CN103608684B - 利用框架签名肽检测动物样品中的治疗性抗体的多重反应监测lc-ms/ms方法 - Google Patents
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Abstract
公开了检测、表征、测量和定量临床前动物生物学样品(包括血浆/血清和组织样品)中存在的人和人源化抗体及它们的偶联物的方法。
Description
对相关申请的交叉引用
依据37CFR§1.53(b)提交的此非临时申请依据35USC§119(e)要求2011年5月12日提交,流水号61/485,249的美国临时申请的权益,通过述及将其完整收录。
发明领域
本发明涉及检测和测定来自动物样品诸如组织、血浆或血清的感兴趣人或人源化抗体的量的方法。该方法包括亲和富集和蛋白酶消化样品以生成一种或多种对于人或人源化抗体的框架区而言独特且保守的肽,通过质谱术检测和定量。
发明背景
生物制药工业对分析自治疗性蛋白质的体内研究生成的血浆/血清样品感兴趣。常规ELISA办法已经使用超过25年且具有数项限制。ELISA要求高质量的定制试剂,这可能需要几个月来生成且测定法优化可能另外需要几个月。因此,ELISA具有较长的测定法开发时间,这在基于蛋白质的药物的早期发现阶段和开发阶段都成为限制(Murray等(2001)J.Imm.Methods255:41-56;Kirchner等(2004)Clin.Pharmacokinetics43(2):83-95)。由于对每种蛋白质治疗剂的高度定制结合要求,合适的ELISA试剂和测定条件在一些情况中可能是不可能的。ELISA的另一项限制是试剂可能非特异性结合血浆/血清蛋白质;基质干扰是一种常见现象。另一方面,通过质谱术进行的蛋白质定量是高度特异性的,因此很少与ELISA比较基质干扰。ELISA测定法的开发可以是费力的且需要复杂的、特异性的试剂。ELISA也对基质干扰和抗体的交叉反应性敏感。ELISA利用结合特性间接测量分析物浓度。这些多项变量使得蛋白质定量的ELISA方法挑战开发和转移至其它实验室(具有更好性能)。基于这些差异,质谱术是一种与ELISA正交的方法。蛋白质定量的质谱术方法(特别是LC-MS/MS)不要求定制试剂且一般产生更快的测定法开发。另外,质谱术不太受基质干扰影响且提供通用测定条件,它们是高度特异性的且能多路化和自动化。质谱术的高特异性利用分析物的内在物理化学特性(即质量和片段化样式)测量分析物浓度。有力的形式容许现成的实验室间转移,这对于得到批准的抗体疗法是一项重要优点。通过质谱术定量蛋白质的一种通用方法学是胰蛋白酶消化完整蛋白质。通过以固定浓度引入相应的稳定同位素标记的内部标准品,通过质谱术分析所得肽。
通过质谱术(MS)进行的肽和蛋白质分析的最新进展要归于前端气相电离发展和诸如电喷射电离(ESI)和基质辅助激光解吸附电离(MALDI,US2003/0027216)等技术的引入,以及仪器灵敏度、分辨率、质量精确度、生物信息学、和软件数据解卷积算法的改进(“ElectrosprayIonizationMassSpectrometry:Fundamentals,Instrumentation,andApplications”,Cole,R.B.编(1997)Wiley,NewYork;“ModernProteinChemistry:PracticalAspects”,Howard,G.C.和Brown,W.E.编(2002)CRCPress,BocaRaton,FL,p.71-102;Martin等(1997)CancerChemother.Pharmacol.40:189-201;WO03/046571;WO03/046572)。
液体层析串联质谱术是非常复杂的基质(像血浆/血清样品)中的蛋白质分析和定量的一种有力工具。由于源自感兴趣蛋白质和其它血浆/血清蛋白质消化的肽可具有相同或相似的名义质量,所以MS片段化的第二维常常提供感兴趣肽的一种独特片段。利用特定亲本肽和独特片段离子的组合来选择性监测要定量的分子。此类办法称作“多重反应监测”(Multiplereactionmonitoring,MRM),也称作选定反应监测(SelectedReactionMonitoring,SRM),它是蛋白质定量的一种常用模式。
电喷射电离(ESI)提供液体样品的大气压电离(API)。电喷射过程产生高度带电荷的小滴,在蒸发下产生代表溶液中包含的种类的离子。质谱仪的离子取样口可用于对这些气相离子取样,进行质量分析。对通过质谱仪检测器测量的分析物的响应依赖于该分析物在液体中的浓度但不依赖于液体流速。
发明概述
本发明提供一种检测人或人源化抗体的方法,其包括下述步骤:
(a)用消化酶处理生物学样品以形成经过消化的抗体样品,其中该生物学样品为来自已经用人或人源化抗体治疗过的动物的血清、血浆、组织、或细胞;并
(b)通过质谱术分析该经过消化的抗体样品以检测一种或多种人框架肽。
在一个例示性实施方案中,人框架肽包含一种或多种选自SEQIDNO:1-8的序列。
在一个例示性实施方案中,该消化酶为胰蛋白酶。
在一个例示性实施方案中,将该生物学样品与亲和捕捉介质或层析吸附剂接触。然后用该消化酶处理经过富集的生物学样品。
在一个例示性实施方案中,测量经过消化的抗体样品的浓度。
本发明的一个方面是蛋白酶消化样品或免疫亲和捕捉继以蛋白酶消化以生成对于人或人源化抗体的框架区而言独特(即动物生物学样品中不存在的)的一种或多种肽(通过质谱术(LC-MS/MS)检测和定量)的方法。
本发明的一个实施方案是偶联至药物模块的人或人源化抗体,其中通过本发明的方法测量抗体-药物偶联物。
附图简述
图1显示人2H7抗体奥瑞珠单抗(ocrelizumab)(在残基101处开始的Hu2H7(SEQIDNO:11))和五种猕猴抗CD20抗体(CynoHC1aD31(SEQIDNO:12),CynoHC1bE51(SEQIDNO:13),CynoHC2a(SEQIDNO:14),CynoHC2bE61(SEQIDNO:15),CynoHC3(SEQIDNO:16))的重链氨基酸序列比对。以下划线标示框架签名肽(FSP1-8),它们对于人2H7(hu2H7)单抗是独特的且在猕猴IgG重链中不存在,每个在序列中携带至少一处氨基酸差异。
图2显示曲妥珠单抗(trastuzumab)((GenentechInc.;rhuMAbHER2,抗p185HER2),重组衍生的人源化单克隆抗体,CAS登记号180288-69-1)的重链(SEQIDNO:17)和轻链(SEQIDNO:18)。
图3显示奥瑞珠单抗(rhuMAb2H7,PRO70769,一种人源化抗CD20抗体,CAS登记号637334-45-3)的重链(SEQIDNO:11)和轻链(SEQIDNO:19)。
图4显示帕妥珠单抗(pertuzumab)(rhuMAb2C4,CAS登记号380610-27-5)的重链(SEQIDNO:20)和轻链(SEQIDNO:21)。FSP2、FSP3、FSP8在重链(SEQIDNO:20)中以下划线标示。
图5显示抗PDL1(T细胞调节物的扩大的CD28/CTLA-4家族的成员)的重链(SEQIDNO:22)和轻链(SEQIDNO:23)。FSP2、FSP4、FSP8在重链(SEQIDNO:22)中以下划线标示。
图6显示抗神经毡蛋白-1(抗NRP1,MNRP1685A)的重链(SEQIDNO:24)和轻链(SEQIDNO:25)。FSP2、FSP4、FSP8在重链(SEQIDNO:24)中以下划线标示。
图7显示抗MUC16(MMUC3333A/DMUC4064A)的重链(SEQIDNO:26)和轻链(SEQIDNO:27)。FSP2、FSP4、FSP8在重链(SEQIDNO:26)中以下划线标示。
图8显示利妥昔单抗(rituximab)(C2B8,MabThera(GenentechInc.,Biogen/Idec),CAS登记号174722-31-7)的重链(SEQIDNO:28)和轻链(SEQIDNO:29)。FSP2、FSP4、FSP8在重链(SEQIDNO:28)中以下划线标示。
图9显示利用一种或多种框架签名肽(FSP)定量动物血浆/血清中的治疗性抗体的LC-MS/MS方法的一般步骤。
图10显示经过胰蛋白酶消化的曲妥珠单抗的多重反应监测。在基线分开并定量框架签名肽FSP3(12.5分钟)、FSP8(15分钟)和FSP5(17分钟)。
图11显示来自掺入血浆的经过亲和捕捉,然后经过消化的抗MUC16抗体-药物偶联物的FSP5的MS/MS谱。
图12显示以1-1000μg/mL的各种浓度掺入通过全血浆消化物/SPE办法制备的锂肝素化猕猴血浆的FSP8的校准曲线。
图13显示LC-MS/MS层析图,证明对全血浆消化物/SPE样品制备后以LLOQ=1μg/mL掺入锂肝素化猕猴血浆的FSP8的检测。
图14显示LC-MS/MS方法的步骤的流程图,其包括亲和捕捉蛋白质治疗剂和酶促消化以生成动物血浆/血清中的单抗的框架签名肽(FSP)。
图15显示在结合至生物素化捕捉探针的链霉亲合素包被的磁珠或蛋白A,G包被的磁珠上捕捉来自动物血浆/血清的单抗,接着通过磁分开来分离,消化捕捉到的抗体和通过LC-MS/MS来分析的卡通图。
图16显示蛋白A,G包被的磁珠(顶部)用于抗体通用捕捉和结合至生物素化捕捉探针的链霉亲合素包被的磁珠(底部)用于抗体特异性捕捉的实施方案。
图17a显示大鼠血浆中1μg/mL曲妥珠单抗抗体关于FSP8的LC-MS/MS分开和检测。
图17b显示稳定同位素标记的(SIL)FSP8内部标准的LC-MS/MS分开和检测。
图18显示检测的线性,大鼠血浆中FSP8对稳定同位素标记的FSP8内部标准的比值对1-250μg/mL曲妥珠单抗浓度绘图。
图19a显示在具有电化学发光或比色检测的ELISA测定法中通过结合至固定化胞外域(ECD)或抗人IgG多克隆抗体捕捉并用马辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG多克隆抗体检测单克隆抗体(单抗治疗剂)的卡通图。
图19b显示LC-MS/MS测定法的原理,始于用蛋白A珠自生物学样品捕捉单抗治疗剂,胰蛋白酶消化捕捉到的单抗治疗剂以形成一种或多种框架签名肽(FSP),例如FSP8,并LC/MS/MS检测多重反应监测(MRM)以检测938.0(M,2+)到836.7(y15,2+)的转变。
图20显示图19b中所示LC-MS/MS测定法和图19a的ELISA测定法之间的一致性,基于来自服用抗HER2单抗曲妥珠单抗的大鼠的血浆/血清样品的个体药动学(PK)。
图21显示图19b中所示LC-MS/MS测定法和图19a的ELISA测定法之间的一致性,基于来自服用抗MUC16单抗3A5的大鼠的血浆/血清样品的个体药动学(PK)。
图22显示图19b中所示LC-MS/MS测定法和图19a的ELISA测定法之间的一致性,基于来自服用抗间皮素(Msln)单抗的大鼠的血浆/血清样品的个体药动学(PK)。
图23显示图19b中所示LC-MS/MS测定法和图19a的ELISA测定法之间的一致性,基于来自服用抗MUC16单抗3A5(MMUC1206A)的猕猴的血浆/血清样品的均值药动学(PK),通过测量28天里血浆中的抗体。
图24显示图19b中所示LC-MS/MS测定法和图19a的ELISA测定法之间的一致性,基于来自服用抗间皮素(Msln)单抗的猕猴的血浆/血清样品的均值药动学(PK),通过测量40天里血浆中的抗体。
图25显示图19b中所示LC-MS/MS测定法和图19a的ELISA测定法之间的一致性,基于来自在小鼠功效研究中服用抗体-药物偶联物(ADC)抗LY6E-MC-vc-PAB-MMAE的小鼠(A、B、C)的血浆/血清样品的个体药动学(PK)。
发明详述
除非另有定义,本文中使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的共同理解相同的含义,而且与下述文献中所述一致:Singleton等(1994)“DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology”,第2版,J.Wiley&Sons,NewYork,NY;及Janeway等(2001)“Immunobiology”,第5版,GarlandPublishing,NewYork。当本文中使用商品名时,还包括产品的商品名产品制剂、仿制药和商品名产品的活性药物组分。
定义
术语“生物学样品”指任何自动物衍生或分离的成分,而且包括血液、血浆、血清、细胞、尿液、脑脊液(CSF)、乳液、支气管灌洗液、骨髓、羊水、唾液、胆汁、玻璃体液、泪液、或组织。
术语“消化酶”指能够以特异性或通用随机方式将肽或蛋白质切割或水解成片段的酶。消化酶能自抗体形成经过消化的抗体样品,其中抗体是生物学样品的成分。消化酶包括蛋白酶,诸如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、内切蛋白酶LysC、内切蛋白酶ArgC、金黄色葡萄球菌V8、胰凝乳蛋白酶、Asp-N、Asn-C、胃蛋白酶、和内切蛋白酶GluC。
术语“抗体”在本文中以最广义使用,涵盖各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段,只要它们展现出期望的抗原结合活性。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子,其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2;双抗体;线性抗体;单链抗体分子(例如scFv);和由抗体片段形成的多特异性抗体。
在某些实施方案中,本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、和scFv片段,及下文所描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述,见Hudson等(2003)Nat.Med.9:129-134。关于scFv片段的综述,见例如Pluckthün,于ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编(Springer-Verlag,NewYork),第269-315页(1994);WO93/16185;US5,571,894;US5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基,并且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论,见US5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段,其可以是二价的或双特异性的(EP404,097;WO1993/01161;Hudson等(2003)Nat.Med.9:129-134;及Hollinger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等(2003)Nat.Med.9:129-134。
单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中,单域抗体是人单域抗体(US6,248,516)。
可以通过多种技术,包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成来生成抗体片段,如本文中所描述的。
术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生,而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中,人IgG重链Fc区自Cys226,或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而,Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定,Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统,又称作EU索引,如记载于Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,1991。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的恒定域残基。一般地,恒定域的FR由4个FR域组成:FR1、FR2、FR3、和FR4。因而,HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以如下的顺序出现:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”、和“全抗体”在本文中可互换使用,指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有如本文中所限定的Fc区的重链的抗体。
“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”指如下的抗体框架区,其代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基。通常,人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常,序列亚组是如Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,NIHPublication91-3242,BethesdaMD(1991),第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中,对于VL,亚组是如Kabat等,见上文中的亚组κI。在一个实施方案中,对于VH,亚组是如Kabat等,见上文中的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中,人源化抗体会包含至少一个,通常两个基本上整个可变域,其中所有或基本上所有HVR(例如,CDR)对应于非人抗体的那些,且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地,人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体,例如非人抗体的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。
