KR101992502B1 - 프레임워크 시그너처 펩티드를 사용하여 동물 샘플에서 치료 항체를 검출하기 위한 다중 반응 모니터링 lc-ms/ms 방법 - Google Patents
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Abstract
혈장/혈청 및 조직 샘플을 포함하는 전임상 동물 생물학적 샘플에 존재하는 인간 및 인간화 항체 및 그의 접합체를 검출, 특성화, 측정 및 정량화하는 방법이 개시되어 있다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
37 CFR §1.53(b) 하에 출원된 본 정식출원은 35 USC §119(e) 하에 2011년 5월 12일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/485,249를 우선권 주장하며, 그의 전문이 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 동물 샘플, 예컨대 조직, 혈장 또는 혈청으로부터 관심 인간 또는 인간화 항체의 양을 검출 및 결정하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 질량 분광측정법에 의해 검출 및 정량화된 인간 또는 인간화 항체의 프레임워크 영역에 대해 특징적이고 보존된 하나 이상의 펩티드를 생산하기 위한 샘플의 친화도 풍부화 및 프로테아제 소화를 포함한다.
치료 단백질의 생체내 연구로부터 생성된 혈장/혈청 샘플의 분석은 생물제약 산업에서 관심대상이다. 종래의 ELISA 접근법은 25년 넘게 사용되어 왔고, 여러 제한을 갖는다. ELISA는 생성까지 수개월이 소요될 수 있는 고품질의 주문 시약을 필요로 하고, 검정 최적화는 수개월이 더 소요될 수 있다. 따라서, ELISA는 단백질-기재 약물의 조기 발견 단계 및 개발 단계 둘 다에서 제한이 되는 긴 검정 개발 시간을 갖는다 (문헌 [Murray et al. (2001) J. Imm. Methods 255:41-56; Kirchner et al. (2004) Clin. Pharmacokinetics 43(2):83-95]). 적합한 ELISA 시약 및 검정 조건은 각각의 단백질 요법에 대한 고도의 주문 결합 요건으로 인해 일부 경우에는 가능하지 않을 수도 있다. ELISA의 또 다른 제한은 시약이 혈장/혈청 단백질과 비-특이적으로 결합할 수 있다는 것이고; 매트릭스 간섭은 통상적인 현상이다. 다른 한편으로 질량 분광측정법에 의한 단백질 정량화는 매우 특이적이고, 따라서 매트릭스 간섭은 ELISA와 비교하여 드물다. ELISA 검정의 개발은 노동-집약적이고 복잡하며 특이적인 시약을 필요로 할 수 있다. ELISA는 또한 매트릭스 간섭 및 항체의 교차-반응성에 민감하다. ELISA는 결합 특성을 이용하여 분석물 농도를 간접적으로 측정한다. 이러한 다수의 변수는 단백질 정량화의 ELISA 방법이 강인 성능을 갖는 다른 실험실로의 개발 및 전달을 위해 도전하도록 만든다. 이러한 차이에 기초하여, 질량 분광측정법은 ELISA에 대한 직교형 방법이다. 단백질 정량화의 질량 분광측정법 방법, 특히 LC-MS/MS는 주문 시약을 필요로 하지 않고, 일반적으로 보다 빠른 검정 개발을 제공한다. 또한, 질량 분광측정법은 매트릭스 간섭이 보다 적게 나타나고, 매우 특이적인 일반 검정 조건을 제공하며, 멀티플렉스화 및 자동화될 수 있다. 질량 분광측정법의 높은 특이성은 분석물의 고유의 물리적 화학적 특성, 즉 질량 및 단편화 패턴을 이용하여 분석물 농도를 측정한다. 강인 포맷은 승인된 항체 요법에 대한 상당한 장점인 실험실-대-실험실 전달을 용이하게 한다. 질량 분광측정법에 의한 단백질 정량화를 위한 일반적 방법론은 무손상 단백질의 트립신 소화이다. 생성된 펩티드는 고정 농도에서 상응하는 안정한 동위원소 표지된 내부 표준을 도입함으로써 질량 분광측정법에 의해 분석된다.
질량 분광측정법 (MS)에 의한 펩티드 및 단백질 분석에서의 최근의 진보는 전단 기체 상 이온화 및 도입 기술, 예컨대 전기분무 이온화 (ESI), 및 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 (MALDI, US 2003/0027216)에서의 발전 뿐만 아니라 기기 민감성, 해상도, 질량 정밀도, 생물정보학, 및 소프트웨어 데이터 디컨볼루션 알고리즘의 개선의 덕분이다 (문헌 ["Electrospray Ionization Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, and Applications", Cole, R.B., Ed. (1997) Wiley, New York; "Modern Protein Chemistry: Practical Aspects", Howard, G.C. and Brown, W.E., Eds. (2002) CRC Press, Boca Raton, FL, p. 71-102; Martin et al. (1997) Cancer Chemother. Pharmacol. 40:189-201]; WO 03/046571; WO 03/046572).
액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광측정법은 혈장/혈청 샘플과 같이 매우 복잡한 매트릭스에서 단백질 분석 및 정량화를 위한 강력한 도구이다. 관심 단백질 및 다른 혈장/혈청 단백질의 소화로부터 생성된 펩티드가 동일하거나 유사한 공칭 질량을 가질 수 있기 때문에, MS 단편화의 제2 차원은 종종 관심 펩티드의 특징적인 단편을 제공한다. 특이적 모 펩티드 및 특징적인 단편 이온의 조합은 정량화될 분자를 선택적으로 모니터링하는데 사용된다. 이러한 접근법은 단백질 정량화를 위해 통상적으로 사용되는 방식인 "다중 반응 모니터링" (MRM) (또한, 선택된 반응 모니터링 (SRM)으로 지칭됨)으로 불린다.
전기분무 이온화 (ESI)는 액체 샘플의 대기압 이온화 (API)를 제공한다. 전기분무 공정은 고충전 액적을 생성하고, 이는 증발 하에 용액에 함유된 종의 대표적인 이온을 생성한다. 질량 분광계의 이온-샘플링 오리피스는 질량 분석을 위해 이러한 기체 상 이온을 샘플링하는데 이용될 수 있다. 질량 분광계 검출기에 의해 측정된 분석물에 대한 반응은 유체에서 분석물의 농도에 의존하고, 유체 유량과는 관계가 없다.
본 발명은
(a) 생물학적 샘플을 소화 효소로 처리하여 소화된 항체 샘플을 형성하며, 여기서 생물학적 샘플은 인간 또는 인간화 항체로 처리된 동물로부터의 혈청, 혈장, 조직 또는 세포인 단계; 및
(b) 소화된 항체 샘플을 질량 분광측정법에 의해 분석하여 하나 이상의 인간 프레임워크 펩티드를 검출하는 단계
를 포함하는, 인간 또는 인간화 항체를 검출하는 방법을 제공한다.
예시적 실시양태에서, 인간 프레임워크 펩티드는 서열 1-8로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함한다.
예시적 실시양태에서, 소화 효소는 트립신이다.
예시적 실시양태에서, 생물학적 샘플은 친화성 포획 매질 또는 크로마토그래피 흡착제와 접촉된다. 풍부화된 생물학적 샘플은 분석된 후에 소화 효소로 처리된다.
예시적 실시양태에서, 소화된 항체 샘플의 농도가 측정된다.
본 발명의 측면은 질량 분광측정법 (LC-MS/MS)에 의해 검출 및 정량화된 인간 또는 인간화 항체의 프레임워크 영역에 대해 특징적인, 즉 동물 생물학적 샘플에는 존재하지 않는 하나 이상의 펩티드를 생산하기 위한, 샘플의 프로테아제 소화 또는 면역친화성 포획에 이은 프로테아제 소화의 방법이다.
본 발명의 실시양태는 항체-약물 접합체가 본 발명의 방법에 의해 측정되는 약물 모이어티에 접합된 인간 또는 인간화 항체이다.
도 1은 잔기 101에서 시작하는 인간 2H7 항체 오크렐리주맙, Hu2H7 (서열 11), 및 5가지 시노몰구스 원숭이 항-CD20 항체: CynoHC 1a D3 1 (서열 12), CynoHC 1b E5 1 (서열 13), Cyno HC 2a (서열 14), CynoHC 2b E6 1 (서열 15), CynoHC 3 (서열 16)의 중쇄 아미노산 서열의 정렬을 보여준다. 각각의 서열 내에 적어도 하나의 아미노산 차이를 보유하면서 인간 2H7 (hu 2H7) Mab에 대해 특징적이고, 시노몰구스 원숭이 IgG 중쇄에는 존재하지 않는 프레임워크 시그너처 펩티드는 밑줄 표시된 바와 같이 확인된다 (FSP 1-8).
도 2는 트라스투주맙 (헤르셉틴(Herceptin)®, 제넨테크 인크.(Genentech Inc.); rhuMAbHER2, 항 p185HER2), 재조합 유래 인간화 모노클로날 항체, CAS 등록 번호 180288-69-1의 중쇄 (서열 17) 및 경쇄 (서열 18)를 보여준다.
도 3은 오크렐리주맙, rhuMAb 2H7, PRO70769, 인간화 항-CD20 항체, CAS 등록 번호 637334-45-3의 중쇄 (서열 11) 및 경쇄 (서열 19)를 보여준다.
도 4는 페르투주맙, rhuMAb 2C4, CAS 등록 번호 380610-27-5의 중쇄 (서열 20) 및 경쇄 (서열 21)를 보여준다. FSP2, FSP3, FSP8은 중쇄 (서열 20)에서 밑줄 표시된 바와 같이 확인된다.
도 5는 항-PDL1, T 세포 조절제의 확장된 CD28/CTLA-4 패밀리의 구성원의 중쇄 (서열 22) 및 경쇄 (서열 23)를 보여준다. FSP2, FSP4, FSP8은 중쇄 (서열 22)에서 밑줄 표시된 바와 같이 확인된다.
도 6은 항-뉴로필린-1, 항-NRP1, MNRP1685A의 중쇄 (서열 24) 및 경쇄 (서열 25)를 보여준다. FSP2, FSP4, FSP8은 중쇄 (서열 24)에서 밑줄 표시된 바와 같이 확인된다.
도 7은 항-MUC16, MMUC3333A/DMUC4064A의 중쇄 (서열 26) 및 경쇄 (서열 27)를 보여준다. FSP2, FSP4, FSP8은 중쇄 (서열 26)에서 밑줄 표시된 바와 같이 확인된다.
도 8은 리툭시맙, C2B8, 맙테라(MabThera), (리툭산(Rituxan)®, 제넨테크 인크., 비오젠/이덱(Biogen/Idec)), CAS 등록 번호 174722-31-7의 중쇄 (서열 28) 및 경쇄 (서열 29)를 보여준다. FSP2, FSP4, FSP8은 중쇄 (서열 28)에서 밑줄 표시된 바와 같이 확인된다.
도 9는 하나 이상의 프레임워크 시그너처 펩티드 (FSP)를 이용하여 동물 혈장/혈청에서 치료 항체를 정량화하기 위한 LC-MS/MS 방법의 일반적 단계를 보여준다.
도 10은 트립신에 의해 소화된 트라스투주맙의 다중 반응 모니터링을 보여준다. 프레임워크 시그너처 펩티드 FSP3 (12.5분), FSP8 (15분) 및 FSP5 (17분)는 분리 및 정량화된 기준선이다.
도 11은 혈장에 첨가된, 친화성-포획에 이어 소화된 항-MUC16 항체-약물 접합체로부터의 FSP5의 MS/MS 스펙트럼을 보여준다.
도 12는 전체 혈장 소화/SPE 접근법에 의해 제조된 리튬 헤파린화 시노몰구스 원숭이 혈장에 1-1000 μg/mL의 다양한 농도로 첨가된 FSP8의 보정 곡선을 보여준다.
도 13은 전체 혈장 소화/SPE 샘플 제조 후에 LLOQ = 1 μg/mL에서 리튬 헤파린화 시노몰구스 원숭이 혈장에 첨가된 FSP8의 검출을 입증하는 LC-MS/MS 크로마토그램을 보여준다.
도 14는 동물 혈장/혈청에서 mAb의 프레임워크 시그너처 펩티드 (FSP)를 생성하기 위한, 치료 단백질의 친화성 포획 및 효소적 소화를 이용하는 LC-MS/MS 방법의 단계의 흐름도를 보여준다.
도 15는 비오티닐화 포획 프로브에 결합된 스트렙타비딘 코팅된 자기 비드 또는 단백질 A, G 코팅된 자기 비드 상에서의 동물 혈장/혈청으로부터의 mAb의 포획, 이어서 자기 분리에 의한 단리, 포획된 항체의 소화 및 LC-MS/MS에 의한 분석의 카툰을 보여준다.
도 16은 항체의 포괄적 포획을 위한 단백질 A, G 코팅된 자기 비드 (상부) 및 항체의 특이적 포획을 위한 비오티닐화 포획 프로브에 결합된 스트렙타비딘 코팅된 자기 비드 (하부)의 실시양태를 보여준다.
도 17a는 래트 혈장에서 1 μg/mL 트라스투주맙 항체에서의 FSP8의 LC-MS/MS 분리 및 검출을 보여준다.
도 17b는 안정한-동위원소 표지된 (SIL) FSP8 내부 표준의 LC-MS/MS 분리 및 검출을 보여준다.
도 18은 래트 혈장에서 1-250 μg/mL의 트라스투주맙 (헤르셉틴®)의 농도에 대해 안정한-동위원소 표지된 FSP8 내부 표준에 대한 FSP8의 비를 플롯팅하여, 검출의 선형성을 보여준다.
도 19a는 전기화학발광 또는 비색 검출을 이용하는 ELISA 검정에서 고정화된 세포외 도메인 (ECD) 또는 항-인간 IgG 폴리클로날 항체에 대한 결합에 의해 포획되고, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)로 표지된 항-인간 IgG 폴리클로날 항체로 검출된 모노클로날 항체 (mAb 치료제)의 카툰을 보여준다.
도 19b는 생물학적 샘플로부터의 mAb 치료제의 단백질 A 비드 포획, 하나 이상의 프레임워크 시그너처 펩티드 (FSP), 예를 들어 FSP8을 형성하기 위한 포획된 mAb 치료제의 트립신 소화, 및 938.0 (M, 2+)의 836.7 (y15, 2+)로의 전이를 검출하기 위한 다중 반응 모니터링 (MRM)의 LC/MS/MS 검출로 시작하는 LC-MS/MS 검정의 요소를 보여준다.
도 20은 트라스투주맙, 항-HER2 mAb를 투여한 래트로부터의 혈장/혈청 샘플의 개별 약동학 (PK)에 기초하여 도 19b에 도시된 LC-MS/MS 검정과 도 19a의 ELISA 검정 사이의 일치를 보여준다.
도 21은 3A5, 항-MUC 16 mAb를 투여한 래트로부터의 혈장/혈청 샘플의 개별 약동학 (PK)에 기초하여 도 19b에 도시된 LC-MS/MS 검정과 도 19a의 ELISA 검정 사이의 일치를 보여준다.
도 22는 항-메소텔린 (Msln) mAb를 투여한 래트로부터의 혈장/혈청 샘플의 개별 약동학 (PK)에 기초하여 도 19b에 도시된 LC-MS/MS 검정과 도 19a의 ELISA 검정 사이의 일치를 보여준다.
도 23은 28일에 걸친 혈장에서의 항체 측정에 의한 3A5 (MMUC1206A), 항-MUC 16 mAb를 투여한 시노몰구스 원숭이로부터의 혈장/혈청 샘플의 평균 약동학 (PK)에 기초하여 도 19b에 도시된 LC-MS/MS 검정과 도 19a의 ELISA 검정 사이의 일치를 보여준다.
도 24는 40일에 걸친 혈장에서의 항체 측정에 의한 항-메소텔린 (Msln) mAb를 투여한 시노몰구스 원숭이로부터의 혈장/혈청 샘플의 평균 약동학 (PK)에 기초하여 도 19b에 도시된 LC-MS/MS 검정과 도 19a의 ELISA 검정 사이의 일치를 보여준다.
도 25는 마우스 효능 연구에서 항체-약물 접합체 (ADC), 항-LY6E-MC-vc-PAB-MMAE를 투여한 마우스 (A, B, C)로부터의 혈장/혈청 샘플의 개별 약동학 (PK)에 기초하여 도 19b에 도시된 LC-MS/MS 검정과 도 19a의 ELISA 검정 사이의 일치를 보여준다.
도 2는 트라스투주맙 (헤르셉틴(Herceptin)®, 제넨테크 인크.(Genentech Inc.); rhuMAbHER2, 항 p185HER2), 재조합 유래 인간화 모노클로날 항체, CAS 등록 번호 180288-69-1의 중쇄 (서열 17) 및 경쇄 (서열 18)를 보여준다.
도 3은 오크렐리주맙, rhuMAb 2H7, PRO70769, 인간화 항-CD20 항체, CAS 등록 번호 637334-45-3의 중쇄 (서열 11) 및 경쇄 (서열 19)를 보여준다.
도 4는 페르투주맙, rhuMAb 2C4, CAS 등록 번호 380610-27-5의 중쇄 (서열 20) 및 경쇄 (서열 21)를 보여준다. FSP2, FSP3, FSP8은 중쇄 (서열 20)에서 밑줄 표시된 바와 같이 확인된다.
