTHTCPPCP
SEQ ID NO:195(重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYAD
SVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKG
PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV
TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT
LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQ
DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP
SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY
TQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:197(度伐鲁单抗重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYV
DSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSSA
STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL
SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKP
KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL
HQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF
YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN
HYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:199(hCTLA-4全长氨基酸序列，无信号肽)
AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTF
LDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDF
LLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN
SEQ ID NO:164(hCTLA-4细胞外结构域氨基酸序列)
AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTF
LDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD
SEQ ID NO:271(AS07189TKDVH11 sdAb核酸序列)
GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGGGGGGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGAAGCCTGAGACT
GAGTTGTGCCGCAAGTGGCGATAGCCCAAGCGTGAACTACATGGGGTGGTTCAGGCAGGC
ACCAGGAAAGGGACGAGAGGAAGTGAGCTCCATCTACCCTACCGGCGGGACATTCTATACT
GACTCTGTCAAGGGCCGGTTTACCATTAGTAGAGATAACGCCAAAAATACACTGTATCTGCA
GATGAACAGCCTGCGACCCGAGGACACCGCTGTCTACTATTGCGCTGCTGGGAAATGGGGG
ACCGACTATTGGGGACAGGGGACACTGGTGACCGTCTCATCA
SEQ ID NO:272(AS07189TKDVH11F27 sdAb核酸序列)
GAAGTGCAACTGGTGGAATCGGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCGGGTGGTAGCCTGCGTCTGT
CCTGTGCGGCAAGCGGTTTTTCGCCGAGCGTCAACTATATGGGCTGGTTTCGTCAGGCGCC
GGGCAAAGGTCGCGAAGAAGTGAGCTCTATCTATCCGACCGGCGGCACGTTTTACACCGAT
AGTGTTAAAGGTCGTTTCACGATCTCCCGCGACAACGCGAAAAATACCCTGTACCTGCAAA
TGAATAGCCTGCGTCCGGAAGATACGGCCGTTTATTACTGCGCGGCAGGCAAATGGGGCAC
GGATTACTGGGGTCAGGGCACGCTGGTCACGGTGTCGTCC
SEQ ID NO:273(AS07189TKDVH11FY sdAb核酸序列)
GAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGAGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGAAGCCTGAGACT
GAGTTGTGCCGCATCTGGGTTTAGCCCCAGCGTGAACTACATGGGGTGGTTCAGGCAGGCA
CCAGGAAAGGGACGAGAGGAAGTGAGCTCCATCTACCCTACCGGCGGGACATTCTATACTG
ACTCTGTCAAGGGCCGGTTTACCATTAGTAGAGATAACGCCAAAAATACACTGTATCTGCAG
ATGAACAGCCTGCGACCCGAGGACACCGCTGTCTACTATTGCGCAGCAGGGAAATACGGAA
CCGATTACTGGGGGCAGGGAACTCTGGTCACTGTCAGCAGC
SEQ ID NO:280(AS07189TKDVH11人源化sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGDSPSVNYMGWFRQAPGKGREEVSSIYPTGGTFYTDSV
KGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAGKWGTDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:281(AS07189TKDVH11F27人源化sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSPSVNYMGWFRQAPGKGREEVSSIYPTGGTFYTDSV
KGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAGKWGTDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:282(AS07189TKDVH11FY人源化sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSPSVNYMGWFRQAPGKGREEVSSIYPTGGTFYTDSV
KGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAGKYGTDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:289(AS07189TKDVH11 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGDSPSVNYMGWFRQAPGKGREEVSSIYPTGGTFYTDSV
KGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAGKWGTDYWGQGTLVTVSSEPKSCDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK
TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL
PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:290(AS07189TKDVH11F27 HCAb二聚体形式氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSPSVNYMGWFRQAPGKGREEVSSIYPTGGTFYTDSV
KGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAGKWGTDYWGQGTLVTVSSEPKSCDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK
TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL
PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:291(AS07189TKDVH11FY HCAb二聚体形式氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSPSVNYMGWFRQAPGKGREEVSSIYPTGGTFYTDSV
KGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAGKYGTDYWGQGTLVTVSSEPKSCDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK
TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL
PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
/>
/>
/>
/>
/>
SEQ ID NO:307(突变的人IgG1(hIgG1)铰链氨基酸序列)
EPKSSDKTHTSPPSP
SEQ ID NO:308(PD1BMmin重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFVFSRYDMAWVRQAPGKGLEWVSFISGGGSNTYYPD
TVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCISPYYYAMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSV
FPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS
SSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE
VTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY
KCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES
NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
K
SEQ ID NO:341(AS07189TKDVH21FY人源化sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSPSVNYMGWVRQAPGKGLEEVSSIYPTGGTFYTDSV
KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGKYGTDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:353(AS07189定向移植的人源化sdAb氨基酸序列；CDR加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSPSVNYMGWVRQAPGKGLEWVSSIYPTGGTFYTDS
VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKWGTDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:365(接头肽氨基酸序列)
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:367(AS07189定向移植的HCAb二聚体形式氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSPSVNYMGWVRQAPGKGLEWVSSIYPTGGTFYTDS
VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKWGTDYWGQGTLVTVSSEPKSCDKT
HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV
YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV
DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:368(AS07189TKDVH21FY HCAb二聚体形式氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSPSVNYMGWVRQAPGKGLEEVSSIYPTGGTFYTDSV
KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGKYGTDYWGQGTLVTVSSEPKSCDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK
TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL
PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:374(AS07189共有氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSPSVNYMGWFRQAPGKGREEVSSIYPTGGTFYTDSV
KGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAGKWGTDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:375(接头氨基酸序列，n是至少为1的整数)
(G)n
SEQ ID NO:376(接头氨基酸序列，n是至少为1的整数)
(GS)n
SEQ ID NO:377(接头氨基酸序列，n是至少为1的整数)
(GSGGS)n
SEQ ID NO:378(接头氨基酸序列，n是至少为1的整数)
(GGGS)n
SEQ ID NO:379(接头氨基酸序列，n是至少为1的整数)
(GGGGS)n
Claims (18)
1.一种包含特异性识别CTLA-4的单结构域抗体(sdAb)部分的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb部分包含以下各物：包含氨基酸序列SEQ ID NO:27、26、220、221、222中的任一者的CDR1；包含氨基酸序列SEQ ID NO:59、58、240、241、242中的任一者的CDR2；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:91、90、260、261、262中的任一者的CDR3。
2.如权利要求1所述的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb部分包含以下各物：
(1)如氨基酸序列SEQ ID NO:27所示的CDR1，如氨基酸序列SEQ ID NO:59所示的CDR2，和如氨基酸序列SEQ ID NO:91所示的CDR3；
(2)如氨基酸序列SEQ ID NO:26所示的CDR1，如氨基酸序列SEQ ID NO:58所示的CDR2，和如氨基酸序列SEQ ID NO:90所示的CDR3；