“嵌合抗体”包含非人可变区(例如,自小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、或非人灵长类,诸如猴衍生的可变区)和人恒定区(US4,816,567;Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855)。在又一个例子中,嵌合抗体是“类转换的”抗体,其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中,嵌合抗体是人源化抗体。通常,将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性,同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地,人源化抗体包含一个或多个可变域,其中HVR,例如CDR(或其部分)自非人抗体衍生,而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地,人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中,将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代,例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro和Fransson(2008)Front.Biosci.13:1619-1633,并且进一步记载于例如Riechmann等(1988)Nature332:323-329;Queen等(1989)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA86:10029-10033;US5,821,337;US7,527,791;US6,982,321;US7,087,409;Kashmiri等(2005)Methods36:25-34(描述了SDR(a-CDR)嫁接);Padlan(1991)Mol.Immunol.28:489-498(描述了“重修表面”);Dall’Acqua等(2005)Methods36:43-60(描述了“FR改组”);及Osbourn等(2005)Methods36:61-68;Klimka等(2000)Br.J.Cancer83:252-260(描述了FR改组的“引导选择”方法)。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于:使用“最佳拟合”(best-fit)方法选择的框架区(见例如Sims等(1993)J.Immunol.151:2296);自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(Carter等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285;及Presta等(1993)J.Immunol.,151:2623);人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(见例如Almagro和Fransson(2008)Front.Biosci.13:1619-1633);和通过筛选FR文库衍生的框架区(Baca等(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684及Rosok等(1996)J.Biol.Chem.271:22611-22618)。
可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地,人抗体记载于vanDijk和vandeWinkel(2001)Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74;Lonberg(2008)Curr.Opin.Immunol.20:450-459。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体,所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座,其替换内源免疫球蛋白基因座,或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中,一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述,见Lonberg(2005)Nat.Biotech.23:1117-1125。还可见例如US6,075,181和US6,150,584,其描述了XENOMOUSETM技术;US5,770,429,其描述了技术;US7,041,870,其描述了K-M技术,和US2007/0061900,其描述了技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系(见例如Kozbor(1984)J.Immunol.133:3001;Brodeur等,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,第51-63页(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987);及Boerner等(1991)J.Immunol.147:86)。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li等(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562。其它方法包括那些例如记载于US7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体);Ni(2006)XiandaiMianyixue,26(4):265-268(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于Vollmers和Brandlein(2005)HistologyandHistopathology20(3):927-937及Vollmers和Brandlein(2005)MethodsandFindingsinExperimentalandClinicalPharmacology27(3):185-91。
也可以通过分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列生成人抗体。然后,可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。
可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如,用于生成噬菌体展示文库并对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等,于MethodsinMolecularBiology178:1-37(O’Brien等编,HumanPress,Totowa,NJ,2001),并且进一步记载于例如McCafferty等,Nature348:552-554;Clackson等(1991)Nature352:624-628;Marks等(1992)J.Mol.Biol.222:581-597;Marks和Bradbury,于MethodsinMolecularBiology248:161-175(Lo编,HumanPress,Totowa,NJ,2003);Sidhu等(2004)J.Mol.Biol.338(2):299-310;Lee等(2004)J.Mol.Biol.340(5):1073-1093;Fellouse(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472;及Lee等(2004)J.Immunol.Methods284(1-2):119-132。
在某些噬菌体展示方法中,将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆,并在噬菌体文库中随机重组,然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体,如记载于Winter等(1994)Ann.Rev.Immunol.,12:433-455的。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体,而不需要构建杂交瘤。或者,可以(例如自人)克隆天然全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源,如由Griffiths等(1993)EMBOJ,12:725-734描述的。最后,也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段,并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库,如由Hoogenboom和Winter(1992)J.Mol.Biol.,227:381-388所描述的。人抗体噬菌体文库记载于US5,750,373;US2005/0079574;US2005/0119455;US2005/0266000;US2007/0117126;US2007/0160598;US2007/0237764;US2007/0292936;US2009/0002360。
认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。
在某些实施方案中,抗体是多特异性抗体,例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中,结合特异性之一针对一种抗原,而另一种针对第二种抗原。在某些实施方案中,双特异性抗体可以结合同一抗原的两个不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达抗原的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。
用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见Milstein和Cuello(1983)Nature305:537;WO93/08829;及Traunecker等(1991)EMBOJ.10:3655)、和“突起-入-空穴”工程化(US5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO2009/089004A1);交联两个或更多个抗体或片段(见例如US4,676,980;及Brennan等(1985)Science,229:81);使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如Kostelny等(1992)J.Immunol.,148(5):1547-1553);使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如Hollinger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448);及使用单链Fv(sFv)二聚体(Gruber等(1994)J.Immunol.,152:5368);及制备三特异性抗体(Tutt等(1991)J.Immunol.147:60)来生成多特异性抗体。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体,包括“章鱼抗体”(见例如US2006/0025576A1)。
本文中的抗体或片段还包括包含结合抗原及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”(见例如US2008/0069820)。
抗体变体
在某些实施方案中,涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如,可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中,或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除、和/或插入和/或替代。可以进行删除、插入、和替代的任何组合以得到最终的构建体,只要最终的构建体拥有期望的特征,例如抗原结合。
抗体包括包含抗体和蛋白质、药物模块、标记物、或一些其它基团的融合蛋白。可以通过重组技术、缀合、或肽合成来生成融合蛋白,以优化诸如药动学等特性。本发明的人或人源化抗体也可以是包含清蛋白结合肽(ABP)序列的融合蛋白(Dennis等(2002)“AlbuminBindingAsAGeneralStrategyForImprovingThePharmacokineticsOfProteins”JBiolChem.277:35035-35043;WO01/45746)。本发明的抗体包括具有下述文献中教导的ABP序列的融合蛋白:(i)Dennis等(2002)JBiolChem.277:35035-35043,第35038页表III和IV;(ii)US2004/0001827,第[0076]段;和(iii)WO01/45746,第12-13页,通过述及将它们都收入本文。
替代、插入、和删除变体
在某些实施方案中,提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表1中在“保守的替代”的标题下显示。更实质的变化在表1中在“例示性替代”的标题下提供,并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中,并且对产物筛选期望的活性,例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。
表1
初始残基 | 例示性替代 | 优选的替代 |
Met(M) | Leu;Phe;Ile | Leu |
Phe(F) | Trp;Leu;Val;Ile;Ala;Tyr | Tyr |
Pro(P) | Ala | Ala |
Ser(S) | Thr | Thr |
Thr(T) | Val;Ser | Ser |
Trp(W) | Tyr;Phe | Tyr |
Tyr(Y) | Trp;Phe;Thr;Ser | Phe |
Val(V) | Ile;Leu;Met;Phe;Ala;正亮氨酸 | Leu |
依照共同的侧链特性,氨基酸可以如下分组:
(1)疏水性的:正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile;
(2)中性、亲水性的:Cys,Ser,Thr,Asn,Gln;
(3)酸性的:Asp,Glu;
(4)碱性的:His,Lys,Arg;
(5)影响链取向的残基:Gly,Pro;
(6)芳香族的:Trp,Tyr,Phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。
一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地,为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力、降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体,其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之,将一个或多个HVR残基突变,并将变体抗体在噬菌体上展示,并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。
可以对HVR做出变化(例如替代),例如以改善抗体亲和力。可以对HVR“热点”,即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(见例如Chowdhury(2008)MethodsMol.Biol.207:179-196),和/或SDR(a-CDR)做出此类变化,其中对所得的变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom等,于MethodsinMolecularBiology178:1-37(O’Brien等编,HumanPress,Totowa,NJ,(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中,通过多种方法(例如,易错PCR、链改组、或寡核苷酸指导的诱变)将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后,创建次级文库。然后,筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的方法,其中将几个HVR残基(例如,一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地,经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中,可以在一个或多个HVR内发生替代、插入、或删除,只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如,可以对HVR做出保守变化(例如,保守替代,如本文中提供的),其不实质性降低结合亲和力。此类变化可以在HVR“热点”或SDR外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中,每个HVR是未改变的,或者含有不超过1、2或3处氨基酸替代。
一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”,如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述的。在此方法中,将残基或靶残基的组(例如,带电荷的残基诸如arg、asp、his、lys、和glu)鉴定,并用中性或带负电荷的氨基酸(例如,丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外,利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。作为替代的候选,可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合,及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
糖基化变体
在某些实施方案中,改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列,使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。
