KR20110120891A - Ｈｅｒ-３의 측정에 의한 환자 반응의 결정 방법 - Google Patents

Ｈｅｒ-３의 측정에 의한 환자 반응의 결정 방법 Download PDF

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제니퍼 더블유 쿡
군도 디드리히
라우리 굿맨
알리 무크헤르지이
고든 파리
제프 스페린드
스티븐 존 윌리암스
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래버러토리 코포레이션 오브 아메리카 홀딩스
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Abstract

본 발명은 샘플 내에서 Her-3 및/또는 복합체 내의 Her-3의 존재 및/또는 양을 측정 및/또는 정량하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 Her-3에 특이적인 항체를 제공한다.

Description

ＨＥＲ-３의 측정에 의한 환자 반응의 결정 방법{METHODS OF DETERMINING PATIENT RESPONSE BY MEASUREMENT OF HER-3}
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 35 USC §119(e) 하에, 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 가출원 61/176,630 (2009년 5월 8일 출원), 미국 특허 가출원 61/187,962 (2009년 6월 17일 출원), 및 미국 특허 가출원 61/145,029 (2009년 1월 15일 출원)의 이익 및 우선권을 주장한다.
생체마커 (biomarker)는 일반적으로 정상 생물학적 과정, 발병 과정 또는 치료적 개입에 대한 약물학적 반응의 표지자로서 객관적으로 측정되고 평가될 수 있는 특징을 갖는다 (Atkinson et al., 2001, Clin. Pharmacol. Ther. 69:89-95 참조). 생체마커는 성질, 측정의 용이함 및 관심있는 생리학적 상태와의 상관성에서 상당히 상이하다 (예를 들어, [Frank et al., 2003, Nature Reviews Drug Discovery 2:566-580] 참조). 새로운 입증된 생체마커의 개발은 보건 및 약물 개발 비용을 유의하게 감소시키고 매우 다양한 질병 및 상태에 대한 치료를 유의하게 개선할 것으로 널리 생각되고 있다. 따라서, 새로운 클래스의 생체마커를 찾기 위해 새로운 기술을 사용하는데 많은 노력이 경주되었다. 예를 들어, 문헌 ([Petricoin et al., 2002, Nature Reviews Drug Discovery, 1:683-695]; 및 [Sidransky, 2002, Nature Reviews Cancer 2:210-219]; [Ludwig and Weinstein, 2005, Nature Reviews Cancer 5:845-856]; [Lee et al, 2007, Adv. Cancer. Res., 96:269-298]; [Dhani and Siu, 2008, Cancer Metastasis Rev. 27:339-349]; [Carden et al, 2009, Clin. Pharmacol. Ther. 85:131-133])을 참조한다.
세포 표면 막 성분들의 상호작용이 정상 생리학에서 및 질병 상태에서 세포외 신호를 세포에 전달하는데 중대한 역할을 한다. 특히, 많은 종류의 세포 표면 수용체는 예를 들어 증식, 증가된 또는 감소된 유전자 발현 등과 같은 세포성 반응으로 세포외 사건 또는 신호의 전달과 관련하여 이량체화, 올리고머화 또는 집단화한다. 예를 들어, 문헌 ([George et al., 2002, Nature Reviews Drug Discovery 1:808-820]; [Mellado et al, 2001, Ann. Rev. Immunol. 19:397-421]; [Schlessinger, 2000, Cell 103:211-225]; 및 [Yarden, 2001, Eur. J. Cancer 37:S3-S8])을 참조한다. 암과 같은 질병에서 그러한 사건의 역할은 집중적인 연구의 목적이었고, 몇몇 새로운 약물 및 약물 후보의 개발을 이끌었다. 예를 들어, 문헌 ([Herbst and Shin, 2002, Cancer 94: 1593-1611]; [Yarden and Sliwkowski, 2001, Nature Reviews Molecular Cell Biology 2: 127-137]; [McCormick, 1999, Trends in Cell Biology 9:53-56 (1999)]; 및 [Blume-Jensen and Hunter, 2001, Nature 411:355-365])을 참조한다.
유방암에서 Her-2와 같은 개별 세포 표면 수용체의 발현 수준은 특히 환자 예후 또는 환자가 특정 치료에 반응할 것인지 그렇지 않을 것인지 결정하기 위해 생체마커로서 사용되었다. 또한, 종양발생성 티로신 키나제, 예를 들어 상피 성장 인자 수용체 패밀리의 구성원은 약물 개발을 위한 표적을 제공하였다. 그러나, EGFR 및 Her-2에 표적화된 티로신 키나제 억제제는 유망한 전임상 연구로부터 예상되는 것보다 더 적은 임상 효능을 보였고, 이는 부분적으로 생체마커로서 예후적 가치로 인해 및 부분적으로 다른 패밀리 구성원과의 상호작용 때문에 다른 EGFR-패밀리 구성원, 예를 들어 Her-3에 대해 관심을 이끌어, 잠재적인 새로운 약물 표적을 생성하였다. 문헌 ([Menendez and Lupu, 2007, Breast Cancer Research 9:111]; [Lee-Hoeflich et al, 2008, Cancer Res 68:5878-5887]; [Fuchs et al, 2006, Anticancer Res. 26:4397-4402]; [Sergina et al., 2007, Nature 445:437-441]; 및 [Tovey et al, 2006, J. Pathol. 210:358-362])을 참조한다.
Her-3은 유방암, 결장직장암, 난소암, 방광암, 전립선암, 비-소세포 폐암, 흑색종, 인두암, 췌장암, 식도암, 신경아교종, 담도 암종, 담관암, 위암, 자궁내막암, 담낭암, 편평세포 암종 또는 기초세포 암종에서 때때로 과다발현된다. 통상적인 면역조직화학 (IHC) 또는 형광 계내 (in situ) 혼성화 (FISH) 분석이 Her-3 과다-발현을 검출하기 위해 사용되었다. 불행히도, IHC 및 FISH는 반드시 정확하지는 않고 또한 상이한 실험실 인력에 의해 상이하게 해석되는 경향이 있는 점에서, 진단 도구로서 특정 단점이 있다. Her-3의 수준을 정확하게 평가하기 위한 방법이 현재에는 없다. Her-3을 평가하기 위한 정량적 방법의 출현은 암 환자의 예후 및/또는 환자가 특정 치료에 반응할 것인지 여부를 정확하게 결정하는 능력을 촉진할 것이다 ([Mosesson et al., 2004, Semin. Cancer. Biol. 14:262-270] 참조).
발명의 개요
제1 측면에서, 본 발명은 샘플을 제공하고, 샘플 내에서 Her-3 및/또는 복합체 내의 Her-3의 존재 및/또는 양을 결정하는 것을 포함하는, 샘플 내에서 Her-3 및/또는 복합체 내의 Her-3의 존재 및/또는 양을 측정 및/또는 정량하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, Her-3의 양은 제1 역치를 초과하여, 샘플은 "다량 (high amount)"의 Her-3 (예를 들어, 총 Her-3 및/또는 Her-3 동종이량체 및/또는 Her-3 이종이량체)을 갖는 것으로서 계층화된다. 일부 실시양태에서, Her-3에 대한 제1 역치값은 0.158 이상의 총 Her-3 (H3T)이고, 낮은 Her-3 값은 상기 역치 미만이다. 또는, 환자 코호트 (cohort) 및/또는 모니터링되는 유의한 사건 (significant event)에 따라 다른 범위가 사용될 수 있다. 따라서, 따라서, 본원에 기재되는 각각의 역치값 및/또는 역치 범위는 로그 스케일에서 약 0.5 로그 단위 또는 그 미만 및/또는 선형 스케일에서 25% 또는 그 미만 (즉, 본원에 개시된 구체적인 범위보다 ≤ 25% 더 크고/크거나 ≤ 25% 더 작은), 또는 약 20% 또는 그 미만, 또는 약 15% 또는 그 미만, 또는 약 10% 또는 그 미만, 또는 약 5% 또는 그 미만으로 변할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 조직 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 신선 조직 샘플, 고정된 샘플, 동결된 샘플 또는 용해물이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 종양 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 동결된 종양 조직 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 신선 또는 동결된 종양 샘플로부터의 종양 용해물을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 FFPE 또는 가용화된 FFPE 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 유방암 샘플을 포함한다. 특정 실시양태에서, 유방암은 조기 (즉, 보조 (adjuvant)) 유방암 또는 전이성 유방암이다.
본원에서 개시되는 바와 같은 본 발명의 각각의 방법 및/또는 측면의 특정 실시양태에서, 방법은 샘플 내에서 다른 생체마커의 검출을 포함한다. 예를 들어, 다른 생체마커, 예를 들어 Her-2 및/또는 p95를 측정할 수 있다. 또는, 다른 생체마커는 FOXM1, PRAME, Bcl2, STK15, CEGP1, Ki-67, GSTM1, CA9, PR, BBC3, NME1, SURV, GATA3, TFRC, YB-1, DPYD, GSTM3, RPS6KB1, Src, Chk1, ID1, EstR1, p27, CCNB1, XIAP, Chk2, CDC25B, IGF1R, AK055699, P13KC2A, TGFB3, BAGI1, CYP3A4, EpCAM, VEGFC, pS2, hENT1, WISP1, HNF3A, NFKBp65, BRCA2, EGFR, TK1, VDR, Contig51037, pENT1, EPHX1, IF1A, CDH1, HIF1α, IGFBP3; CTSB, Her3 또는 DIABLO 중 적어도 하나일 수 있다. 특정 실시양태에서, 다른 생체마커는 VEGF, CD31, KDR, p95, 또는 Her-2일 수 있다.
본원에서 개시되는 바와 같은 본 발명의 각각의 방법 및/또는 측면의 특정 실시양태에서, 유방암에서 Her-2 발현의 수준은 높다. 특정 실시양태에서, 높은 Her-2 발현은 log10H2T ≥ 약 1.14 - 1.25이다. 특정 실시양태에서, 높은 Her-2 발현은 매우 높은 및/또는 비교적 높은 발현을 포함한다. 특정 실시양태에서, 매우 높은 Her-2 발현은 log10H2T ≥ 약 1.84 - 2.21이다. 본원에 개시된 각각의 방법의 특정 실시양태에서, 비교적 높은 발현은 1.14 - 1.25 내지 1.84 - 2.21이다 (즉, ≥ 1.14 - 1.25 내지 ≤ 1.84 - 2.21). 또는, 환자 코호트 및/또는 모니터링되는 유의한 사건에 따라 다른 범위가 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기재되는 각각의 역치값 및/또는 역치 범위는 로그 스케일에서 약 0.5 로그 단위 또는 그 미만 및/또는 선형 스케일에서 25% 또는 그 미만 (즉, 본원에 개시된 구체적인 범위보다 ≤ 25% 더 크고/크거나 ≤ 25% 더 작은), 또는 약 20% 또는 그 미만, 또는 약 15% 또는 그 미만, 또는 약 10% 또는 그 미만, 또는 약 5% 또는 그 미만으로 변할 수 있다.
또한, 본원에서 개시되는 바와 같은 본 발명의 각각의 방법 및/또는 측면의 특정 실시양태에서, p95의 수준은 높은 또는 낮은 것으로서 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, p95에 대한 제1 역치값은 90 이상의 총 p95 값 (선형 스케일에서)이고, 낮은 p95 값은 상기 역치 미만이다. 또는, 환자 코호트 및/또는 모니터링되는 유의한 사건에 따라 다른 범위가 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기재되는 각각의 역치값 및/또는 역치 범위는 로그 스케일에서 약 0.5 로그 단위 또는 그 미만 및/또는 선형 스케일에서 25% 또는 그 미만 (즉, 본원에 개시된 구체적인 범위보다 ≤ 25% 더 크고/크거나 ≤ 25% 더 작은), 또는 약 20% 또는 그 미만, 또는 약 15% 또는 그 미만, 또는 약 10% 또는 그 미만, 또는 약 5% 또는 그 미만으로 변할 수 있다.
특정 실시양태에서, Her-3의 수준이 높으면, 환자는 표적화된 요법제에 반응할 가능성이 더 작거나 반응할 가능성이 있지 않다. 특정 실시양태에서, Her-3의 수준이 낮으면, 환자가 표적화된 요법제에 반응할 가능성이 더 크다. 특정 실시양태에서, 요법제는 Her 작동제이다. 특정 실시양태에서, 요법제는 HER-2 작동제 또는 HER-3-표적화제 중 적어도 하나이다.