도 5는 항-PDL1, T 세포 조절제의 확장된 CD28/CTLA-4 패밀리의 구성원의 중쇄 (서열 22) 및 경쇄 (서열 23)를 보여준다. FSP2, FSP4, FSP8은 중쇄 (서열 22)에서 밑줄 표시된 바와 같이 확인된다.
도 6은 항-뉴로필린-1, 항-NRP1, MNRP1685A의 중쇄 (서열 24) 및 경쇄 (서열 25)를 보여준다. FSP2, FSP4, FSP8은 중쇄 (서열 24)에서 밑줄 표시된 바와 같이 확인된다.
도 7은 항-MUC16, MMUC3333A/DMUC4064A의 중쇄 (서열 26) 및 경쇄 (서열 27)를 보여준다. FSP2, FSP4, FSP8은 중쇄 (서열 26)에서 밑줄 표시된 바와 같이 확인된다.
도 8은 리툭시맙, C2B8, 맙테라(MabThera), (리툭산(Rituxan)®, 제넨테크 인크., 비오젠/이덱(Biogen/Idec)), CAS 등록 번호 174722-31-7의 중쇄 (서열 28) 및 경쇄 (서열 29)를 보여준다. FSP2, FSP4, FSP8은 중쇄 (서열 28)에서 밑줄 표시된 바와 같이 확인된다.
도 9는 하나 이상의 프레임워크 시그너처 펩티드 (FSP)를 이용하여 동물 혈장/혈청에서 치료 항체를 정량화하기 위한 LC-MS/MS 방법의 일반적 단계를 보여준다.
도 10은 트립신에 의해 소화된 트라스투주맙의 다중 반응 모니터링을 보여준다. 프레임워크 시그너처 펩티드 FSP3 (12.5분), FSP8 (15분) 및 FSP5 (17분)는 분리 및 정량화된 기준선이다.
도 11은 혈장에 첨가된, 친화성-포획에 이어 소화된 항-MUC16 항체-약물 접합체로부터의 FSP5의 MS/MS 스펙트럼을 보여준다.
도 12는 전체 혈장 소화/SPE 접근법에 의해 제조된 리튬 헤파린화 시노몰구스 원숭이 혈장에 1-1000 μg/mL의 다양한 농도로 첨가된 FSP8의 보정 곡선을 보여준다.
도 13은 전체 혈장 소화/SPE 샘플 제조 후에 LLOQ = 1 μg/mL에서 리튬 헤파린화 시노몰구스 원숭이 혈장에 첨가된 FSP8의 검출을 입증하는 LC-MS/MS 크로마토그램을 보여준다.
도 14는 동물 혈장/혈청에서 mAb의 프레임워크 시그너처 펩티드 (FSP)를 생성하기 위한, 치료 단백질의 친화성 포획 및 효소적 소화를 이용하는 LC-MS/MS 방법의 단계의 흐름도를 보여준다.
도 15는 비오티닐화 포획 프로브에 결합된 스트렙타비딘 코팅된 자기 비드 또는 단백질 A, G 코팅된 자기 비드 상에서의 동물 혈장/혈청으로부터의 mAb의 포획, 이어서 자기 분리에 의한 단리, 포획된 항체의 소화 및 LC-MS/MS에 의한 분석의 카툰을 보여준다.
도 16은 항체의 포괄적 포획을 위한 단백질 A, G 코팅된 자기 비드 (상부) 및 항체의 특이적 포획을 위한 비오티닐화 포획 프로브에 결합된 스트렙타비딘 코팅된 자기 비드 (하부)의 실시양태를 보여준다.
도 17a는 래트 혈장에서 1 μg/mL 트라스투주맙 항체에서의 FSP8의 LC-MS/MS 분리 및 검출을 보여준다.
도 17b는 안정한-동위원소 표지된 (SIL) FSP8 내부 표준의 LC-MS/MS 분리 및 검출을 보여준다.
도 18은 래트 혈장에서 1-250 μg/mL의 트라스투주맙 (헤르셉틴®)의 농도에 대해 안정한-동위원소 표지된 FSP8 내부 표준에 대한 FSP8의 비를 플롯팅하여, 검출의 선형성을 보여준다.
도 19a는 전기화학발광 또는 비색 검출을 이용하는 ELISA 검정에서 고정화된 세포외 도메인 (ECD) 또는 항-인간 IgG 폴리클로날 항체에 대한 결합에 의해 포획되고, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)로 표지된 항-인간 IgG 폴리클로날 항체로 검출된 모노클로날 항체 (mAb 치료제)의 카툰을 보여준다.
도 19b는 생물학적 샘플로부터의 mAb 치료제의 단백질 A 비드 포획, 하나 이상의 프레임워크 시그너처 펩티드 (FSP), 예를 들어 FSP8을 형성하기 위한 포획된 mAb 치료제의 트립신 소화, 및 938.0 (M, 2+)의 836.7 (y15, 2+)로의 전이를 검출하기 위한 다중 반응 모니터링 (MRM)의 LC/MS/MS 검출로 시작하는 LC-MS/MS 검정의 요소를 보여준다.
도 20은 트라스투주맙, 항-HER2 mAb를 투여한 래트로부터의 혈장/혈청 샘플의 개별 약동학 (PK)에 기초하여 도 19b에 도시된 LC-MS/MS 검정과 도 19a의 ELISA 검정 사이의 일치를 보여준다.
도 21은 3A5, 항-MUC 16 mAb를 투여한 래트로부터의 혈장/혈청 샘플의 개별 약동학 (PK)에 기초하여 도 19b에 도시된 LC-MS/MS 검정과 도 19a의 ELISA 검정 사이의 일치를 보여준다.
도 22는 항-메소텔린 (Msln) mAb를 투여한 래트로부터의 혈장/혈청 샘플의 개별 약동학 (PK)에 기초하여 도 19b에 도시된 LC-MS/MS 검정과 도 19a의 ELISA 검정 사이의 일치를 보여준다.
도 23은 28일에 걸친 혈장에서의 항체 측정에 의한 3A5 (MMUC1206A), 항-MUC 16 mAb를 투여한 시노몰구스 원숭이로부터의 혈장/혈청 샘플의 평균 약동학 (PK)에 기초하여 도 19b에 도시된 LC-MS/MS 검정과 도 19a의 ELISA 검정 사이의 일치를 보여준다.
도 24는 40일에 걸친 혈장에서의 항체 측정에 의한 항-메소텔린 (Msln) mAb를 투여한 시노몰구스 원숭이로부터의 혈장/혈청 샘플의 평균 약동학 (PK)에 기초하여 도 19b에 도시된 LC-MS/MS 검정과 도 19a의 ELISA 검정 사이의 일치를 보여준다.
도 25는 마우스 효능 연구에서 항체-약물 접합체 (ADC), 항-LY6E-MC-vc-PAB-MMAE를 투여한 마우스 (A, B, C)로부터의 혈장/혈청 샘플의 개별 약동학 (PK)에 기초하여 도 19b에 도시된 LC-MS/MS 검정과 도 19a의 ELISA 검정 사이의 일치를 보여준다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 당업자가 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가지며, 하기 문헌과 일치한다: 문헌 [Singleton et al., (1994) "Dictionary of Microbiology and Molecular Biology", 2nd Ed., J. Wiley & Sons, New York, NY; 및 Janeway, et al. (2001) "Immunobiology", 5th Ed., Garland Publishing, New York]. 본원에서 상표가 사용되는 경우에, 상표 제품 제제, 일반 약물 및 상표 제품의 활성 제약 성분(들)이 또한 포함된다.
정의
용어 "생물학적 샘플"은 동물로부터 유래되거나 분리된 임의의 성분이고, 혈액, 혈장, 혈청, 세포, 소변, 뇌척수액 (CSF), 유액, 기관지 세척액, 골수, 양수, 타액, 담즙, 유리체, 누액 또는 조직을 포함한다.
용어 "소화 효소"는 특이적 또는 일반적인 임의의 방식으로 펩티드 또는 단백질을 단편으로 절단하거나 가수분해할 수 있는 효소이다. 소화 효소는 생물학적 샘플의 성분인 항체로부터 소화된 항체 샘플을 형성할 수 있다. 소화 효소는 프로테아제, 예컨대 트립신, 파파인, 엔도프로테이나제 LysC, 엔도프로테이나제 ArgC, 스타필로코쿠스 아우레우스 V8, 키모트립신, Asp-N, Asn-C, 펩신 및 엔도프로테이나제 GluC를 포함한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 항체 구조를 포함한다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부를 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편들로 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 및 하기 기재된 다른 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 문헌 [Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Pluckthuen, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]; WO 93/16185; US 5571894; US 5587458을 참조한다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의에 대해, US 5869046을 참조한다.
디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다 (EP 404097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134; Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448]). 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌 [Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134]에 기재되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (US 6248516).
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같은 무손상 항체의 단백질분해 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) 또는 파지)에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 공급원 또는 종으로부터 유래되고, 반면에 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실-말단으로 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은 EU 넘버링 시스템 (또한 EU 인덱스로 지칭됨)에 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 불변 도메인 잔기를 지칭한다. 불변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 교환가능하게 사용되며, 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 이용하여 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 배제된다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택시에 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 항체의 프레임워크 영역이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 행한다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우에 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우에 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군 III이다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.
"키메라" 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다 (US 4816567; 문헌 [Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855]). 추가의 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 모 항체의 것으로부터 변화된 "부류 스위칭" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성이 감소하도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR (또는 그의 일부)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 그의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래된 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 또는 개선시키기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에서 검토되고, 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; US 5821337; US 7527791; US 6982321; US 7087409; [Kashmiri et al. (2005) Methods 36:25-34] (SDR (a-CDR) 그래프팅 기재); [Padlan, (1991) Mol. Immunol. 28:489-498] ("리서페이싱" 기재); [Dall'Acqua et al. (2005) Methods 36:43-60] ("FR 셔플링" 기재); 및 [Osbourn et al., (2005) Methods 36:61-68; Klimka et al. (2000) Br. J. Cancer 83:252-260] (FR 셔플링에 대한 "가이드 선택" 접근법 기재)에 추가로 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "최적-적합" 방법을 이용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (문헌 [Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623]); 인간 성숙 (체세포 성숙) 프레임워크 영역 또는 인간 배선 프레임워크 영역 (문헌 [Almagro and Fransson, (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633]); 및 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Baca et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; 및 Rosok et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:22611-22618] 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 문헌 [van Dijk and van de Winkel, (2001) Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74; Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 개괄적으로 기재되어 있다.
인간 항체는 항원 접종에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 무손상 인간 항체 또는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여하여 제조할 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 이뮤노글로불린 좌위를 대체하거나 또는 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체로 무작위적으로 통합된 인간 이뮤노글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 이뮤노글로불린 좌위는 일반적으로 불활성화된다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 문헌 [Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 (제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술 기재); US 5770429 (HuMab® 기술 기재); US 7041870 (K-M 마우스(K-M MOUSE)® 기술 기재), 및 US 2007/0061900 (벨로시마우스(VelociMouse)® 기술 기재)을 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터의 인간 가변 영역은 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 조합시켜 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., (1991) J. Immunol., 147: 86] 참조) 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는 또한 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체 생산 기재); 문헌 [Ni, (2006) Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268] (인간-인간 하이브리도마 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마(Trioma) 기술)은 또한 문헌 [Vollmers and Brandlein, (2005) Histology and Histopathology, 20(3):927-937 및 Vollmers and Brandlein, (2005) Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91]에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리하여 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변 도메인 서열은 바람직한 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 하기 기재된다.
본 발명의 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 원하는 결합 특성을 보유하는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에 검토되어 있고, 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al. (1992) J. Mol. Biol. 222: 581-597; Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al. (2004) J. Mol. Biol. 338(2): 299-310; Lee et al. (2004) J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093; Fellouse, (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472; 및 Lee et al. (2004) J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132]에 추가로 기재되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 개별적으로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 클로닝되고, 파지 라이브러리에 무작위적으로 재조합되며, 이는 이어서 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레퍼토리를 클로닝 (예를 들어, 인간으로부터)하여, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 최종적으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열이 달성되도록 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리를 또한 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리는 US 5750373; US 2005/0079574; US 2005/0119455; US 2005/0266000; US 2007/0117126; US 2007/0160598; US 2007/0237764; US 2007/0292936; US 2009/0002360에 기재되어 있다. 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 여겨진다.
특정 실시양태에서, 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 하나의 항원에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 제2 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 동일한 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 항원을 발현하는 세포에 세포독성제를 국재화시키는데 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983))], WO 93/08829, 및 [Traunecker et al., EMBO J.10: 3655 (1991)] 참조), 및 "노브-인-홀(knob-in-hole)" 조작 (US 5731168)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다중특이적 항체는 또한, 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과를 조작하는 것 (WO 2009/089004A1); 2종 이상의 항체 또는 단편을 가교시키는 것 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 이중특이적 항체를 생산하기 위해 류신 지퍼를 이용하는 것 (예를 들어, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위해 "디아바디" 기술을 이용하는 것 (예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체를 이용하는 것 (문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]); 및 삼중특이적 항체를 제조하는 것 (문헌 [Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147: 60]에 의해 제조될 수 있다.
"옥토퍼스 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576A1 참조).
본원의 항체 또는 단편은 또한 항원 뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).
항체 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변형을 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 원하는 특성, 예를 들어 항원-결합을 보유하는 한, 최종 구축물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다.
항체는 항체 및 단백질, 약물 모이어티, 표지 또는 일부 다른 군을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 융합 단백질은 특성, 예컨대 약동학을 최적화하기 위해, 재조합 기술, 접합 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 인간 또는 인간화 항체는 또한 알부민-결합 펩티드 (ABP) 서열을 포함하는 융합 단백질일 수 있다 (문헌 [Dennis et al. (2002) "Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins" J Biol Chem. 277:35035-35043]; WO 01/45746). 본 발명의 항체는 (i) 문헌 [Dennis et al. (2002) J Biol Chem. 277:35035-35043] (표 III 및 IV, 페이지 35038); (ii) US 2004/0001827 ([0076]); 및 (iii) WO 01/45746 (페이지 12-13) (이들은 모두 본원에 참고로 포함됨)에 의해 교시된 ABP 서열을 갖는 융합 단백질을 포함한다.
치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "보존적 치환"의 표제 하에 표 1에 제시된다. 보다 더 실질적인 변화는 "예시적인 치환"의 표제 하의 표 1에 아미노산 측쇄 부류에 관하여 하기 추가로 기재된 바와 같이 제공된다. 아미노산 치환은 관심 항체에 도입되고, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 포함할 것이다.
치환 변이체의 한 유형은 모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 모 항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 상승된 친화도, 감소된 면역원성)의 변형 (예를 들어, 개선)을 가질 것이고/거나 모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 이용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙 항체이다. 간략하게, 하나 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고, 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되고, 특정한 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
변경 (예를 들어, 치환)은 예를 들어 항체 친화도를 개선시키기 위해 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 체세포 성숙 과정 동안 HVR "핫스팟", 즉 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 코딩된 잔기 (예를 들어, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조), 및/또는 SDR (a-CDR)에서 이루어질 수 있고, 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 친화도 성숙은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 기재되어 있다. 친화도 성숙의 일부 실시양태에서, 다양성은 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이유발)에 의한 성숙을 위해 선택된 가변 유전자로 도입된다. 이어서, 2차 라이브러리를 생성한다. 이어서, 바람직한 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하게 위해 라이브러리를 스크리닝한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 HVR-지시된 접근법과 연관되며, 여기서 여러 HVR 잔기 (예를 들어, 한 번에 4-6개의 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합과 연관된 HVR 잔기는 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 구체적으로 확인될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 외부일 수 있다. 상기에서 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이, 돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라고 불린다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기들의 군이 확인되고 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu), 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 항체와 항원과의 상호작용에 영향을 미치는지 여부를 결정한다. 추가의 치환은 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 입증하는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 치환을 위한 후보로 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 그들이 바람직한 특성을 함유하는지 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드가 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다.
글리코실화 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 1개 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우에, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 대한 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지형 이분지 올리고사카라이드를 포함한다 (문헌 [Wright et al. (1997) TIBTECH 15:26-32]). 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산 뿐만 아니라 이분지 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 내의 올리고사카라이드의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 제조하기 위해 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결핍된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 측정된 Asn 297에 부착된 모든 당구조물 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노스 구조물)의 합에 비해 Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균 양을 계산하여 결정된다. Asn297은 Fc 영역의 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 나타내지만; Asn297은 또한 항체의 부차적 서열 변이로 인해 위치 297의 약 ± 3 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294 및 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다 (US 2003/0157108; US 2004/0093621). "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 대한 공개의 예는 US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌 [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotech. Bioeng. 87:614]을 포함한다. 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; US 2003/0157108 (Presta, L); 및 WO 2004/056312 (Adams et al.), 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (문헌 [Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotech. Bioeng. 87:614; Kanda, Y. et al. (2006) Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688]; WO2003/085107)를 포함한다.
이등분 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 추가로 제공되는데, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이분지 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는, 예를 들어 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 적어도 1개의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 기재되어 있다 (WO 1997/30087; WO 1998/58964; WO 1999/22764).