在抗体包含Fc区的情况中,可以改变其附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的、双触角寡糖,其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297(Wright等(1997)TIBTECH15:26-32)。寡糖可以包括各种碳水化合物,例如,甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、和唾液酸,以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中,可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中,提供了抗体变体,其具有缺乏附着(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如,此类抗体中的岩藻糖量可以是1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如,复合的、杂合的和高甘露糖的结构)的总和,计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量,如通过MALDI-TOF质谱术测量的,例如如记载于WO2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的Eu编号方式)的天冬酰胺残基;然而,Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸,即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能(US2003/0157108;US2004/0093621)。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括:US2003/0157108;WO2000/61739;WO2001/29246;US2003/0115614;US2002/0164328;US2004/0093621;US2004/0132140;US2004/0110704;US2004/0110282;US2004/0109865;WO2003/085119;WO2003/084570;WO2005/035586;WO2005/035778;WO2005/053742;WO2002/031140;Okazaki等(2004)J.Mol.Biol.336:1239-1249;Yamane-Ohnuki等(2004)Biotech.Bioeng.87:614。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等(1986)Arch.Biochem.Biophys.249:533-545;US2003/0157108;及WO2004/056312,Adams等,尤其在实施例11),和敲除细胞系,诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(Yamane-Ohnuki等(2004)Biotech.Bioeng.87:614;Kanda,Y.等(2006)Biotechnol.Bioeng.94(4):680-688;WO2003/085107)。
进一步提供了具有两分型寡糖的抗体变体,例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO2003/011878(Jean-Mairet等);US6,602,684(Umana等);及US2005/0123546(Umana等)。还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体有记载(WO1997/30087;WO1998/58964;WO1999/22764)。
Fc区变体
在某些实施方案中,可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中,由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中,本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体,所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物,其中抗体的体内半衰期是重要的,而某些效应器功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如,可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性),但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII,而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet(1991)Annu.Rev.Immunol.9:457-492的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于US5,500,362;Hellstrom,I.等(1986)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA83:7059-7063;Hellstrom,I等(1985)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA82:1499-1502;US5,821,337;Bruggemann,M.等(1987)J.Exp.Med.166:1351-1361。或者,可以采用非放射性测定方法(见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.MountainView,CA;和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外,可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性,例如在动物模型中,诸如披露于Clynes等(1998)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA95:652-656的。也可以实施C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q,并且因此缺乏CDC活性。见例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活,可以实施CDC测定法(Gazzano-Santoro等(1996)J.Immunol.Methods202:163;Cragg,M.S.等(2003)Blood101:1045-1052;Cragg,M.S.和M.J.Glennie(2004)Blood103:2738-2743)。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(Petkova,S.B.等(2006)Int’l.Immunol.18(12):1759-1769)。
具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的替代的(US6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体,包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(US7,332,581)。
描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体(US6,737,056;WO2004/056312;Shields等(2001)J.Biol.Chem.9(2):6591-6604)。
在某些实施方案中,抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代,例如Fc区的位置298、333、和/或334(残基的EU编号方式)的替代的Fc区。
在一些实施方案中,对Fc区做出改变,其导致改变的(即,改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC),例如,如记载于US6,194,551;WO99/51642;及Idusogie等(2000)J.Immunol.164:4178-4184的。
具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等),新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等(1976)J.Immunol.117:587;Kim等(1994)J.Immunol.24:249)。那些抗体包含其中具有改善Fc区对FcRn结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一处或多处具有替代,例如,Fc区残基434的替代的(US7,371,826)。
还可见Duncan和Winter(1988)Nature322:738-40;US5,648,260;US5,624,821;及WO94/29351,其关注Fc区变体的其它例子。
经半胱氨酸工程化改造的抗体变体
在某些实施方案中,可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体,例如,“thioMAb”,其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在具体的实施方案中,替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基,反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点,并且可以用于将抗体与其它模块,诸如药物模块或接头-药物模块缀合,以创建抗体-药物缀合物(ADC),也称作免疫缀合物,如本文中进一步描述的。在某些实施方案中,可以用半胱氨酸替代下列残基之任一个或多个:轻链的V205(Kabat编号方式);重链的A118(EU编号方式);和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如US7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。
抗体衍生物
在某些实施方案中,可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)、和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性,聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量,而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化,而且如果附着了超过一个聚合物,那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言,可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型,包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。
在另一个实施方案中,提供了抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中,非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:11600-11605)。辐射可以是任何波长的,并且包括但不限于对普通细胞没有损害,但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。
在用于本文时,术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区。一般地,天然的4链抗体包含6个HVR;三个在VH中(H1、H2、H3),且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基,后一种是最高序列变异性的和/或牵涉抗原识别。例示性高变区存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、和96-101(H3)(Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。例示性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3)存在于氨基酸残基L1的24-34、L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65、和H3的95-102(Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991))。除了VH中的CDR1外,CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”,或“SDR”,其是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短的-CDR,或a-CDR的CDR区内。例示性的a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34、L2的50-55、L3的89-96、H1的31-35B、H2的50-58、和H3的95-102(Almagro和Fransson(2008)Front.Biosci.13:1619-1633)。除非另有指示,可变域中的HVR残基和其它残基(例如,FR残基)在本文中依照Kabat等,见上文编号。
“分离的”抗体指已经与其天然环境的组分分开的抗体。在一些实施方案中,抗体纯化至大于95%或99%的纯度,如通过例如电泳(例如,SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如,离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述,见例如Flatman等(2007)J.Chromatogr.B848:79-87。
在用于本文时,术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体,即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位,除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外,此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同,单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此,修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特性,而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如,可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体,包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法,本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如,天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白,由二硫化物键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端,每条重链具有一个可变区(VH),又称作可变重链域或重链可变域,接着是三个恒定域(CH1、CH2、和CH3)。类似地,从N至C端,每条轻链具有一个可变区(VL),又称作可变轻链域或轻链可变域,接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列,抗体轻链可归入两种类型中的一种,称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
关于参照多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后,且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时,候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行,例如使用公众可得到的计算机软件,诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定用于比对序列的合适参数,包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而,为了本发明的目的,%氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写,并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(USCopyrightOffice,WashingtonD.C.,20559),其中其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,California可获得ALIGN-2程序,或者可以从源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统,包括数码UNIXV4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中,给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算:
分数X/Y乘100