따라서, 본원에서 개시되는 본 발명의 각각의 방법 및 측면의 특정 실시양태에서, 방법은 대상체의 암으로부터의 생물학적 샘플 내에서 Her-2 및/또는 Her-2 동종이량체의 양을 측정하는 것을 포함하고, 여기서 Her-2 및/또는 Her-2 동종이량체의 양이 비교적 높고 Her-3 발현이 낮으면, 환자는 HER-2 작동제에 반응할 가능성이 있고/있거나 환자는 긴 시간 경과 (time course)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 방법은 대상체의 암으로부터의 생물학적 샘플 내에서 Her-2 및/또는 Her-2 동종이량체의 양을 측정하는 것을 포함하고, 여기서 Her-2 및/또는 Her-2 동종이량체의 양이 비교적 높고 Her-3 발현이 높으면, 환자는 HER-2 작동제에 반응할 가능성이 있지 않고/않거나 환자는 짧은 시간 경과를 갖는다.
추가로 및/또는 별법으로, 본원에서 개시되는 본 발명의 각각의 방법 및 측면의 특정 실시양태에서, 방법은 대상체의 암으로부터의 생물학적 샘플 내에서 p95의 양을 측정하는 것을 포함하고, 여기서 p95 및 Her-3 발현의 양은 낮으면, 환자는 치료상 활성제에 반응할 가능성이 있고/있거나 환자는 긴 시간 경과를 갖는다. 한 실시양태에서, 환자는 또한 높은 (또는 비교적 높은) 수준의 Her-2를 갖는다. 특정 실시양태에서, 방법은 대상체의 암으로부터의 생물학적 샘플 내에서 Her-2 및/또는 Her-2 동종이량체의 양을 측정하는 것을 포함하고, Her-2 및/또는 Her-2 동종이량체의 양이 많고/많거나 비교적 많고 Her-3 발현 및/또는 p95 발현이 높으면, 환자는 HER-2 작동제에 반응할 가능성이 있지 않고/않거나 환자는 짧은 시간 경과를 갖는다.
바람직한 실시양태에서, 샘플은 혈액, 혈장 또는 림프 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 혈액 또는 혈장 샘플은 순환 종양 세포를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 세포주를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 측정은 넓은 동적 범위 (dynamic range)에 걸쳐 정량적일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 방법은 샘플을 결합 화합물과 혼합하고, Her-3 및/또는 복합체 내의 Her-3에 결합된 결합 화합물의 존재 및/또는 양을 결정하는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 결합 화합물은 Her-3에 특이적으로 결합한다. 바람직한 실시양태에서, 결합 화합물은 항체를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 실시예 2에 제시되고 도 2a에 도시된 서열 1-8을 갖는 펩티드 중의 하나에 대해 생성된다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (a) 각각 서열 13, 14 및 15에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 각각 서열 16, 17 및 18에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체; 및/또는 (a) 각각 서열 19, 20 및 21에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 각각 서열 22, 23 및 24에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 표 1 (상세한 설명 참조)에 제시된 서열 9 및 11, 및/또는 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 표 1 (상세한 설명 참조)에 제시된 서열 10 및 12를 갖는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 방법은 (i) Her-3 및/또는 복합체 내의 Her-3을 함유할 수 있는 샘플; (ii) Her-3에 결합할 수 있는 근접 (proximity) 프로브 (상기 근접 프로브는 유효 근접성을 갖는다); 및 (iii) 적어도 하나의 결합 화합물 (상기 적어도 하나의 결합 화합물은 Her-3에 결합할 수 있고 부착된 하나 이상의 신호전달 분자를 갖는다)을 혼합하는 것을 포함하고, 여기서 유효 근접성 내에서 근접 프로브 및 결합 화합물의 결합은 Her-3 및/또는 복합체 내의 Her-3의 존재 및/또는 양과 상호관련 있는 분자 태그 (tag)로부터 신호를 생성한다. 바람직한 실시양태에서, 근접 프로브 및/또는 결합 화합물은 Her-3 또는 적어도 하나의 다른 분석물에 특이적으로 결합할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 근접 프로브 및/또는 결합 화합물은 항체를 추가로 포함하고, 각각의 항체는 Her-3 상의 특이적 에피토프에 결합할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 실시예 2에 제시되고 도 2a에 도시된 서열 1-8을 갖는 펩티드 중의 하나에 대해 생성된다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (a) 각각 서열 13, 14 및 15에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 각각 서열 16, 17 및 18에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체; 및/또는 (a) 각각 서열 19, 20 및 21에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 각각 서열 22, 23 및 24에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 표 1 (상세한 설명 참조)에 제시된 서열 9 및 11, 및/또는 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 표 1 (상세한 설명 참조)에 제시된 서열 10 및 12를 갖는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 조직 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 고정된 샘플, 동결된 샘플 또는 용해물이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 종양 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 동결된 종양 조직 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 종양 용해물을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 유방암 샘플을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 FFPE 샘플 또는 가용화된 FFPE 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 혈액, 혈장 또는 림프 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 혈액 또는 혈장 샘플은 순환 종양 세포를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 세포주를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 측정은 넓은 동적 범위에 걸쳐 정량적일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 넓은 동적 범위는 약 2 로그이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 넓은 동적 범위는 유방암 샘플에서 약 1-1.5 로그이다. 바람직한 실시양태에서, 방법은 Her-3 발현의 정량적 연속체 (continuum)를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 측정 또는 양은 잘 특성화된 세포주 모델 및 교차-검증 기술, 예를 들어 ELISA 및 유동 세포측정을 이용하는 정확도 연구에 의해 결정할 때 적어도 세포당 약 1,000개의 수용체 내지 세포당 약 200,000개의 수용체에 감수성이다. 바람직한 실시양태에서, 측정 또는 양은 적어도 세포당 약 5,000개의 수용체 내지 세포당 약 200,000개의 수용체에 감수성이다. 바람직한 실시양태에서, 측정 또는 양은 적어도 세포당 약 10,000개의 수용체 내지 세포당 약 200,000개의 수용체에 감수성이다. 바람직한 실시양태에서, 측정 또는 양은 적어도 세포당 약 25,000개의 수용체 내지 세포당 약 200,000개의 수용체에 감수성이다. 바람직한 실시양태에서, 측정은 이소형 대조군 항체 및 통상적인 IHC 방법을 사용한 비교를 이용하여 결정할 때 특이적이다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 근접 프로브는 항체 및 제1 핵산을 포함하고, 결합 화합물은 항체 및 제2 핵산을 포함하고, 여기서 제1 및 제2 핵산은 서로 상보성이고 혼성화할 수 있어서, 유효 근접성을 결정하고 혼성화를 통해 직접 또는 간접적으로 신호를 생성한다. 바람직한 실시양태에서, 근접 프로브 및/또는 결합 화합물은 Her-3에 특이적으로 결합할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 결합 화합물 및/또는 근접 프로브는 항체를 추가로 포함하고, 각각의 항체는 Her-3 상의 상이한 에피토프에 결합한다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 실시예 2에 제시되고 도 2a에 도시된 서열 1-8을 갖는 펩티드 중의 하나에 대해 생성된다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (a) 각각 서열 13, 14 및 15에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 각각 서열 16, 17 및 18에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체; 및/또는 (a) 각각 서열 19, 20 및 21에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 각각 서열 22, 23 및 24에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 표 1 (상세한 설명 참조)에 제시된 서열 9 및 11, 및/또는 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 표 1 (상세한 설명 참조)에 제시된 서열 10 및 12를 갖는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 조직 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 고정된 샘플, 동결된 샘플 또는 용해물이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 종양 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 동결된 종양 조직 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 종양 용해물을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 유방암 샘플을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 FFPE 샘플 또는 가용화된 FFPE 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 혈액, 혈장 또는 림프 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 혈액 또는 혈장 샘플은 순환 종양 세포를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 세포주를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 측정은 넓은 동적 범위에 걸쳐 정량적일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 넓은 동적 범위는 약 2 로그이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 넓은 동적 범위는 유방암 샘플에서 약 1-1.5 로그이다. 바람직한 실시양태에서, 방법은 Her-3 발현의 정량적 연속체를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 측정 또는 양은 잘 특성화된 세포주 모델 및 교차-검증 기술, 예를 들어 ELISA 및 유동 세포측정을 이용하는 정확도 연구에 의해 결정할 때 적어도 세포당 약 1,000개의 수용체 내지 세포당 약 200,000개의 수용체에 감수성이다. 바람직한 실시양태에서, 측정 또는 양은 적어도 세포당 약 5,000개의 수용체 내지 세포당 약 200,000개의 수용체에 감수성이다. 바람직한 실시양태에서, 측정 또는 양은 적어도 세포당 약 10,000개의 수용체 내지 세포당 약 200,000개의 수용체에 감수성이다. 바람직한 실시양태에서, 측정 또는 양은 적어도 세포당 약 25,000개의 수용체 내지 세포당 약 200,000개의 수용체에 감수성이다. 바람직한 실시양태에서, 측정은 이소형 대조군 항체 및 통상적인 IHC 방법을 사용한 비교를 이용하여 결정할 때 특이적이다.
바람직한 실시양태에서, 근접 프로브는 절단-유도 모이어티 (moiety)를 갖는 절단 프로브를 포함하고, 적어도 하나의 결합 화합물은 절단가능한 연결에 의해 결합 화합물에 부착된 하나 이상의 분자 태그를 갖고, 여기서 절단가능한 연결은 유효 근접성 내에서 절단될 수 있어서, Her-3의 존재 및/또는 양과 상호관련 있는 신호를 생성한다. 바람직한 실시양태에서, 절단 프로브 및/또는 결합 화합물은 Her-3에 특이적으로 결합할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 결합 화합물 및/또는 근접 프로브는 항체를 추가로 포함하고, 각각의 항체는 Her-3 상의 상이한 에피토프에 결합한다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 실시예 2에 제시되고 도 2a에 도시된 서열 1-8을 갖는 펩티드 중의 하나에 대해 생성된다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (a) 각각 서열 13, 14 및 15에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 각각 서열 16, 17 및 18에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체; 및/또는 (a) 각각 서열 19, 20 및 21에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 각각 서열 22, 23 및 24에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 표 1 (상세한 설명 참조)에 제시된 서열 9 및 11, 및/또는 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 표 1 (상세한 설명 참조)에 제시된 서열 10 및 12를 갖는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 조직 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 고정된 샘플, 동결된 샘플 또는 용해물이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 종양 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 동결된 종양 조직 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 종양 용해물을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 유방암 샘플을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 FFPE 샘플 또는 가용화된 FFPE 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 혈액, 혈장 또는 림프 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 혈액 또는 혈장 샘플은 순환 종양 세포를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 세포주를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 측정은 넓은 동적 범위에 걸쳐 정량적일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 넓은 동적 범위는 약 2 로그이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 넓은 동적 범위는 유방암 샘플에서 약 1-1.5 로그이다. 바람직한 실시양태에서, 방법은 Her-3 발현의 정량적 연속체를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 측정 또는 양은 잘 특성화된 세포주 모델 및 교차-검증 기술, 예를 들어 ELISA 및 유동 세포측정을 이용하는 정확도 연구에 의해 결정할 때 적어도 세포당 약 1,000개의 수용체 내지 세포당 약 200,000개의 수용체에 감수성이다. 바람직한 실시양태에서, 측정 또는 양은 적어도 세포당 약 5,000개의 수용체 내지 세포당 약 200,000개의 수용체에 감수성이다. 바람직한 실시양태에서, 측정 또는 양은 적어도 세포당 약 10,000개의 수용체 내지 세포당 약 200,000개의 수용체에 감수성이다. 바람직한 실시양태에서, 측정 또는 양은 적어도 세포당 약 25,000개의 수용체 내지 세포당 약 200,000개의 수용체에 감수성이다. 바람직한 실시양태에서, 측정은 이소형 대조군 항체 및 통상적인 IHC 방법을 사용한 비교를 이용하여 결정할 때 특이적이다.