Fc 영역 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어 Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 모든 이펙터 기능은 아니지만, 일부 이펙터 기능을 보유하고 있으므로, 생체내에서의 항체의 반감기가 중요하긴 하지만 특정의 이펙터 기능 (예컨대, 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 해로운 적용에 대한 바람직한 후보가 되는 항체 변이체를 고려한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합이 결핍되어 있지만 (따라서, 아마도 ADCC 활성이 결핍될 것임), FcRn 결합 능력은 보유하고 있는 것을 확인하기 위해 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 단지 FcγRIII만을 발현하고, 반면에 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 페이지 464 상의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예는 US 5500362; 문헌 [Hellstrom, I. et al. (1986) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063); Hellstrom, I et al. (1985) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502]; US 5821337; [Bruggemann, M. et al. (1987) J. Exp. Med. 166:1351-1361)]에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법을 이용할 수 있다 (예를 들어, 유동 세포측정법을 위한 액티(ACTI)™ 비-방사성 세포독성 검정 (셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰); 및 시토톡스 96(CytoTox 96)® 비-방사성 세포독성 검정 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨) 참조). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. (1998) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 항체가 C1q에 결합하지 못하여 CDC 활성이 결핍되어 있는지를 확인하기 위해 또한 C1q 결합 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해 CDC 검정을 수행할 수 있다 (문헌 [Gazzano-Santoro et al. (1996), J. Immunol. Methods 202:163; Cragg, M.S. et al. (2003) Blood 101:1045-1052; Cragg, M.S. and M.J. Glennie, (2004) Blood 103:2738-2743]). FcRn 결합 및 생체내 제거율/반감기 결정은 또한 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다 (문헌 [Petkova, S.B. et al. (2006) Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769]).
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (US 6737056). 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체 (잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는, 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 포함)를 포함한다 (US 7332581).
FcR에 대해 개선되거나 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재되어 있다. (US 6737056; WO 2004/056312; 문헌 [Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604]).
특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642, 및 문헌 [Idusogie et al. (2000) J. Immunol. 164: 4178-4184]에 기재된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 나타내는 변경들이 Fc 영역에서 이루어진다.
증가된 반감기, 및 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])에 대한 개선된 결합을 갖는 항체가 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826). Fc 영역 변이체의 다른 예에 관한 문헌 [Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; US 5648260; US 5624821; 및 WO 94/29351을 또한 참조한다.
시스테인 조작된 항체 변이체
특정 실시양태에서, 항체의 1개 이상의 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킨 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 이와 같이 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 일어난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 반응성 티올 기가 항체의 접근가능한 부위에 배치되고, 이것을 이용하여 항체를 본원에 추가로 기재된 바와 같이 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜 항체-약물 접합체 (ADC) (또한, 면역접합체로 지칭됨)를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 하기 잔기 중 임의의 하나 이상은 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어 US 7521541에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
항체 유도체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 당업계에 공지되고 용이하게 입수가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어 글리세롤), 폴리비닐 알콜 및 그의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 물에서의 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착되어 있는 중합체의 수는 달라질 수 있고, 1개 초과의 중합체가 부착되어 있는 경우에, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건 하에 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고려사항에 기초하여 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체, 및 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (문헌 [Kam et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:11600-11605]). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포는 사멸시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열이 초가변성이고/거나 구조적으로 한정된 루프 ("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6개의 HVR; VH 내의 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내의 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프로부터의 및/또는 "상보성 결정 영역" (CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 서열 가변성이 가장 높고/거나 항원 인식과 관련된다. 예시적인 초가변 루프는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3)에서 발생한다 (문헌 [Chothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917]). 예시적인 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65, 및 H3의 95-102에서 발생한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]). VH 내의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원에 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 단축-CDR 또는 a-CDR로 지칭되는 CDR의 영역 내에 함유된다. 예시적인 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58, 및 H3의 95-102에서 발생한다 (문헌 [Almagro and Fransson, (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633]). 달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인에서의 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 본원에서 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 넘버링된다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분에서 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체를 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의한 측정시 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제한다. 항체 순도의 평가 방법의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Flatman et al. (2007) J. Chromatogr. B 848:79-87]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 이러한 집단을 구성하는 개별 항체는 일반적으로 소량으로 존재하는, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 함유하거나 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 생성되는 가능한 변이체 항체를 제외하고는 동일하고/거나, 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 동종 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로서 간주되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 이뮤노글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조할 수 있고, 상기 방법 및 모노클로날 항체를 제조하기 위한 다른 예시적인 방법이 본원에 기재된다.
"네이키드 항체"는 이종 모이어티 (예를 들어, 세포독성 모이어티) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 네이키드 항체는 제약 제제에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 다양한 구조를 갖는 자연 발생 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 디술피드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 영역 (VH) (또한 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로 지칭됨)에 이어 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 영역 (VL) (또한 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로 지칭됨)에 이어 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 지칭되는 2개의 유형 중 하나로 할당될 수 있다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는 서열을 정렬시키고 필요한 경우에는 최대 서열 동일성 퍼센트 달성을 위해 갭을 도입한 후 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않으면서 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 당업계 기술 범위 내의 다양한 방식, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교할 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열 정렬에 적절한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크. 소유로서, 소스 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱턴 디.씨.)에 사용자 문서로 제출되어 있고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)를 통해 공개적으로 이용가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 비롯한 UNIX 운영 시스템에서 사용되도록 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있으며 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 % (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 또는 이를 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 기재될 수 있음)는 하기와 같이 계산된다: X/Y의 분율 x 100 (여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 A 및 B의 프로그램 정렬시에 상기 프로그램에 의해 동일한 매치로 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 총 수임). 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에는 B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %가 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 상기 단락에 기재한 바와 같이 수득한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 항원에 대한 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄 (각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 각각의 도메인이 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 갖는 유사한 구조를 갖는다. 예를 들어, 문헌 [Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)]을 참조한다. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정한 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다 (문헌 [Portolano et al. (1993) J. Immunol. 150:880-887; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628]).
"종양-연관 항원" (TAA)은 당업계에 공지되어 있고, 당업계에 널리 공지되어 있는 방법 및 정보를 이용하여 인간 또는 인간화 항체를 생성시키는데 사용하기 위해 제조할 수 있다. 암 진단 및 요법을 위한 효과적인 세포 표적을 발견하기 위한 시도에서, 연구자들은 하나 이상의 정상적인 비-암성 세포(들)에 비해 하나 이상의 특정한 유형(들)의 암 세포의 표면에서 특이적으로 발현되는 막횡단 또는 다른 종양-연관 폴리펩티드를 확인하고자 하였다. 종종, 이러한 종양-연련 폴리펩티드는 비-암성 세포의 표면에서와 비교하여 암 세포의 표면에서 보다 풍부하게 발현된다. 이러한 종양-연관 세포 표면 항원 폴리펩티드의 확인을 통해, 항체-기반 요법을 통해 파괴시킬 암 세포를 특이적으로 표적화하는 능력이 생성된다.
TAA의 예는 하기 수록된 TAA (1)-(36)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 편의상, 이러한 항원에 관한 정보 (모두가 당업계에 공지되어 있음)를 아래에 기재하였고, 이것은 미국립 생물 공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information) (NCBI)의 핵산 및 단백질 서열 확인 규정에 따른 명칭, 대체 명칭, 진뱅크(Genbank) 등록 번호 및 주요 참고문헌(들)을 포함한다. TAA (1)-(36)에 상응하는 핵산 및 단백질 서열은 공공 데이터베이스, 예컨대 진뱅크에서 입수가능하다. 항체가 표적으로 하는 종양-연관 항원은 언급된 참고문헌에서 확인되는 서열과 비교하여 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 서열 동일성을 갖거나 언급된 참고문헌에서 확인되는 서열을 갖는 TAA와 실질적으로 동일한 생물학적 특성 또는 특징을 나타내는 모든 아미노산 서열 변이체 및 이소형을 포함한다. 예를 들어, 일반적으로, 변이체 서열을 갖는 TAA는 수록된 상응하는 서열을 갖는 TAA에 특이적으로 결합하는 항체에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에서 구체적으로 언급된 참고문헌에서의 서열 및 개시내용은 명백하게 참고로 포함된다.
종양-연관 항원 (1)-(36):
(1) BMPR1B (골 형태발생 단백질 수용체-유형 IB, 진뱅크 등록 번호 NM_001203) ten Dijke,P., et al. Science 264 (5155):101-104 (1994), Oncogene 14 (11):1377-1382 (1997)); WO2004/063362 (청구항 2); WO2003/042661 (청구항 12); US2003/134790-A1 (페이지 38-39); WO2002/102235 (청구항 13; 페이지 296); WO2003/055443 (페이지 91-92); WO2002/99122 (실시예 2; 페이지 528-530); WO2003/029421 (청구항 6); WO2003/024392 (청구항 2; 도 112); WO2002/98358 (청구항 1; 페이지 183); WO2002/54940 (페이지 100-101); WO2002/59377(페이지 349-350); WO2002/30268 (청구항 27; 페이지 376); WO2001/48204 (실시예; 도 4); NP_001194 골 형태발생 단백질 수용체, 유형 IB /pid=NP_001194.1. 상호-참조: MIM:603248; NP_001194.1; AY065994
(2) E16 (LAT1, SLC7A5, 진뱅크 등록 번호 NM_003486) Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (2), 283-288 (1999), Nature 395 (6699):288-291 (1998), Gaugitsch, H.W., et al. (1992) J. Biol. Chem. 267 (16):11267-11273); WO2004/048938 (실시예 2); WO2004/032842 (실시예 IV); WO2003/042661 (청구항 12); WO2003/016475 (청구항 1); WO2002/78524 (실시예 2); WO2002/99074 (청구항 19; 페이지 127-129); WO2002/86443 (청구항 27; 페이지 222, 393); WO2003/003906 (청구항 10; 페이지 293); WO2002/64798 (청구항 33; 페이지 93-95); WO2000/14228 (청구항 5; 페이지 133-136); US2003/224454 (도 3); WO2003/025138 (청구항 12; 페이지 150); NP_003477 용질 캐리어 패밀리 7 (양이온성 아미노산 수용체, y+시스템), 구성원 5 /pid=NP_003477.3 - 호모 사피엔스; 상호-참조: MIM:600182; NP_003477.3; NM_015923; NM_003486_1
(3) STEAP1 (전립선의 6회 막횡단 상피 항원, 진뱅크 등록 번호 NM_012449); Cancer Res. 61 (15), 5857-5860 (2001), Hubert, R.S., et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (25):14523-14528); WO2004/065577 (청구항 6); WO2004/027049 (도 1L); EP1394274 (실시예 11); WO2004/016225 (청구항 2); WO2003/042661 (청구항 12); US2003/157089 (실시예 5); US2003/185830 (실시예 5); US2003/064397 (도 2); WO2002/89747 (실시예 5; 페이지 618-619); WO2003/022995 (실시예 9; 도 13A, 실시예 53; 페이지 173, 실시예 2; 도 2A); NP_036581 전립선의 6회 막횡단 상피 항원; 상호-참조: MIM:604415; NP_036581.1; NM_012449_1
(4) 0772P (CA125, MUC16, 진뱅크 등록 번호 AF361486); J. Biol. Chem. 276 (29):27371-27375 (2001)); WO2004/045553 (청구항 14); WO2002/92836 (청구항 6; 도 12); WO2002/83866 (청구항 15; 페이지 116-121); US2003/124140 (실시예 16); 상호-참조: GI:34501467; AAK74120.3; AF361486_1
(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, 거핵구 증강 인자, 메소텔린, 진뱅크 등록 번호 NM_005823) Yamaguchi, N., et al. Biol. Chem. 269 (2), 805-808 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20):11531-11536 (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (1):136-140 (1996), J. Biol. Chem. 270 (37):21984-21990 (1995)); WO2003/101283 (청구항 14); (WO2002/102235 (청구항 13; 페이지 287-288); WO2002/101075 (청구항 4; 페이지 308-309); WO2002/71928 (페이지 320-321); WO94/10312 (페이지 52-57); 상호-참조: MIM:601051; NP_005814.2; NM_005823_1
(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, 용질 캐리어 패밀리 34 (인산나트륨), 구성원 2, 유형 II 나트륨-의존성 포스페이트 수송체 3b, 진뱅크 등록 번호 NM_006424) J. Biol. Chem. 277 (22):19665-19672 (2002), Genomics 62 (2):281-284 (1999), Feild, J.A., et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3):578-582); WO2004/022778 (청구항 2); EP1394274 (실시예 11); WO2002/102235 (청구항 13; 페이지 326); EP0875569 (청구항 1; 페이지 17-19); WO2001/57188 (청구항 20; 페이지 329); WO2004/032842 (실시예 IV); WO2001/75177 (청구항 24; 페이지 139-140); 상호-참조: MIM:604217; NP_006415.1; NM_006424_1
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, 세마포린 5b Hlog, sema 도메인, 7개 트롬보스폰딘 반복부 (유형 1 및 유형 1-유사), 막횡단 도메인 (TM) 및 짧은 세포질 도메인, (세마포린) 5B, 진뱅크 등록 번호 AB040878); Nagase T., et al. (2000) DNA Res. 7 (2):143-150); WO2004/000997 (청구항 1); WO2003/003984 (청구항 1); WO2002/06339 (청구항 1; 페이지 50); WO2001/88133 (청구항 1; 페이지 41-43, 48-58); WO2003/054152 (청구항 20); WO2003/101400 (청구항 11); 등록: Q9P283; EMBL; AB040878; BAA95969.1. Genew; HGNC:10737
(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 유전자, 진뱅크 등록 번호 AY358628); Ross et al. (2002) Cancer Res. 62:2546-2553; US2003/129192 (청구항 2); US2004/044180 (청구항 12); US2004/044179 (청구항 11); US2003/096961 (청구항 11); US2003/232056 (실시예 5); WO2003/105758 (청구항 12); US2003/206918 (실시예 5); EP1347046 (청구항 1); WO2003/025148 (청구항 20); 상호-참조: GI:37182378; AAQ88991.1; AY358628_1
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(10) MSG783 (RNF124, 가설 단백질 FLJ20315, 진뱅크 등록 번호 NM_017763); WO2003/104275 (청구항 1); WO2004/046342 (실시예 2); WO2003/042661 (청구항 12); WO2003/083074 (청구항 14; 페이지 61); WO2003/018621 (청구항 1); WO2003/024392 (청구항 2; 도 93); WO2001/66689 (실시예 6); 상호-참조: LocusID:54894; NP_060233.2; NM_017763_1
(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, 전립선암 연관 유전자 1, 전립선암 연관 단백질 1, 전립선의 6회 막횡단 상피 항원 2, 6회 막횡단 전립선 단백질, 진뱅크 등록 번호 AF455138); Lab. Invest. 82 (11):1573-1582 (2002)); WO2003/087306; US2003/064397 (청구항 1; 도 1); WO2002/72596 (청구항 13; 페이지 54-55); WO2001/72962 (청구항 1; 도 4B); WO2003/104270 (청구항 11); WO2003/104270 (청구항 16); US2004/005598 (청구항 22); WO2003/042661 (청구항 12); US2003/060612 (청구항 12; 도 10); WO2002/26822 (청구항 23; 도 2); WO2002/16429 (청구항 12; 도 10); 상호-참조: GI:22655488; AAN04080.1; AF455138_1
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, 일시적 수용체 잠재성 양이온 채널, 서브패밀리 M, 구성원 4, 진뱅크 등록 번호 NM_017636); Xu, X.Z., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (19):10692-10697 (2001), Cell 109 (3):397-407 (2002), J. Biol. Chem. 278 (33):30813-30820 (2003)); US2003/143557 (청구항 4); WO2000/40614 (청구항 14; 페이지 100-103); WO2002/10382 (청구항 1; 도 9A); WO2003/042661 (청구항 12); WO2002/30268 (청구항 27; 페이지 391); US2003/219806 (청구항 4); WO2001/62794 (청구항 14; 도 1A-D); 상호-참조: MIM:606936; NP_060106.2; NM_017636_1
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 기형암종-유래 성장 인자, 진뱅크 등록 번호 NP_003203 또는 NM_003212); Ciccodicola, A., et al. EMBO J. 8 (7):1987-1991 (1989), Am. J. Hum. Genet. 49 (3):555-565 (1991)); US2003/224411 (청구항 1); WO2003/083041 (실시예 1); WO2003/034984 (청구항 12); WO2002/88170 (청구항 2; 페이지 52-53); WO2003/024392 (청구항 2; 도 58); WO2002/16413 (청구항 1; 페이지 94-95, 105); WO2002/22808 (청구항 2; 도 1); US5854399 (실시예 2; Col 17-18); US5792616 (도 2); 상호-참조: MIM:187395; NP_003203.1; NM_003212_1
(14) CD21 (CR2 (보체 수용체 2) 또는 C3DR (C3d/엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스 수용체) 또는 Hs.73792 진뱅크 등록 번호 M26004); Fujisaku et al. (1989) J. Biol. Chem. 264 (4):2118-2125); Weis J.J., et al. J. Exp. Med. 167, 1047-1066, 1988; Moore M., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 9194-9198, 1987; Barel M., et al. Mol. Immunol. 35, 1025-1031, 1998; Weis J.J., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5639-5643, 1986; Sinha S.K., et al. (1993) J. Immunol. 150, 5311-5320; WO2004/045520 (실시예 4); US2004/005538 (실시예 1); WO2003/062401 (청구항 9); WO2004/045520 (실시예 4); WO91/02536 (도 9.1-9.9); WO2004/020595 (청구항 1); 등록: P20023; Q13866; Q14212; EMBL; M26004; AAA35786.1.