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数,且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当领会,若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等,则A相对于B的%氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的%氨基酸序列同一性。除非另有明确说明,本文中所使用的所有%氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述,使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构,其中每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)。见例如Kindt等,KubyImmunology,第6版,W.H.FreemanandCo.,第91页(2007)。单个VH或VL域可以足以赋予抗原结合特异性。此外,可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体(Portolano等(1993)J.Immunol.150:880-887;Clarkson等(1991)Nature352:624-628)。
“肿瘤-相关抗原”(TAA)为本领域中公知的并且可以制备它们以便用于使用本领域众所周知的方法和信息生产人或人源化抗体。在发现用于癌症诊断和疗法的有效细胞靶标的尝试中,研究人员寻求鉴定与一种或多种正常非癌细胞相比在一种或多种特定类型的癌细胞表面上特异性表达的跨膜多肽,或肿瘤相关多肽。与非癌细胞相比,通常这类肿瘤-相关多肽更大量地在癌细胞表面上表达。对这类肿瘤-相关细胞表面抗原多肽的鉴定已经使人们能够特异性靶向癌细胞,通过基于抗体的疗法对其进行破坏。
TAA的实例包括,但不限于下述TAA(1)-(36)。为方便起见,均为本领域公知的有关这些抗原的信息如下所列,并且按照NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)的核酸和蛋白质序列鉴定规定,包括名称,可选择的名称,Genbank登记号和主要参考文献。相当于TAA(1)-(36)的核酸和蛋白质序列可以在公共数据库,诸如GenBank中获得。由抗体靶向的肿瘤-相关抗原包括所有氨基酸序列变体和同种型,它们与引述的参考文献中鉴定的序列相比具有至少约70%,80%,85%,90%或95%序列同一性,或表现出基本上与具有引述参考文献中发现的序列的TAA相同的生物特性或特征。例如,具有变体序列的TAA一般能够特异性结合文献中所示相应序列TAA特异性结合的抗体。特别将本文特别引述的参考文献中的序列和披露内容引入作为参考。
肿瘤相关抗原(1)-(36):
(1)BMPR1B(骨形态发生蛋白受体-IB型(bonemorphogeneticreceptor-typeIB),Genbank登记号NM_001203)tenDijke,P.,等Science264(5155):101-104(1994),Oncogene14(11):1377-1382(1997));WO2004063362(权利要求2);WO2003042661(权利要求12);US2003134790-A1(38-39页);WO2002102235(权利要求13;页296);WO2003055443(91-92页);WO200299122(实施例2;528-530页);WO2003029421(权利要求6);WO2003024392(权利要求2;附图112);WO200298358(权利要求1;183页);WO200254940(100-101页);WO200259377(349-350页);WO200230268(权利要求27;376页);WO200148204(实施例;附图4);NP_001194骨形态发生蛋白受体,IB型/pid=NP_001194.1.交叉参考:MIM:603248;NP_001194.1;AY065994
(2)E16(LAT1,SLC7A5,Genbank登记号NM_003486)Biochem.Biophys.Res.Commun.255(2),283-288(1999),Nature395(6699):288-291(1998),Gaugitsch,H.W.,等(1992)J.Biol.Chem.267(16):11267-11273);WO2004048938(实施例2);WO2004032842(实施例IV);WO2003042661(权利要求12);WO2003016475(权利要求1);WO200278524(实施例2);WO200299074(权利要求19;页127-129);WO200286443(权利要求27;222,393页);WO2003003906(权利要求10;293页);WO200264798(权利要求33;页93-95);WO200014228(权利要求5;133-136页);US2003224454(附图3);WO2003025138(权利要求12;150页);NP_003477溶质载体家族7(solutecarrierfamily7)(阳离子氨基酸转运蛋白(cationicaminoacidtransporter),y+系统),成员5/pid=NP_003477.3–人类;交叉参考:MIM:600182;NP_003477.3;NM_015923;NM_003486_1
(3)STEAP1(前列腺的六跨膜上皮细胞抗原(sixtransmembraneepithelialantigenofprostate),Genbank登记号NM_012449);CancerRes.61(15),5857-5860(2001),Hubert,R.S.,等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(25):14523-14528);WO2004065577(权利要求6);WO2004027049(附图1L);EP1394274(实施例11);WO2004016225(权利要求2);WO2003042661(权利要求12);US2003157089(实施例5);US2003185830(实施例5);US2003064397(附图2);WO200289747(实施例5;页618-619);WO2003022995(实施例9;附图13A,实施例53;173页,实施例2;附图2A);NP_036581前列腺的六跨膜上皮抗原;交叉参考:MIM:604415;NP_036581.1;NM_012449_1
(4)0772P(CA125,MUC16,Genbank登记号AF361486);J.Biol.Chem.276(29):27371-27375(2001));WO2004045553(权利要求14);WO200292836(权利要求6;附图12);WO200283866(权利要求15;116-121页);US2003124140(实施例16);交叉参考P:GI:34501467;AAK74120.3;AF361486_1
(5)MPF(MPF,MSLN,SMR,巨核细胞强化因子(megakaryocytepotentiatingfactor),mesothelin,Genbank登记号NM_005823)Yamaguchi,N.,等Biol.Chem.269(2),805-808(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(20):11531-11536(1999),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93(1):136-140(1996),J.Biol.Chem.270(37):21984-21990(1995));WO2003101283(权利要求14);(WO2002102235(权利要求13;287-288页);WO2002101075(权利要求4;页308-309);WO200271928(320-321页);WO9410312(52-57页);交叉参考:MIM:601051;NP_005814.2;NM_005823_1
(6)Napi3b(NAPI-3B,NPTIIb,SLC34A2,溶质载体家族(solutecarrierfamily)34(磷酸钠),成员2,II型钠依赖性磷酸转运蛋白3b,Genbank登记号NM_006424)J.Biol.Chem.277(22):19665-19672(2002),Genomics62(2):281-284(1999),Feild,J.A.,等(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.258(3):578-582);WO2004022778(权利要求2);EP1394274(实施例11);WO2002102235(权利要求13;326页);EP0875569(权利要求1;17-19页);WO200157188(权利要求20;329页);WO2004032842(实施例IV);WO200175177(权利要求24;139-140页);交叉参考:MIM:604217;NP_006415.1;NM_006424_1
(7)Sema5b(FLJ10372,KIAA1445,Mm.42015,SEMA5B,SEMAG,脑信号蛋白(Semaphorin)5bHlog,sema结构域,七血小板反应蛋白重复(seventhrombospondinrepeats)(1型(type1)和类1型(type1-like)),跨膜结构域(TM)和短胞质域,(脑信号蛋白)5B,Genbank登记号AB040878);NagaseT.,等(2000)DNARes.7(2):143-150);WO2004000997(权利要求1);WO2003003984(权利要求1);WO200206339(权利要求1;50页);WO200188133(权利要求1;页41-43,48-58);WO2003054152(权利要求20);WO2003101400(权利要求11);登记号:Q9P283;EMBL;AB040878;BAA95969.1.Genew;HGNC:10737
(8)PSCAhlg(2700050C12Rik,C530008O16Rik,RIKENcDNA2700050C12,RIKENcDNA2700050C12基因,Genbank登记号AY358628);Ross等(2002)CancerRes.62:2546-2553;US2003129192(权利要求2);US2004044180(权利要求12);US2004044179(权利要求11);US2003096961(权利要求11);US2003232056(实施例5);WO2003105758(权利要求12);US2003206918(实施例5);EP1347046(权利要求1);WO2003025148(权利要求20);交叉参考:GI:37182378;AAQ88991.1;AY358628_1
(9)ETBR(内皮缩血管肽B型受体(EndothelintypeBreceptor),Genbank登记号AY275463);NakamutaM.,等Biochem.Biophys.Res.Commun.177,34-39,1991;OgawaY.,等Biochem.Biophys.Res.Commun.178,248-255,1991;AraiH.,等Jpn.Circ.J.56,1303-1307,1992;AraiH.,等J.Biol.Chem.268,3463-3470,1993;SakamotoA.,YanagisawaM.,等Biochem.Biophys.Res.Commun.178,656-663,1991;ElshourbagyN.A.,等J.Biol.Chem.268,3873-3879,1993;HaendlerB.,等J.Cardiovasc.Pharmacol.20,s1-S4,1992;TsutsumiM.,等Gene228,43-49,1999;StrausbergR.L.,等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99,16899-16903,2002;BourgeoisC.,等J.Clin.Endocrinol.Metab.82,3116-3123,1997;OkamotoY.,等Biol.Chem.272,21589-21596,1997;VerheijJ.B.,等Am.J.Med.Genet.108,223-225,2002;HofstraR.M.W.,等Eur.J.Hum.Genet.5,180-185,1997;PuffenbergerE.G.,等Cell79,1257-1266,1994;AttieT.,等,Hum.Mol.Genet.4,2407-2409,1995;AuricchioA.,等Hum.Mol.Genet.5:351-354,1996;AmielJ.,等Hum.Mol.Genet.5,355-357,1996;HofstraR.M.W.,等Nat.Genet.12,445-447,1996;SvenssonP.J.,等Hum.Genet.103,145-148,1998;FuchsS.,等Mol.Med.7,115-124,2001;PingaultV.,等(2002)Hum.Genet.111,198-206;WO2004045516(权利要求1);WO2004048938(实施例2);WO2004040000(权利要求151);WO2003087768(权利要求1);WO2003016475(权利要求1);WO2003016475(权利要求1);WO200261087(附图1);WO2003016494(附图6);WO2003025138(权利要求12;144页);WO200198351(权利要求1;页124-125);EP0522868(权利要求8;附图2);WO200177172(权利要求1;页297-299);US2003109676;US6518404(附图3);US5773223(权利要求1a;Col31-34);WO2004001004
(10)MSG783(RNF124,推定蛋白(hypotheticalprotein)FLJ20315,Genbank登记号NM_017763);WO2003104275(权利要求1);WO2004046342(实施例2);WO2003042661(权利要求12);WO2003083074(权利要求14;页61);WO2003018621(权利要求1);WO2003024392(权利要求2;附图93);WO200166689(实施例6);交叉参考:LocusID:54894;NP_060233.2;NM_017763_1
(11)STEAP2(HGNC_8639,IPCA-1,PCANAP1,STAMP1,STEAP2,STMP,前列腺癌相关基因1,前列腺癌相关蛋白1,前列腺的六跨膜上皮细胞抗原2,六跨膜前列腺蛋白,Genbank登记号AF455138);Lab.Invest.82(11):1573-1582(2002));WO2003087306;US2003064397(权利要求1;附图1);WO200272596(权利要求13;页54-55);WO200172962(权利要求1;附图4B);WO2003104270(权利要求11);WO2003104270(权利要求16);US2004005598(权利要求22);WO2003042661(权利要求12);US2003060612(权利要求12;附图10);WO200226822(权利要求23;附图2);WO200216429(权利要求12;附图10);交叉参考:GI:22655488;AAN04080.1;AF455138_1
(12)TrpM4(BR22450,FLJ20041,TRPM4,TRPM4B,瞬时型受体电位阳离子通道(transientreceptorpotentialcationchannel),亚族M,成员4,Genbank登记号NM_017636);Xu,X.Z.,等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(19):10692-10697(2001),Cell109(3):397-407(2002),J.Biol.Chem.278(33):30813-30820(2003));US2003143557(权利要求4);WO200040614(权利要求14;页100-103);WO200210382(权利要求1;附图9A);WO2003042661(权利要求12);WO200230268(权利要求27;391页);US2003219806(权利要求4);WO200162794(权利要求14;附图1A-D);交叉参考:MIM:606936;NP_060106.2;NM_017636_1
(13)CRIPTO(CR,CR1,CRGF,CRIPTO,TDGF1,畸胎瘤-衍生的生长因子(teratocarcinoma-derivedgrowthfactor),Genbank登记号NP_003203或NM_003212);Ciccodicola,A.,等EMBOJ.8(7):1987-1991(1989),Am.J.Hum.Genet.49(3):555-565(1991));US2003224411(权利要求1);WO2003083041(实施例1);WO2003034984(权利要求12);WO200288170(权利要求2;页52-53);WO2003024392(权利要求2;附图58);WO200216413(权利要求1;页94-95,105);WO200222808(权利要求2;附图1);US5854399(实施例2;Col17-18);US5792616(附图2);交叉参考:MIM:187395;NP_003203.1;NM_003212_1
(14)CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/EB病毒受体(EpsteinBarrvirusreceptor))或Hs.73792Genbank登记号M26004);Fujisaku等(1989)J.Biol.Chem.264(4):2118-2125);WeisJ.J.,等J.Exp.Med.167,1047-1066,1988;MooreM.,等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84,9194-9198,1987;BarelM.,等Mol.Immunol.35,1025-1031,1998;WeisJ.J.,等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83,5639-5643,1986;SinhaS.K.,等(1993)J.Immunol.150,5311-5320;WO2004045520(实施例4);US2004005538(实施例1);WO2003062401(权利要求9);WO2004045520(实施例4);WO9102536(附图9.1-9.9);WO2004020595(权利要求1);登记号:P20023;Q13866;Q14212;EMBL;M26004;AAA35786.1