제2 측면에서, 본 발명은 대상체의 암으로부터의 생물학적 샘플 내에서 Her-3의 양을 측정하는 것을 포함하는, 질병의 시간 경과를 예측하기 위해 및/또는 대상체의 암의 시간 경과에서 유의한 사건의 확률을 예측하기 위해 암이 있는 대상체가 표적화된 요법제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는지를 결정하는 방법에 관한 것이고, 여기서 방법은 Her-3의 수준에 의존적이다. 특정 실시양태에서, Her-3의 수준이 높으면, 환자는 표적화된 요법제에 반응할 가능성이 더 작거나 반응할 가능성이 있지 않다. 특정 실시양태에서, Her-3의 수준이 낮으면, 환자가 표적화된 요법제에 반응할 가능성이 더 크다. 특정 실시양태에서, 본원에서 보다 상세히 설명한 바와 같이, 요법제는 Her 작동제이다. 추가의 실시양태에서, 치료제는 HER-2 작동제 또는 HER-3-표적화제 중 적어도 하나이다. 특정 실시양태에서, Her-3의 양은 제1 역치를 초과하여, 샘플은 "다량"의 Her-3 (예를 들어, 총 Her-3 및/또는 Her-3 동종이량체 및/또는 Her-3 이종이량체)을 갖는 것으로서 계층화된다. 일부 실시양태에서, Her-3에 대한 제1 역치값이 0.158 이상의 총 Her-3 (H3T)이고, 낮은 Her-3 값은 상기 역치 미만이다. 또는, 환자 코호트 및/또는 모니터링되는 유의한 사건에 따라 다른 범위가 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기재되는 각각의 역치값 및/또는 역치 범위는 로그 스케일에서 약 0.5 로그 단위 또는 그 미만 및/또는 선형 스케일에서 25% 또는 그 미만 (즉, 본원에 개시된 구체적인 범위보다 ≤ 25% 더 크고/크거나 ≤ 25% 더 작은), 또는 약 20% 또는 그 미만, 또는 약 15% 또는 그 미만, 또는 약 10% 또는 그 미만, 또는 약 5% 또는 그 미만으로 변할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 대상체의 암은 유방암, 결장직장암, 난소암, 방광암, 전립선암, 비-소세포 폐암, 흑색종, 인두암, 췌장암, 식도암, 신경아교종, 담도 암종, 담관암, 위암, 자궁내막암, 담낭암, 편평세포 암종 또는 기초세포 암종이다. 바람직한 실시양태에서, 대상체의 암은 유방암, 흑색종, 활막 암종, 결장직장암 또는 난소암이다. 바람직한 실시양태에서, 대상체의 암은 Her-2 양성 유방암이다. 특정 실시양태에서, 유방암은 조기 (즉, 보조) 유방암 또는 전이성 유방암이다.
상기한 바와 같이, 특정 실시양태에서, 방법은 샘플 내에서 다른 생체마커의 검출을 포함한다. 예를 들어, 다른 생체마커, 예를 들어 Her-2 및/또는 p95를 측정할 수 있다. 또는, 다른 생체마커는 FOXM1, PRAME, Bcl2, STK15, CEGP1, Ki-67, GSTM1, CA9, PR, BBC3, NME1, SURV, GATA3, TFRC, YB-1, DPYD, GSTM3, RPS6KB1, Src, Chk1, ID1, EstR1, p27, CCNB1, XIAP, Chk2, CDC25B, IGF1R, AK055699, P13KC2A, TGFB3, BAGI1, CYP3A4, EpCAM, VEGFC, pS2, hENT1, WISP1, HNF3A, NFKBp65, BRCA2, EGFR, TK1, VDR, Contig51037, pENT1, EPHX1, IF1A, CDH1, HIF1α, IGFBP3; CTSB, Her3 또는 DIABLO 중 적어도 하나일 수 있다. 특정 실시양태에서, 다른 생체마커는 VEGF, CD31, KDR, p95, 또는 Her-2일 수 있다.
특정 실시양태에서, 유방암에서 Her-2 발현 수준은 높다. 특정 실시양태에서, 높은 Her-2 발현은 log10H2T ≥ 약 1.14 - 1.25이다. 특정 실시양태에서, 높은 Her-2 발현은 매우 높은 및/또는 비교적 높은 발현을 포함한다. 특정 실시양태에서, 매우 높은 Her-2 발현은 log10H2T ≥ 약 1.84 - 2.21이다. 본원에 개시된 각각의 방법의 특정 실시양태에서, 비교적 높은 발현은 1.14 - 1.25 내지 1.84 - 2.21이다 (즉, ≥ 1.14 - 1.25 내지 ≤ 1.84 - 2.21). 또는, 환자 코호트 및/또는 모니터링되는 유의한 사건에 따라 다른 범위가 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기재되는 각각의 역치값 및/또는 역치 범위는 로그 스케일에서 약 0.5 로그 단위 또는 그 미만 및/또는 선형 스케일에서 25% 또는 그 미만 (즉, 본원에 개시된 구체적인 범위보다 ≤ 25% 더 크고/크거나 ≤ 25% 더 작은), 또는 약 20% 또는 그 미만, 또는 약 15% 또는 그 미만, 또는 약 10% 또는 그 미만, 또는 약 5% 또는 그 미만으로 변할 수 있다.
또한, 특정 실시양태에서, p95의 수준은 높은 또는 낮은 것으로서 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, p95에 대한 제1 역치값은 90 초과 또는 90 이상의 총 p95 값 (선형 스케일에서)이고, 낮은 p95 값은 상기 역치 미만이다. 또는, 환자 코호트 및/또는 모니터링되는 유의한 사건에 따라 다른 범위가 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기재되는 각각의 역치값 및/또는 역치 범위는 약 25% 또는 그 미만 (즉, 본원에 개시된 구체적인 범위보다 ≤ 25% 더 크고/크거나 ≤ 25% 더 작은), 또는 약 20% 또는 그 미만, 또는 약 15% 또는 그 미만, 또는 약 10% 또는 그 미만, 또는 약 5% 또는 그 미만으로 변할 수 있다
특정 실시양태에서, Her-3의 수준이 높으면, 환자는 표적화된 요법제에 반응할 가능성이 더 작거나 반응할 가능성이 있지 않다. 특정 실시양태에서, Her-3의 수준이 낮으면, 환자는 표적화된 요법제에 반응할 가능성이 더 크다. 특정 실시양태에서, 요법제는 Her 작동제이다. 특정 실시양태에서, 요법제는 HER-2 작동제 또는 HER-3-표적화제 중 적어도 하나이다.
따라서, 특정 실시양태에서, 방법은 대상체의 암으로부터의 생물학적 샘플 내에서 Her-2 및/또는 Her-2 동종이량체의 양을 측정하는 것을 포함하고, 여기서 Her-2 및/또는 Her-2 동종이량체의 양이 비교적 높고 Her-3 발현이 낮으면, 환자는 HER-2 작동제에 반응할 가능성이 있고/있거나 환자는 긴 시간 경과를 갖는다. 특정 실시양태에서, 방법은 대상체의 암으로부터의 생물학적 샘플 내에서 Her-2 및/또는 Her-2 동종이량체의 양을 측정하는 것을 포함하고, 여기서 Her-2 및/또는 Her-2 동종이량체의 양이 비교적 높고 Her-3 발현이 높으면, 환자는 HER-2 작동제에 반응할 가능성이 있지 않고/않거나 환자는 짧은 시간 경과를 갖는다.
추가로 및/또는 별법으로, 특정 실시양태에서, 방법은 대상체의 암으로부터의 생물학적 샘플 내에서 p95의 양을 측정하는 것을 포함하고, 여기서 p95 및 Her-3 발현의 양이 낮으면, 환자는 치료상 활성제에 반응할 가능성이 있고/있거나 환자는 긴 시간 경과를 갖는다. 한 실시양태에서, 환자는 또한 높은 (또는 비교적 높은) 수준의 Her-2를 갖는다. 특정 실시양태에서, 방법은 대상체의 암으로부터의 생물학적 샘플 내에서 Her-2 및/또는 Her-2 동종이량체의 양을 측정하는 것을 포함하고, 여기서 Her-2 및/또는 Her-2 동종이량체의 양이 많고/많거나 비교적 많고 Her-3 발현 및/또는 p95 발현이 높으면, 환자는 HER-2 작동제에 반응할 가능성이 있지 않고/않거나 환자는 짧은 시간 경과를 갖는다.
바람직한 실시양태에서, 표적화된 요법제는 적어도 하나의 Her 패밀리-표적화제이다. 바람직한 실시양태에서, Her 패밀리-표적화제는 다중- 또는 단일-표적화제이다. 바람직한 실시양태에서, 다중-표적화제는 이중 키나제 억제제 또는 이중특이적 항체이다. 바람직한 실시양태에서, Her 패밀리-표적화제는 트라스투주맙, 라파티닙 또는 페르투주맙이다. 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 Her 패밀리-표적화제는 적어도 2가지 물질이고, 여기서 적어도 2가지 물질은 하나 이상의 Her-2-표적화 모노클로날 항체 및/또는 EGFR-표적화 모노클로날 항체, 및/또는 EGFR 및 Her-2 이중 키나제 억제제이다. 바람직한 실시양태에서, 모노클로날 항체는 트라스투주맙이다. 바람직한 실시양태에서, EGFR-표적화 모노클로날 항체는 세툭시맙 또는 파니투무맙이다. 바람직한 실시양태에서, 이중 키나제 억제제는 라파티닙, 에를로니팁 또는 게피티닙이다. 바람직한 실시양태에서, 표적화된 요법제는 Her-3 또는 Her-3 신호전달 경로 작용제이다. 바람직한 실시양태에서, Her-3 또는 Her-3 신호전달 경로 표적화제는 Her-3 모노클로날 항체, Her-3 이량체화 억제제, Her-3 인산화 억제제, 및/또는 PI3K, Akt, mTOR 및 ERK1/2로 이루어지는 군 중에서 선택되는 Her-3 신호전달 경로 구성원의 억제제이다. 바람직한 실시양태에서, 반응할 가능성, 긴 시간 경과를 가질 가능성 및/또는 유의한 사건을 가질 가능성은 전체 생존율으로서, 질병 진행까지의 시간으로서, 무병 생존으로서, 무진행 생존으로서, 및/또는 RECIST 기준을 이용한 객관적인 종양 반응으로서 측정된다.
바람직한 실시양태에서, 암이 Her-2 양성인지 여부는 IHC, FISH, CISH, 정량적 mRNA, 혼성화 어레이, 또는 베라태그 (VERATAG)®에 의해 결정한다. 바람직한 실시양태에서, Her-3의 수준 결정은 IHC, FISH, CISH, 정량적 mRNA, 혼성화 어레이, 또는 베라태그®을 이용하여 수행한다.
바람직한 실시양태에서, 방법은 대상체가 본 발명의 방법에 따른 치료에 반응할 가능성이 있지 않은 Her-2 양성 암에 걸렸는지 결정한 후, 의료 전문인에게 대상체에게 유효량의 상이한 치료제를 투여하는 치료 선택사항을 조언하는 것을 추가로 포함한다.
제3 측면에서, 본 발명은 Her-3에 결합하는 정제된 항체에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 실시예 2에 제시되고 도 2a에 도시된 서열 1-8을 갖는 펩티드 중의 하나에 대해 생성된다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (a) 각각 서열 13, 14 및 15에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 각각 서열 16, 17 및 18에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체; 및/또는 (a) 각각 서열 19, 20 및 21에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 각각 서열 22, 23 및 24에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 표 1 (상세한 설명 참조)에 제시된 서열 9 및 11을 갖는 아미노산 서열, 및/또는 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 표 1 (상세한 설명 참조)에 제시된 서열 10 및 12를 갖는 아미노산 서열을 갖는 항체이다.
도 1은 HER3 발현 벡터로 형질감염된 HEK 293 (인간 배아 신장 세포)의 몇몇 안정적으로-형질감염된 클론에서 Her-3 ELISA 키트 (R&D 시스템즈, 인크. (R&D Systems, Inc.))에 의해 결정할 때 Her-3의 발현 수준을 보여준다. 발현 벡터의 제작은 실시예 1에 설명되어 있다. 하나의 클론, 293H3-클론 1은 높은 수준의 HER3을 발현하였고, 최적화된 HER3 베라태그® 분석에서 사용하기 위한 대조군으로서 선택하였다.