(15) CD79b (CD79B, CD79β, IGb (이뮤노글로불린-연관 베타), B29, 진뱅크 등록 번호 NM_000626 또는 11038674); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (7):4126-4131, Blood (2002) 100 (9):3068-3076, Muller et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22 (6):1621-1625); WO2004/016225 (청구항 2, 도 140); WO2003/087768, US2004/101874 (청구항 1, 페이지 102); WO2003/062401 (청구항 9); WO2002/78524 (실시예 2); US2002/150573 (청구항 5, 페이지 15); US5644033; WO2003/048202 (청구항 1, 페이지 306 및 309); WO 99/58658, US6534482 (청구항 13, 도 17A/B); WO2000/55351 (청구항 11, 페이지 1145-1146); 상호-참조: MIM:147245; NP_000617.1; NM_000626_1
(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (SH2 도메인 함유 포스파타제 앵커 단백질 1a), SPAP1B, SPAP1C, 진뱅크 등록 번호 NM_030764, AY358130); Genome Res. 13 (10):2265-2270 (2003), Immunogenetics 54 (2):87-95 (2002), Blood 99 (8):2662-2669 (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17):9772-9777 (2001), Xu, M.J., et al. (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3):768-775; WO2004/016225 (청구항 2); WO2003/077836; WO2001/38490 (청구항 5; 도 18D-1-18D-2); WO2003/097803 (청구항 12); WO2003/089624 (청구항 25); 상호-참조: MIM:606509; NP_110391.2; NM_030764_1
(17) HER2 (ErbB2, 진뱅크 등록 번호 M11730); Coussens L., et al. Science (1985) 230(4730):1132-1139); Yamamoto T., et al. Nature 319, 230-234, 1986; Semba K., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6497-6501, 1985; Swiercz J.M., et al. J. Cell Biol. 165, 869-880, 2004; Kuhns J.J., et al. J. Biol. Chem. 274, 36422-36427, 1999; Cho H.-S., et al. Nature 421, 756-760, 2003; Ehsani A., et al. (1993) Genomics 15, 426-429; WO2004/048938 (실시예 2); WO2004/027049 (도 1I); WO2004/009622; WO2003/081210; WO2003/089904 (청구항 9); WO2003/016475 (청구항 1); US2003/118592; WO2003/008537 (청구항 1); WO2003/055439 (청구항 29; 도 1A-B); WO2003/025228 (청구항 37; 도 5C); WO2002/22636 (실시예 13; 페이지 95-107); WO2002/12341 (청구항 68; 도 7); WO2002/13847 (페이지 71-74); WO2002/14503 (페이지 114-117); WO2001/53463 (청구항 2; 페이지 41-46); WO2001/41787 (페이지 15); WO2000/44899 (청구항 52; 도 7); WO2000/20579 (청구항 3; 도 2); US5869445 (청구항 3; Col 31-38); WO9630514 (청구항 2; 페이지 56-61); EP1439393 (청구항 7); WO2004/043361 (청구항 7); WO2004/022709; WO2001/00244 (실시예 3; 도 4); 등록: P04626; EMBL; M11767; AAA35808.1. EMBL; M11761; AAA35808.1
(18) NCA (CEACAM6, 진뱅크 등록 번호 M18728); Barnett T., et al. Genomics 3, 59-66, 1988; Tawaragi Y., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 89-96, 1988; Strausberg R.L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:16899-16903, 2002; WO2004/063709; EP1439393 (청구항 7); WO2004/044178 (실시예 4); WO2004/031238; WO2003/042661 (청구항 12); WO2002/78524 (실시예 2); WO2002/86443 (청구항 27; 페이지 427); WO2002/60317 (청구항 2); 등록: P40199; Q14920; EMBL; M29541; AAA59915.1. EMBL; M18728
(19) MDP (DPEP1, 진뱅크 등록 번호 BC017023); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26):16899-16903 (2002)); WO2003/016475 (청구항 1); WO2002/64798 (청구항 33; 페이지 85-87); JP05003790 (도 6-8); WO99/46284 (도 9); 상호-참조: MIM:179780; AAH17023.1; BC017023_1
(20) IL20Rα (IL20Ra, ZCYTOR7, 진뱅크 등록 번호 AF184971); Clark H.F., et al. Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Mungall A.J., et al. Nature 425, 805-811, 2003; Blumberg H., et al. Cell 104, 9-19, 2001; Dumoutier L., et al. J. Immunol. 167, 3545-3549, 2001; Parrish-Novak J., et al. J. Biol. Chem. 277, 47517-47523, 2002; Pletnev S., et al. (2003) Biochemistry 42:12617-12624; Sheikh F., et al. (2004) J. Immunol. 172, 2006-2010; EP1394274 (실시예 11); US2004/005320 (실시예 5); WO2003/029262 (페이지 74-75); WO2003/002717 (청구항 2; 페이지 63); WO2002/22153 (페이지 45-47); US2002/042366 (페이지 20-21); WO2001/46261 (페이지 57-59); WO2001/46232 (페이지 63-65); WO98/37193 (청구항 1; 페이지 55-59); 등록: Q9UHF4; Q6UWA9; Q96SH8; EMBL; AF184971; AAF01320.1.
(21) 브레비칸 (BCAN, BEHAB, 진뱅크 등록 번호 AF229053); Gary S.C., et al. Gene 256, 139-147, 2000; Clark H.F., et al. Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Strausberg R.L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; US2003/186372 (청구항 11); US2003/186373 (청구항 11); US2003/119131 (청구항 1; 도 52); US2003/119122 (청구항 1; 도 52); US2003/119126 (청구항 1); US2003/119121 (청구항 1; 도 52); US2003/119129 (청구항 1); US2003/119130 (청구항 1); US2003/119128 (청구항 1; 도 52); US2003/119125 (청구항 1); WO2003/016475 (청구항 1); WO2002/02634 (청구항 1)
(22) EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5, 진뱅크 등록 번호 NM_004442); Chan,J. and Watt, V.M., Oncogene 6 (6), 1057-1061 (1991) Oncogene 10 (5):897-905 (1995), Annu. Rev. Neurosci. 21:309-345 (1998), Int. Rev. Cytol. 196:177-244 (2000)); WO2003042661 (청구항 12); WO200053216 (청구항 1; 페이지 41); WO2004065576 (청구항 1); WO2004020583 (청구항 9); WO2003004529 (페이지 128-132); WO200053216 (청구항 1; 페이지 42); 상호-참조: MIM:600997; NP_004433.2; NM_004442_1
(23) ASLG659 (B7h, 진뱅크 등록 번호 AX092328); US2004/0101899 (청구항 2); WO2003104399 (청구항 11); WO2004000221 (도 3); US2003/165504 (청구항 1); US2003/124140 (실시예 2); US2003/065143 (도 60); WO2002/102235 (청구항 13; 페이지 299); US2003/091580 (실시예 2); WO2002/10187 (청구항 6; 도 10); WO2001/94641 (청구항 12; 도 7b); WO2002/02624 (청구항 13; 도 1A-1B); US2002/034749 (청구항 54; 페이지 45-46); WO2002/06317 (실시예 2; 페이지 320-321, 청구항 34; 페이지 321-322); WO2002/71928 (페이지 468-469); WO2002/02587 (실시예 1; 도 1); WO2001/40269 (실시예 3; 페이지 190-192); WO2000/36107 (실시예 2; 페이지 205-207); WO2004/053079 (청구항 12); WO2003/004989 (청구항 1); WO2002/71928 (페이지 233-234, 452-453); WO 01/16318
(24) PSCA (전립선 줄기 세포 항원 전구체, 진뱅크 등록 번호 AJ297436); Reiter R.E., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1735-1740, 1998; Gu Z., et al. Oncogene 19, 1288-1296, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275(3):783-788; WO2004/022709; EP1394274 (실시예 11); US2004/018553 (청구항 17); WO2003/008537 (청구항 1); WO2002/81646 (청구항 1; 페이지 164); WO2003/003906 (청구항 10; 페이지 288); WO2001/40309 (실시예 1; 도 17); US2001/055751 (실시예 1; 도 1b); WO2000/32752 (청구항 18; 도 1); WO98/51805 (청구항 17; 페이지 97); WO98/51824 (청구항 10; 페이지 94); WO98/40403 (청구항 2; 도 1B); 등록: O43653; EMBL; AF043498; AAC39607.1
(25) GEDA (진뱅크 등록 번호 AY260763); AAP14954 지방종 HMGIC 융합-파트너 유사 단백질 /pid=AAP14954.1 - 호모 사피엔스 (인간); WO2003/054152 (청구항 20); WO2003/000842 (청구항 1); WO2003/023013 (실시예 3, 청구항 20); US2003/194704 (청구항 45); 상호-참조: GI:30102449; AAP14954.1; AY260763_1
(26) BAFF-R (B 세포-활성화 인자 수용체, BLyS 수용체 3, BR3, 진뱅크 등록 번호 AF116456); BAFF 수용체 /pid=NP_443177.1 - 호모 사피엔스: Thompson, J.S., et al. Science 293 (5537), 2108-2111 (2001); WO2004/058309; WO2004/011611; WO2003/045422 (실시예; 페이지 32-33); WO2003/014294 (청구항 35; 도 6B); WO2003/035846 (청구항 70; 페이지 615-616); WO2002/94852 (Col 136-137); WO2002/38766 (청구항 3; 페이지 133); WO2002/24909 (실시예 3; 도 3); 상호-참조: MIM:606269; NP_443177.1; NM_052945_1; AF132600
(27) CD22 (B-세포 수용체 CD22-B 이소형, BL-CAM, Lyb-8, Lyb8, SIGLEC-2, FLJ22814, 진뱅크 등록 번호 AK026467); Wilson et al. (1991) J. Exp. Med. 173:137-146; WO2003/072036 (청구항 1; 도 1); 상호-참조: MIM:107266; NP_001762.1; NM_001771_1
(28) CD79a (CD79A, CD79α, 이뮤노글로불린-연관 알파, B 세포-특이적 단백질 (Ig 베타 (CD79B)와 공유 상호작용하고, 표면 상에서 IgM 분자와 복합체를 형성하여, B-세포 분화에 관련된 신호를 변환시킴)), pI: 4.84, MW: 25028 TM: 2 [P] 유전자 염색체: 19q13.2, 진뱅크 등록 번호 NP_001774.10); WO2003/088808, US2003/0228319; WO2003/062401 (청구항 9); US2002/150573 (청구항 4, 페이지 13-14); WO99/58658 (청구항 13, 도 16); WO92/07574 (도 1); US5644033; Ha et al. (1992) J. Immunol. 148(5):1526-1531; Mueller et al. (1992) Eur. J. Immunol.. 22:1621-1625; Hashimoto et al. (1994) Immunogenetics 40(4):287-295; Preud homme et al. (1992) Clin. Exp. Immunol. 90(1):141-146; Yu et al. (1992) J. Immunol. 148(2) 633-637; Sakaguchi et al. (1988) EMBO J. 7(11):3457-3464
(29) CXCR5 (버킷 림프종 수용체 1, G 단백질-커플링된 수용체 (CXCL13 케모카인에 의해 활성화되고, 림프구 이동 및 체액 방어에서 기능하고, HIV-2 감염 및 아마도 AIDS, 림프종, 골수종, 및 백혈병의 발생에서 소정의 역할을 함)); 372 aa, pI: 8.54 MW: 41959 TM: 7 [P] 유전자 염색체: 11q23.3, 진뱅크 등록 번호 NP_001707.1); WO2004/040000; WO2004/015426; US2003/105292 (실시예 2); US6555339 (실시예 2); WO2002/61087 (도 1); WO2001/57188 (청구항 20, 페이지 269); WO2001/72830 (페이지 12-13); WO2000/22129 (실시예 1, 페이지 152-153, 실시예 2, 페이지 254-256); WO99/28468 (청구항 1, 페이지 38); US5440021 (실시예 2, col 49-52); WO94/28931 (페이지 56-58); WO92/17497 (청구항 7, 도 5); Dobner et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22:2795-2799; Barella et al. (1995) Biochem. J. 309:773-779
(30) HLA-DOB (MHC 클래스 II 분자 (Ia 항원)의 베타 서브유닛 (펩티드에 결합하고, 이들을 CD4+ T 림프구에 제시함)); 273 aa, pI: 6.56, MW: 30820.TM: 1 [P] 유전자 염색체: 6p21.3, 진뱅크 등록 번호 NP_002111.1); Tonnelle et al. (1985) EMBO J. 4(11):2839-2847; Jonsson et al. (1989) Immunogenetics 29(6):411-413; Beck et al. (1992) J. Mol. Biol. 228:433-441; Strausberg et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903; Servenius et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:8759-8766; Beck et al. (1996) J. Mol. Biol. 255:1-13; Naruse et al. (2002) Tissue Antigens 59:512-519; WO99/58658 (청구항 13, 도 15); US6153408 (Col 35-38); US5976551 (col 168-170); US6011146 (col 145-146); Kasahara et al. (1989) Immunogenetics 30(1):66-68; Larhammar et al. (1985) J. Biol. Chem. 260(26):14111-14119
(31) P2X5 (퓨린성 수용체 P2X 리간드-게이팅 이온 채널 5, 세포외 ATP에 의해 게이팅된 이온 채널 (시냅스 전달 및 신경발생에 관련될 수 있고, 결핍은 특발성 배뇨근 불안정의 병리생리에 기여할 수 있음)); 422 aa), pI: 7.63, MW: 47206 TM: 1 [P] 유전자 염색체: 17p13.3, 진뱅크 등록 번호 NP_002552.2); Le et al. (1997) FEBS Lett. 418(1-2):195-199; WO2004/047749; WO2003/072035 (청구항 10); Touchman et al. (2000) Genome Res. 10:165-173; WO2002/22660 (청구항 20); WO2003/093444 (청구항 1); WO2003/087768 (청구항 1); WO2003/029277 (페이지 82)
(32) CD72 (B-세포 분화 항원 CD72, Lyb-2); 359 aa, pI: 8.66, MW: 40225, TM: 1 [P] 유전자 염색체: 9p13.3, 진뱅크 등록 번호 NP_001773.1); WO2004042346 (청구항 65); WO2003/026493 (페이지 51-52, 57-58); WO2000/75655 (페이지 105-106); Von Hoegen et al. (1990) J. Immunol. 144(12):4870-4877; Strausberg et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903.
(33) LY64 (림프구 항원 64 (RP105), 류신 풍부 반복부 (LRR) 패밀리의 유형 I 막 단백질 (B-세포 활성화 및 아폽토시스를 조절하고, 기능의 손실은 전신 홍반성 루푸스를 갖는 환자에서 증가된 질환 활성과 관련됨)); 661 aa, pI: 6.20, MW: 74147 TM: 1 [P] 유전자 염색체: 5q12, 진뱅크 등록 번호 NP_005573.1); US2002/193567; WO97/07198 (청구항 11, 페이지 39-42); Miura et al. (1996) Genomics 38(3):299-304; Miura et al. (1998) Blood 92:2815-2822; WO2003/083047; WO97/44452 (청구항 8, 페이지 57-61); WO2000/12130 (페이지 24-26)
(34) FcRH1 (Fc 수용체-유사 단백질 1, C2 유형 Ig-유사 및 ITAM 도메인을 함유하는 이뮤노글로불린 Fc 도메인에 대한 추정 수용체 (B-림프구 분화에서 소정의 역할을 할 수 있음)); 429 aa, pI: 5.28, MW: 46925 TM: 1 [P] 유전자 염색체: 1q21-1q22, 진뱅크 등록 번호 NP_443170.1); WO2003/077836; WO2001/38490 (청구항 6, 도 18E-1-18-E-2); Davis et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98(17):9772-9777; WO2003/089624 (청구항 8); EP1347046 (청구항 1); WO2003/089624 (청구항 7)
(35) IRTA2 (FcRH5, 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리 수용체 전위 연관 2, B 세포 발생 및 림프종발생에서 가능한 역할을 갖는 추정 면역수용체; 전위에 의한 유전자의 탈조절이 일부 B 세포 악성종양에서 일어남); 977 aa, pI: 6.88, MW: 106468, TM: 1 [P] 유전자 염색체: 1q21, 진뱅크 등록 번호 Human:AF343662, AF343663, AF343664, AF343665, AF369794, AF397453, AK090423, AK090475, AL834187, AY358085; Mouse:AK089756, AY158090, AY506558; NP_112571.1; WO2003/024392 (청구항 2, 도 97); Nakayama et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 277(1):124-127; WO2003/077836; WO2001/38490 (청구항 3, 도 18B-1-18B-2)
(36) TENB2 (TMEFF2, 토모레귤린, TPEF, HPP1, TR, 추정 막횡단 프로테오글리칸 (성장 인자의 EGF/헤레귤린 패밀리 및 폴리스타틴과 관련됨)); 374 aa, NCBI 등록: AAD55776, AAF91397, AAG49451, NCBI RefSeq: NP_057276; NCBI 유전자: 23671; OMIM: 605734; SwissProt Q9UIK5; 진뱅크 등록 번호 AF179274; AY358907, CAF85723, CQ782436; WO2004/074320; JP2004113151; WO2003/042661; WO2003/009814; EP1295944 (페이지 69-70); WO2002/30268 (페이지 329); WO2001/90304; US2004/249130; US2004/022727; WO2004/063355; US2004/197325; US2003/232350; US2004/005563; US2003/124579; Horie et al. (2000) Genomics 67:146-152; Uchida et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:593-602; Liang et al. (2000) Cancer Res. 60:4907-12; Glynne-Jones et al. (2001) Int J Cancer. Oct 15; 94(2):178-84.