(15)CD79b(CD79B,CD79β,IGb(免疫球蛋白-相关β(immunoglobulin-associatedbeta),B29,Genbank登记号NM_000626或11038674);Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(7):4126-4131,Blood(2002)100(9):3068-3076,Muller等(1992)Eur.J.Immunol.22(6):1621-1625);WO2004016225(权利要求2,附图140);WO2003087768,US2004101874(权利要求1,页102);WO2003062401(权利要求9);WO200278524(实施例2);US2002150573(权利要求5,页15);US5644033;WO2003048202(权利要求1,306和309页);WO99/58658,US6534482(权利要求13,附图17A/B);WO200055351(权利要求11,1145-1146页);交叉参考:MIM:147245;NP_000617.1;NM_000626_1
(16)FcRH2(IFGP4,IRTA4,SPAP1A(含有SH2结构域的磷酸酶锚定蛋白1a(SH2domaincontainingphosphataseanchorprotein1a),SPAP1B,SPAP1C,Genbank登记号NM_030764,AY358130);GenomeRes.13(10):2265-2270(2003),Immunogenetics54(2):87-95(2002),Blood99(8):2662-2669(2002),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(17):9772-9777(2001),Xu,M.J.,等(2001)Biochem.Biophys.Res.Commun.280(3):768-775;WO2004016225(权利要求2);WO2003077836;WO200138490(权利要求5;附图18D-1-18D-2);WO2003097803(权利要求12);WO2003089624(权利要求25);交叉参考:MIM:606509;NP_110391.2;NM_030764_1
(17)HER2(ErbB2,Genbank登记号M11730);CoussensL.,等Science(1985)230(4730):1132-1139);YamamotoT.,等Nature319,230-234,1986;SembaK.,等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82,6497-6501,1985;SwierczJ.M.,等J.CellBiol.165,869-880,2004;KuhnsJ.J.,等J.Biol.Chem.274,36422-36427,1999;ChoH.-S.,等Nature421,756-760,2003;EhsaniA.,等(1993)Genomics15,426-429;WO2004048938(实施例2);WO2004027049(附图1I);WO2004009622;WO2003081210;WO2003089904(权利要求9);WO2003016475(权利要求1);US2003118592;WO2003008537(权利要求1);WO2003055439(权利要求29;附图1A-B);WO2003025228(权利要求37;附图5C);WO200222636(实施例13;95-107页);WO200212341(权利要求68;附图7);WO200213847(71-74页);WO200214503(页114-117);WO200153463(权利要求2;41-46页);WO200141787(15页);WO200044899(权利要求52;附图7);WO200020579(权利要求3;附图2);US5869445(权利要求3;Col31-38);WO9630514(权利要求2;页56-61);EP1439393(权利要求7);WO2004043361(权利要求7);WO2004022709;WO200100244(实施例3;附图4);登记号:P04626;EMBL;M11767;AAA35808.1.EMBL;M11761;AAA35808.1
(18)NCA(CEACAM6,Genbank登记号M18728);BarnettT.,等Genomics3,59-66,1988;TawaragiY.,等Biochem.Biophys.Res.Commun.150,89-96,1988;StrausbergR.L.,等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:16899-16903,2002;WO2004063709;EP1439393(权利要求7);WO2004044178(实施例4);WO2004031238;WO2003042661(权利要求12);WO200278524(实施例2);WO200286443(权利要求27;页427);WO200260317(权利要求2);登记号:P40199;Q14920;EMBL;M29541;AAA59915.1.EMBL;M18728
(19)MDP(DPEP1,Genbank登记号BC017023);Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26):16899-16903(2002));WO2003016475(权利要求1);WO200264798(权利要求33;85-87页);JP05003790(附图6-8);WO9946284(附图9);交叉参考:MIM:179780;AAH17023.1;BC017023_1
(20)IL20Rα(IL20Ra,ZCYTOR7,Genbank登记号AF184971);ClarkH.F.,等GenomeRes.13,2265-2270,2003;MungallA.J.,等Nature425,805-811,2003;BlumbergH.,等Cell104,9-19,2001;DumoutierL.,等J.Immunol.167,3545-3549,2001;Parrish-NovakJ.,等J.Biol.Chem.277,47517-47523,2002;PletnevS.,等(2003)Biochemistry42:12617-12624;SheikhF.,等(2004)J.Immunol.172,2006-2010;EP1394274(实施例11);US2004005320(实施例5);WO2003029262(74-75页);WO2003002717(权利要求2;63页);WO200222153(45-47页);US2002042366(20-21页);WO200146261(57-59页);WO200146232(63-65页);WO9837193(权利要求1;55-59页);登记号:Q9UHF4;Q6UWA9;Q96SH8;EMBL;AF184971;AAF01320.1
(21)Brevican(BCAN,BEHAB,Genbank登记号AF229053);GaryS.C.,等Gene256,139-147,2000;ClarkH.F.,等GenomeRes.13,2265-2270,2003;StrausbergR.L.,等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99,16899-16903,2002;US2003186372(权利要求11);US2003186373(权利要求11);US2003119131(权利要求1;附图52);US2003119122(权利要求1;附图52);US2003119126(权利要求1);US2003119121(权利要求1;附图52);US2003119129(权利要求1);US2003119130(权利要求1);US2003119128(权利要求1;附图52);US2003119125(权利要求1);WO2003016475(权利要求1);WO200202634(权利要求1)
(22)EphB2R(DRT,ERK,Hek5,EPHT3,Tyro5,Genbank登记号NM_004442);Chan,J.和Watt,V.M.,Oncogene6(6),1057-1061(1991)Oncogene10(5):897-905(1995),Annu.Rev.Neurosci.21:309-345(1998),Int.Rev.Cytol.196:177-244(2000));WO2003042661(权利要求12);WO200053216(权利要求1;页41);WO2004065576(权利要求1);WO2004020583(权利要求9);WO2003004529(128-132页);WO200053216(权利要求1;42页);交叉参考:MIM:600997;NP_004433.2;NM_004442_1
(23)ASLG659(B7h,Genbank登记号AX092328);US20040101899(权利要求2);WO2003104399(权利要求11);WO2004000221(附图3);US2003165504(权利要求1);US2003124140(实施例2);US2003065143(附图60);WO2002102235(权利要求13;299页);US2003091580(实施例2);WO200210187(权利要求6;附图10);WO200194641(权利要求12;附图7b);WO200202624(权利要求13;附图1A-1B);US2002034749(权利要求54;45-46页);WO200206317(实施例2;320-321页,权利要求34;321-322页);WO200271928(468-469页);WO200202587(实施例1;附图1);WO200140269(实施例3;页190-192);WO200036107(实施例2;205-207页);WO2004053079(权利要求12);WO2003004989(权利要求1);WO200271928(233-234,452-453页);WO0116318
(24)PSCA(前列腺干细胞抗原前体(prostatestemcellprecursor),Genbank登记号AJ297436);ReiterR.E.,等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,1735-1740,1998;GuZ.,等Oncogene19,1288-1296,2000;Biochem.Biophys.Res.Commun.(2000)275(3):783-788;WO2004022709;EP1394274(实施例11);US2004018553(权利要求17);WO2003008537(权利要求1);WO200281646(权利要求1;页164);WO2003003906(权利要求10;页288);WO200140309(实施例1;附图17);US2001055751(实施例1;附图1b);WO200032752(权利要求18;附图1);WO9851805(权利要求17;页97);WO9851824(权利要求10;94页);WO9840403(权利要求2;附图1B);登记号:O43653;EMBL;AF043498;AAC39607.1
(25)GEDA(Genbank登记号AY260763);AAP14954脂肪瘤HMGIC融合-配偶体-类蛋白(lipomaHMGICfusion-partner-likeprotein)/pid=AAP14954.1-人类(人);WO2003054152(权利要求20);WO2003000842(权利要求1);WO2003023013(实施例3,权利要求20);US2003194704(权利要求45);交叉参考:GI:30102449;AAP14954.1;AY260763_1
(26)BAFF-R(B细胞-活化因子受体,BLyS受体3,BR3,Genbank登记号AF116456);BAFF受体/pid=NP_443177.1-人类:Thompson,J.S.,等Science293(5537),2108-2111(2001);WO2004058309;WO2004011611;WO2003045422(实施例;32-33页);WO2003014294(权利要求35;附图6B);WO2003035846(权利要求70;615-616页);WO200294852(Col136-137);WO200238766(权利要求3;133页);WO200224909(实施例3;附图3);交叉参考:MIM:606269;NP_443177.1;NM_052945_1;AF132600
(27)CD22(B-细胞受体CD22-B同种型,BL-CAM,Lyb-8,Lyb8,SIGLEC-2,FLJ22814,Genbank登记号AK026467);Wilson等(1991)J.Exp.Med.173:137-146;WO2003072036(权利要求1;附图1);交叉参考:MIM:107266;NP_001762.1;NM_001771_1
(28)CD79a(CD79A,CD79α,免疫球蛋白-相关α,一种B细胞-特异性蛋白,其与Igβ(CD79B)共价相互作用并且在表面上与IgM分子形成复合物,转导涉及B-细胞分化的信号),pI:4.84,MW:25028TM:2[P]GeneChromosome:19q13.2,Genbank登记号NP_001774.10);WO2003088808,US20030228319;WO2003062401(权利要求9);US2002150573(权利要求4,13-14页);WO9958658(权利要求13,附图16);WO9207574(附图1);US5644033;Ha等(1992)J.Immunol.148(5):1526-1531;Müller等(1992)Eur.J.Immunol.22:1621-1625;Hashimoto等(1994)Immunogenetics40(4):287-295;Preud’homme等(1992)Clin.Exp.Immunol.90(1):141-146;Yu等(1992)J.Immunol.148(2)633-637;Sakaguchi等(1988)EMBOJ.7(11):3457-3464
(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受体1(Burkitt’slymphomareceptor1),一种G蛋白偶联受体,由CXCL13趋化因子活化,在淋巴细胞迁移和体液防御中起作用,在HIV-2感染中起作用和可能在AIDS、淋巴瘤、黑素瘤和白血病发生中起作用);372aa,pI:8.54MW:41959TM:7[P]GeneChromosome:11q23.3,Genbank登记号NP_001707.1);WO2004040000;WO2004015426;US2003105292(实施例2);US6555339(实施例2);WO200261087(附图1);WO200157188(权利要求20,页269);WO200172830(12-13页);WO200022129(实施例1,152-153页,实施例2,254-256页);WO9928468(权利要求1,页38);US5440021(实施例2,col49-52);WO9428931(56-58页);WO9217497(权利要求7,附图5);Dobner等(1992)Eur.J.Immunol.22:2795-2799;Barella等(1995)Biochem.J.309:773-779
(30)HLA-DOB(MHCII类分子的β亚单位(Ia抗原),其与肽结合并且将其呈递给CD4+T淋巴细胞);273aa,pI:6.56,MW:30820.TM:1[P]GeneChromosome:6p21.3,Genbank登记号NP_002111.1);Tonnelle等(1985)EMBOJ.4(11):2839-2847;Jonsson等(1989)Immunogenetics29(6):411-413;Beck等(1992)J.Mol.Biol.228:433-441;Strausberg等(2002)Proc.Natl.Acad.SciUSA99:16899-16903;Servenius等(1987)J.Biol.Chem.262:8759-8766;Beck等(1996)J.Mol.Biol.255:1-13;Naruse等(2002)TissueAntigens59:512-519;WO9958658(权利要求13,附图15);US6153408(Col35-38);US5976551(col168-170);US6011146(col145-146);Kasahara等(1989)Immunogenetics30(1):66-68;Larhammar等(1985)J.Biol.Chem.260(26):14111-14119
(31)P2X5(嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5(purinergicreceptorP2Xligand-gatedionchannel5),即由胞外ATP门控的离子通道,可能涉及突触传递和神经发生,其缺陷可以促使特发性逼尿肌不稳定病理生理学情况);422aa),pI:7.63,MW:47206TM:1[P]GeneChromosome:17p13.3,Genbank登记号NP_002552.2);Le等(1997)FEBSLett.418(1-2):195-199;WO2004047749;WO2003072035(权利要求10);Touchman等(2000)GenomeRes.10:165-173;WO200222660(权利要求20);WO2003093444(权利要求1);WO2003087768(权利要求1);WO2003029277(82页)
(32)CD72(B-细胞分化抗原CD72,Lyb-2;359aa),pI:8.66,MW:40225TM:1[P]GeneChromosome:9p13.3,Genbank登记号NP_001773.1);WO2004042346(权利要求65);WO2003026493(51-52,57-58页);WO200075655(105-106页);VonHoegen等(1990)J.Immunol.144(12):4870-4877;Strausberg等(2002)Proc.Natl.Acad.SciUSA99:16899-16903