도 2a는 Her-3-특이적 항체를 생성하기 위해 마우스의 면역화를 위해 사용된 펩티드 서열을 나열한 것이고, 여기서 서열 1은
Figure pct00001
이고; 서열 2는
Figure pct00002
이고; 서열 3은
Figure pct00003
이고; 서열 4는
Figure pct00004
이고; 서열 5는
Figure pct00005
이고; 서열 6은
Figure pct00006
이고; 서열 7은
Figure pct00007
이고; 서열 8은
Figure pct00008
이다. 펩티드 서열은 Her-3의 C-말단 영역으로부터 상이한 에피토프를 나타낸다 (각각의 펩티드의 길이 및 단백질의 N-말단에 대한 위치가 도시된다). 각각의 펩티드에 대해 생성된 항체를 네 번째 컬럼에 나열한다. 각각의 항체는 ELISA, IHC, 및 베라태그® 분석에서 양성으로 시험되는 것이 확인되었다. 도 2b는 IHC 연구의 결과를 보여주고, 여기서 2가지 세포주를 B9A11 (Her-3 펩티드 중의 하나에 대해 생성된 Her-3-특이적 항체), Her-2-특이적 항체 Ab8 (HerceptTest™), 및 대조군 항체 ITC-IgG2a를 사용하여 스크리닝하였다. 하나의 세포주, SKOV3 (상부 패널)은 높은 수준의 HER2 및 낮은 수준의 HER3을 발현하는 것으로 공지되어 있다. 다른 세포주 293H3-클론 1 (하부 패널)은 낮은 수준의 HER2를 발현하지만 HER3을 과다발현하는 것으로 실시예 1에서 설명되고 도 1에 제시된 안정적으로 형질감염된 세포주이다. IHC 결과는 예상되는 바와 같이 293H3-클론 1 세포를 사용할 때 B9A11의 강한 신호를 보여주지만, SKOV3 세포를 사용할 때는 그렇지 않았다.
도 3은 3가지 다른 분석 (IHC, ELISA, 및 유동 세포측정)으로부터의 데이타와 교차-검정된, 4가지 상이한 세포주로부터의 FFPE 블록에서 베라태그®에 의해 결정할 때 HER3 수준을 보여준다. 이들 연구를 위해 상이한 수준의 HER3을 발현하는 세포주를 선택하였다: 293H3-클론 1, MDA-MB-453, MDAMB-468 및 SKOV3 (마지막 3개는 ATCC로부터 입수함). 세포주는 2 로그보다 더 크게 걸쳐있는 HER3 수용체 수준을 나타내도록 선택되었다. HER3 베라태그® 분석 및 IHC를 사용하는 시험을 위해 실시예 3에 설명된 바와 같이 FFPE 블록을 제조하였다. 동일한 로트 (lot)로부터의 세포 일부를 유동 세포측정을 이용하여 HER3 수용체 수에 대해 시험하였다. 추가로, ELISA 키트 (Human ErbB3-DuoSet ELISA: R&D 시스템즈, 인크.)를 사용하여 HER3을 정량하기 위해 동일한 세포의 로트로부터 전체 세포 용해물을 제조하였다. 데이타는 베라태그® 분석에 대한 넓은 동적 범위를 보여주고, 결과는 모든 3개의 다른 방법과 일치한다.
도 4는 환자 종양 샘플의 예를 보여주고, 여기서 공인 (Board-certified) 병리학자가 종양 영역에 원을 그렸다.
도 5는 사용된 장비 및 HER3 베라태그® 분석의 흐름도를 보여준다. FFPE 샘플을 먼저 파라핀 제거하고 일련의 용매를 사용하여 재수화시킨다 (상단 패널 1). 항원 회복 (retrieval)은 압력솥 내에서 1x DAKO (랩 비젼 (Lab Vision))을 사용하여 달성한다 (상단 패널 2). 이어서, 샘플을 물로 세정하고, 소수성 펜을 사용하여 샘플 주위에 원을 그려, 슬라이드 상에 시약을 보유시킨다. 이어서, 샘플을 차단하고 베라태그®-접합된 Ab-6 (랩 비젼) 및 비오틴-접합된 B9A11 (상단 패널 3)의 혼합물로 처리한다. 인큐베이션 및 세척 후에, 스트렙타비딘-접합된 메틸렌 블루 시약을 첨가하고 인큐베이팅하고 세척한 후, 플루오레세인 및 2개의 모세관 전기영동 내부 마커 (MF 및 ML, 각각 제1 및 마지막 마커)를 함유하는 조명 (illumination) 버퍼를 첨가한다. 결합된 베라태그®는 LED 어레이를 이용하여 방출시키고, 이는 베라태그®의 절단을 광활성화시킨다 (상단 패널 4). 베라태그® 중간체는 수소화붕소나트륨을 이용하여 정량가능한 형태로 환원시키고, 베라태그® 리포터는 모세관 전기영동 (ABB130 CE 기기, 상단 패널 5)을 이용하여 분리하고 검출한다.
도 6은 베라태그® 분석의 동적 범위를 최대화하기 위한 최적 항체 농도를 확인하기 위해 설계된 실험의 결과를 보여준다. 분석의 전체 동적 범위에 걸쳐있는 세포주를 선택하였다: 293H3-클론 1, MDA-MB-453, MDA-MB-468, MDA-MB-231 및 SKOV3. 항체 B9A11-비오틴 및 Ab-6 Pro-11의 농도는 다음과 같이 변하였다 (표의 컬럼 1): 4열, 5열 및 6열에서 각각 1 mg/mL B9A11-비오틴 및 1 mg/mL Ab-6 Pro-11, 1 mg/mL B9A11-비오틴 및 2 mg/mL Ab-6 Pro-11, 및 2 mg/mL B9A11-비오틴 및 1 mg/mL Ab-6 Pro-11. 각각의 세포주에 대한 결과를 막대 그래프에 제시한다. 쌍별 (pairwise) 비교를 위한 예상된 배수 변화는 동일한 세포주 FFPE 블록 제제로부터 HER3 유동세포분석 및 ELISA 결과에 기초하였다. 표의 2열에 제시된 예상된 배수 변화에 비해, HER3의 정확한 검출에 기초한 최상의 수행을 위해 2 mg/mL B9A11-비오틴 및 1 mg/mL Ab-6 Pro-11의 최적 농도를 선택하였다 (원을 그림). 여기서 제시된 동적 범위는 약 2 로그이다.
도 7은 4가지 잘 특성화된 세포주 (293H3-클론 1, MDA-MB-453, MDA-MB-468 및 SKOV3)로부터 3개의 성공적인 복제물을 사용하는 HER3 베라태그® 분석의 정확성을 보여준다. 베라태그® 측정을 사내 (in-house) 생성된 유동 세포측정 및 ELISA 데이타와 비교하였다. 결과의 100%가 293H3-클론 1 > MDA-MB-453 > MDA-MB-468 > SKOV3인 점에서 유동 세포측정 및 ELISA로부터의 사내 데이타와 일치하였다. 임의의 4개의 세포주 샘플에 대한 신호 수준들 사이에서 오버랩 (overlap)은 관찰되지 않았다.
도 8은 HER3 베라태그® 분석의 민감도를 나타낸다. 민감도를 결정하기 위해, 낮은 HER3 발현 대조군 세포주, MDA-MB-468의 8개의 복제물을 함유하는 하나의 배치 (batch)를 낮은/음성 FfER3 발현 대조군 세포주, SKOV3의 8개의 복제물과 비교하였다. MDA-MB-468 및 SKOV3 사이의 모든 쌍별 비교 (64/64)에서 MDA-MB-468이 SKOV3보다 더 높은 수준의 HER3을 갖는 것으로 밝혀졌다.
도 9는 HER3 베라태그® 분석의 분석간 재현성을 보여준다. 8개의 별개의 총 HER3 베라태그® 분석을 상이한 CE 일루미네이터 (illuminator), 몇몇 오퍼레이터 (operator)를 사용하여 4주 기간에 걸쳐 상이한 날에 4개의 잘 특성화된 세포주인 293H3-클론 1, MDA-MB-453, MDA-MB-468 및 SKOV3에 대해 수행하였다. 배치 표준화 절차에 이어, 재현성을 확인하기 위해 데이타를 8개의 배치에 걸쳐 비교하였다. 동적 범위 전체에서 변동 계수는 8 내지 15%이었다. 값을 Log10 normRPA (이는 표준화된 상대 피크 면적/종양 영역의 로그임)로서 나타낸 후, 배치를 예상된 값을 이용하여 표준화하였다.
도 10은 HER3 베라태그® 분석의 정밀도를 보여준다. HER3 베라태그® 분석의 분석내 재현성은 각각의 3개의 대조군 세포주, 293H3-클론 1, MDA-MB-453 및 MDA-MB468의 15개의 복제물의 수행을 비교함으로써 입증하였다. 정밀도를 결정하기 위해, 각각의 배치에서 15개의 복제물의 쌍별 비교를 수행하였다. 293H3-클론 1 데이타의 95%가 1.2배 내에 있고, MDA-MB-468 데이타의 95%가 1.37배 내에 있었다. 각각의 세포주의 15개의 복제물에 대한 베라태그® 데이타 (표준화된 RPA로 제시됨)를 각각의 패널의 우측에 15개의 막대에 의해 제시한다. 중등도 내지 높은 수준의 HER3을 발현하는 3개의 세포주 및 낮은/음성 HER3을 발현하는 세포주, SKOV3에 대한 대조군 데이타를 각각의 패널의 좌측에 제시한다.
도 11은 상이한 샘플 크기를 사용하여 HER3 베라태그® 분석의 선형성을 보여준다. 각각의 3개의 잘 특성화된 세포주인 293H3-클론 1, MDA-MB-453 및 MDA-MB-468로부터 감소하는 크기 (1x, 1/2x, 1/4x, 1/16x)의 샘플을 베라태그® 분석으로 시험하고, 분석의 선형성을 평가하기 위해 데이타를 쌍별 방식으로 비교하였다. MDA-MB-453 세포주는 낮은 쪽으로 원래의 샘플 크기의 약 1/16번째까지 선형성을 보여주고; MDA-MB-468은 낮은 쪽으로 원래의 샘플 크기의 약 1/2번째까지 선형성을 보여준다.
도 12는 이소형 대조군에 의해 결정할 때 HER3 베라태그® 분석의 특이성을 보여준다. 분석의 비-특이적 배경을 확인하기 위해, 이소형 대조군 항체를 베라태그® 분석 포맷으로 시험하였다. HER3 Ab-6-Pro11 항체에 대해, 이소형 대조군은 IgG1-Pro11이었다. HER3 B9A11-비오틴 항체에 대해, 이소형 대조군은 IgG1-비오틴이었다. 이들 이소형 대조군을 사용하여 유래된 신호는 항원-특이적이지 않고, 따라서 비-특이적 배경을 나타낸다. 각각의 패널에서, HER3 Ab6-Pro11 및 B9A11-비오틴 항체를 사용하는 정상 분석 포맷에 대한 베라태그® 결과를 "대조군"으로 표지한 막대에 제시한다. 좌측 패널에서, HER3 Ab6-Pro11 및 IgG1-비오틴 항체에 대한 베라태그® 데이타를 "IgG-bio"로 표지한 막대에 제시한다. 우측 패널에서, HER3 B9A11-비오틴 및 IgG1-Pro11 항체에 대한 베라태그® 데이타를 "IgG-Pro11"로 표지한 막대에 제시한다. 각각의 항체 페어링 (pairing)을 표준 세포주 대조군 (293H3-클론 1, MDA-MB-453, MDA-MB468, SKOV3 및 T47D) 및 몇몇 종양 샘플 (41776B1, 32712A2, 30345C2, 106305A2, 및 106341A2)을 포함한 FFPE 샘플의 어레이에 대해 시험하였다. 단위는 표준화된 RPA*IB/TA이다.
도 13은 국제 혈청 Her-2/neu 연구군 (International Serum Her-2/neu Study Group) 시험으로부터의 종양 샘플에 대한 베라태그® 데이타를 보여준다. 상기 코호트의 환자 (n=105)를 1999년에서 2006년 사이에 트라스투주맙 치료 동안 전향적으로 관찰하였다. 모든 환자는 IHC 또는 FISH에 의해 Her-2 양성인 것으로 결정되었고, 연구에 앞서 트라스투주맙에 노출되지 않았다. 샘플을 8개의 별개의 배치에서 HER3 베라태그® 분석을 이용하여 HER3 수준에 대해 평가하였다. 결과를 본 도면에서 8개의 패널에 제시한다. 각각의 패널은 또한 5개의 대조군 세포주: 293H3-클론 1, MDA-MB-453, MDA-MB-468, SKOV3 및 T47D (각각의 패널의 좌측에 제시됨)에 대한 결과를 또한 포함한다. 결과를 log10 표준화된 RPA 단위로 제시한다.