재조합 방법 및 조성물
항체는 재조합 방법 및 조성물을 이용하여, 예를 들어 US 4816567에 기재된 바와 같이 생산할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 한 이러한 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다 (예를 들어, 이들로 형질감염된다). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프성 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 상기에 제공된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체가 발현하는데 적합한 조건 하에 배양하는 것, 및 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 임의로 회수하는 것을 포함하는 항체를 제조하는 방법이 제공된다.
항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 이러한 핵산은 통상적인 절차를 이용하여 용이하게 단리하고 서열분석할 수 있다 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것에 의함).
항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않을 경우에, 항체를 박테리아에서 생산할 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해, 예를 들어 US 5648237; US 5789199; US 5840523; 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, (2003), pp. 245-254) (이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현 기재)을 참조한다. 발현 후에, 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 항체를 단리할 수 있고, 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물 뿐만 아니라, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어 항체를 부분적 또는 완전 인간 글리코실화 패턴으로 생산하는, 진균 및 효모 균주를 비롯한 사상 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 숙주 발현에 적합하다 (문헌 [Gerngross, (2004) Nat. Biotech. 22:1409-1414; Li et al. (2006) Nat. Biotech. 24:210-215]).
글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큘로바이러스 균주가 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있는 것으로 확인되어 있다.
식물 세포 배양물은 또한 숙주로 사용될 수 있다 (US 5959177; US 6040498; US 6420548; US 7125978; US 6417429, 트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)™ 기재).
척추동물 세포가 또한 숙주로 이용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장시키는데 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40 (COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주; 인간 배아 신장 세포주 (293 또는, 예를 들어 문헌 [Graham et al. (1977, J. Gen Virol. 36:59]에 기재된 바와 같은 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어 문헌 [Mather, (1980) Biol. Reprod. 23:243-251]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK; 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어 문헌 [Mather et al. (1982) Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예를 들어 DHFR- CHO 세포 (문헌 [Urlaub et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216]); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.
검정
항체는 당업계에 공지된 다양한 검정에 의해 그의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인되거나, 스크리닝되거나, 또는 특성화될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 항체를 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 등과 같은 공지된 방법에 의해 그의 항원 결합 활성에 대해 시험한다. 또 다른 측면에서, 경쟁 검정을 이용하여 항원에 대한 결합에 대해 또 다른 공지된 항체와 경쟁하는 항체를 확인할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 경쟁 항체는 공지된 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프 (예를 들어, 선형 또는 입체형태적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하는 예시적인 방법의 상세내용은 문헌 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공된다.
예시적인 경쟁 검정에서, 고정화된 항원은 항원에 결합하는 제1 표지된 항체 (예를 들어, HER2 또는 CD20) 및 항원에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하는 그의 능력에 대해 시험되는 제2 비표지된 항체를 포함하는 용액 중에서 인큐베이션한다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정화된 항원은 제1 표지된 항체를 포함하고 제2 비표지된 항체를 포함하지 않는 용액에서 인큐베이션한다. 항원에 대한 제1 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 인큐베이션한 후에, 잉여량의 미결합 항체를 제거하고, 고정화된 항원과 연관된 표지의 양을 측정한다. 고정화된 항원과 연관된 표지의 양이 대조 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소된 경우에, 이것은 제2 항체가 항원에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁한다는 것을 나타낸다. 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]을 참조한다.
한 측면에서, 생물학적 활성을 갖는 항체를 확인하기 위한 검정이 제공된다. 생물학적 활성은 예를 들어 종양 억제를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법의 항체는 생물학적 샘플에서 항원의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에 사용된 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 세포, 소변, 유리체, 누액 또는 조직을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 항원에 대한 본원에 기재된 바와 같은 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 생물학적 샘플을 상기 항체와 접촉시키는 것, 및 항체와 항원 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 예를 들어 발현된 항원 단백질이 환자의 선택을 위한 바이오마커인 경우에 항체를 사용하는 요법에 적격인 대상체를 선택하는데 사용된다. 본 발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 예시적인 장애는 암 및 면역 장애를 포함한다.
표지 및 접합된 항체가 본 발명의 방법의 특정 실시양태에 사용된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예컨대, 형광, 발색, 전자-밀집, 화학발광 및 방사성 표지) 뿐만 아니라 간접적으로, 예를 들어 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통해 검출되는 모이어티, 예를 들어 효소 또는 리간드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 표지는 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라제, 예를 들어 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제 (US 4737456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소, 예컨대 HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제와 커플링된 헤테로시클릭 옥시다제, 예컨대 우리카제 및 크산틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
세포-사멸에 영향을 미치는 약물 모이어티는 링커 유닛을 통해 항체에 공유 부착되어 표적화된 세포-사멸 치료 효과를 위한 항체-약물 접합체를 형성할 수 있다. 항체-약물 접합체 (ADC) 화합물의 예시적 실시양태는 종양 세포를 표적으로 하는 항체 (Ab), 및 세포독성 또는 세포증식억제 약물 모이어티 (D), 및 Ab를 D에 부착시키는 링커 모이어티 (L)를 포함한다. 항체는 하나 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 리신 및 시스테인을 통해 링커 모이어티 (L)에 의해 D에 부착되고; 조성물은 하기 화학식 I을 갖는다:
<화학식 I>
Ab-(L-D)p
여기서, p는 1 내지 약 20, 또는 약 2 내지 약 5이다. 항체 분자에 반응성 링커 모이어티를 통해 접합될 수 있는 약물 모이어티의 수는 본원에 기재된 방법에 의해 도입된 유리 시스테인 잔기의 수에 의해 제한될 수 있다.
항체-약물 접합체 (ADC)의 약물 모이어티 (D)는 세포독성 또는 세포증식억제 효과를 갖는 임의의 화합물, 모이어티 또는 기를 포함한다. 약물 모이어티는 튜불린 결합, DNA 결합 또는 삽입을 포함하지만 이에 제한되지는 않은 메카니즘, 및 RNA 폴리머라제, 단백질 합성 및 토포이소머라제의 억제에 의해 그의 세포독성 및 세포증식억제 효과를 전할 수 있다. 일부 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합되는 경우에 불활성이 되거나 활성이 감소되는 경향이 있다. 예시적인 약물 모이어티는 메이탄시노이드, 돌라스타틴, 아우리스타틴, 칼리케아미신, 피롤로벤조디아제핀 (PBD), PNU-159682, 안트라시클린, 두오카르마이신, 빈카 알칼로이드, 탁산, 트리코테센, CC1065, 두오카르마이신, 캄프토테신, 엘리나피드, 및 그의 입체이성질체, 동배체, 유사체 또는 유도체 (및 세포독성 활성을 갖는 이러한 약물의 유도체 포함)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
항체-약물 접합체 (ADC)는 종래의 소분자 및 항체 암 화학요법과 관련하여 비특이적 독성을 감소시키고 효능을 증가시키도록 설계된 표적화된 항암 치료제이다. 이들은 매우 강력한, 접합된 소분자 치료제를 암 세포에 특이적으로 전달하는 모노클로날 항체의 강력한 표적화 능력을 이용한다. 이러한 항체-약물 접합체의 특성, 예컨대 약동학 및 독성을 평가하기 위해, 혈장, 소변, 및 다른 생물학적 샘플로부터 이들을 특성화하고 정량화할 수 있는 것이 유용하다. 비드-기반 친화성 포획 방법 (US 2009/0286258)을 비롯하여, 면역친화성 막 (IAM) 포획 및 질량 분광측정법에 의해 항체-약물 접합체를 검출 및 스크리닝하는 방법이 개시되어 있다 (US 2005/0232929).
생물학적 샘플에서의 인간 및 인간화 항체의 측정 방법
본 발명의 한 측면은 전임상 연구로부터의, 시노몰구스 원숭이 및 래트 혈장 및 조직 샘플에서 공통적인 항체 스캐폴드 구조를 갖는 다양한 인간 및 인간화 모노클로날 항체 (MAb) 치료제, 및 잠재적으로 다른 비-인간 종의 정량화를 위한 재현가능하고, 효율적이며 경제적인 일반적 LC-MS/MS-기반 방법이다. 항체의 소화는 투여된 인간 또는 인간화 치료 항체에 대해 특징적이고, 내인성 원숭이 및 래트 단백질에서 발견되지 않는 보존된 프레임워크 영역으로부터 펩티드를 제공한다.
도 9는 하나 이상의 프레임워크 시그너처 펩티드 (FSP)를 이용하여 동물 혈장/혈청에서 치료 항체를 정량화하기 위한 일반적 LC-MS/MS 방법을 보여준다.
본 발명의 방법은
(a) 생물학적 샘플을 소화 효소로 처리하여 소화된 항체 샘플을 형성하며, 여기서 혈청 또는 혈장 샘플은 인간 또는 인간화 항체로 처리된 동물로부터의 것인 단계; 및
(b) 소화된 항체 샘플을 질량 분광측정법에 의해 분석하여 하나 이상의 공통적인 인간 프레임워크 펩티드의 농도를 검출 및 측정하며, 여기서 인간 프레임워크 펩티드는 서열 1-8로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 것인 단계
를 포함하는, 인간 또는 인간화 항체를 정량화하는 일반적 접근법을 포함한다.
한 예시적 실시양태에서, 소화 효소는 트립신이다. 대안적 프로테아제는 서열 1-8을 갖는 것 이외에 추가의 프레임워크 펩티드를 생성할 수 있다. 임의의 특이적 효소, 예컨대 엔도프로테이나제 LysC, 엔도프로테이나제 ArgC, 스타필로코쿠스 아우레우스 V8 및 엔도프로테이나제 GluC가 사용될 수 있다. 비-특이적 프로테아제, 예컨대 파파인이 사용될 수 있다. 정량화를 위해 생성된 펩티드는 트립신을 사용한 것과 상이한 서열을 가질 수 있으나, 인간에 존재하고 동물 항체에는 존재하지 않는 일반적 프레임워크 펩티드를 사용하는 개념은 동일하다.
또 다른 실시양태에서, 방법은 소화된 항체 샘플을 친화성 포획 매질 또는 고체-상 추출 (SPE) 샘플 클린업과 접촉시키고, 풍부화된 소화된 항체 샘플을 용리하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 방법은 서열 1-8로부터 선택된 서열을 갖는 하나 이상의 인간 프레임워크 펩티드를 포함하는 항체의 친화성 포획에 이어 소화를 포함한다. 친화성 포획 방법은 ECD (세포외 도메인 항원 결합), 항-ID 포획 또는 단백질 A 또는 G에 의해 달성될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 비-인간 포유동물로부터 유래된 혈청, 혈장, 조직 또는 세포주이다.
방법의 예시적인 입증에서, 항체는 항-HER2 트라스투주맙 (헤르셉틴®, 제넨테크, 인크.)이다. 다른 항체가 본 발명의 방법에 적용된다. 비-임상 혈장으로부터 트립신 소화되고 분석된 항체는 항-MUC16, 항-MSLN (메소텔린), 항-Steap1, 항-CD20 (2H7 및 리툭시맙), 항-HER3 (2C4, 페르투주맙), 항-NRP1, 항-PDL1, 항-LRP6, 항-B7-H4, 항-GFRA1 7C9, 항-NRG1 및 항-LY6E를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체 샘플은 비드-지지된 단백질 A/G에 의한 면역침전 (IP) 친화성 포획에 이어 비드 상의 소화 및 분석을 이용하여 분석된다.
프레임워크 시그너처 펩티드
인간 항체의 프레임워크 영역은 대부분 보존된다. 도 1은 인간 2H7 항체 오크렐리주맙 (서열 11) 및 5가지 시노몰구스 원숭이 항-CD20 항체: CynoHC 1a D3 1 (서열 12), CynoHC 1b E5 1 (서열 13), Cyno HC 2a (서열 14), CynoHC 2b E6 1 (서열 15), CynoHC 3 (서열 16)의 중쇄 아미노산 서열의 서열 정렬을 보여준다. 각각 서열에 적어도 하나의 아미노산 차이를 보유하면서, 인간 2H7 (hu 2H7) Mab에 대해 특징적이고 시노몰구스 원숭이 IgG 중쇄에는 존재하지 않는 프레임워크 시그너처 펩티드가 확인된다 (FSP 1-8). 이용가능한 서열 정보에 기초하여, 프레임워크 시그너처 펩티드 (FSP1-8)는 오직 인간 항체에 대해 특징적이고, 시노몰구스 IgG 변이체에 대해서는 그렇지 않다. 표 2의 프레임워크 시그너처 펩티드 (FSP 1-8)는 또한 내인성 IgG1, 일부 경우에는 IgG2, IgG3 및 IgG4에 존재한다. 이러한 펩티드는 또한 다른 인간 또는 인간화 치료 항체 및 인간 IgG 사이에서 공통적이다.
트라스투주맙 (헤르셉틴®, 제넨테크)은 모델 참조 표준물로서 사용되고, 시노몰구스 원숭이 및 래트 혈장으로 첨가되고, 이어서 SPE 예비농축 또는 단백질 A/G 자기 비드에 의한 면역침전의 존재 또는 부재 하의 직접적 전체 혈장 소화 및 이후의 비드 상의 소화에 이어 LC-MS/MS 분석이 수행되고, 작동 보정 범위는 혈장 매트릭스 둘 다에서 1-1000 μg/mL로 확립된다. 특이성은 음성 대조군 블랭크 혈장 및 첨가된 혈장 샘플에 의해 시험 및 확인된다.
트라스투주맙 (헤르셉틴®, huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, 제넨테크)은 세포-기반 검정 (Kd = 5 nM)에서 고친화도로 인간 표피 성장 인자 수용체2 단백질, HER2 (ErbB2)의 세포외 도메인에 선택적으로 결합하는 뮤린 HER2 항체의 재조합 DNA-유래 인간화, IgG1 카파, 모노클로날 항체 버전이다 (US 5821337; US 6054297; US 6407213; US 6639055; 문헌 [Coussens L, et al. (1985) Science 230:1132-9; Slamon DJ, et al. (1989) Science 244:707-12]). 트라스투주맙은 HER2에 결합하는 뮤린 항체 (4D5)의 상보성 결정 영역을 갖는 인간 프레임워크 영역을 함유한다. 트라스투주맙은 HER2 항원에 결합하여, 암성 세포의 성장을 억제한다. 트라스투주맙은 시험관내 검정 및 동물 둘 다에서 HER2를 과다발현하는 인간 종양 세포의 증식을 억제하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Hudziak RM, et al. (1989) Mol Cell Biol 9:1165-72; Lewis GD, et al. (1993) Cancer Immunol Immunother; 37:255-63; Baselga J, et al. (1998) Cancer Res. 58:2825-2831]). 트라스투주맙은 항체-의존성 세포 세포독성, ADCC의 매개자이다 (문헌 [Hotaling TE, et al. (1996) [abstract]. Proc. Annual Meeting Am Assoc Cancer Res; 37:471; Pegram MD, et al. (1997) [abstract]. Proc Am Assoc Cancer Res; 38:602; Sliwkowski et al. (1999) Seminars in Oncology 26(4), Suppl 12:60-70; Yarden Y. and Sliwkowski, M. (2001) Nature Reviews: Molecular Cell Biology, Macmillan Magazines, Ltd, Vol. 2:127-137]). 헤르셉틴®은 ErbB2-과다발현 전이성 유방암을 갖는 환자의 치료를 위해 1998년에 승인되었다 (문헌 [Baselga et al., (1996) J. Clin. Oncol. 14:737-744]).
FSP1-8 (서열 1-8)의 안정한 동위원소-표지된 (SIL) 유사체가 계내 ("첨가된") 내부 표준으로 사용될 수 있다. 전형적인 안정한 동위원소 표지는 13C, 15N 및 2H를 포함한다. 내부 표준은 펩티드 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기에 혼입될 수 있다. 내부 표준은 소화 전후에 샘플에 도입될 수 있고, LC-MS/MS 분석 동안 발생하는 변화 (예를 들어, 오토샘플러 성능, LC 분리 및 MS 반응에서의 변화)를 보상하는 기능을 한다. 예를 들어, 페닐알라닌 (F)과 티로신 (Y) 사이의 리신이 13C 및 15N으로 표지된 FSP8의 안정한 동위원소 표지된 버전이 제조된다.
그의 MS 특성에 기초하여, FSP8이 경험적으로 정량화를 위한 1차 펩티드로서 그의 가장 강렬한 신호 반응으로 인해 선택된다. 또한, 3가지 다른 펩티드, FSP4, FSP5 및 FSP3은 정성적 확인을 위해 모니터링된다. 각각의 이러한 4가지 펩티드는 동물 생물학적 매트릭스에서 mAb를 정량화하기 위한 대용물로 사용될 수 있다. 그의 상응하는 SIL IS가 검정에 사용된다 (표 3). FSP6은 공동-용리 간섭 배경이 시노몰구스 원숭이 혈장에서 검출되었기 때문에 시노몰구스 원숭이가 아닌 동물 매트릭스에서만 사용될 수 있다. 상대적으로 보다 약한 이온화가 FSP1, FSP5 및 FSP2에서 관찰되었다.