(33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105),即富含亮氨酸重复(LRR)家族I型膜蛋白(typeImemberaneproteinoftheleucinerichrepeatfamily),调节B-细胞细胞活化和程序性细胞死亡,其功能缺失与患有系统性红斑狼疮的患者的疾病活动增加有关);661aa,pI:6.20,MW:74147TM:1[P]GeneChromosome:5q12,Genbank登记号NP_005573.1);US2002193567;WO9707198(权利要求11,39-42页);Miura等(1996)Genomics38(3):299-304;Miura等(1998)Blood92:2815-2822;WO2003083047;WO9744452(权利要求8,57-61页);WO200012130(24-26页)
(34)FcRH1(Fc受体-样蛋白1(Fcreceptor-likeprotein1),即含有C2型Ig-样结构域和ITAM结构域的免疫球蛋白Fc结构域的推定受体,可能在B-淋巴细胞分化中起作用);429aa,pI:5.28,MW:46925TM:1[P]GeneChromosome:1q21-1q22,Genbank登记号NP_443170.1);WO2003077836;WO200138490(权利要求6,附图18E-1-18-E-2);Davis等(2001)Proc.Natl.Acad.SciUSA98(17):9772-9777;WO2003089624(权利要求8);EP1347046(权利要求1);WO2003089624(权利要求7)
(35)IRTA2(FcRH5,免疫球蛋白超家族受体易位相关2,即在B细胞发育和淋巴瘤的生成中具有可能的作用的推定的免疫受体;由于易位所导致的基因失调在某些B细胞恶性肿瘤中发生);977aa,pI:6.88,MW:106468,TM:1[P]GeneChromosome:1q21,Genbank登记号人:AF343662,AF343663,AF343664,AF343665,AF369794,AF397453,AK090423,AK090475,AL834187,AY358085;小鼠:AK089756,AY158090,AY506558;NP_112571.1;WO2003024392(权利要求2,附图97);Nakayama等(2000)Biochem.Biophys.Res.Commun.277(1):124-127;WO2003077836;WO200138490(权利要求3,附图18B-1-18B-2)
(36)TENB2(TMEFF2,tomoregulin,TPEF,HPP1,TR,与EGF/调蛋白(heregulin)家族生长因子和卵泡抑素(follistatin)有关的推定的跨膜蛋白聚糖);374aa,NCBI登记号:AAD55776,AAF91397,AAG49451,NCBIRefSeq:NP_057276;NCBI基因:23671;OMIM:605734;SwissProtQ9UIK5;Genbank登记号AF179274;AY358907,CAF85723,CQ782436;WO2004074320;JP2004113151;WO2003042661;WO2003009814;EP1295944(69-70页);WO200230268(329页);WO200190304;US2004249130;US2004022727;WO2004063355;US2004197325;US2003232350;US2004005563;US2003124579;Horie等(2000)Genomics67:146-152;Uchida等(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.266:593-602;Liang等(2000)CancerRes.60:4907-12;Glynne-Jones等(2001)IntJCancer.Oct15;94(2):178-84。
重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物来生成抗体,例如,如记载于US4,816,567的。在一个实施方案中,提供了编码本文中所描述的抗体的分离的核酸。此类核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含VH的氨基酸序列(例如,抗体的轻和/或重链)。在又一个实施方案中,提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如,表达载体)。在又一个实施方案中,提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中,宿主细胞包含(例如,已经用下列载体转化):(1)包含核酸的载体,所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列,或(2)第一载体和第二载体,所述第一载体包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸,所述第二载体包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中,宿主细胞是真核的,例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中,提供了生成抗体的方法,其中该方法包括在适合于表达抗体的条件下培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞,如上文提供的,并且任选地,自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收抗体。
对于抗体的重组生成,将编码抗体的核酸(例如如上文所描述的)分离,并插入一种或多种载体中,以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程将此类核酸容易地分离并测序(例如,通过使用寡核苷酸探针来进行,所述寡核苷酸探针能够特异性结合编码抗体的重和轻链的基因)。
适合于克隆或表达抗体编码载体的宿主细胞包括本文中所描述的原核或真核细胞。例如,可以在细菌中生成抗体,特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达,见例如US5,648,237;US5,789,199;US5,840,523(还可见Charlton,MethodsinMolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo编,HumanaPress,Totowa,NJ,2003),第245-254页,其描述了抗体片段在大肠杆菌(E.coli)中的表达)。表达后,可以将抗体在可溶性级分中自细菌细胞团糊分离,并可以进一步纯化。
在原核生物外,真核微生物诸如丝状真菌或酵母是适合于抗体编码载体的克隆或表达宿主,包括其糖基化途径已经“人源化”,导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的真菌和酵母菌株(Gerngross(2004)Nat.Biotech.22:1409-1414;Li等(2006)Nat.Biotech.24:210-215)。
适合于表达糖基化抗体的宿主细胞也自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株,其可以与昆虫细胞一起使用,特别是用于转染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主(US5,959,177;US6,040,498;US6,420,548;US7,125,978;US6,417,429,描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如,适合于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7);人胚肾系(293或293细胞,如记载于例如Graham等(1977)J.GenVirol.36:59的);幼年仓鼠肾细胞(BHK);小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞,如记载于例如Mather(1980)Biol.Reprod.23:243-251的);猴肾细胞(CV1);非洲绿猴肾细胞(VERO-76);人宫颈癌细胞(HELA);犬肾细胞(MDCK);牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL3A);人肺细胞(W138);人肝细胞(HepG2);小鼠乳房肿瘤(MMT060562);TRI细胞,如记载于例如Mather等(1982)AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68的;MRC5细胞;和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216);和骨髓瘤细胞系诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述,见例如Yazaki和Wu,MethodsinMolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo编,HumanaPress,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。
测定法
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗体鉴定、筛选、或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。一方面,对本发明的抗体测试其抗原结合活性,例如通过已知的方法诸如ELISA或Western印迹等来进行。另一方面,可使用竞争测定法来鉴定与另一种已知抗体竞争对抗原的结合的抗体。在某些实施方案中,此类竞争性抗体结合与已知抗体所结合表位相同的表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法见Morris(1996)“EpitopeMappingProtocols”,MethodsinMolecularBiologyVol.66(HumanaPress,Totowa,NJ)。
在一种例示性竞争测定法中,在包含第一经标记抗体(其结合抗原,例如HER2或CD20)和第二未标记抗体(其要测试与第一抗体竞争对抗原的结合的能力)的溶液中温育固定化抗原。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照,在包含第一经标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育固定化抗原。在允许第一抗体结合抗原的条件下温育后,除去过量的未结合抗体,并测量与固定化抗原联合的标记物的量。如果测试样品中与固定化抗原联合的标记物的量相对于对照样品实质性降低,那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对抗原的结合。参见HarlowandLane(1988)Antibodies:ALaboratoryManual,第14章(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY)。
在一个方面,提供了用于鉴定具有生物学活性的抗体的测定法。生物学活性可包括例如肿瘤抑制。
在某些实施方案中,本发明方法的抗体可用于检测生物学样品中抗原的存在。如本文中所使用的,术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中,生物学样品包含血液、血浆、血清、细胞、尿液、玻璃体液、泪液、或组织。在某些实施方案中,该方法包括在允许抗体结合抗原的条件下使生物学样品与本文所述抗体接触,并检测抗体和抗原之间是否形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中,使用抗体来选择适合用抗体治疗的受试者,例如其中表达的抗原蛋白是一种用于选择患者的生物标志。可使用本发明的抗体来诊断的例示性病症包括癌症和免疫性病症。
在本发明方法的某些实施方案中利用标记的和缀合的抗体。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块(诸如荧光、发色、电子致密、化学发光、和放射性标记物)、及例如经由酶反应或分子相互作用间接检测的模块,诸如酶或配体。例示性的标记物包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H、和131I、荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明(rhodamine)及其衍生物、丹酰、伞形酮、萤光素酶,例如,萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(US4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶,例如,葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶(其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶诸如HRP偶联)、乳过氧化物酶、或微过氧化物酶、生物素/亲合素、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定的自由基、等等。
可以经由接头单元将实现细胞杀伤的药物模块共价附着至抗体以形成抗体-药物偶联物,以实现靶向细胞杀伤治疗效应。抗体-药物偶联物(ADC)化合物的一个例示性实施方案包含靶向肿瘤细胞的抗体(Ab)和细胞毒性或细胞抑制性药物模块(D),及将Ab附着至D的接头模块(L)。通过接头模块(L)经由一个或多个氨基酸残基(诸如赖氨酸和半胱氨酸)将抗体附着至D;组成具有式I:
Ab-(L-D)pI
其中p为1至约20,或约2至约5。可经由反应性接头模块偶联至抗体分子的药物模块的数目可受到通过本文所述方法引入的游离半胱氨酸残基的数目限制。
抗体-药物偶联物(ADC)的药物模块(D)包括任何具有细胞毒性或细胞抑制性效应的化合物、模块或基团。药物模块可通过包括但不限于微管蛋白结合、DNA结合或插层、和抑制RNA聚合酶、蛋白质合成、和拓扑异构酶的机制来发挥它们的细胞毒性和细胞抑制性效应。一些细胞毒性药物在偶联至大型抗体或蛋白质受体配体时趋于没有活性或不太有活性。例示性药物模块包括但不限于美登素类生物碱(maytansinoid)、多拉司他汀(dolastatin)、奥瑞司他汀(auristatin)、加利车霉素(calicheamicin)、吡咯并苯并二氮卓(pyrrolobenzodiazepine,PBD)、PNU-159682、蒽环类抗生素(anthracycline)、度卡霉素(duocarmycin)、长春花生物碱(vincaalkaloid)、紫杉烷(taxane)、单端孢菌素(trichothecene)、CC1065、度卡霉素、喜树碱(camptothecin)、依利奈法德(elinafide)及其立体异构体、电子等排体、类似物或衍生物,而且包括这些药物具有细胞毒性活性的衍生物。
抗体-药物偶联物(ADC)是设计用于相对于常规小分子和抗体癌症化疗降低非特异性毒性并提高功效的靶向抗癌治疗剂。它们采用单克隆抗体有力的靶向能力来将高度有力的、偶联的小分子治疗剂特异性投递至癌细胞。为了评估这些抗体-药物偶联物诸如药动学和毒性等特性,能够自血浆、尿液、和其它生物学样品对它们进行表征和定量是有用的。已经公开了通过免疫亲和膜(IAM)捕捉和质谱术来检测和筛选抗体-药物偶联物的方法(US2005/0232929),包括基于珠的亲和捕捉方法(US2009/0286258)。
测量生物学样品中的人和人源化抗体的方法
本发明的一个方面是可再现、有效且经济的、通用的、基于LC-MS/MS的方法,其用于定量来自临床前研究的猕猴和大鼠血浆和组织样品和潜在的其它非人物种中具有共同抗体支架结构的各种人和人源化单克隆抗体(单抗)治疗剂。抗体消化产生来自保守框架区的肽,它们对于施用的人或人源化治疗性抗体是独特的,而且在内源猴和大鼠蛋白质中没找到。
图9显示利用一种或多种框架签名肽(FSP)定量动物血浆/血清中治疗性抗体的通用LC-MS/MS方法。
本发明的方法包括定量人或人源化抗体的通用办法,其包括下述步骤:
(a)用消化酶处理生物学样品以形成经过消化的抗体样品,其中该血清或血浆样品来自已经用人或人源化抗体治疗过的动物;并
(b)通过质谱术分析该经过消化的抗体样品以检测和测量一种或多种共同人框架肽的浓度,其中该人框架肽包含一种或多种选自SEQIDNO:1-8的序列。
在一个例示性实施方案中,该消化酶为胰蛋白酶。除具有SEQIDNO:1-8的框架肽外,备选的蛋白酶可生成别的框架肽。可使用任何特异性酶,诸如内切蛋白酶LysC、内切蛋白酶ArgC、金黄色葡萄球菌V8、和内切蛋白酶GluC。可以使用非特异性蛋白酶,诸如木瓜蛋白酶。为定量生成的肽可具有与胰蛋白酶不同的序列,但是利用人中存在且动物抗体中不存在的通用框架肽的概念是相同的。
在另一个实施方案中,该方法进一步包括使该经过消化的抗体样品与亲和捕捉介质或固相提取(SPE)样品清理接触并洗脱经过富集的经过消化的抗体样品。
在另一个实施方案中,该方法包括亲和捕捉包含一种或多种具有选自SEQIDNO:1-8的序列的人框架肽的抗体,继以消化。亲和捕捉方法可通过ECD(胞外域抗原结合)、抗ID捕捉或蛋白A或G来实现。
在另一个实施方案中,该生物学样品为自非人哺乳动物衍生的血清、血浆、组织或细胞系。
在该方法的一个例示性演示中,该抗体为抗HER2曲妥珠单抗(Genentech,Inc.)。对其它抗体进行了本发明的方法。来自非临床血浆、经过胰蛋白酶消化且经过分析的抗体的包括抗MUC16、抗MSLN(间皮素)、抗Steap1、抗CD20(2H7和利妥昔单抗)、抗HER3(2C4,帕妥珠单抗)、抗NRP1、抗PDL1、抗LRP6、抗B7-H4、抗GFRA17C9、抗NRG1、和抗LY6E。
在另一个实施方案中,通过使用珠支持的蛋白A/G进行的免疫沉淀(IP)亲和捕捉来分析抗体样品,继以珠上消化和分析。
框架签名肽