도 14는 트라스투주맙 (즉, 헤르셉틴) 반응에 대한 최적의 컷오프 (cut-off)를 결정하기 위해 사용된 위치 (positional) 스캐닝 분석으로부터 데이타를 보여준다. 좌측 패널에서, 통계상 유의한 컷오프 (화살표 참조) 위의 환자는 컷오프 아래의 환자에 비해 불리한 질병 진행까지의 시간 (TTP)을 가졌다 (위험비 (hazard ratio) = 2.3; p = 0.0004). 우측 패널에서, 유의한 컷오프는 결정될 수 없었지만, TTP에 대해 발견된 컷오프를 사용하여, 컷오프 (화살표로 나타냄) 위의 환자에서 악화된 전체 생존 (OS)에 대한 경향이 관찰되었다 (위험비 =1.7; p = 0.059).
도 15는 먼저 총 HER2 수준 (H2T)에 의해 계층화되고 이어서 총 HER3 수준 (H3T)에 의해 추가로 계층화된 82명의 트라스투주맙-치료된 환자의 코호트에 대한 카플란-마이어 (Kaplan-Meier) 플롯을 보여준다. 상부 좌측 패널에서, 카플란-마이어 플롯은 HER2-정상 및 HER-2 과다발현군으로 세분한 (앞서 보고된 컷오프에 기초하여) 2군의 환자에 대해 무진행 생존 (개월)을 갖는 환자의 백분율을 보여준다. 이어서, HER2 과다발현군을 도 14에 제시된 컷오프를 이용하여, HER3의 수준에 기초하여 2개의 하위군으로 추가로 세분하였다. 이들 2개의 하위군의 카플란-마이어 플롯을 상부 우측 패널에 제시한다. 하부 패널은 상부 패널로부터의 결과의 3개 세트를 보여준다: 정상 HER2군 (log(H2T) < 1.14), HER2-높은, HER3-낮은 군 (log(H2T) > 1.14, H3T < O.158) 및 HER2-높은, HER3-높은 군 (log(H2T) > 1.14, H3T > 0.158). HER3-과다발현 하위군을 검사하는 단변량 Cox 비례 위험 분석으로 H3T (높은 대 낮은)을 질병 진행까지의 시간의 가장 유의한 예측인자로서 확인하였다 (TTP; HR = 2.98, p = 0.0004).
도 16은 활막 암종, 결장암 및 난소암에서 HER3 베라태그® 분석의 결과를 보여준다. 상부 패널은 활막 암종 샘플의 패널에 대한 결과를 보여준다. 좌측 상의 4개의 막대는 대조군 샘플이다 (각각 좌측에서 우측으로 293H3-클론 13, MDA-MB-453, MDAMB-468 및 SKOV3). 중앙 패널은 결장암 샘플의 패널에 대한 결과를 보여준다. 동일한 대조군 세포주를 사용한다 (좌측의 4개의 막대로 제시함). 하부 패널은 난소 종양 샘플의 패널에서 HER2 발현을 HER3 발현에 비교한 결과를 보여준다. 결과를 표준화된 RPA 단위로 제시한다. 이들 종양 샘플의 동적 범위는 암에 따라 0.5 - 1.5이다.
도 17은 높은 HER2 (H2T)군 (log10H2T > 1.25 또는 선형 스케일에서 > 13.8)에서, 환자를 높은 또는 낮은 p95 (p95 >90 또는 <=90) 및 높은 또는 낮은 HER3 (H3T)에 기초하여 상이한 군으로 세분하는 능력은 중앙 (median) TTP에 의해 측정될 때 임상 성과의 추가의 계층화를 허용함을 보여준다. p95 및 H3T 하위군을 조합한 단변량 KM 분석은 본 도면의 KM 플롯에 결과를 제공한다. 이들 데이타는 HERmark/베라태그® (즉, 높은 H2T, 즉, log10H2T > 1.25 또는 선형 스케일에서 >13.8)에 의해 평가될 때 HER2-양성 유방암 환자가 트라스투주맙 치료 이후 상이한 성과를 갖는 적어도 4개의 하위군으로 분류될 수 있음을 제안한다. KM에서, 낮은 H3T (HER3 분석의 세대 1에서, H3T<0.158) 및 낮은 p95 (p95<90)을 갖는 군은 중앙 TTP가 15.0개월인 것에 비해, 낮은 H3T (H3T<0.158) 및 높은 p95 (p95>90)를 갖는 군에 대해 9.3개월이고; 높은 H3T 군 (HER3 분석의 세대 1에서 H3T>0.158) 및 낮은 p95군에 대해 6.4개월이고, 높은 H3T (H3T>0.158) 및 높은 p95 (p95>90)에 비해 3.2개월이다. 군들 사이의 차이에 대한 경향은 유의하다 (p<0.0001).
도 18은 총 HER2 (H2T 높은 또는 낮은), p95HER2 (p95 높은 또는 낮은), 및 총 HER3 (H3T) 높은 (H3T>0.158, H3T 분석의 세대 1에서) 또는 H3T 낮은 (H3T<=0.158, 분석의 세대 1에서)의 조합된 베라태그® 측정치에 의해 규정될 때, 립톤 (Lipton) 코호트로부터 다양한 하위군의 y축 상의 % 무진행을 x축 상의 시간 (질병 진행까지의 시간, TTP)에 비교하는 카플란-마이어 (KM) 분석을 보여준다. 컷오프는 위치 스캐닝 분석에서 최저 p-값에 의해 확인되었다. H2T 높은 = (log10H2T > 1.25 또는 선형 스케일에서 > 13.8). 낮은 H2T = log10H2T <= 1.25 또는 선형 스케일에서 <= 13.8. p95 낮은 = p95 <= 90 및 p95 높은 = p95 > 90 (선형 스케일에서), 및 H3Thi > 0.158 (선형 스케일에서), 및 H3Tlo <= 0.158 (선형 스케일에서). KM 분석은 FISH 양성, H2T 높은, p95lo (낮은) 및 H3Tlo (낮은)인 환자는 중앙 TTP가 14.7개월인 것이 비해, 4개의 다른 군들은 그만큼 좋지 않았음을 입증하였다. 거의 겹치는 선을 가진 3개의 군 (즉, FISH음성/H2Tlo군 - 중앙 TTP = 4.5, FISH 양성/H2Tlo(낮은)군 - 중앙 TTP = 3.7, 및 FISH양성/H2Thi(높은)/p95hi(높은)/H3Thi(높은) - 중앙 TTP = 3.2)은 모두 중앙 TTP가 FISH양성/H2T높은/p95lo/H3Tlo (중앙 TTP = 15)군보다 더 짧았다. FISH양성/H2Thi(높은)/및 p95 또는 H3T높은으로서 규정된 군은 중앙 TTP = 9.3이고, 이것은 최상의 중앙 TTP를 갖는 군 (FISH양성/H2T높은/p95lo/H3Tlo) 및 적색/청색 및 흑색의 3개의 군 사이의 값이었다. 따라서, HERmark 분석으로 트라스투주맙-기반 요법에 대해 TTP에 의해 측정될 때 가변적인 임상 성과를 갖는 HER2 양성 환자의 다수의 하위군을 확인하였다. HER2 과다-발현의 진도 또는 이들 하위군에 대한 성과는 FISH/CEP 17 카피수에 의해 예측가능하지 않았다. 높은 p95 및/또는 높은 H3T를 갖는 HER2 FISH 양성 MBC 환자는 트라스투주맙에 대한 드 노보 (de novo) 내성을 갖는 환자의 하위세트를 나타낼 수 있다. 임의의 특정 기계적인 이론에 한정되기를 바라지 않지만, 이들 하위군에서 관찰된 트라스투주맙에 대한 불량한 반응을 설명할 수 있는 가능한 메카니즘은 불충분한 트라스투주맙 및/또는 트라스투주맙 결합 표적 (즉, p95)의 결핍, 및 트라스투주맙에 의해 완전히 억제되지 않는 이종이량체의 형성을 통한 증가된 신호전달을 포함할 수 있다.
발명의 상세한 설명
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "실시양태" 및 "측면"은 상호교환가능하게 사용된다.
"항체"는 또 다른 분자의 특정 공간적 및 극성 구조에 결합하고 따라서 이에 상보적인 것으로 규정되는 면역글로불린을 의미한다. 항체는 모노클로날, 폴리클로날 또는 재조합 항체일 수 있고, 당업계에 잘 알려진 기술, 예를 들어 숙주의 면역화 및 혈청의 수집 (폴리클로날) 또는 연속적인 하이브리드 세포주의 제조 및 분비된 단백질의 수집 (모노클로날) 또는 뉴클레오티드 서열 또는 적어도 결합에 필요한 아미노산 서열을 코딩하는 그의 돌연연이 형태의 코딩 및 발현에 의해 제조될 수 있다. 항체는 완전한 면역글로불린 또는 그의 단편을 포함할 수 있고, 면역글로불린은 다양한 클래스 및 이소형, 예를 들어 IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3, IgM 등을 포함할 수 있다. 그의 단편은 Fab, Fv 및 F(ab')2, Fab' 등을 포함할 수 있다. 또한, 항체는 단일쇄 항체, 키메라 (chimeric) 항체, 인간화 항체 또는 특정 결합 부위에 특이적인 결합 활성을 보유하는, 당업자에게 공지된 임의의 다른 항체 유도체일 수 있다. 또한, 특정 결합 부위에 대한 결합 친화도가 유지된다면, 면역글로불린 또는 그의 단편의 응집체, 중합체 및 접합체가 적절한 경우에 사용될 수 있다. 방출가능한 분자 태그 (아래에서 설명됨)를 사용하는 상기 면역 분석을 포함하여 면역분석에 사용하기 위한 항체 및 항체 유도체의 생산 및 선택에 대한 지침은 쉽게 이용가능한 교재 및 매뉴얼, 예를 들어 문헌 ([Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]; [Howard and Bethell, 2001, Basic Methods in Antibody Production and Characterization, CRC Press]; [Wild, ed., 1994, The Immunoassay Handbook, Stockton Press, New York])에서 볼 수 있다.
"결합 화합물"은 또 다른 관심있는 분자에 결합할 수 있는 분자를 의미한다. 결합 화합물은 항체, 펩티드, 세포 표면 수용체에 대한 펩티드 또는 비-펩티드 리간드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 펩티드 핵산, 렉틴 또는 표적 분자 또는 복합체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 다른 분자 엔티티 (entity)일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 표적 분자는 단백질 또는 단백질 복합체이다. 또 다른 실시양태에서, 결합 화합물은 근접 프로브를 추가로 포함한다. 하나의 실시양태에서, 결합 화합물은 결합 모이어티에 부착된 하나 이상의 분자 태그를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제2 결합 화합물이 결합 화합물에 결합되고, 표적 단백질에 결합된 결합 화합물의 존재에 대한 상관물로서 측정 또는 정량될 수 있다. 또 다른 구체적인 예로서, 제1 또는 제2 결합 화합물은 유효 근접성을 갖는 근접 프로브와 함께 작용하여 표적 단백질의 존재와 상호관련 있는 신호를 생성하는 효과기 분자를 생성할 수 있다. 추가로, 또 다른 실시양태에서, 결합 화합물은 유효 근접성 내에서 서로 작용하여 신호를 생성하는 복합체를 형성하는 분자 태그를 가질 수 있거나 또는 표적 단백질의 존재와 상호관련 있는 방식으로 검출되고 측정될 수 있다. 보다 구체적으로, 표적 단백질 또는 복합체는 Her-3 또는 복합체 내의 Her-3일 수 있다.
"결합 모이어티"는 분자 태그가 그에 대해 직접 또는 간접적으로 부착된, 분석물에 결합할 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 결합 모이어티는 분자량이 약 1000 달톤 이하이고 수소, 탄소, 산소, 질소, 황 및 인으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 원자를 함유하는 항체, 펩티드, 단백질, 핵산 및 유기 분자를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 결합 모이어티는 항체이다.
"세포주"는 그의 본래의 조직으로부터 분리되고, 클론 방식으로 증식하고/하거나 배양액에 유지된 세포를 의미한다. 구체적인 예로서, 세포주는 각각의 종류의 암으로부터 유래될 수 있고, 다수의 상이한 세포주는 동일한 종류의 암의 샘플로부터 유래될 수 있다. 상이한 종류의 세포주의 예는 유방암 세포주, 예를 들어 MCF-7, MDA-MB-453, MDA-MB-468, 또는 T-47D 또는 다른 조직으로부터 유래된 세포주, 예를 들어 SKOV3 또는 HEK293을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
"화학요법제"는 상태, 특히 암 치료에 사용되는 화학 물질을 의미한다.
"절단가능한 연결"은 본원에서 사용되는 바와 같이, 절단가능한 연결을 이용하여 결합 모이어티에 연결된 검출가능한 분자 태그를 방출시키기 위해 절단될 수 있는 화학적 연결기를 의미한다.