인간 및 인간화 항체
도 2는 트라스투주맙 (헤르셉틴®, 제넨테크 인크.; rhuMAbHER2, 항 p185HER2), 재조합 유래 인간화 모노클로날 항체, CAS 등록 번호 180288-69-1의 중쇄 (서열 17) 및 경쇄 (서열 18)를 보여준다.
도 3은 오크렐리주맙, rhuMAb 2H7, PRO70769, 인간화 항-CD20 항체, CAS 등록 번호 637334-45-3의 중쇄 (서열 11) 및 경쇄 (서열 19)를 보여준다.
도 4는 페르투주맙, rhuMAb 2C4, CAS 등록 번호 380610-27-5의 중쇄 (서열 20) 및 경쇄 (서열 21)를 보여준다. FSP2, FSP3, FSP8은 중쇄 (서열 20)에서 밑줄 표시된 바와 같이 확인된다.
도 5는 항-PDL1, T 세포 조절제의 확장된 CD28/CTLA-4 패밀리의 구성원의 중쇄 (서열 22) 및 경쇄 (서열 23)를 보여준다. FSP2, FSP4, FSP8은 중쇄 (서열 22)에서 밑줄 표시된 바와 같이 확인된다.
도 6은 항-뉴로필린-1, 항-NRP1, MNRP1685A의 중쇄 (서열 24) 및 경쇄 (서열 25)를 보여준다. FSP2, FSP4, FSP8은 중쇄 (서열 24)에서 밑줄 표시된 바와 같이 확인된다. 항-NRP1은 VEGF 패밀리의 구성원을 포함하여 다양한 리간드에 결합하는 것으로 알려져 있는 다중-도메인 수용체인 뉴로필린-1 (NRP1)을 특이적으로 표적화하는 재조합, 파지-유래, 인간 모노클로날 항체이다. 항-NRP1은 마우스 이종이식 모델에서 항-VEGF와 조합된 효능 및 전임상 종에서 넓은 용량 범위에 걸쳐 강한 비선형 약동학을 입증하였다. 이는 현재 단일 작용제로서 및 파클리탁셀의 존재 또는 부재 하에 베바시주맙과 조합되어 I상 연구에서 평가되고 있다.
도 7은 항-MUC16, DMUC4064A의 중쇄 (서열 26) 및 경쇄 (서열 27)를 보여준다. FSP2, FSP4, FSP8은 중쇄 (서열 26)에서 밑줄 표시된 바와 같이 확인된다.
도 8은 리툭시맙, C2B8, 맙테라, (리툭산®, 제넨테크 인크., 비오젠/이덱)의 중쇄 (서열 28) 및 경쇄 (서열 19)를 보여준다. FSP2, FSP4, FSP8은 중쇄 (서열 28)에서 밑줄 표시된 바와 같이 확인된다. 리툭시맙 (리툭산®, 제넨테크/비오젠 이덱; 맙테라®, 로슈(Roche), 레디툭스(REDITUX)®, CAS 등록 번호 174722-31-7)은 CD20 항원에 대해 지시된 유전자 조작된 키메라 뮤린/인간 모노클로날 항체이다. 리툭시맙은 US 5736137에서 "C2B8"로 불리는 항체이다. 리툭시맙은 재발성 또는 불응성 저등급 또는 여포성, CD20-양성, B-세포 NHL을 갖는 환자의 치료를 위해 지시된다. 리툭시맙은 세포 표면 CD-20에 결합하고, B-세포 고갈을 초래한다 (문헌 [Cartron et al. (2002) Blood 99: 754-758; Idusogie et al. (2000) J. Immunol. 164: 4178-4184; Grillo-Lopez AJ, et al. (1999) Semin Oncol; 26:66-73]; US 5736137). 리툭산 (US 5677180; US 5736137)은 조혈 악성종양에서 가장 널리 사용되는 모노클로날 항체이고, 광범위한 임상 실시에서 확립되었다. 리툭산은 재발성 또는 불응성, 저등급 또는 여포성, CD20-양성, B-세포 비-호지킨 림프종 (NHL)의 치료를 위해 1997년에 처음 FDA 승인을 받았다. 이는 또한 1998년 6월에 상표 맙테라®로 유럽 연합의 승인을 받았다. 2006년 2월에, 리툭산은 또한 하나 이상의 TNF 길항제 요법에 부적절한 반응을 나타낸 중등도-내지-중증-활성 류마티스 관절염을 갖는 성인 환자에서 징후 및 증상을 감소시키기 위해 메토트렉세이트와 함께 FDA 승인을 받았다. 리툭시맙 항체 (또한 C2B8로 명명됨)의 아미노산 서열 및 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 재조합 발현을 통한 그의 생산을 위한 예시적인 방법은 미국 특허 번호 5736137에 개시되어 있다.
샘플 제조
도 15는 비오티닐화 포획 프로브에 결합된 스트렙타비딘 코팅된 자기 비드 또는 단백질 A, G 코팅된 자기 비드 상에서의 동물 혈장/혈청으로부터의 mAb의 포획, 이어서 자기 분리에 의한 단리, 포획된 항체의 소화 및 LC-MS/MS에 의한 분석의 카툰을 보여준다.
도 16은 항체의 포괄적 포획을 위한 단백질 A, G 코팅된 자기 비드 (상부) 및 항체의 특이적 포획을 위한 비오티닐화 포획 프로브에 결합된 스트렙타비딘 코팅된 자기 비드 (하부)의 실시양태를 보여준다.
표적 모노클로날 항체 (MAb)를 단백질 A와 효율적으로 및 재현가능하게 단리하기 위한 면역침전의 잠재성을 2가지 포맷으로 평가한다: (a) 자기 비드에 커플링된 단백질 A 및 (b) 96-웰 마이크로-타이터 플레이트 상에 코팅된 단백질 A. 예비 시험에서, 단백질 A 마이크로-타이터 플레이트는 또한 특히 원숭이 혈장으로부터, 표적 Mab와 함께 내인성 IgG의 총 적용된 로드를 포획하는데 단백질 A 자기 비드와 비교하여 제한된 용량이다. 단백질 A 자기 비드를 사용하는 비드 상의 소화가 리튬/헤파린 처리된 시노몰구스 원숭이 및 스프라그-돌리 래트 혈장 둘 다로부터 FSP의 단리에 대한 평가를 위해 선택된다. 전체 혈장 소화에 이어 고체 상 추출 (SPE)을 또한 시험하였고, 배경 잡음으로부터 간섭을 제거하는데 덜 효과적인 것으로 밝혀졌다.
생물학적 샘플의 분리 및 분석
FSP 특이성, 검출 민감성 및 재현가능성을 평가하기 위한 2가지 접근법이 연구되었다: (1) 전체 혈장 소화/SPE (고체 상 추출), 및 (2) 면역침전 (IP).
원숭이 (시노몰구스) 및 래트 혈장 샘플 (각 종에서 n = 10 로트)은 로트-대-로트 특이성, 잠재적 간섭 효과 및 재현가능성을 평가하기 위해 평가된다. 블랭크 혈장 대조군과 함께, 블랭크 혈장 샘플이 강화되고, 즉 20 μg/ml의 트라스투주맙이 "첨가"된다. 1-1000 μg/ml 트라스투주맙 범위의 일련의 보정기 트라스투주맙 샘플은 수집된 혈장 매트릭스에서 개별 원숭이 및 래트 혈장 샘플과 병행하여 제조 및 실행된다.
도 12는 전체 혈장 소화/SPE 접근법에 의해 제조된 리튬 헤파린 시노몰구스 원숭이 혈장에 1-1000 μg/mL의 다양한 농도로 첨가된 트라스투주맙 (대용물로서 FSP8 사용)의 보정 곡선을 보여준다. 안정한 동위원소-표지된 펩티드 내부 표준 (IS)이 적절한 농도를 함유하는 작동 내부 표준 용액을 만들기 위해 20% 아세토니트릴에서 제조된다.
도 14는 동물 혈장 또는 혈청에서 모노클로날 항체의 면역침전 (IP) 및 상응하는 프레임워크 시그너처 펩티드 (FSP)의 생성을 위한 단계를 보여준다. 프로토콜은 실시예 1-4에 규정된다.
동물 샘플은 단백질 A 상자성 비드 (밀리포어(Millipore))로의 면역침전 (IP)에 이어 트립신 소화에 의해 제조된다. 96-웰 원뿔형-바닥 마이크로타이터 플레이트 (VWR 사이언티픽(VWR Scientific))에, 25 μL 희석된 혈장 또는 혈청의 분취액 [0.1:5.0:3.0:0.2:91.7:0.1 트윈 20 / 트리즈마 히드로클로라이드 (1 M) / 염화나트륨 (5 M) / EDTA (0.5 M) / 물 / BSA, v/v/v/v/v/w의 로딩 완충제 (SN1)로의 1:2 v/v 희석]을 125 μL 로딩 완충제와 함께 두었다. 로딩 완충제에서 미리 세척되고 재현탁된 단백질 A 자기 비드의 25 μL 분취액을 각 웰에 첨가한다. 이어서, 혼합물을 지속적인 혼합 하에 120분 동안 실온 (RT)에서 인큐베이션하여 mAb의 포획을 허용한다. 상청액을 버리고, 비드를 5.0:3.0:0.2:91.8 트리즈마 히드로클로라이드 (1 M) / 염화나트륨 (5 M) / EDTA (0.5 M) / 물, v/v/v/v의 세척 완충제 (SN2)에서 완전히 세척한다. 세척 및 자기 분리는 각각 마이크로플레이트 세척기 (바이오텍(BioTek), 미국 버몬트주) 및 96-웰 편평 자석 (바이오텍)을 사용하여 수행한다. 세척/분리 과정은 또한 킹피셔(KingFisher) 96 자기 입자 처리기 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))로 수행될 수 있다.
면역침전 (IP)에 따라, 작동 IS 용액의 25 μL 분취액을 블랭크를 제외한 각 웰에 첨가하고, 블랭크에는 대신 20% 아세토니트릴 25 μL을 첨가한다. 75 μL 라피제스트(RapiGest) 용액의 분취액 (0.05:37.5:10 라피제스트 분말/50 mM 중탄산암모늄/아세토니트릴, w/v/v) 및 10 μL의 0.1 M DTT를 첨가한다. 플레이트를 접착 밀봉 필름 (VWR 사이언티픽)으로 덮고, 대략 1분 동안 부드럽게 진탕시킨 후에 60분 동안 60℃에서 인큐베이션한다. 25 μL 아이오도아세트산 (0.1 M)의 부피를 첨가하고, 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고, 광을 차단하여 대략 30분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 10 μL 트립신 용액 (0.250 mg/mL)의 분취액을 각 웰에 첨가하고, 이후에 플레이트를 대략 90분 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 소화는 각 웰에 2 M HCl 15 μL를 첨가하여 종결시키고, 플레이트를 30분 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 이어서, 샘플을 톰텍 (미국 코네티컷주)에 의해 96-웰, 원뿔형-바닥 수집 플레이트 상에 놓인 멀티스크린(Multiscreen) HTS 필터 플레이트 (0.45μm, 밀리포어)로 전달하고, 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 여과물을 수집한다. 수집 플레이트를 밀봉하고, 20 μL 여과물의 부피를 직접 LC-MS/MS 상에 주사한다.
ELISA 및 LC-MS/MS
ELISA (도 19a) 및 LC-MS/MS (도 19b)는 항체의 단일 용량 후에 래트 혈장에서의 총 항체를 측정하여 비교한다. 도 19a는 전기화학발광, 비색 또는 담색 기질 검출을 이용하는 ELISA 검정에서 고정화된 세포외 도메인 (ECD) 또는 항-인간 IgG 폴리클로날 항체에 대한 결합에 의해 포획되고, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)로 표지된 항-인간 IgG 폴리클로날 항체로 검출된 모노클로날 항체 (mAb 치료제)의 카툰을 보여준다.
액체 크로마토그래피 분리는 200 μL/분의 유량으로 작동하는 역상 바이오스위트(BioSuite) C18 PA-A 칼럼 (2.1 x 50 mm, 3 μm, 워터스(Waters))을 사용하는 HP 애질런트(Agilent) 1100 시리즈 LC 이원 시스템 또는 시마즈(Shimadzu) LC-10ADvp 이원 시스템에 의해 수행한다. 칼럼을 칼럼 가열기 (애널리티컬 세일즈 앤드 프로덕츠(Analytical Sales and Products), 미국 뉴저지주)에 의해 50℃에서 유지한다. 이동상은 A: 물 중 0.1% 포름산 및 B: 아세토니트릴/메탄올 (75:25, v/v) 중 0.1% 포름산으로 구성된다. 구배 조건은 0.4분 동안 5% B에서 유지하고, 3.4분 내에 40% B로 올리고, 1분 내에 95% B로 추가로 증가시키고, 0.5분 동안 95% B에서 유지한 후에 0.1분 내에 5% B로 되돌린다. 이어서, 0.5분 동안 5%에서 유지한 후에 0.1분 내에 95% B로 다시 올리고, 0.5분 동안 이 수준에서 유지하여 잠재적 캐리오버(carryover)를 감소시킨다. 최종적으로, 구배를 0.1분 내에 5% B로 되돌리고, 0.9분 동안 5% B에서 재평형시킨다. 총 LC 실행 시간은 7.5분이다. 샘플을 20 μL의 주사기 루프를 갖는 CTC HTS PAL 오토샘플러 (LEAP 테크놀로지스(LEAP Technologies), 미국, 노스캐롤라이나주)를 이용하여 주사한다. 오토샘플러 세척 1은 아세토니트릴/이소프로판올/트리플루오로에탄올/메탄올/물/포름산 (부피로, 60:15:15:5:5:0.2)이고, 세척 2는 물/아세토니트릴/포름산 (부피로, 95:5:0.2)이다.
터보 이온스프레이가 장착된 사이엑스 API 4000® 3중 사중극자 질량 분광계 (AB 사이엑스(AB Sciex), 미국 캘리포니아주)가 정량화에 이용된다. MS 기기는 500℃에서의 소스 온도 세트 및 5000 V에서의 이온스프레이 전압을 사용하는 양성 이온 모드에서 작동한다. 기체 파라미터는 25에서의 커튼 기체, 45에서의 네뷸라이저 기체 및 40에서의 보조 기체로 셋팅된다. 10의 충돌 기체가 사용된다. 시그너처 펩티드 및 그의 상응하는 내부 표준에 대한 다중 반응 모니터링 (MRM) 전이에 대한 상세한 내용은 표 4에 수록된다. 체류 시간을 각각의 MRM 전이에 대해 50 ms로 셋팅하고, 10 V의 동일한 진입 전위를 적용한다. Q1 및 Q3 해상도가 둘 다 장치에서 셋팅된다. 정량화는 피크 면적에 기초하여 인텔리콴(Intelliquan)을 이용하여 수행한다.
정량화 방법은 트라스투주맙을 모델로 사용하여 수행한다. 보정 표준은 1.00, 1.75, 3.00, 10.0, 25.0, 75.0, 200 및 250 μg/mL에서 시노몰구스 원숭이 혈장 또는 스프라그-돌리 래트 혈장으로 트라스투주맙을 첨가함으로써 제조된다. 품질 대조군 (QC)은 혈장에서 트라스투주맙의 1.00 (LLOQ), 2.50 (LQC), 15.0 (MQC) 및 190 μg/mL (UQC)에서 제조된다. 또한, 1000 μg/mL 최초 농도의 10x 희석 배율로의 QC 희석액이 포함된다. 검정내 QC는 6회 반복하여 제조하고, QC 희석액을 3회 반복하여 제조한다. 정량화 방법의 데이터는 표 5에 보고된다. 데이터는 LC-MS/MS 검정이 미리 정의된 허용 기준 내의 값으로 우수한 정밀도 및 정확도를 갖는다는 것을 나타낸다.
도 17a는 대용물로서 FSP8을 사용하여 래트 혈장에서 1 μg/mL (LLOQ)의 트라스투주맙 항체를 동일한 체류 시간에서 검출된 안정한-동위원소 표지된 FSP8 내부 표준 (도 17b)으로 검출하는 것을 보여준다. 샘플을 실시예 4의 프로토콜에 따라 제조한다. 도 18의 래트 혈장에서 1-250 μg/mL의 트라스투주맙으로부터 우수한 선형성이 입증되었다.