人抗体的框架区在很大程度上是保守的。图1显示了人2H7抗体奥瑞珠单抗(SEQIDNO:11)和五种猕猴抗CD20抗体(CynoHC1aD31(SEQIDNO:12),CynoHC1bE51(SEQIDNO:13),CynoHC2a(SEQIDNO:14),CynoHC2bE61(SEQIDNO:15),CynoHC3(SEQIDNO:16))的重链氨基酸序列的序列比对。鉴定了人2H7(hu2H7)单抗独特的且在猕猴IgG重链中不存在的框架签名肽(FSP1-8),每个在序列中携带至少一处氨基酸差异。基于可得序列信息,框架签名肽(FSP1-8)只对人抗体是独特的,对猕猴IgG变体不是独特的。表2的框架签名肽(FSP1-8)还存在于内源IgG1中,而且在一些情况中还存在于IgG2、IgG3、和IgG4中。这些肽在其它人或人源化治疗性抗体和人IgG中也是常见的。
表2:来自HuMAb的重链框架签名肽(FSP1-8)
FSP | 序列 | MW | SEQ ID NO: |
FSP1 | GPSVFPLAPSSK | 1185.6 | 1 |
FSP2 | STSGGTAALGCLVK | 1263.6 | 2 |
FSP3 | TPEVTCVVVDVSHEDPEVK | 2081.01 | 3 |
FSP4 | FNWYVDGVEVHNAK | 1676.8 | 4 |
FSP5 | VVSVLTVLHQDWLNGK | 1807.0 | 5 |
FSP6 | ALPAPIEK | 837.5 | 6 |
FSP7 | GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK | 2543.1 | 7 |
FSP8 | TTPPVLDSDGSFFLYSK | 1872.9 | 8 |
8种具有人IgG独特(粗体)的残基的框架签名肽(frameworksignaturepeptide,FSP)
使用曲妥珠单抗(Genentech)作为模型参照标准并掺入猕猴和大鼠血浆,接着直接全血浆消化,有或无SPE预浓缩或蛋白A/G磁珠免疫沉淀及后续珠上消化,之后LC-MS/MS分析,在两种血浆基质中建立1-1000μg/mL工作校准范围。还用阴性对照空白血浆和掺样血浆样品二者测试并确认了特异性。
曲妥珠单抗(huMAb4D5-8,rhuMAbHER2,Genentech)是鼠HER2抗体的一种重组DNA衍生的人源化,IgG1κ,单克隆抗体形式,在基于细胞的测定法以高亲和力(Kd=5nM)选择性结合人表皮生长因子受体2蛋白,HER2(ErbB2)的胞外域的(US5,821,337;US6,054,297;US6,407,213;US6,639,055;CoussensL等(1985)Science230:1132-9;SlamonDJ等(1989)Science244:707-12)。曲妥珠单抗包含人框架区及结合HER2的鼠抗体(4D5)的互补决定区。曲妥珠单抗结合HER2抗原且因此抑制癌性细胞生长。曲妥珠单抗在体外测定法中及在动物中显示出抑制过表达HER2的人肿瘤细胞增殖(HudziakRM等(1989)MolCellBiol9:1165-72;LewisGD等(1993)CancerImmunolImmunother37:255-63;BaselgaJ等(1998)CancerRes.58:2825-2831)。曲妥珠单抗是抗体依赖性细胞的细胞毒性,ADCC的介导物(HotalingTE等(1996)[abstract].Proc.AnnualMeetingAmAssocCancerRes37:471;PegramMD等(1997)[abstract].ProcAmAssocCancerRes38:602;Sliwkowski等(1999)SeminarsinOncology26(4),Suppl12:60-70;YardenY.和Sliwkowski,M.(2001)NatureReviews:MolecularCellBiology,MacmillanMagazines,Ltd.,Vol.2:127-137)。在1998年批准用于治疗具有过表达ErbB2的转移性乳腺癌的患者(Baselga等(1996)J.Clin.Oncol.14:737-744)。
可以使用稳定同位素标记的(SIL)FSP1-8(SEQIDNO:1-8)类似物作为原位(“掺入”)内部标准。稳定同位素标记物通常包括13C、15N、和2H。可以将内部标准掺入肽序列的一个或多个氨基酸残基。可以在消化之前或之后将内部标准引入样品,发挥补偿LC-MS/MS分析期间发生的差异(例如自动取样仪性能、LC分开和MS响应的变化)的功能。例如,制备了FSP8的一种稳定同位素标记形式,其中用13C和15N标记苯丙氨酸(F)和酪氨酸(Y)之间的赖氨酸。
基于它们的MS特征,凭经验选择FSP8,因为它作为用于定量的主要肽的信号响应最强烈。另外,对其它三种肽(FSP4、FSP5、和FSP3)监测定性确认。这四种肽中每一种均能作为代替品用于定量动物生物学基质中的单抗。在测定法中使用它们的相应SILIS(表3)。FSP6只能在除猕猴以外的动物基质中使用,因为在猕猴血浆中检测到共洗脱干涉背景。对FSP1、FSP5和FSP2观察到相对较弱的电离。
表3:相应稳定同位素标记的内部标准
内部标准 | 氨基酸序列 | SEQ ID NO: |
FSP8IS | TTPPVLDSDGSFFL*(13C6,15N1)YSK | 8 |
FSP4IS | FNWYVDGVEV*(13C5,15N1)HNAK | 4 |
FSP5IS | VVSVLTVLHQDWL*(13C6,15N1)NGK | 5 |
FSP3IS | TPEVTcVVVDVSHEDPEV*(13C5,15N1)K | 3 |
*表示含有稳定同位素标记的氨基酸
C表示已经用碘乙酰胺烷基化的半胱氨酸残基
人和人源化抗体
图2显示曲妥珠单抗(GenentechInc.;rhuMAbHER2,抗p185HER2),一种重组衍生的人源化单克隆抗体,CAS登记号180288-69-1的重链(SEQIDNO:17)和轻链(SEQIDNO:18)。
图3显示奥瑞珠单抗,rhuMAb2H7,PRO70769,一种人源化抗CD20抗体,CAS登记号637334-45-3的重链(SEQIDNO:11)和轻链(SEQIDNO:19)。
图4显示帕妥珠单抗,rhuMAb2C4,CAS登记号380610-27-5的重链(SEQIDNO:20)和轻链(SEQIDNO:21)。FSP2、FSP3、FSP8在重链(SEQIDNO:20)中以下划线标示。
图5显示抗PDL1,T细胞调节物的扩大的CD28/CTLA-4家族的成员的重链(SEQIDNO:22)和轻链(SEQIDNO:23)。FSP2、FSP4、FSP8在重链(SEQIDNO:22)中以下划线标示。
图6显示抗神经毡蛋白-1,抗NRP1,MNRP1685A的重链(SEQIDNO:24)和轻链(SEQIDNO:25)。FSP2、FSP4、FSP8在重链(SEQIDNO:24)中以下划线标示。抗NRP1是一种重组、噬菌体衍生的人单克隆抗体,其特异性靶向神经毡蛋白-1(neuropilin-1,NRP1),一种已知结合多种配体(包括VEGF家族的成员)的多结构域受体。抗NRP1在小鼠异种移植物模型中与抗VEGF组合展现出功效,而且在临床前物种中在较宽的剂量范围上展现出较强的非线性药动学。它当前正在I期研究中作为单一药剂和与贝伐单抗(bevacizumab)的组合(有或无帕利他赛(paclitaxel))进行评价。
图7显示抗MUC16,DMUC4064A的重链(SEQIDNO:26)和轻链(SEQIDNO:27)。FSP2、FSP4、FSP8在重链(SEQIDNO:26)中以下划线标示。
图8显示利妥昔单抗,C2B8,MabThera(GenentechInc.,Biogen/Idec)的重链(SEQIDNO:28)和轻链(SEQIDNO:19)。FSP2、FSP4、FSP8在重链(SEQIDNO:28)中以下划线标示。利妥昔单抗Genentech/BiogenIdec;Roche,CAS注册号174722-31-7)是一种针对CD20抗原的遗传工程嵌合鼠/人单克隆抗体。利妥昔单抗即US5,736,137中称作“C2B8”的抗体。利妥昔单抗指示用于治疗具有复发性或顽固性低级或滤泡性,CD20阳性,B-细胞NHL的患者。利妥昔单抗结合细胞表面CD-20且导致B-细胞消减(Cartron等(2002)Blood99:754-758;Idusogie等(2000)J.Immunol.164:4178-4184;Grillo-LópezAJ等(1999)SeminOncol26:66-73;US5,736,137)。RITUXAN(US5,677,180;US5,736,137)是在造血恶性肿瘤中最广泛使用的单克隆抗体,而且在广泛的临床实践中得以确立。RITUXAN首先在1997年得到FDA批准用于治疗复发性或顽固性,低级或滤泡性,CD20阳性,B-细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。它还在1998年6月在商品名下在欧盟得到批准。在2006年2月,RITUXAN还得到FDA批准,与甲氨蝶呤组合用于减轻对一种或多种TNF拮抗剂疗法响应不足的具有中等至严重活动性类风湿性关节炎的成人患者中的体征和症状。US5,736,137中公开了利妥昔单抗抗体(也称作C2B8)的氨基酸序列及在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中经重组表达生成它的例示性方法。
样品的制备
图15显示在结合至生物素化捕捉探针的链霉亲合素包被的磁珠或蛋白A,G包被的磁珠上捕捉来自动物血浆/血清的单抗,接着通过磁分开来分离,消化捕捉到的抗体和通过LC-MS/MS来分析的卡通图。
图16显示蛋白A,G包被的磁珠(顶部)用于抗体通用捕捉和结合至生物素化捕捉探针的链霉亲合素包被的磁珠(底部)用于抗体特异性捕捉的实施方案。
以两种形式评价该用蛋白A进行免疫沉淀以有效且可再现地分离靶单克隆抗体(单抗)的潜力:(a)将蛋白A偶联至磁珠和(b)在96孔微量滴定板上包被蛋白A。在一项预备测试中,与蛋白A磁珠相比,蛋白A微量滴定板在捕捉连同靶单抗一起的全部应用的内源IgG加载(特别是来自猴血浆)方面容量太有限。选择使用蛋白A磁珠的珠上消化来评价自锂/肝素处理的猕猴和Sprague-Dawley大鼠血浆二者分离FSP。还测试了全血浆消化继以固相提取(SPE),发现在消除来自背景噪声的干涉方面不太有效。
生物学样品的分开和分析
调查了两种办法,评估FSP特异性、检测灵敏度、和再现性:(1)全血浆消化物/SPE(固相提取),和(2)免疫沉淀(IP)。
评价了猴(猕猴)和大鼠血浆样品(n=每个物种10个批次),评估批次间特异性、潜在干涉效应、和再现性。连同空白血浆对照一起,以20μg/ml曲妥珠单抗加强空白血浆样品,即“掺样”。在合并血浆基质中制备了范围为1-1000μg/ml曲妥珠单抗的一套校准曲妥珠单抗样品并与个体猴和大鼠血浆样品平行运行。
图12显示以1-1000μg/mL的各种浓度掺入通过全血浆消化物/SPE办法制备的肝素锂猕猴血浆的曲妥珠单抗(使用FSP8作为代替品)的校准曲线。在20%乙腈中制备稳定同位素标记的肽内部标准(IS)以生成含有适宜浓度的内部标准工作溶液。
图14显示在动物血浆或血清中免疫沉淀(IP)单克隆抗体及生成相应框架签名肽(FSP)的步骤。实施例1-4中限定了方案。
制备动物样品,即用蛋白A顺磁珠(Millipore)免疫沉淀(IP),接着胰蛋白酶消化。与125μL加载缓冲液一起向96孔锥底微量滴定板(VWRScientific)放置等分试样25μL稀释的血浆或血清[用加载缓冲液(SN1)(0.1:5.0:3.0:0.2:91.7:0.1Tween20/盐酸Trizma(1M)/氯化钠(5M)/EDTA(0.5M)/水/BSA,v/v/v/v/v/w)1:2v/v稀释]。将等分试样25μL在加载缓冲液中预清洗并重悬浮的蛋白A磁珠,添加至每个孔。然后将混合物于室温(RT)温育120分钟,持续混合以容许捕捉单抗。丢弃上清液并将珠在清洗缓冲液(SN2)(5.0:3.0:0.2:91.8盐酸Trizma(1M)/氯化钠(5M)/EDTA(0.5M)/水,v/v/v/v)中彻底清洗)。分别使用微量板清洗仪(BioTek,VT,USA)和96孔平磁铁(Biotek)实施清洗和磁分开。也可以用KingFisher96磁性颗粒处理器(ThermoScientific)进行清洗/分开过程。
免疫沉淀(IP)之后,将25μL等分试样IS工作溶液掺入除空白以外的每个孔,所述空白添加25μL20%乙腈。添加等分试样75μLRapiGest溶液(0.05:37.5:10RapiGest粉/50mM碳酸氢铵/乙腈,w/v/v)和10μL0.1MDTT。通过粘性密封膜(VWRScientific)覆盖板并温和摇动大约1分钟,接着于60℃温育60分钟。添加25μL体积的碘乙酸(0.1M),并通过铝箔覆盖板并于室温避光温育大约30分钟。将等分试样10μL胰蛋白酶溶液(0.250mg/mL)添加至每个孔,并随后将板于37℃温育大约90分钟。通过将15μL2MHCl添加至每个孔并将板于37℃温育30分钟来终止消化。然后通过Tomtec(CT,USA)将样品转移至放置在96孔锥底收集板顶部的MultiscreenHTS滤板(0.45μm,Millipore)并以3000rpm离心5分钟以收集滤出液。密封收集板,并将20μL体积的滤出液直接注射到LC-MS/MS上。
ELISA和LC-MS/MS
在测量单剂抗体后大鼠血浆中的总抗体方面比较ELISA(图19a)和LC-MS/MS(图19b)。图19a显示在具有电化学发光、比色、或发色底物检测的ELISA测定法中通过结合至固定化胞外域(ECD)或抗人IgG多克隆抗体来捕捉并用马辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG多克隆抗体检测单克隆抗体(单抗治疗剂)的卡通图。
通过HPAgilent1100SeriesLC二元系统或ShimadzuLC-10ADvp二元系统进行液体层析分开,以流速200μL/min运转反相BioSuiteC18PA-A柱(2.1x50mm,3μm,Waters)。通过柱加热器(AnalyticalSalesandProducts,NJ,USA)将柱维持于50℃。流动相由A:含0.1%甲酸的水和B:含0.1%甲酸的乙腈/甲醇(75:25,v/v)组成。将梯度条件于5%B维持0.4min,在3.4min中斜升至40%B,在1min中进一步升至95%B,于95%B保持0.5min,之后在0.1min中回到5%B。然后于5%保持0.5min,之后在0.1min中斜升回到95%B,并在该水平维持0.5min以降低潜在遗留物。最后,将梯度在0.1min中返回到5%B并于5%B再平衡0.9min。总LC运行时间为7.5min。使用CTCHTSPAL自动取样仪(LEAPTechnologies,NC,USA)注射样品,注射环为20μL。自动取样仪洗液1为乙腈/异丙醇/三氟乙醇/甲醇/水/甲酸(60:15:15:5:5:0.2,以体积计)而洗液2为水/乙腈/甲酸(95:5:0.2,以体积计)。
使用配备有涡轮离子喷射的SciexAPI三联四极质谱仪(ABSciex,CA,USA)进行定量。阳离子模式运转MS设备,源温度设为500℃且离子喷射电压设为5000V。气体参数设为气帘气25,喷雾气45和辅助气40。使用碰撞气10。表4中列出了签名肽及它们的相应内部标准的多重反应监测(MRM)转变的详情。对于每项MRM转变,停延时间设为50ms,并应用相同入口电压10V。Q1和Q3分辨率均设为单元。基于峰面积使用Intelliquan实施定量。
使用曲妥珠单抗作为模型实施了定量方法。通过将曲妥珠单抗以1.00、1.75、3.00、10.0、25.0、75.0、200和250μg/mL掺入猕猴血浆或Sprague-Dawley大鼠血浆来制备校准标准。以血浆中1.00(LLOQ)、2.50(LQC)、15.0(MQC)和190μg/mL(UQC)曲妥珠单抗来制备质量对照(QC)。另外,包括1000μg/mL初始浓度、10倍稀释因子的稀释QC。以6份重复制备测定法内QC并以3份重复制备稀释QC。表5中报告了定量方法的数据。数据指示LC-MS/MS测定法具有较好的精确性和准确性,数值在预定的接受标准之内。
表5:大鼠血浆中曲妥珠单抗的定量方法的精确性和准确性
QC | LLOQ1.00 | LQC2.50 | MQC15.0 | UQC190 | Dil10QC1000 |
1 | 1.01 | 2.42 | 14.2 | 206 | 996 |
2 | 1.07 | 2.48 | 15.1 | 203 | 984 |
3 | 1.03 | 2.43 | 14.7 | 191 | 1050 |
4 | 1.05 | 2.51 | 15.3 | 187 | n/a |
5 | 1.12 | 2.76 | 14.8 | 186 | n/a |
6 | 1.08 | 2.40 | 14.5 | 183 | n/a |
均值 | 1.06 | 2.50 | 14.8 | 193 | 1010 |
SD | 0.0375 | 0.135 | 0.391 | 9.61 | 34.3 |
%CV | 3.5 | 5.4 | 2.7 | 5.0 | 3.4 |
%理论 | 106.0 | 100.0 | 98.5 | 101.4 | 100.9 |
%偏差 | 6.0 | 0.0 | -1.5 | 1.4 | 0.9 |
图17显示大鼠血浆中1μg/mL(LLOQ)曲妥珠单抗抗体的检测,使用FSP8作为代替品,在相同的保留时间检测到稳定同位素标记的FSP8内部标准(图17b)。依照实施例4中的方案制备样品。在图18中大鼠血浆中1-250μg/mL曲妥珠单抗展现较好的线性。
图20显示服用2mg/kg推注抗HER2单抗曲妥珠单抗的大鼠(1A、1B、1C)的个体浓度时间概况。通过LC-MS/MS(图19b)和ELISA(图19a)测定法分析剂量给药后28个小时里的血浆样品。在两种测定方法之间观察到较好的一致性。来自图20的PK参数为:
aPK参数基于n=2,由于可能的ATA(不包括SD)
图21显示服用2mg/kg推注抗MUC16单抗3A5的大鼠(2D,2E,2F)的个体浓度时间概况。通过LC-MS/MS(图19b)和ELISA(图19a)测定法分析剂量给药后28个小时里的血浆样品。在两种方法之间观察到较好的一致性。来自图21的PK参数为:
图22显示服用2mg/kg推注抗间皮素(Msln)单抗的大鼠(3G,3H,3I)的结果。通过LC-MS/MS(图19b)和ELISA(图19a)测定法分析剂量给药后28个小时里的血浆样品。在两种方法之间观察到较好的一致性。来自图22的PK参数为:
图23显示图19b中所示LC-MS/MS测定法和图19a的ELISA测定法之间的一致性,基于来自服用抗MUC16单抗3A5的猕猴的血浆/血清样品的均值药动学(PK),通过测量28天里血液中的抗体进行。来自图23的PK参数为:
测定法 | CL(mL/d/kg) | C最大(μg/mL) | T1/2(d) |
ELISA | 7.86±2.75 | 32.0±2.25 | 7.97±2.72 |