"절단-유도 모이어티", 또는 "절단제"는 본원에서 사용되는 바와 같이 절단가능한 연결을 절단할 수 있는 활성종을 생산하는 기이다. 바람직하게는, 활성종은 그의 절단-유도 효과가 단지 그의 생성 부위의 근접이 되도록 수명이 짧은 활성을 보이는 화학물질종이다.
"절단 프로브"는 본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에서 규정되는 바와 같은 절단-유도 모이어티, 및 결합 화합물, 예를 들어 항체, 펩티드, 세포 표면 수용체에 대한 펩티드 또는 비-펩티드 리간드, 단백질, 예를 들어 스트렙타비딘, 소분자, 예를 들어 비오틴, 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 펩티드 핵산, 렉틴 또는 표적 단백질 또는 분자 또는 안정한 분자 복합체에 결합할 수 있는 임의의 다른 분자 엔티티를 포함하는 시약을 의미한다.
"이중 키나제 억제제"는 하나 초과의 키나제를 억제하는 분자, 예를 들어 EGFR 및 Her-2 키나제 활성 모두의 억제제 (이로 제한되지 않음), 예를 들어 라파티닙을 의미한다.
"유효 근접성"은 본원에서 사용될 때, 표적 분자의 존재를 나타내는 검출가능한 신호를 생성하기에 충분한, 2개의 결합 화합물 사이의 거리를 설명한다. 예를 들어, 유효 근접성 내에서 Her-3 상에 (또는 관심있는 또 다른 분석물과) 결합된 근접 프로브 및 결합 화합물은 Her-3 및/또는 Her-3 복합체의 존재를 나타내고/내거나 정량하는, 검출가능한 신호를 생성할 것이다. 바람직하게는, 많은 검출 시스템에 대한 유효 근접성 범위는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 50 nM 미만이다.
"EGFR", "ErbB1", "erbB-1", "HER1", "her-1", "Her-1" 등은 예를 들어 문헌 [Ono and Kuwano (2006) Cuin. Cancer Res. 12:7242-7251] 및 Genbank 기탁 번호 P00533에 기재된 바와 같은 상피 성장 인자 수용체 및 그의 대립유전자 변이체를 의미한다. 달리 지시하지 않으면, 용어 "EGFR", "ErbB1", "erbB-1", "HER1", "her-1", "Her-1"은 본원에서 사용될 때 인간 단백질을 의미한다.
"에피토프"는 항체 분자 또는 다른 결합 화합물이 그에 대해 결합하는 분자, 대체로 단백질의 표면 상의 부위를 의미한다. 일반적으로, 단백질은 항원 결정자로도 불리는 몇개의 또는 많은 상이한 에피토프를 갖고, 상이한 특이성의 항체와 반응한다.
"FFPE"는 고정된, 특히 통상적인 포르말린-고정된 파라핀-포매된 샘플인 일군의 세포 또는 다량의 조직을 의미한다. 그러한 샘플은 일반적으로 비제한적인 예로서, 현미경 슬라이드 또는 동등한 표면 상에 올린 고정된 조직의, 예를 들어 3-10 ㎛ 두께의 얇은 절편 형태의 수용체 복합체에 대한 분석에 사용된다. 또한, 상기 샘플은 일반적으로 통상적인 재수화 절차, 및 임의로, 분석 측정의 일부로서 또는 분석 측정에 대한 예비 과정으로서의 항원 회복 절차를 거친다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "보다 큰 또는 같은" (즉, ≥ 또는 >=)은 다른 특정 실시양태에서 "보다 큰" (>)을 의미할 수 있다. 또한, 본원에서 사용되는 바와 같이, "보다 작은 또는 같은" (즉, ≤ 또는 <=)은 다른 특정 실시양태에서 "보다 작은" (<)을 의미할 수 있다.
"Her-2", "ErbB2", "c-Erb-B2", "HER2", "Her2" 및 "neu"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 예를 들어 문헌 ([Semba et al., 1985, P.N.A.S. USA 82:6497-650] 및 [Yamamoto et al., 1986, Nature 319:230-234]) 및 Genebank 기탁 번호 X03363에서 설명되는 바와 같이 천연 Her-2, 및 그의 대립유전자 변이체를 의미한다. 달리 지시하지 않으면, 용어 "Her-2", "ErbB2", "c-Erb-B2", "HER2" 및 "Her2"는 본원에서 사용될 때 인간 단백질을 의미한다. Her2를 코딩하는 유전자는 본원에서 "erbB2"로 언급된다.
"HER-2 작동제"는 본원에서 사용되는 바와 같이, Her-2 또는 Her-2 발현 세포 또는 Her-2 양성 암 세포의 생물학적 활성을 변경할 수 있는 화합물을 의미한다. 그러한 생물학적 활성은 이량체화, 자가인산화, 또 다른 수용체의 인산화, 신호 전달 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 생물학적 활성은 세포 생존 및 세포 증식 (이로 제한되지 않음)을 포함할 수 있고, HER-2 작동제에 의한 상기 활성의 억제는 직접 또는 간접적인 세포 치사 (예를 들어, ADCC), 단백질 복합체 또는 복합체 형성의 붕괴, 단백질 수송 (trafficking) 또는 효소 억제의 조정일 수 있다. 또한, 생물학적 활성은 본원에 제시된 바와 같은 환자 반응을 포함할 수 있다. 예시적인 HER-2 작동제는 대분자 4D5, 페르투주맙, 및 트라스투주맙 및 소분자, 예를 들어 AEE-788 및 라파티닙을 포함하고 이로 제한되지 않는다. Her-2 복합체는 단백질의 복합체, 예를 들어 Her-2가 한 성분인 이종이량체를 설명하기 위해 사용된다. Her-2 복합체는 Her-2 동종이량체, 또는 Her-2를 포함하는 이종이량체 (예를 들어, Her-2/Her-3 이종이량체)를 포함할 수 있다.
"Her-3", "ErbB3", "c-erb-B3", "erbB-3", "HER3" 및 "Her3"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 예를 들어 문헌 ([Kraus MH, et al. (1989) Proc Natl Acad Sd USA 86:9193-9197] 및 [Plowman GD, et al. (1990) Proc Natl Acad Sci USA. 87:4905-4909]) 및 Genbank 기탁 번호 P21860에서 설명되는 바와 같이 천연 Her-3, 및 그의 대립유전자 변이체를 의미한다. 달리 지시하지 않으면, 용어 "Her-3", "ErbB3", "c-erb-B3", "erbB-3", "HER3" 및 "Her3"은 본원에서 사용될 때 인간 단백질을 의미한다. Her3을 코딩하는 유전자는 본원에서 "erbB3"으로서 언급된다.
Her-3 복합체는 단백질의 복합체, 예를 들어 Her-3이 한 성분인 이종이량체를 설명하기 위해 사용된다. Her-3을 포함하는 이종이량체의 예는 Her-1/Her-3 및 Her-2/Her-3을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
"HER-3-표적화제" 또는 "Her-3 신호전달 경로 표적화제"는 Her-3 또는 Her 패밀리 신호전달 경로의 구성원의 생물학적 활성을 변경하는 치료제를 의미한다. 그러한 생물학적 활성은 이량체화, 자가인산화, 또 다른 수용체의 인산화, 신호 전달 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 생물학적 활성은 세포 생존 및 세포 증식 (이로 제한되지 않음)을 포함할 수 있고, Her-3 또는 Her-3 신호전달 경로 구성원 작용제에 의한 상기 활성의 억제는 직접 또는 간접적인 세포 치사 (예를 들어, ADCC), 단백질 복합체 또는 복합체 형성의 붕괴, 단백질 수송 또는 효소 억제의 조정일 수 있다. 또한, 생물학적 활성은 본원에 제시된 바와 같은 환자 반응을 포함할 수 있다. 예시적인 Her-3 또는 Her-3 신호전달 경로 구성원 작용제는 Her-3, PI3K, Akt, mTOR, ERK1/2 또는 PYK2를 표적으로 하는 대분자 (예를 들어, 항체) 또는 소분자 (예를 들어, 소분자 키나제 억제제)를 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다.
"높은"은 정상보다 더 큰, 표준, 예를 들어 소정의 측정치보다 더 큰 측정치 또는 또 다른 하위군 측정치보다 비교적 더 큰 또는 하위군 측정치를 지칭한다. 예를 들어, 높은 Her-3은 정상 Her-3 측정치보다 더 큰 Her-3의 측정치를 지칭한다. 정상 Her-3 측정치는 당업자에게 이용가능한 임의의 방법에 따라 결정될 수 있다. 또한, 높은 Her-3은 소정의 측정치, 예를 들어 소정의 컷오프와 동일하거나 이보다 큰 측정치를 지칭할 수 있다. 또한, 높은 Her-3은 높은 Her-3 하위군이 또 다른 하위군보다 비교적 더 큰 수준의 Her-3을 갖는, Her-3의 측정치를 지칭할 수 있다. 비제한적인 예를 들어, 본 명세서에 따르면, 2개의 별개의 환자 하위군은 수학적으로 결정된 지점, 예를 들어 중앙 (이로 제한되지 않음) 주위에서 샘플을 나누어, 그의 측정치가 높은 (즉, 중앙값보다 더 높은) 하위군 및 그의 측정치 낮은 또 다른 하위군을 생성함으로써 생성될 수 있다. Her-3은 당업자에게 공지된 임의의 방법, 비제한적인 예를 들어 베라태그® 또는 임의의 표준 면역조직화학 (IHC) 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 경우에, "높은" 발현 수준은 매우 높은 발현의 범위 및 "비교적 높은" 발현의 범위를 포함할 수 있고, 여기서 "비교적 높은"은 정상보다는 크지만 "매우 높은"보다는 작은 발현 수준이다. 높은 (매우 높은 및 비교적 높은 포함) Her-2 발현 및/또는 높은 Her-3 및/또는 높은 p95 발현의 범위의 예가 본원에서 제시된다.
"IHC, FISH 및 CISH"는 세포 또는 조직에서 분자 엔티티의 존재를 검출하기 위해 사용되는 방법 (각각 면역조직화학, 형광 계내 혼성화, 및 발색성 계내 혼성화)이다. 예를 들어, 막 수용체, 예를 들어 Her-3 및/또는 EGFR 수용체 패밀리의 다른 구성원이 이들 방법을 이용하여 검출될 수 있다.
"이소형 대조군 항체"는 결합 화합물로서 사용된 특이적 항체와 동일한 근본적인 면역글로불린 구조를 갖지만 표적화된 에피토프에 대한 특이성을 갖지 않는 항체를 의미한다. 이소형 대조군 항체를 사용함으로써, 비-특이적 결합에 의한 임의의 결합을 관찰할 수 있다.
"할 가능성이 있는" (및 "할 가능성이 있지 않은")은 본원에서 사용되는 바와 같이, 물품, 물건, 물체 또는 사람이 발생할 확률의 증가 (또는 감소)를 의미한다. 따라서, 한 예에서, 트라스투주맙을 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는 대상체는 참조 대상체 또는 대상체의 군에 비해 트라스투주맙을 사용한 치료에 대한 반응이 증가된 확률을 갖는다.
"긴"은 본원에서 사용되는 바와 같이, 정상보다 더 큰, 표준, 예를 들어 소정의 측정치보다 더 큰 시간 측정치 또는 또 다른 하위군 측정치보다 비교적 더 긴 하위군 측정치를 지칭한다. 예를 들어, 환자의 수명에 대해서, 긴 진행까지의 시간은 정상 진행까지의 시간보다 더 긴 진행까지의 시간을 의미한다. 진행까지의 시간이 길지의 여부는 당업자에게 이용가능한 임의의 방법에 따라 결정될 수 있다. 하나의 실시양태에서, "긴"은 질병에서 유의한 사건이 발생하기 위해 필요한 중간 시간 경과보다 큰 시간을 의미한다.