도 20은 2 mg/kg 볼루스의 트라스투주맙, 항-HER2 mAb를 투여한 래트 (1A, 1B, 1C)의 개별 농도 시간 프로파일을 보여준다. 투여후 28시간에 걸친 혈장 샘플은 LC-MS/MS (도 19b) 및 ELISA (도 19a) 검정에 의해 분석한다. 2가지 검정 방법 사이에서 우수한 일치가 관찰되었다. 도 20으로부터의 PK 파라미터는 다음과 같다:
도 21은 2 mg/kg 볼루스의 3A5, 항-MUC 16 mAb를 투여한 래트 (2D, 2E, 2F)의 개별 농도 시간 프로파일을 보여준다. 투여후 28시간에 걸친 혈장 샘플은 LC-MS/MS (도 19b) 및 ELISA (도 19a) 검정에 의해 분석한다. 2가지 방법 사이에서 우수한 일치가 관찰되었다. 도 21로부터의 PK 파라미터는 다음과 같다:
도 22는 2 mg/kg 볼루스의 항-메소텔린 (Msln) mAb를 투여한 래트 (3G, 3H, 3I)의 결과를 보여준다. 28시간에 걸친 혈장 샘플을 투여 후에 LC-MS/MS (도 19b) 및 ELISA (도 19a) 검정에 의해 분석한다. 2가지 방법 사이에서 우수한 일치가 관찰되었다. 도 22로부터의 PK 파라미터는 다음과 같다:
도 23은 28일에 걸친 혈액에서의 항체 측정에 의한 3A5, 항-MUC 16 mAb를 투여한 시노몰구스 원숭이로부터의 혈장/혈청 샘플의 평균 약동학 (PK)에 기초하여 도 19b에 도시된 LC-MS/MS 검정과 도 19a의 ELISA 검정 사이의 일치를 보여준다. 도 23으로부터의 PK 파라미터는 다음과 같다:
도 24는 42일에 걸친 혈액에서의 항체 측정에 의한 항-메소텔린 (Msln) mAb를 투여한 시노몰구스 원숭이로부터의 혈장/혈청 샘플의 평균 약동학 (PK)에 기초하여 도 19b에 도시된 LC-MS/MS 검정과 도 19a의 ELISA 검정 사이의 일치를 보여준다. 도 24로부터의 PK 파라미터는 다음과 같다:
도 25는 항체-약물 접합체 (ADC), 항-LY6E-MC-vc-PAB-MMAE (하기 구조를 가짐)를 투여한 마우스 (A, B, C)로부터의 혈장/혈청 샘플의 개별 약동학 (PK)에 기초하여 도 19b에 도시된 LC-MS/MS 검정과 도 19a의 ELISA 검정 사이의 일치를 보여준다:
여기서 Ab는 링커의 말레이미도카프로일 (MC) 기에 시스테인 아미노산을 통해 연결된 항-LY6E 항체이고, p는 ADC 분자에서 항체당 약물 모이어티 (MMAE)의 수이다. ADC의 전형적인 혼합물에서 p의 범위는 약 0 내지 약 20, 또는 0 내지 약 8이다. p가 0인 경우에, 특정 양의 네이키드, 비접합 항체가 존재할 수 있다. 항체당 평균 약물 부하는 약 2 내지 약 5 또는 약 3 내지 약 4일 수 있다. 따라서 항체-약물 접합체 (ADC)의 전형적인 제제는 약물 모이어티, 예컨대 MMAE 몇 개와 접합된 항체를 갖는 종의 불균질 혼합물이다. 링커는 또한 카텝신 인식에 영향을 받기 쉬운 발린-시트룰린 (Val-Cit) 디펩티드 유닛 및 파라-아미노벤질옥시메틸 (PAB) 유닛을 포함한다 (US 7659241; US 7498298; 문헌 [Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124; 및 Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784]).
약물 모이어티 MMAE (베도틴, (S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-히드록시-1-페닐프로판-2-일)아미노)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필)피롤리딘-1-일)-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일)-N,3-디메틸-2-((S)-3-메틸-2-(메틸아미노)부탄아미도)부탄아미드, CAS 등록 번호 474645-27-7)는 항체에 그의 N-말단을 통해 연결된 돌라스타틴의 모노메틸아우리스타틴 유사체이다 (US 5635483; US 5780588). MMAE는 하기 구조를 갖는다:
도 23-28의 항체 투약 실험으로부터의 2가지 검정 방법 (LC-MS/MS 및 ELISA)으로부터의 PK 프로파일 및 파라미터는 대용물로서 공통적인 프레임워크 시그너처 펩티드를 이용하는 단일 일반적 LC-MS/MS 검정에 의한 시노몰구스 원숭이, 래트 및 마우스를 포함하는 동물에서의 mAb의 정량화가 실현가능하고, 강인 성능을 갖는다는 것을 나타내는 고도의 일치를 보여준다. 단일 MS-기반 접근법은 그렇지 않으면 달성을 위해 다중 ELISA 검정을 필요로 하는 신뢰할만한 PK 데이터를 생성할 수 있다. 또한, MS 접근법은 방법 개발 과정을 가속화하고 약물 개발의 조기 단계에서 이용가능한 PK 평가를 만드는 것을 도울 수 있는 어떠한 주문 시약도 요구하지 않는다.
데이터 분석
보정 곡선은 DWYIHWVR (서열 9), FSP3, FSP4, FSP5, FSP8 (원숭이 및 래트 둘 다의 경우에 모두) 및 NQVSLTCLVK (서열 10) (래트 단독)에 대한 면역침전 접근법에서, 및 FSP4, FSP5, FSP8 (원숭이 및 래트 둘 다의 경우에 모두)에 대한 전체 혈장 소화/SPE 접근법에서 확립되었다. 블랭크 및 첨가된 혈장 샘플에 대한 특이성 데이터가 확립되었다. FSP8 (1차 정량화에 대한 후보)과 관련하여 상이한 펩티드에 대한 면적 비 및 상응하는 CV (가변 계수)가 소화 재현가능성의 기준으로 제공되었다. 2차 (1/계량된 농도2) 회귀를 이용하여 데이터를 핏팅하였다.
원숭이 혈장 샘플의 처리를 위한 전체 혈장 소화/SPE 접근법에서 (실시예 3b), FSP8은 가장 민감한 펩티드이다. 도 13은 전체 혈장 소화/SPE 샘플 제조 후에 LLOQ (정량화의 하한치) = 1 μg/mL에서 리튬 헤파린화 시노몰구스 원숭이 혈장에 첨가된 FSP8의 검출을 입증하는 LC-MS/MS 크로마토그램을 보여준다. 4.47 및 5.20분에서의 피크는 블랭크에 있다. FSP8은 4.66분의 체류 시간을 갖는다. 낮은 농도에서 정량화가능한 다른 펩티드는 오직 FSP4 및 FSP5이었다. 그러나, 1 μg/mL-LLOQ 수준에서의 그의 신호 대 잡음 비 (s/n)는 5 미만(< 5)이었다. 예상되는 바와 같이, 펩티드 NQVSLTCLVK (서열 10)는 모든 원숭이 혈장에서 높은 내인성 배경 수준을 보여주었다. 시험된 10개 개별 로트 중 9개는 유사하고 허용되는 특이성을 갖는다. 로트# 5는 모든 정량화가능한 펩티드에 대해 흔치 않은 배경 수준을 갖는다. 패턴은 이것이 일부 인간 혈장으로 오염될 수도 있음을 시사한다. 전반적으로, FSP (즉, 첨가된) 샘플은 1차 정량화를 위한 잠재적 시그너처 펩티드인 FSP8에 대한 모든 로트에 대해 우수한 정확도 및 정밀도를 보여주었다 (예외: 27% CV를 갖는 FSP7). FSP8과 비교하여 FSP4 및 FSP5의 피크 면적 비는 상이한 샘플 및 샘플 유형에 걸쳐 20% 미만의 CV를 보여주었다.
래트 혈장 샘플의 처리를 위한 전체 혈장 소화/SPE 접근법에서 (실시예 3b), FSP8은 가장 강력한 펩티드이다. 낮은 수준 농도에서 정량화가능한 다른 펩티드는 FSP4 및 FSP5이다. 그러나, LLOQ 수준에서의 이러한 펩티드에 대한 s/n은 5 미만이다. 보정 곡선은 아마도 나중에 주사된 샘플의 신호 억제 때문일 수 있는 분열된 특성을 보여주었다. 시험된 개별 로트 중 어느 것도 모든 펩티드에 대해 정량화가능한 배경 피크를 갖지 않았다. 분열된 곡선으로 인해, FSP 샘플은 매우 가변성인 정확도 및 정밀도 값을 보여주었다. FSP8과 관련하여 FSP4 및 FSP5의 피크 면적 비는 대부분의 경우에 20% 초과의 CV를 보여주었고, 이는 다시 검정 가변성을 지적한다.
원숭이 혈장 샘플의 치료를 위한 면역침전 접근법에서 (실시예 4), FSP8은 가장 민감한, 즉 강력한 펩티드이다. 다른 모든 펩티드는 또한 낮은 수준 농도에 정량화될 수 있다. LLOQ 수준에서의 다른 모든 펩티드에 대한 s/n은 5 초과이다 (FSP2 제외). 예상되는 바와 같이, 펩티드 NQVSLTCLVK (서열 10)는 모든 원숭이 혈장 샘플에 대한 배경 수준을 보여주었다. 농도와 반응 사이의 관계는 높은 농도에서 약간 비선형성을 보여주었는데, 이는 아마도 단백질 A 자기 비드의 포화 및/또는 내인성 시노몰구스 원숭이 IgG와의 경쟁 때문일 수 있다. 시험된 10개 개별 로트 중에서, 로트# 5로부터의 샘플은 유사한 수준에서 모든 정량화가능한 펩티드에 대해 배경 피크를 갖는다 (가변 영역 펩티드 DTYIHWVR (서열 9)의 경우 제외). 전반적으로, FSP 샘플은 FSP8에 대한 모든 로트에 대해 우수한 정확도 및 정밀도를 보여주었다 (블랭크에서의 배경 농도가 고려되는 경우에 로트#5 포함). 거의 모든 펩티드의 피크 면적 비는 상이한 샘플 및 샘플 유형에 걸쳐 15% 미만의 CV를 보여주었다 (약 23%의 CALS에 대한 CV를 갖는 FSP5 제외).
래트 혈장 샘플의 처리를 위한 면역침전 (IP) 접근법에서 (실시예 4), FSP8은 가장 강력한 펩티드이다. 다른 모든 펩티드는 또한 낮은 수준 농도에서 정량화될 수 있다. LLOQ 수준에서의 다른 모든 펩티드에 대한 s/n은 5 초과이다 (FSP2 제외). 농도와 반응 사이의 관계는 원숭이 면역침전 (IP) 데이터보다 우수한 선형성을 보여주었으며, 이는 아마도 래트 혈장에서의 보다 낮은 친화도 내인성 IgG로부터의 보다 적은 경쟁 때문일 것이다. 시험된 개별 로트 중 어느 것도 모든 펩티드에 대해 정량화가능한 배경 피크를 갖지 않았다. 전반적으로, FSP 샘플은 FSP8에 대한 모든 로트에 대해 우수한 정확도 및 정밀도를 보여주었다. 거의 모든 펩티드의 피크 면적 비는 상이한 샘플 및 샘플 유형에 걸쳐 20% 미만의 CV를 보여주었다 (24% 초과(> 24%)의 CALS에 대한 CV를 갖는 FSP5 및 FSP2 제외).
단백질 A 자기 비드를 사용하는 면역침전 (IP) 추출은 전체 혈장 소화/SPE 추출보다 우수한 민감성 및 재현가능성을 보여주었다. IP 접근법은 전체 매트릭스 소화/SPE 접근법 보다 빠르고 "완벽하다".
실시예
실시예 1 단순 전체 혈장 소화 및 추출 절차
1. 10 μL의 (시트르산나트륨) 혈장을 lo-결합 플레이트에 분취한다
2. 50 mM 중탄산암모늄의 10 mM DTT 용액 95 μL를 첨가한다
3. 혼합하고, 60℃에서 60분 동안 인큐베이션한다
4. 50 mM 중탄산암모늄 중 100 mM 아이오도아세트아미드 (IAA) 20 μL를 첨가한다
5. 암실에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션한다
6. 광실에 20분 동안 둔다
7. 50 mM 중탄산암모늄 중 500 μg/mL 트립신 용액 15 μL를 첨가한다
8. 37℃에서 밤새 인큐베이션한다
9. 1% 포름산 용액 15 μL를 첨가한다. 혼합하고, 원심분리한다.
10. LC-MS/MS (20 μL 주사, 0.7 mL/분 UPLC)에 의해 분석한다
실시예 2 MAX/WCX 마이크로일루션(microElution)® 플레이트 (워터스 코포레이션(Waters Corp.))에 대한 고체-상 추출 프로토콜
1. 혈청/혈장 소화물 600 μL를 8% H3PO4 100 μL와 혼합한다
2. MAX/WCX μ일루션 SPE 플레이트 (워터스 코포레이션, 매사추세츠주 밀포드)를 MeOH 200 μL로 조건화한다
3. MAX/WCX μ일루션 SPE 플레이트를 H2O 200 μL로 평형화한다
4. 희석된 혈청/혈장 소화물을 MAX/WCX μ일루션 SPE 플레이트 상에 로딩한다 (2 x 350 μL 분취액). 각각의 첨가 후에 충분한 만큼만 진공을 적용하여 샘플이 점적 방식으로 층을 통과하도록 한다.
5. 5% NH4OH 200μL로 세척한다
6. 20% ACN (아세토니트릴) 200μL로 세척한다
7. 적당한 진공 하에 (2 x 25 μL)의 75:25:1 아세토니트릴 / 물 / TFA, v/v/v로 96-위치, 2.0 mL, 사각형-웰, 원뿔형-바닥, 폴리프로필렌 플레이트에 용리한다.
8. 물 200 μL를 첨가하고, 플레이트를 자주색 매트 실(seal)로 밀봉하고, 대략 30초 동안 볼텍싱한다.
9. 4000 QTRAP® LC/MS/MS 시스템 (AB 사이엑스, 미국 캘리포니아주 포스터 시티) 상에 25 μL를 주사한다
실시예 3a 전체 혈장 소화 절차 #1
1. 혈장 10 μL를 lo-결합 플레이트에 분취한다
2. 50 mM 중탄산암모늄 중 10 mM DTT 용액 95 μL를 첨가한다
3. 혼합하고, 60℃에서 60분 동안 인큐베이션한다
4. 50 mM 중탄산암모늄 중 100 mM 아이오도아세트아미드 20 μL를 첨가한다
5. 암실에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션한다
6. 광실에 20분 동안 둔다
7. 50 mM 중탄산암모늄 중 500 μg/mL 트립신 15 μL를 첨가한다
8. 37℃에서 밤새 인큐베이션한다
9. 1% 포름산 용액 15 μL를 첨가한다. 혼합하고, 원심분리한다.
10. LC-MS/MS에 의해 분석한다
실시예 3b 전체 혈장 소화물/SPE (고체 상 추출) - 프로토콜 #2
1. 혈장 샘플 25 μL를 라피제스트™ (워터스 코포레이션, 매사추세츠주 밀포드) SF 계면활성제 용액 (0.05:40:10 라피제스트™/암모늄 아세테이트, 50 mM / ACN, w/v/v) 100 μL와 혼합한다. 라피제스트™ 희석제 (80:20 아세트산암모늄, 50 mM / ACN, v/v) 400 μL를 더 첨가한다.
2. DTT (1 M) 10 μL를 첨가한다. 60℃에서 약 1시간 동안 인큐베이션한다.
3. IAA (1M) 25 μL를 첨가한다. 광을 차단하여 RT에서 약 0.5시간 동안 인큐베이션한다.
4. 트립신 20 μg을 첨가한다. 37℃에서 약 16시간 동안 인큐베이션한다.
5. 트립신 20 μg의 또 다른 용량을 첨가한다. 37℃에서 약 4시간 동안 인큐베이션한다.
6. 6M HCl 50 μL를 첨가한다. 37℃에서 약 0.5시간 동안 인큐베이션한다.
7. 오아시스(Oasis)® MAX μ일루션 플레이트 ((워터스 코포레이션, 매사추세츠주 밀포드))를 이용하여 전체 혈장 소화물 500 μL를 SPE에 적용한다.
8. 혈장 소화물 500 μL를 8% H3PO4 100 μL와 혼합한다
9. 오아시스® MAX μ일루션 SPE 플레이트를 MeOH 200 μL로 조건화한다
10. 오아시스® MAX μ일루션 SPE 플레이트를 H2O 200 μL로 평형화한다
11. 희석된 혈장 소화물을 오아시스® MAX μ일루션 SPE 플레이트 상에 로딩한다 (2 x 300 μL 분취액). 충분한 만큼만 진공을 적용하여 샘플이 점적 방식으로 층을 통과하도록 한다.
12. 5% NH4OH 200μL로 세척한다
13. 20% 아세토니트릴 200μL로 세척한다
14. 적당한 진공 하에 (2 x 25 μL)의 75:25:1 아세토니트릴 / 물 / TFA, v/v/v로 용리한다
15. 물 200 μL를 첨가하고, 플레이트를 밀봉한다. 대략 30초 동안 볼텍싱한다.
16. SPE 용리액의 최종 부피는 대략 250 μL이다. 이 추출물 25 μL를 직접 주사한다.
실시예 4 면역침전 프로토콜
1. 모든 비드가 균일하게 현탁되도록 단백질 A 비드 현탁액을 부드럽게 혼합한다.