(3)如氨基酸序列SEQ ID NO:220所示的CDR1，如氨基酸序列SEQ ID NO:240所示的CDR2，和如氨基酸序列SEQ ID NO:260所示的CDR3；
(4)如氨基酸序列SEQ ID NO:221所示的CDR1，如氨基酸序列SEQ ID NO:241所示的CDR2，和如氨基酸序列SEQ ID NO:261所示的CDR3；或，
(5)如氨基酸序列SEQ ID NO:222所示的CDR1，如氨基酸序列SEQ ID NO:242所示的CDR2，和如氨基酸序列SEQ ID NO:262所示的CDR3。
3.如权利要求1或2所述的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb部分包含如氨基酸序列SEQ ID NO:123、122、353、280、281、282和341中的任一者所示的VHH结构域或与其相比具有至少约80％序列同一性的变体。
4.如权利要求1-3中任一项所述的经分离的抗CTLA-4构建体，其中特异性识别CTLA-4的所述sdAb部分是骆驼科动物的、嵌合的、人的、部分人源化的或完全人源化的。
5.如权利要求1-4中任一项所述的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述经分离的抗CTLA-4构建体是仅有重链的抗体(HCAb)；
优选地，所述HCAb是单体或二聚体；
优选地，所述HCAb包含氨基酸序列SEQ ID NO:367、289、290、291和368中的任一者。
6.如权利要求1-5中任一项所述的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述经分离的抗CTLA-4构建体进一步包含特异性识别第二表位的第二抗体部分；
优选地，所述第二抗体部分是全长抗体、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、scFv-scFv、微型抗体、双体抗体或sdAb；
优选地，所述抗CTLA-4构建体具有多特异性；
优选地，特异性识别CTLA-4的所述sdAb部分和所述第二抗体部分任选由肽接头连接；
优选地，所述肽接头包含氨基酸序列SEQ ID NO:162、163、307或365。
7.如权利要求6所述的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述第二抗体部分是由两个重链和两个轻链组成的全长抗体；
优选地，特异性识别CTLA-4的所述sdAb部分的N末端融合于所述全长抗体的至少一个重链的C末端；
优选地，特异性识别CTLA-4的所述sdAb部分的C末端融合于所述全长抗体的至少一个重链的N末端；
优选地，特异性识别CTLA-4的所述sdAb部分的N末端融合于所述全长抗体的至少一个轻链的C末端；
优选地，特异性识别CTLA-4的所述sdAb部分的C末端融合于所述全长抗体的至少一个轻链的N末端；
优选地，所述抗CTLA-4构建体包含四个特异性识别CTLA-4的sdAb部分，并且其中各个特异性识别CTLA-4的sdAb部分的C末端融合于所述全长抗体的各链的N末端。
8.如权利要求7所述的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述全长抗体特异性识别PD-1；
优选地，所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:159的轻链；
优选地，所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:161的轻链；
优选地，所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:309的轻链。
9.如权利要求8所述的经分离的抗CTLA-4构建体，其中：
(1)所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:158的重链和含有氨基酸序列SEQID NO:159的轻链，其中所述全长抗体的至少一个重链融合于所述抗CTLA-4sdAb，并且其中重链融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:294、296、321和323中的任一者；
(2)所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:160的重链和含有氨基酸序列SEQID NO:161的轻链，其中所述全长抗体的至少一个重链融合于所述抗CTLA-4sdAb，并且其中重链融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:299、301、326和328中的任一者；
或，
(3)所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:308的重链和含有氨基酸序列SEQID NO:309的轻链，其中所述全长抗体的至少一个重链融合于所述抗CTLA-4sdAb，并且其中重链融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:310、312、318、329、331和337中的任一者。
10.如权利要求8所述的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述抗CTLA-4构建体包含特异性识别CTLA-4的四个相同sdAb，其中两个特异性识别CTLA-4的sdAb融合在一起，其进一步融合于所述全长抗体的各重链的N末端。
11.如权利要求7所述的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述全长抗体特异性识别PD-L1；
优选地，所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链；
优选地，所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:197的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:198的轻链。
12.如权利要求11所述的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述全长抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:195的重链和含有氨基酸序列SEQ ID NO:196的轻链，其中所述全长抗体的至少一个重链融合于所述抗CTLA-4sdAb，并且其中重链融合多肽包含氨基酸序列SEQ IDNO:304、306、347和349中的任一者。
13.一种包含特异性识别CTLA-4的sdAb部分的经分离的抗CTLA-4构建体，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:123、122、353、280、281、282和341中的任一者的CDR1、CDR2和CDR3。
14.一种药物组合物，其包含如权利要求1-13中任一项所述的经分离的抗CTLA-4构建体和药物可接受载体。
15.如权利要求1-13中任一项所述的经分离的抗CTLA-4构建体或如权利要求14所述的药物组合物在制备用于治疗患有CTLA-4相关疾病的个体的药物中的用途；
优选地，所述CTLA-4相关疾病是癌症；
优选地，所述癌症是实体肿瘤；
优选地，所述癌症是结肠癌、黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌或胶质母细胞瘤；
优选地，所述用途进一步包括向所述个体施用额外癌症疗法；
优选地，所述药物组合物全身施用；
优选地，所述药物组合物局部施用。
16.一种经分离的核酸，其编码权利要求1-13中的任一项所述的经分离的抗CTLA-4构建体；
优选地，其中所述经分离的核酸包含核酸序列SEQ ID NO:106-107和271-273中的任一者。
17.一种载体，其包含权利要求16所述的经分离的核酸。
18.一种经分离的宿主细胞，其包含权利要求16所述的经分离的核酸或权利要求17所述的载体。
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