"낮은"은 정상보다 작은, 표준, 예를 들어 소정의 측정치보다 더 작은 측정치 또는 또 다른 하위군 측정치보다 비교적 더 작은 하위군 측정치를 지칭하는 용어이다. 예를 들어, 낮은 Her-3은 환자의 특정 샘플 세트에서 정상 Her-3 측정치보다 더 작 Her-3의 측정치를 의미한다. 정상 Her-3 측정치는 당업자에게 이용가능한 임의의 방법에 따라 결정될 수 있다. 또한, 낮은 Her-3은 소정의 측정치, 예를 들어 소정의 컷오프보다 작은 측정치를 의미할 수 있다. 또한, 낮은 Her-3은 낮은 Her-3 하위군이 또 다른 하위군보다 비교적 더 낮은 측정치를 지칭할 수 있다. 비제한적인 예를 들어, 본 명세서에 따르면, 2개의 별개의 환자 하위군은 수학적으로 결정된 지점, 예를 들어 중앙 (이로 제한되지 않음) 주위에서 샘플을 나누어, 그의 측정치가 높은 (즉, 중앙값보다 더 큰) 또 다른 군에 대해 그의 측정치가 낮은 (즉, 중앙값보다 더 작은) 군을 생성함으로써 생성될 수 있다. Her-3은 당업자에게 공지된 임의의 방법, 비제한적인 예를 들어 베라태그® 또는 임의의 표준 면역조직화학 (IHC) 방법에 의해 측정될 수 있다. Her-3, Her-2 및 p95 발현의 낮은 값에 대한 범위의 예가 본원에서 제시된다.
"용해물"은 세포의 세포막이 물리적 또는 화학적 방법에 의해 붕괴될 때 생산되는 용액을 의미한다. 예를 들어, "종양 용해물"은 일반적으로 단백질 마커, 효소, 핵산 및 단백질의 복합체 및 다양한 분석에서 후속적으로 측정될 수 있는 다른 분자를 포함하고 이로 제한되지 않는, 종양을 포함하는 세포의 대표적인 성분을 함유한다.
"분자 태그"는 본원에서 사용되는 바와 같이, 직접 또는 간접적으로 측정될 수 있고, 전기영동에 의한 이동성, 분자량, 형상, 용해도, pKa, 소수도, 전하, 비전하 (charge/mass ratio), 극성 등을 포함하고 이로 제한되지 않는, 분리되는 분자들 사이의 하나 이상의 물리적, 화학적 또는 광학적 차이에 기초하여 다른 분자와 구분될 수 있는 분자를 나타낸다. 하나의 실시양태에서, 복수조 (plurality) 또는 세트 내의 분자 태그들은 전기영동에 의한 이동성 및 광학적 검출 특성이 상이하고, 전기영동에 의해 분리될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 복수조 또는 세트 내의 분자 태그들은 분자량, 형상, 용해도, pKa, 소수도, 전하, 극성이 다를 수 있고, 정상 또는 역상 HPLC, 이온 교환 HPLC, 모세관 전기크로마토그래피, 질량분광법, 기체상 크로마토그래피 등의 기술에 의해 분리될 수 있다.
또한, 분자 태그의 측정은 분석물, 예를 들어 Her-3 또는 복합체 내의 Her-3의 존재 및/또는 양에 대한 상관물로서 작용하는 측정가능한 신호를 검출, 향상 또는 증폭시키기 위해, 추가로 변형하거나 변형하지 않으면서 2차 분자 상호작용의 사용을 수반할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 2개 또는 그 초과의 분자 태그는 유효 근접성 내에서 상호작용하여 측정가능한 신호를 생성할 수 있다. 분자 태그로서, 측정가능한 신호는 예를 들어 상보성 서열이 유효 근접성 내에 존재할 때 혼성화하는 2개의 상보성 핵산 서열의 검출에 의해 생성될 수 있다. 측정가능한 신호를 생성하거나 또는 당업계에 공지된 검출 방법을 사용하여 측정될 수 있는 다른 예는 FRET, BRET, BiFC, LCI 및 QPCR을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
"전체 생존" 또는 "OS"는 치료 개시로부터 사망 또는 중도절단 (censor)시까지 측정된 시간을 의미한다. 중도절단은 연구 종료 또는 치료의 변경에 의한 것일 수 있다. 전체 생존은 확률, 예를 들어 카플란-마이어 플롯에서 제시될 때 치료 개시로부터 사망 또는 중도절단시까지의 특정 시간에 생존할 확률을 의미할 수 있다.
"소정의 컷오프"는 본원에서 사용되는 바와 같이, 특정 특질의 2 이상의 카테고리를 가장 우수하게 식별할 수 있도록 하는, 상기 특질을 보이는 대상체에 대한 소정의 측정치의 값을 의미한다. 예를 들어, 전체 생존을 결정하기 위해 높은 Her-3 발현 및 낮은 Her-3 발현과 같은 2개의 카테고리를 식별할 수 있도록 하는 소정의 컷오프가 사용될 수 있다. 소정의 컷오프는 예측 모델을 최적화하기 위해 소정의 컷오프보다 더 낮거나 더 높은 값을 갖는 대상체를 분리하기 위해 사용될 수 있다.
"근접 프로브"는 본원에서 사용되는 바와 같이, 검출가능한 신호를 생성하기위해 결합 화합물 상의 분자 태그에 대해 유효 근접성 내에서 작용할 수 있는 모이어티, 및 항체, 펩티드, 세포 표면 수용체에 대한 펩티드 또는 비-펩티드 리간드, 단백질, 예를 들어 스트렙타비딘, 소분자, 예를 들어 비오틴, 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 펩티드 핵산, 렉틴 또는 표적 단백질 또는 분자 또는 안정한 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 다른 분자 엔티티를 포함하는 시약을 의미한다. 예를 들어, 분자 태그를 갖는 Her-3 표적화된 항체로 이루어진 근접 프로브는 하나 이상의 Her-3 결합 화합물, 또는 하나 이상의 분자 태그가 부착된 관심있는 또 다른 단백질의 결합 화합물에 대한 유효 근접성 내에서 Her-3에 결합할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 근접 프로브는 결합 분자 및 제1 핵산을 포함하고, 결합 분자는 항체 및 제2 핵산을 포함하고, 여기서 제1 및 제2 핵산은 서로 상보성이고, 핵산이 서로 유효 근접성 내에 존재할 때 혼성화하도록 하는 소정의 길이를 각각 갖는다. 혼성화는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 형광단이 혼성화의 표시자로서 핵산에 부착될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 혼성화는 비제한적인 예를 들어 롤링 써클 (rolling circle) 증폭 방법과 같은 핵산 증폭 방법으로 측정한다 (예를 들어, 문헌 [Lizardi et al,., (1998) Nat Genet. 19: 225-232] 참조).
"RECIST"는 "고형 종양에서 반응 평가 기준"을 의미하고, 치료 동안 암 환자가 개선될 때 ("반응함"), 동일하게 유지될 때 ("안정한") 또는 악화될 때 ("진행")를 규정하는 공표된 규칙의 세트이다. RECIST 기준에 의해 규정된 반응은 예를 들어 문헌 [Journal of the National Cancer Institute, Vol. 92, No. 3, February 2, 2000]에 공개되었고, RECIST 기준은 다른 유사한 공표된 정의 및 규칙 세트를 포함할 수 있다.
치료에 "반응하다" 및 이의 다른 형태는 본원에서 사용되는 바와 같이, 대상체의 물질을 사용한 치료에 대한 반응을 의미한다. 예로서, 대상체에서 종양의 성장이 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과로 지연될 경우, 대상체는 치료에 반응한 것이다. 또 다른 예에서, 임의의 적절한 측정치, 예를 들어 질량 또는 부피에 의해 결정될 때 대상체 내의 종양이 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 초과로 수축될 경우, 대상체는 치료에 반응한 것이다. 또 다른 예에서, 대상체가 치료가 수행되지 않을 경우에 예측된 평균 여명보다 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 초과로 연장된 평균 여명을 경험할 경우, 대상체는 HER-2 작동제를 사용한 치료에 반응한 것이다. 또 다른 예에서, 대상체가 전체 생존 또는 증가된 질병 진행까지의 시간을 보일 경우, 대상체는 물질을 사용한 치료에 반응한 것이다. 환자가 치료에 반응하는지를 결정하기 위해 본원에서 제시된 RECIST 기준을 포함하여 여러 방법이 사용될 수 있다.
"샘플" 또는 "조직 샘플" 또는 "환자 샘플" 또는 "환자 세포 또는 조직 샘플" 또는 "검사물"은 각각 대상체 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 수집물을 의미한다. 조직 샘플의 공급원은 신선 조직과 같은 고형 조직, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 또는 생검 또는 흡인물 (aspirate); 혈액 또는 임의의 혈액 구성분, 체액, 예를 들어 뇌척수액, 양수, 복막액 또는 간질액 또는 대상체의 임신 기간 또는 발달의 임의의 시점에서의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 자연에서 조직과 본래 서로 혼합되지 않는 화합물, 예를 들어 보존제, 항응고제, 버퍼, 고정제, 영양물질, 항생제 등을 함유할 수 있다. 세포는 통상적인 방식, 예를 들어 FFPE 방식으로 고정될 수 있다.
"짧은"은 본원에서 사용되는 바와 같이, 정상보다 더 짧은, 표준, 예를 들어 소정의 측정치보다 더 짧은 시간 측정치 또는 또 다른 하위군 측정치보다 비교적 더 짧은 하위군 측정치를 지칭한다. 예를 들어, 환자의 수명에 대해서, 짧은 진행까지의 시간은 정상 진행까지의 시간보다 더 짧은 또는 예상보다 더 짧은 진행까지의 시간을 의미한다. 진행까지의 시간이 짧을지의 여부는 당업자에게 이용가능한 임의의 방법에 따라 결정될 수 있다. 하나의 실시양태에서, "짧은"은 질병에서 유의한 사건이 발생하기 위해 필요한 중간 시간 경과보다 더 짧은 시간을 의미한다.
"신호전달 경로"는 본원에서 사용되는 바와 같이, 세포-표면 수용체에 대한 세포외 신호전달 분자의 결합이 세포 내에서의 사건을 촉발하는 과정 및/또는 세포내 신호전달 캐스케이드가 세포내 상호작용을 통해 촉발될 수 있는 과정을 의미한다. 예를 들어, 수용체 티로신 키나제는 성장 인자 신호를 세포 표면으로부터, 성장, 분화, 혈관신생 및 세포자멸의 억제와 같은 중요한 기능을 제어하는 세포내 과정으로 전달하는 막횡단 단백질이다. 암에서, 이들 신호전달 경로는 종종 종양 성장 및 전이를 촉진하기 위해 이용된다. 수용체 티로신 키나제의 상기 패밀리의 하나는 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 패밀리이다. EGFR 패밀리 구성원 EGFR, HER2, HER3 및 HER4는 매우 다양한 종양 종류에서 과다발현된다.
"유의한 사건"은 본원에서 사용되는 바와 같이, 당업자에 의해 결정할 때 환자의 질병에서 중요한 사건을 의미한다. 유의한 사건의 예는 비제한적인 예를 들어 일차 진단, 사망, 재발, 환자의 질병의 전이성 결정, 환자의 질병의 재발 또는 환자의 질병의 상기 병기의 임의의 하나로부터 또 다른 병기로의 진행이다. 유의한 사건은 OS, TTP를 평가하기 위해 사용되는 임의의 중요한 사건 및/또는 당업자에 의해 결정할 때 RECIST 또는 다른 반응 기준의 사용일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환가능하게 사용된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "대상체들"은 동물, 바람직하게는 비-영장류 (예를 들어, 소, 돼지, 말, 당나귀, 염소, 낙타, 고양이, 개, 기니 피그, 래트, 마우스 또는 양) 및 영장류 (예를 들어, 원숭이, 예를 들어 사이노몰거스 (cynomolgus) 원숭이, 고릴라, 침팬지 또는 인간)를 포함하는 포유동물을 의미한다.
"표적화된 요법"은 정상 세포를 해롭게 하거나 변경하지 않으면서 질병에 관련되는 특이적 세포를 확인하고 치료하기 위해 시도되는 치료적 처리를 의미한다. 표적화된 치료제는 소분자, 예를 들어 라파티닙 및 이레사/글리벡, 모노클로날 항체, 예를 들어 트라스투주맙 또는 핵산, 예를 들어 질병 진행에 관련되는 유전자 생성물의 발현을 차단하기 위해 사용되는 siRNA를 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 표적화된 요법은 많은 질병 진행, 예를 들어 암의 치료에서 유용하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "시간 경과"는 초기 사건과 후속 사건 사이의 시간의 양을 의미한다. 예를 들어, 환자의 암에 관하여, 시간 경과는 환자의 질병에 관련될 수 있고, 제1 사건이 진단일 수 있고 후속 사건은 예를 들어 전이일 수 있는, 질병 과정에서 유의한 사건을 평가함으로써 측정될 수 있다.