LC-MS/MS | 7.63±2.64 | 31.6±1.46 | 6.99±2.97 |
所有值为均值±标准偏差(SD)
图24显示图19b中所示LC-MS/MS测定法和图19a的ELISA测定法之间的致性,基于来自服用抗间皮素(Msln)单抗的猕猴的血浆/血清样品的均值药动学(PK),通过测量42天里血液中的抗体进行。来自图24的PK参数为:
测定法 | CL(mL/d/kg) | C最大(μg/mL) | T1/2(d) |
ELISA | 4.41±0.773 | 24.8±4.63 | 9.51±2.68 |
LC-MS/MS | 4.26±0.848 | 25.4±4.78 | 11.2±3.52 |
所有值为均值±标准偏差(SD)
图25显示图19b中所示LC-MS/MS测定法和图19a的ELISA测定法之间的一致性,基于来自服用具有下述结构的抗体-药物偶联物(ADC)抗LY6E-MC-vc-PAB-MMAE的小鼠(A,B,C)的血浆/血清样品的个体药动学(PK):
其中Ab为经由半胱氨酸氨基酸连接至接头的马来酰亚胺己酰基(MC)基团的抗LY6E抗体,且p为ADC分子中每个抗体的药物模块(MMAE)数目。ADC的典型化合物中p的范围为约0至约20,或0至约8。在p为0的情况中,可存在一定量的裸的、未偶联的抗体。每个抗体的平均药物载荷可以为约2至约5,或约3至约4。如此,抗体-药物偶联物(ADC)的典型制备物是抗体与一些数目的药物模块(诸如MMAE)偶联的种类的异质混合物。接头还包括对组织蛋白酶识别易感的缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)二肽单元和para-氨基苄基氧甲基(PAB)单元(US7,659,241;US7,498,298;Doronina等(2006)BioconjugateChem.17:114-124;及Doronina等(2003)Nat.Biotech.21:778-784)。
药物模块MMAE(Vedotin,(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺基)丁酰胺,CAS注册号474645-27-7)是多拉司他汀的单甲基奥瑞司他汀类似物(US5,635,483;US5,780,588),经由其N端连接至抗体的。MMAE具有结构:
来自图23-28的抗体剂量给药实验,来自两种测定方法(LC-MS/MS和ELISA)的PK概况和参数显示高度一致性,指示通过使用共同框架签名肽作为代替品的单一通用LC-MS/MS测定法,动物(包括猕猴,大鼠和小鼠)中单抗的定量是可行的且具有稳健的性能。单一的基于MS的办法能够生成可靠的PK数据,这在其它情况中需要多重ELISA测定法来实现。另外,MS办法不要求任何定制试剂,这会有助于加速方法开发过程及使PK评估在药物开发的早期阶段即可得到。
数据分析
在免疫沉淀办法中为DWYIHWVR(SEQIDNO:9)、FSP3、FSP4、FSP5、FSP8(均为猴和大鼠二者)和NQVSLTCLVK(SEQIDNO:10)(仅大鼠)及在全血浆消化物/SPE办法中为FSP4、FSP5、FSP8(均为猴和大鼠二者)建立了校准曲线。为空白和带掺样的血浆样品建立了特异性数据。提供了不同肽关于FSP8(主要定量的候选)的面积比和相应CV(变异系数)作为消化再现性的标尺。使用二次(1/浓度2加权的)回归来拟合数据。
在处理猴血浆样品的全血浆消化物/SPE办法(实施例3b)中,FSP8是最灵敏的肽。图13显示的LC-MS/MS层析图证明对全血浆消化物/SPE样品制备后以LLOQ(定量下限)=1μg/mL掺入锂肝素化猕猴血浆的FSP8的检测。4.47和5.20分钟处的峰在空白中。FSP8具有4.66分钟的保留时间。唯一在低浓度可定量的其它肽是FSP4和FSP5。然而,它们在1μg/mL-LLOQ水平的信噪比(s/n)小于(<)5。正如预期的,肽NQVSLTCLVK(SEQIDNO:10)在所有猴血浆中均显示高内源背景水平。测试的10个批次9个批次具有相似且可接受的特异性。批号5对于所有可定量肽具有不寻常的背景水平。该样式提示它可能污染一些人的血浆。总之,FSP(即带掺样的)样品对于FSP8(主要定量的潜在签名肽)的所有批次显示良好的准确性和精确性(FSP7除外,它的CV为27%)。FSP4和FSP5与FSP8相比的峰面积比显示在不同样品和样品类型之间小于20%的CV。
在处理大鼠血浆样品的全血浆消化物/SPE办法(实施例3b)中,FSP8是最极度的肽(intensepeptide)。在低水平浓度可定量的其它肽是FSP4和FSP5。然而,这些肽在LLOQ水平的s/n小于5。校准曲线显示分裂性质,可能是由于稍后注射的样品的信号阻抑。测试的各个批次无一对于所有肽具有可定量的背景峰。由于分裂曲线,FSP样品显示高度可变的准确性和精确性值。FSP4和FSP5关于FSP8的峰面积比在大多数情况中显示大于20%的CV,再次指示测定法的可变性。
在处理猴血浆样品的免疫沉淀办法(实施例4)中,FSP8是最灵敏(即极度)的肽。所有其它肽在低水平浓度也是可定量的。所有其它肽在LLOQ水平的s/n大于5(FSP2除外)。正如预期的,肽NQVSLTCLVK(SEQIDNO:10)对于所有猴血浆样品均显示背景水平。浓度和响应之间的相关性在高浓度显示一些非线性,可能是由于蛋白A磁珠的饱和和/或内源猕猴IgG的竞争。在测试的10个批次中,来自批号5的样品对所有可定量肽均具有相似水平的背景峰,可变区肽DTYIHWVR(SEQIDNO:9)除外。总之,FSP样品对于FSP8的所有批次均显示较好的准确性和精确性(包括批号5,如果考虑空白中的背景浓度的话)。几乎所有肽的峰面积比均显示在不同样品和样品类型之间小于15%的CV(FSP5除外,它CALS的CV为约23%)。
在处理大鼠血浆样品的免疫沉淀(IP)办法(实施例4)中,FSP8是最极度的肽。所有其它肽在低水平浓度也是可定量的。所有其它肽在LLOQ水平的s/n大于5(FSP2除外)。浓度和响应之间的相关性显示比猴免疫沉淀(IP)数据更好的线性,可能是由于大鼠血浆中来自较低亲和力内源IgG的竞争较少。测试的各个批次无一对于所有肽具有可定量的背景峰。总之,FSP样品对于FSP8的所有批次均显示较好的准确性和精确性。几乎所有肽的峰面积比显示在不同样品和样品类型之间小于20%的CV(FSP5和FSP2除外,它们CALS的CV大于(>)24%)。
用蛋白A磁珠进行的免疫沉淀(IP)提取显示比全血浆消化物/SPE提取更好的灵敏度和再现性。IP办法比全基质消化物/SPE办法更快且“更干净”。
实施例
实施例1:简单全血浆消化和提取规程
1.将10μL(柠檬酸钠)血浆等分入低结合板
2.添加95μL50mM碳酸氢铵中的10mMDTT溶液
3.混合并于60℃温育60分钟
4.添加20μL50mM碳酸氢铵中的100mM碘乙酰胺(IAA)
5.在黑暗中于室温温育30分钟
6.在光照中放置20分钟
7.添加15μL50mM碳酸氢铵中的500μg/mL胰蛋白酶溶液
8.于37℃温育过夜
9.添加15μL1%甲酸溶液。混合并离心。
10.通过LC-MS/MS(20μL注射,以0.7mL/minUPLC)分析
实施例2:用于MAX/WCX板(WatersCorp.)的固相提取方案
1.将600μL血清/血浆消化物与100μL8%H3PO4混合
2.用200μLMeOH条件化MAX/WCXμElutionSPE板(WatersCorp.,MilfordMA)
3.用200μLH2O平衡MAX/WCXμElutionSPE板
4.将经过稀释的血清/血浆消化物加载到MAX/WCXμElutionSPE板上(2x350μL等分试样)。在每次添加后应用刚刚足够的真空以容许样品以逐滴方式通过床。
5.用200μL5%NH4OH清洗
6.用200μL20%ACN(乙腈)清洗
7.在中等真空下用(2x25μL)75:25:1乙腈/水/TFA,v/v/v洗脱入96位,2.0mL,方孔,锥底,聚丙烯板
8.添加200μL水并将板用紫色封垫密封并漩涡震荡大约30秒。
9.在4000LC/MS/MS系统(ABSciex,FosterCity,CA,USA)上注射25μL
实施例3a:全血浆消化物规程#1
1.将10μL血浆等分入低结合板
2.添加95μL50mM碳酸氢铵中的10mMDTT溶液
3.混合并于60℃温育60分钟
4.添加20μL50mM碳酸氢铵中的100mM碘乙酰胺
5.在黑暗中于室温温育30分钟
6.在光照中放置20分钟
7.添加15μL50mM碳酸氢铵中的500μg/mL胰蛋白酶
8.于37℃温育过夜
9.添加15μL1%甲酸溶液。混合并离心。
10.通过LC-MS/MS分析
实施例3b:全血浆消化物/SPE(固相提取)–方案#2
1.将25μL血浆样品与100μLRapiGestTM(WatersCorp.,MilfordMA)SF表面活性剂溶液(0.05:40:10RapiGestTM/乙酸铵,50mM/ACN,w/v/v)混合。另外添加400μLRapiGestTM稀释剂(80:20乙酸铵,50mM/ACN,v/v)。
2.添加10μLDTT(1M)。于60℃温育约1小时。
3.添加25μLIAA(1M)。于室温避光温育约0.5小时。
4.添加20μg胰蛋白酶。于37℃温育约16小时。
5.添加另一剂20μg胰蛋白酶。于37℃温育约4小时。
6.添加50μL6MHCl。于37℃温育约0.5小时。
7.使用MAXμElution板(WatersCorp.,MilfordMA),对500μL全血浆消化物进行SPE。
8.将500μL血浆消化物与100μL8%H3PO4混合
9.用200μLMeOH条件化MAXμElutionSPE板
10.用200μLH2O平衡MAXμElutionSPE板
11.将经过稀释的血浆消化物加载到MAXμElutionSPE板上(2x300μL等分试样)。应用刚刚足够的真空以容许样品以逐滴方式通过床。
12.用200μL5%NH4OH清洗
13.用200μL20%乙腈清洗
14.在中等真空下用(2x25μL)75:25:1乙腈/水/TFA,v/v/v洗脱
15.添加200μL水并密封板。漩涡震荡大约30秒。
16.SPE洗脱物的终体积为大约250μL。直接注射25μL此提取物。
实施例4:免疫沉淀方案
1.温和混合蛋白A珠悬浮液使得所有珠均匀悬浮。
2.在聚丙烯管中吸取所需体积的悬浮珠。借助外部磁铁将珠与贮存缓冲液分开,并在不扰动珠的情况下用移液器温和除去贮存缓冲液。(注意:基于每孔所需25μL珠体积计算所需珠体积)。
3.将与初始珠体积相等体积的SN1缓冲液添加至聚丙烯管。简短漩涡震荡使得珠在SN1缓冲液中重悬浮。
4.再次借助外部磁铁将珠与SN1缓冲液分开,并在不扰动珠的情况下温和除去SN1缓冲液。
5.将步骤3-4再重复两次。
6.在清洗珠后,再次添加与初始珠体积相等体积的SN1缓冲液。简短漩涡震荡使得珠在SN1缓冲液中重悬浮。进过清洗的珠溶液要在使用当天新鲜制备。如果不在清洗后1小时内使用的话,应当保存于2-4℃。
7.漩涡震荡血浆样品并在微量离心管中等分25μL。
8.用50μLSN1缓冲液稀释血浆样品。简短漩涡震荡。
9.在96孔微量滴定板中等分25μL经过稀释的血浆样品。
10.向每个孔添加125μLSN1缓冲液。
11.向每个孔添加25μL经过清洗的蛋白A珠(来自步骤6)。确保珠在添加前在溶液中较好的悬浮。
12.用粘性封膜覆盖板,并于室温在滴定板摇床上温和摇动大约2小时。
13.使用外部磁铁和洗板仪将磁珠分开并丢弃上清液中未结合的蛋白质。使用洗板仪将珠用SN2缓冲液清洗三次。通过在滴定板摇床上摇动确保珠在每个清洗步骤前在溶液中较好的悬浮。
14.向每个孔添加25μL工作内部溶液,没有内部标准品的空白除外。向含有没有内部标准品的空白的孔添加25μL工作内部标准品稀释液。
15.向每个孔添加75μLRapiGest溶液。
16.向每个孔添加10μL0.1MDTT。用粘性封膜覆盖板并在滴定板摇床上温和摇动大约1分钟。
17.将板在预加热的烤箱中于60℃温育大约1小时。
18.向每个孔添加25μL0.1MIAA。用粘性封膜覆盖板并在滴定板摇床上温和摇动大约1分钟。这些步骤应当避光实施。用铝箔覆盖板并于室温温育大约30分钟。
19.向每个孔添加10μL胰蛋白酶溶液。用粘性封膜覆盖板并在滴定板摇床上温和摇动大约1分钟。
20.将板在预加热的温箱中于37℃温育大约90分钟。
21.向每个孔添加15μL2MHCl。用粘性封膜覆盖板并在滴定板摇床上温和摇动大约1分钟。
22.将板在预加热的温箱中于37℃温育30分钟。
23.将板在滴定板摇床上温和摇动大约1分钟。使用Tomtec将溶液自每个孔转移至放置在96孔锥底收集板顶部的MultiscreenHTS滤板。
24.将MultiscreenHTS滤板/96孔锥底收集板组合以3000rpm离心5分钟以在96孔锥底收集板中收集滤出液。
25.用黄色注射垫密封96孔锥底收集板并直接注射。
SN1缓冲液:0.1:5.0:3.0:0.2:91.7:0.1Tween20/盐酸Trizma(1M)/氯化钠(5M)/EDTA(0.5M)/水/牛血清清蛋白,v/v/v/v/w。如下制备此溶液,即在1L容量瓶中组合1mLTween20,50.0mL1M盐酸Trizma,30mL5M氯化钠溶液,2mL0.5MEDTA和1.00g牛血清清蛋白。然后用水补满体积并混匀以溶解牛血清清蛋白。在密闭容器中于2-8℃保存长至1个月。
SN2缓冲液:5.0:3.0:0.2:91.8盐酸Trizma(1M)/氯化钠(5M)/EDTA(0.5M)/水,v/v/v/v。如下制备此溶液,即在1L容量瓶中组合50.0mL1M盐酸Trizma,30mL5M氯化钠溶液和2mL0.5MEDTA。然后用水补满体积并混匀。在密闭容器中于2-8℃保存长至1个月。
例示性HPLC方法#1:
自动取样仪 | Acquity BSM |
强洗液 | 乙腈 |
弱洗液 | 乙腈:水10:90v/v |
注射模式 | 全环 |
LC系统 | Acquity BSM |
流速 | 0.7mL/min |
分析柱 | 100x2.1mm i.d.Waters Acquity Phenyl |
柱温度 | 名义上+60℃ |
运行时间 | 7.5分钟 |
流动相A | 含0.2%(v/v)甲酸的乙腈 |
流动相B | 含0.2%(v/v)甲酸的水 |
梯度概况
时间(min) | %A | %B |
初始 | 15.0 | 85.0 |
3.00 | 17.5 | 82.5 |
3.10 | 22.5 | 77.5 |
6.00 | 27.5 | 72.5 |
6.10 | 95.0 | 5.00 |
6.90 | 95.0 | 5.00 |
7.00 | 15.0 | 85.038 --> |
7.50 | 15.0 | 85.0 |
例示性HPLC方法#2
柱:WatersBioSuiteC18PA-A,3μm,2.1x50mm(Part#188002425)
流动相A:0.1:100甲酸/水,v/v
流动相B:0.1:75:25甲酸/乙腈/甲醇,v/v/v
流速:0.20mL/min
梯度:
时间 | %A | %B |
0.00 | 95.0 | 5.0 |
0.50 | 95.0 | 5.0 |
4.00 | 60.0 | 40.0 |
5.00 | 5.0 | 95.0 |
5.90 | 5.0 | 95.0 |
6.00 | 95.0 | 5.0 |
7.00 | 95.0 | 5.0 |
MS/MS条件
质谱仪 | Applied Biosystems API5500 |
电离/界面 | TurboIon SprayTM |
源温度 | 550℃ |
GS1 | 50psi |
GS2 | 50psi |
气帘气设置 | 30psi |
碰撞气设置 | 中等 |
离子喷射电压 | 5500V |
虽然出于清楚理解的目的,前述发明已经作为例示和例子相当详细地进行了描述,但是说明书和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过提及而明确将本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容完整收录。
Claims (12)
1.一种检测人或人源化抗体的方法,其包括下述步骤:
(a)用消化酶处理包含人或人源化抗体的生物学样品以形成经过消化的抗体样品,其中该生物学样品为来自已经用人或人源化抗体治疗过的动物的血清、血浆、组织或细胞;并
(b)通过质谱术分析该经过消化的抗体样品以检测一种或多种人重链框架签名肽,其中该人重链框架签名肽包含一种或多种选自SEQIDNO:1-8的序列:
2.权利要求1的方法,其中该消化酶为胰蛋白酶。
3.权利要求1的方法,其进一步包括使该经过消化的抗体样品与亲和捕捉介质或层析吸附剂接触并洗脱经过富集的经过消化的抗体样品。
4.权利要求1的方法,其进一步包括使该生物学样品与亲和捕捉介质或层析吸附剂接触并洗脱经过富集的生物学样品,然后用该消化酶处理该经过富集的生物学样品。
5.权利要求3或4的方法,其中该亲和捕捉介质是珠支持的蛋白A/G。
6.权利要求3或4的方法,其中该层析吸附剂是固相提取吸附剂。
7.权利要求1的方法,其中该生物学样品为血清或血浆。
8.权利要求1的方法,其中测量该经过消化的抗体样品的浓度。
9.权利要求1的方法,其中该人或人源化抗体结合一种或多种选自
(1)-(36)的肿瘤相关抗原或细胞表面受体:
(1)BMPR1B;
(2)E16;
(3)STEAP1;
(4)0772P;
(5)MPF;
(6)Napi3b;
(7)Sema5b;
(8)PSCAhlg;
(9)ETBR;
(10)MSG783;
(11)STEAP2;
(12)TrpM4;
(13)CRIPTO;
(14)CD21;
(15)CD79b;
(16)FcRH2;
(17)HER2;
(18)NCA;
(19)MDP;
(20)IL20Rα;
(21)Brevican;
(22)EphB2R;
(23)ASLG659;
(24)PSCA;
(25)GEDA;
(26)BAFF-R;
(27)CD22;
(28)CD79a;
(29)CXCR5;
(30)HLA-DOB;
(31)P2X5;
(32)CD72;
(33)LY64;
(34)FcRH1;
(35)IRTA2;和
(36)TENB2。
10.权利要求1的方法,其中该人或人源化抗体选自曲妥珠单抗、奥瑞珠单抗、帕妥珠单抗、抗PDL1、抗神经毡蛋白-1、抗MUC16、利妥昔单抗、抗间皮素和抗LY6E。
11.权利要求1的方法,其中该人或人源化抗体偶联至药物模块。
12.权利要求11的方法,其中该药物模块选自美登素类生物碱、多拉司他汀、奥瑞司他汀、加利车霉素、吡咯并苯并二氮卓、PNU-159682、蒽环类抗生素、度卡霉素、长春花生物碱、紫杉烷、单端孢菌素、CC1065、度卡霉素、喜树碱、依利奈法德及其立体异构体、电子等排体、类似物或衍生物。
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