2. 필요한 부피의 현탁된 비드를 폴리프로필렌 튜브에서 피펫팅한다. 외부 자석의 도움으로, 비드를 저장 완충제로부터 분리하고, 비드를 건드리지 않으면서 피펫으로 저장 완충제를 부드럽게 제거한다. (주: 필요한 비드 부피를 웰당 필요한 25-μL 비드 부피에 기초하여 계산한다).
3. 초기 비드 부피와 동일한 부피의 SN1 완충제를 폴리프로필렌 튜브에 첨가한다. 비드가 SN1 완충제에 재현탁되도록 잠시 볼텍싱한다.
4. 다시 외부 자석의 도움으로, 비드를 SN1 완충제로부터 분리하고, 비드를 건드리지 않으면서 SN1 완충제를 부드럽게 제거한다.
5. 단계 3-4를 2회 더 반복한다.
6. 비드를 세척한 후에, 초기 비드 부피와 동일한 부피의 SN1 완충제를 다시 첨가한다. 비드가 SN1 완충제에서 재현탁되도록 잠시 볼텍싱한다. 세척된 비드 용액은 사용 당일에 새롭게 준비된다. 이는 세척 1 시간 내에 사용되지 않으면 2-4℃에 저장해야 한다.
7. 혈장 샘플을 볼텍싱하고, 25-μL를 마이크로원심분리 튜브에 분취한다.
8. 혈장 샘플을 SN1 완충제 50 μL로 희석한다. 잠시 볼텍싱한다.
9. 희석된 혈장 샘플 25 μL를 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 분취한다.
10. SN1 완충제 125 μL를 각 웰에 첨가한다.
11. (6 단계로부터의) 세척된 단백질 A 비드 25 μL를 각 웰에 첨가한다. 비드를 첨가 전에 용액에 잘 현탁시킨다.
12. 플레이트를 접착 밀봉 필름으로 덮고, 적정 플레이트 진탕기 상에서 대략 2시간 동안 실온에서 부드럽게 진탕시킨다.
13. 외부 자석 및 플레이트 세척기를 이용하여, 자기 비드를 분리하고, 상청액에서 미결합 단백질을 제거한다. 비드를 플레이트 세척기를 이용하여 SN2 완충제로 3회 세척한다. 적정 플레이트 진탕기 상에서 진탕시킴으로써 비드를 각각의 세척 단계 전에 용액에 잘 현탁시킨다.
14. 내부 표준이 없는 블랭크를 제외하고 작동 내부 용액 25 μL를 각 웰에 첨가한다. 작동 내부 표준 희석제 25 μL를 내부 표준이 없는 블랭크를 함유하는 웰에 첨가한다.
15. 라피제스트 용액 75 μL를 각 웰에 첨가한다.
16. 0.1 M DTT 10 μL를 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 접착 밀봉 필름으로 덮고, 적정 플레이트 진탕기 상에서 대략 1분 동안 부드럽게 진탕시킨다.
17. 플레이트를 60℃에서 대략 1시간 동안 예열된 오븐에서 인큐베이션한다.
18. 0.1 M IAA 25 μL를 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 접착 밀봉 필름으로 덮고, 적정 플레이트 진탕기 상에서 대략 1분 동안 부드럽게 진탕시킨다. 이들 단계는 광을 차단하고 수행되어야 한다. 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고, 실온에서 대략 30분 동안 인큐베이션한다.
19. 트립신 용액 10 μL를 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 접착 밀봉 필름으로 덮고, 및 적정 플레이트 진탕기 상에서 대략 1분 동안 부드럽게 진탕시킨다.
20. 플레이트를 37℃에서 대략 90분 동안 예열된 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
21. 2 M HCl 15 μL를 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 접착 밀봉 필름으로 덮고, 적정 플레이트 진탕기 상에서 대략 1분 동안 부드럽게 진탕시킨다.
22. 플레이트를 37℃에서 30분 동안 예열된 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
23. 플레이트를 대략 1분 동안 적정 플레이트 진탕기 상에서 부드럽게 진탕시킨다. 톰텍(Tomtec)을 이용하여, 용액을 각 웰로부터 96-웰, 원뿔형-바닥 수집 플레이트의 상부에 놓인 멀티스크린 HTS 필터 플레이트로 옮긴다.
24. 멀티스크린 HTS 필터 플레이트 / 96-웰 원뿔형-바닥 수집 플레이트 조합물을 5분 동안 3000 rpm에서 원심분리하여 96-웰, 원뿔형-바닥 수집 플레이트에 여과물을 수집한다.
25. 96-원뿔형-바닥 수집 플레이트를 황색 주사 매트로 밀봉하고, 직접 주사한다.
SN1 완충제: 0.1:5.0:3.0:0.2:91.7:0.1 트윈 20 / 트리즈마 히드로클로라이드 (1 M) / 염화나트륨 (5 M) / EDTA (0.5 M) / 물 / 소 혈청 알부민, v/v/v/v/w. 이 용액은 트윈 20 1 mL, 1M 트리즈마 히드로클로라이드 50.0 mL, 5 M 염화나트륨 용액 30 mL, 0.5 M EDTA 2 mL 및 소 혈청 알부민 1.00 g을 1 L 용적 플라스크에서 합하여 제조한다. 이어서, 부피를 물로 채우고, 웰을 혼합하여 소 혈청 알부민을 용해시킨다. 이를 최대 1개월 동안 2-8℃에서 밀폐된 용기에 저장한다.
SN2 완충제: 5.0:3.0:0.2:91.8 트리즈마 히드로클로라이드 (1 M) / 염화나트륨 (5 M) / EDTA (0.5 M) / 물, v/v/v/v. 이 용액은 1M 트리즈마 히드로클로라이드 50.0 mL, 5 M 염화나트륨 용액 30 mL 및 0.5 M EDTA 2 mL를 1 L 용적 플라스크에서 합하여 제조한다. 이어서, 부피를 물로 채우고, 웰을 혼합한다. 이를 최대 1개월 동안 2-8℃에서 밀폐된 용기에 저장한다.
예시적인 HPLC 방법 #1:
구배 프로파일
예시적인 HPLC 방법 #2
칼럼: 워터스 바이오스위트 C18 PA-A, 3μm, 2.1 x 50 mm (부분# 188002425)
이동상 A: 0.1:100 포름산 / 물, v/v
이동상 B: 0.1:75:25 포름산 /아세토니트릴 / 메탄올, v/v/v
유량: 0.20 mL/분
구배:
MS/MS 조건
상기 본 발명이 이해를 명확하게 하고자 하는 목적으로 예시 및 실시예로서 어느 정도 상세하게 기재되었지만, 상기 설명 및 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그의 전문이 명백하게 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> GENENTECH, INC. et al.
<120> MULTIPLE REACTION MONITORING LC-MS/MS METHOD TO
DETECT THERAPEUTIC ANTIBODIES IN ANIMAL
SAMPLES USING FRAMEWORK SIGNATURE PEPTIDES
<130> P4615R1-WO
<141> 2012-05-11
<150> US 61/485,249
<151> 2011-05-12
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20
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1 5 10 15
Ser Lys
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<400> 9
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1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
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Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr
50 55 60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
65 70 75
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95 100 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
110 115 120
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
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Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
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155 160 165
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
170 175 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
185 190 195
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230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
305 310 315
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
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Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
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365 370 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
380 385 390
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
395 400 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
410 415 420
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
425 430 435
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
440 445 450
Gly Lys
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
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Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
20 25 30
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser
35 40 45
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
50 55 60
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
65 70 75
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Val Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
80 85 90
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95 100 105
Gly Ser Lys Pro Pro Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
110 115 120
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
125 130 135
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
140 145 150
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Asp Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
155 160 165
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170 175 180
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185 190 195
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Ser
200 205 210
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Arg Gln Lys Thr Val Ser Lys Thr
215 220 225
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230 235 240
Arg Glu Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile
245 250 255
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu Trp Ala Ser Asn
260 265 270
Gly Gln Pro Glu Asn Thr Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
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Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
305 310 315
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Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
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Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser
35 40 45
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
50 55 60
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
65 70 75
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Val Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
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95 100 105
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110 115 120
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
125 130 135
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
140 145 150
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155 160 165
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu
170 175 180
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185 190 195
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Ser
200 205 210
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Arg Gln Lys Thr Val Ser Lys Thr
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Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro
230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Gly Gln Pro Glu Asn Thr Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
275 280 285
Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Arg Ser Thr Ser Gln Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
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Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
35 40 45
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
50 55 60
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
65 70 75
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Val Cys Asn Val Val His Glu Pro Ser
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Cys Cys Pro Cys Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
110 115 120
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
125 130 135
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
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Asp Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asn Gly Ala Glu Val His His
155 160 165
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Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu Thr Lys Asn
230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
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Arg Ser Thr Ser Gln Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
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Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
35 40 45
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
50 55 60
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
65 70 75
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Val Cys Asn Val Val His Glu Pro Ser
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110 115 120
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
125 130 135
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Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu Thr Lys Asn
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Ile Val Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Thr Tyr
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Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
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Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
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Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
50 55 60
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
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Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Val Cys Asn Val Val His Glu Pro Ser
80 85 90
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Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
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Glu Tyr Thr Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Arg
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Gln Lys Thr Val Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
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Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Arg Glu Glu Leu Thr Lys Asn Gln
230 235 240
Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Val Val Glu Trp Ala Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Thr Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr
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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Thr
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Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys
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Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
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Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr
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Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr
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110 115 120
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Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
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Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
170 175 180
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
185 190 195
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
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290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
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Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
335 340 345
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Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
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Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
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His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
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Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn
20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
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Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
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Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
110 115 120
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
125 130 135
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
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Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
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Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
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Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
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Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro
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Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
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Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
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Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr
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Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
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Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
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Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
200 205 210
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
215 220 225
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
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Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
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Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
335 340 345
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
350 355 360
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
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395 400 405
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
410 415 420
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
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Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser
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Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser
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Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
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Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
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Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
155 160 165
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
170 175 180
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
185 190 195
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
200 205 210
Arg Gly Glu Cys
<210> 22
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> sequence is synthesized
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
Asp Ser Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe
95 100 105
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
110 115 120
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
125 130 135
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
140 145 150
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
155 160 165
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
170 175 180
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
185 190 195
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
200 205 210
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
215 220 225
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
320 325 330
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
335 340 345
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
350 355 360
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
365 370 375
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
380 385 390
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
395 400 405
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
410 415 420
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
425 430 435
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
440 445
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<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> sequence is synthesized
<400> 23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
110 115 120
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
125 130 135
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
140 145 150
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
155 160 165
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
170 175 180
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
185 190 195
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
200 205 210
Arg Gly Glu Cys
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> sequence is synthesized
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Ser Gln Ile Ser Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Glu Leu Pro Tyr Tyr Arg
95 100 105
Met Ser Lys Val Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
110 115 120
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
125 130 135
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
140 145 150
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
155 160 165
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
170 175 180
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
185 190 195
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
200 205 210
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
215 220 225
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
290 295 300
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
305 310 315
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
320 325 330
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
335 340 345
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
350 355 360
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
365 370 375
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
380 385 390
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
395 400 405
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
410 415 420
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
425 430 435
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
440 445 450
Pro Gly Lys
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<223> sequence is synthesized
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Tyr Leu Gly Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
110 115 120
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
125 130 135
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
140 145 150
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
155 160 165
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
170 175 180
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
185 190 195
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
200 205 210
Arg Gly Glu Cys
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr
20 25 30
Asn Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
35 40 45
Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Tyr Thr Thr Tyr
50 55 60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Thr Ser Gly Leu Asp Tyr
95 100 105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Cys Ser Thr Lys
110 115 120
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
125 130 135
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
140 145 150
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
155 160 165
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
170 175 180
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
185 190 195
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
200 205 210
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
215 220 225
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
320 325 330
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
335 340 345
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
350 355 360
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
365 370 375
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
380 385 390
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
395 400 405
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
410 415 420
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
425 430 435
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
440 445
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<223> sequence is synthesized
<400> 27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp Leu Ile His
20 25 30
Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
80 85 90
Tyr Trp Thr Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
110 115 120
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
125 130 135
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
140 145 150
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
155 160 165
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
170 175 180
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
185 190 195
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
200 205 210
Arg Gly Glu Cys
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<211> 451
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<220>
<223> sequence is synthesized
<400> 28
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr
50 55 60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser
65 70 75
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
80 85 90
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp
95 100 105
Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
110 115 120
Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
125 130 135
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
140 145 150
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
155 160 165
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
170 175 180
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
185 190 195
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
200 205 210
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp
215 220 225
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
320 325 330
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
335 340 345
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
350 355 360
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
365 370 375
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
380 385 390
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
395 400 405
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
410 415 420
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
425 430 435
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
440 445 450
Lys
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<400> 29
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro
1 5 10 15
Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
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Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro
35 40 45
Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
65 70 75
Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
80 85 90
Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
95 100 105
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
110 115 120
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
125 130 135
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
140 145 150
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
155 160 165
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
170 175 180
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
185 190 195
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
200 205 210
Gly Glu Cys
Claims (12)
- 제1항에 있어서, 소화 효소가 트립신인 방법.
- 제1항에 있어서, 소화된 항체 샘플을 친화성 포획 매질 또는 크로마토그래피 흡착제와 접촉시키고, 풍부화된 소화된 항체 샘플을 용리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 생물학적 샘플을 친화성 포획 매질 또는 크로마토그래피 흡착제와 접촉시키고, 풍부화된 생물학적 샘플을 용리한 후에 풍부화된 생물학적 샘플을 소화 효소로 처리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, 친화성 포획 매질이 비드-지지된 단백질 A/G인 방법.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, 크로마토그래피 흡착제가 고체-상 추출 (SPE) 흡착제인 방법.
- 제1항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈청 또는 혈장인 방법.
- 제1항에 있어서, 소화된 항체 샘플의 농도를 측정하는 방법.
- 제1항에 있어서, 인간 또는 인간화 항체가 하기 (1)-(36):
(1) BMPR1B (골 형태발생 단백질 수용체-유형 IB);
(2) E16 (LAT1, SLC7A5);
(3) STEAP1 (전립선의 6회 막횡단 상피 항원);
(4) 0772P (CA125, MUC16);
(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, 거핵구 증강 인자, 메소텔린);
(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, 용질 캐리어 패밀리 34 (인산나트륨), 구성원 2, 유형 II 나트륨-의존성 포스페이트 수송체 3b);
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, 세마포린 5b Hlog, sema 도메인, 7개 트롬보스폰딘 반복부 (유형 1 및 유형 1-유사), 막횡단 도메인 (TM) 및 짧은 세포질 도메인, (세마포린) 5B);
(8) PSCA hlg;
(9) ETBR (엔도텔린 유형 B 수용체);
(10) MSG783 (RNF124, 가설 단백질 FLJ20315);
(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, 전립선암 연관 유전자 1, 전립선암 연관 단백질 1, 전립선의 6회 막횡단 상피 항원 2, 6회 막횡단 전립선 단백질);
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, 일시적 수용체 잠재성 양이온 채널, 서브패밀리 M, 구성원 4);
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 기형암종-유래 성장 인자);
(14) CD21 (CR2 (보체 수용체 2) 또는 C3DR (C3d/엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스 수용체) 또는 Hs 73792);
(15) CD79b (CD79B, CD79β, IGb (이뮤노글로불린-연관 베타), B29);
(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (포스파타제 앵커 단백질 1a를 함유하는 SH2 도메인), SPAP1B, SPAP1C);
(17) HER2 (ErbB2);
(18) NCA;
(19) MDP;
(20) IL20Rα;
(21) 브레비칸;
(22) EphB2R;
(23) ASLG659;
(24) PSCA;
(25) GEDA;
(26) BAFF-R (B 세포-활성화 인자 수용체, BLyS 수용체 3, BR3);
(27) CD22 (B-세포 수용체 CD22-B 이소형);
(28) CD79a (CD79A, CD79α, 이뮤노글로불린-연관 알파);
(29) CXCR5 (버킷 림프종 수용체 1);
(30) HLA-DOB (MHC 클래스 II 분자의 베타 서브유닛 (Ia 항원));
(31) P2X5 (퓨린성 수용체 P2X 리간드-게이팅 이온 채널 5);
(32) CD72 (B-세포 분화 항원 CD72, Lyb-2);
(33) LY64 (림프구 항원 64 (RP105), 류신 풍부 반복부 (LRR) 패밀리의 유형 I 막 단백질);
(34) FcRH1 (Fc 수용체-유사 단백질 1);
(35) IRTA2 (FcRH5, 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리 수용체 전위 연관 2); 및
(36) TENB2 (추정 막횡단 프로테오글리칸)
로부터 선택된 하나 이상의 종양-연관 항원 또는 세포-표면 수용체에 결합하는 것인 방법. - 제1항에 있어서, 인간 또는 인간화 항체가 트라스투주맙, 오크렐리주맙, 페르투주맙, 항-PDL1, 항-뉴로필린-1, 항-MUC16, 리툭시맙, 항-메소텔린 및 항-LY6E로부터 선택된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 인간 또는 인간화 항체가 약물 모이어티에 접합된 것인 방법.
- 제11항에 있어서, 약물 모이어티가 메이탄시노이드, 돌라스타틴, 아우리스타틴, 칼리케아미신, 피롤로벤조디아제핀 (PBD), PNU-159682, 안트라시클린, 두오카르마이신, 빈카 알칼로이드, 탁산, 트리코테센, CC1065, 두오카르마이신, 캄프토테신, 엘리나피드, 및 그의 입체이성질체, 동배체, 유사체 또는 유도체로부터 선택된 것인 방법.
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