"질병 진행까지의 시간" 또는 "TTP"는 치료 개시로부터 진행 또는 암 또는 중도절단시까지 측정된 시간을 의미한다. 중도절단은 연구 종료 또는 치료의 변경에 의한 것일 수 있다. 질병 진행까지의 시간은 또한 예를 들어 질병 진행까지의 시간이 치료 개시로부터 진행 또는 중도절단시까지의 특정 시간에 걸쳐 무진행 상태일 확률을 나타낼 수 있는 카플란-마이어 플롯에서의 확률로서 제시될 수 있다.
"치료", 및 상기 용어의 다른 형태는 질병, 예를 들어 암의 성장 지연, 암의 중량 또는 부피 감소, 대상체의 예상된 생존 시간 및/또는 종양의 질병 진행까지의 시간 연장 등을 위한 물질의 투여를 의미한다. 또한, 치료는 당업자, 예를 들어 주치의가 처방으로 생각하는 임의의 과정을 의미할 수 있다.
용어 "베라태그®"는 그 분석에 관련된 시약, 분석 절차 및 소프트웨어를 포함하고 이로 제한되지 않는, 그 분석을 수행하고 이용하기 위한 단일 및 다중화된 (multiplexed) 및 다중-표지 분석, 물질, 방법 및 기술을 나타낸다. 용어 베라태그®, vTag 및 ETAG®은 상호교환가능하게 사용될 것이다.
제1 측면에서, 본 발명은 샘플을 제공하고, 샘플 내에서 Her-3 및/또는 복합체 내의 Her-3의 존재 및/또는 양을 결정하는 것을 포함하는, 샘플 내에서 Her-3 및/또는 복합체 내의 Her-3의 존재 및/또는 양을 측정 및/또는 정량하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 조직 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 신선 조직 샘플, 고정된 샘플, 동결된 샘플 또는 용해물이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 종양 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 동결된 종양 조직 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 신선 또는 동결된 종양 샘플로부터의 종양 용해물을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 FFPE 샘플 또는 가용화된 FFPE 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 유방암 샘플을 포함한다. 특정 실시양태에서, 유방암은 조기 (즉, 보조) 유방암 또는 전이성 유방암이다. 특정 실시양태에서, 유방암에서 Her-2의 발현 수준은 높다. 특정 실시양태에서, 높은 Her-2 발현은 log10H2T ≥ 약 1.14 - 1.25이다. 특정 실시양태에서, 높은 Her-2 발현은 매우 높은 및/또는 비교적 높은 발현을 포함한다. 특정 실시양태에서, 매우 높은 Her-2 발현은 log10H2T ≥ 약 1.84 - 2.21이다. 또는, 환자 코호트에 따라 다른 범위가 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, Her-3의 수준이 높으면, 환자는 표적화된 요법제에 반응할 가능성이 더 작거나 반응할 가능성이 있지 않다. 특정 실시양태에서, Her-3 수준이 낮으면, 환자는 표적화된 요법제에 반응할 가능성이 더 크다. 특정 실시양태에서, 본원에서 보다 상세히 설명한 바와 같이, 요법제는 Her 작동제이다. 추가의 실시양태에서, 요법제는 HER-2 작동제 또는 HER-3-표적화제 중 적어도 하나이다.
바람직한 실시양태에서, 샘플은 혈액, 혈장 또는 림프 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 혈액 또는 혈장 샘플은 순환 종양 세포를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 세포주를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 측정은 넓은 동적 범위에 걸쳐 정량적일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 방법은 샘플을 결합 화합물과 혼합하고, Her-3 및/또는 복합체 내의 Her-3에 결합된 결합 화합물의 존재 및/또는 양을 결정하는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 결합 화합물은 Her-3에 특이적으로 결합한다. 바람직한 실시양태에서, 결합 화합물은 항체를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 실시예 2에 제시되고 도 2a에 도시된 서열 1-8을 갖는 펩티드 중의 하나에 대해 생성된다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (a) 각각 서열 13, 14 및 15에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 각각 서열 16, 17 및 18에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체; 및/또는 (a) 각각 서열 19, 20 및 21에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 각각 표 1B에 제시된 서열 22, 23 및 24에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 표 1A에 제시된 서열 9 및 11, 및/또는 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 표 1B에 제시된 서열 10 및 12를 갖는 아미노산 서열을 갖는 항체이다.
<표 1A>
Figure pct00009
<표 1B>
Figure pct00010
표 1A 및 1B. Her3에 결합하는 2개의 항체, 즉, Her3.B9A11.H1 및 Her3.F9B10.3의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열을 표 1A에 제시한다. 그로부터 서열이 유래된 클론 단리물을 제시하고, 상보적인 결정 영역 (CDR)을 밑줄로 표시한다. 경쇄 및 중쇄를 각각 "_LC" 또는 "_HC"로 나타낸다. 표 1B는 각각 B9A11.H1 경쇄 및 중쇄, 및 F9B10.3 경쇄 및 중쇄에 대한 3개의 CDR을 보여준다.
바람직한 실시양태에서, 방법은 (i) Her-3 및/또는 복합체 내의 Her-3을 함유할 수 있는 샘플; (ii) Her-3 및/또는 적어도 하나의 다른 분석물에 결합할 수 있는 근접 프로브 (상기 근접 프로브는 유효 근접성을 갖는다) 및 (iii) 적어도 하나의 결합 화합물 (상기 적어도 하나의 결합 화합물은 Her-3에 결합할 수 있고 부착된 하나 이상의 신호전달 분자를 갖는다)을 혼합하는 것을 포함하고, 여기서 유효 근접성 내에서 근접 프로브 및 결합 화합물의 결합은 Her-3 및/또는 복합체 내의 Her-3의 존재 및/또는 양과 상호관련 있는 분자 태그로부터의 신호를 생성한다. 바람직한 실시양태에서, 근접 프로브 및/또는 결합 화합물은 Her-3에 특이적으로 결합할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 근접 프로브 및/또는 결합 화합물은 항체를 추가로 포함하고, 각각의 항체는 Her-3 상의 특이적 에피토프에 결합할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 실시예 2에 제시되고 도 2a에 도시된 서열 1-8을 갖는 펩티드 중의 하나에 대해 생성된다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (a) 각각 서열 13, 14 및 15에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 각각 서열 16, 17 및 18에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체; 및/또는 (a) 각각 서열 19, 20 및 21에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 각각 서열 22, 23 및 24에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체이다 (표 1B). 바람직한 실시양태에서, 항체는 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 표 1A에 제시된 서열 9 및 11, 및/또는 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 표 1A에 제시된 서열 10 및 12를 갖는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 조직 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 고정된 샘플, 동결된 샘플 또는 용해물이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 종양 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 동결된 종양 조직 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 종양 용해물을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 본원에 논의된 바와 같이 유방암 샘플을 포함한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 유방암은 조기 (즉, 보조) 유방암 또는 전이성 유방암이다. 특정 실시양태에서, 유방암에서 Her-2의 발현 수준은 높다. 특정 실시양태에서, 높은 Her-2 발현은 log10H2T ≥ 약 1.14 - 1.25이다. 특정 실시양태에서, 높은 Her-2 발현은 매우 높은 및/또는 비교적 높은 발현을 포함한다. 특정 실시양태에서, 매우 높은 Her-2 발현은 log10H2T ≥ 약 1.84 - 2.21이다. 또는, 환자 코호트에 따라 다른 범위가 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 샘플은 FFPE 샘플 또는 가용화된 FFPE 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 혈액, 혈장 또는 림프 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 혈액 또는 혈장 샘플은 순환 종양 세포를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 엑소좀 (exosome) 및/또는 다른 소포체 (vesicle)를 함유한다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 세포주를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 측정은 넓은 동적 범위에 걸쳐 정량적일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 넓은 동적 범위는 약 2 로그이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 넓은 동적 범위는 유방암 샘플에서 약 1-1.5 로그이다. 바람직한 실시양태에서, 방법은 Her-3 발현의 정량적 연속체를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 측정 또는 양은 잘 특성화된 세포주 모델 및 교차-검증 기술, 예를 들어 ELISA 및 유동 세포측정을 이용하는 정확도 연구에 의해 결정할 때 적어도 세포당 약 1,000개의 수용체 내지 세포당 약 200,000개의 수용체에 감수성이다. 바람직한 실시양태에서, 측정 또는 양은 적어도 세포당 약 5,000개의 수용체 내지 세포당 약 200,000개의 수용체에 감수성이다. 바람직한 실시양태에서, 측정 또는 양은 적어도 세포당 약 10,000개의 수용체 내지 세포당 약 200,000개의 수용체에 감수성이다. 바람직한 실시양태에서, 측정 또는 양은 적어도 세포당 약 25,000개의 수용체 내지 세포당 약 200,000개의 수용체에 감수성이다. 바람직한 실시양태에서, 측정은 이소형 대조군 항체 및 통상적인 IHC 방법을 사용한 비교를 이용하여 결정할 때 특이적이다.
바람직한 실시양태에서, Her-3에 결합된 결합 화합물의 존재 및/또는 양을 결정하는 것은 제2 결합 화합물을 제공하고 (상기 제2 결합 화합물은 Her-3에 결합된 결합 화합물에 특이적으로 결합할 수 있다), Her-3에 결합된 결합 화합물의 존재 및/또는 양의 상관물로서 제2 결합 화합물의 존재 및/또는 양을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 제2 결합 화합물은 항체이다.
제1 결합 화합물에 특이적으로 결합할 수 있고 하나 이상의 분자 태그를 갖는 제2 결합 화합물의 사용은 실용적인 잇점을 가질 수 있다. 예를 들어, 그에 하나 이상의 분자 태그가 부착된 단일 제2 결합 화합물을 사용하여 다수의 Her-3-특이적 제1 결합 화합물을 시험할 수 있어서, 분자 태그를 각각의 다수의 Her-3-특이적 제1 결합 화합물에 부착시킬 필요를 없앤다. 바람직한 실시양태에서, 제1 결합 화합물은 마우스 항체이고, 제2 결합 화합물은 절단가능한 분자 태그가 그에 부착된, 비-마우스 종에서 생성된 항-마우스 항체 (예를 들어, 염소 항-마우스 항체)이다.
제2 결합 화합물은 대개 검출을 위해 유용한 프로브로 표지된다. 제2 결합 화합물을 검출하기 위해 일방적으로 사용되는 검출 시스템은 본원에 기재된 바와 같은 절단가능한 분자 태그; 방사성 표지 (즉, 방사성 동위원소, 예를 들어 I-125); 화학물을 측정가능한 비색, 형광 또는 전기화학 신호로 전환시키는 효소 (예를 들어, 퍼옥시다제) 및 형광 단백질 (예를 들어, 초록 형광 단백질 및 그의 많은 유도체)를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
항체는 모노클로날, 폴리클로날 또는 재조합 항체일 수 있고, 당업계에 잘 알려진 기술에 의해 제조될 수 있다. 항체는 완전한 면역글로불린 또는 그의 단편을 포함할 수 있고, 상기 면역글로불린은 다양한 클래스 및 이소형, 예를 들어 IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3, IgM 등을 포함할 수 있다. 그의 단편은 Fab, Fv 및 F(ab')2, Fab' 등을 포함할 수 있다. 또한, 항체는 단일쇄 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 특정 결합 부위에 특이적인 결합 활성을 보유하는 당업자에게 공지된 임의의 다른 항체 유도체일 수 있다. 또한, 결합 친화도가 유지된다면, 면역글로불린 또는 그의 단편의 응집체, 중합체 및 접합체가 적절하게 사용될 수 있다.
생물학적 샘플 내의 Her-3을 측정하는 방법의 개발을 용이하게 하기 위해, Her-3-특이적 모노클로날 항체를 생성하였다. 마우스를 Her-3으로부터의 펩티드 (도 2a에 제시함)에 대해 면역화시키고, 본원에서 추가로 기재하거나 당업자에게 공지된 바와 같은 표준 방법을 이용하여 하이브리도마 (hybridoma)를 생성하였다. 모노클로날 항체의 생성 및 생산을 위한 많은 방법, 예를 들어, 문헌 [Koehler et al. (1975) Nature 256:495-497]에 처음 기재된 하이브리도마 방법 또는 문헌 ([Goding, JW (1980) J. Immunol. Methods 34:285-308]; [Harlow E and Lane D (1988) in Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 6]; [Kennett RH et al. (1980) Monoclonal Antibodies, Plenum Press]; [Zola H (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press] 참조)에 기재된 다른 방법이 공지되어 있다.
하나의 실시양태에서, 하이브리도마를 생성하는 방법은 숙주 동물, 예를 들어 마우스를 면역화시켜 관심있는 펩티드 또는 단백질(들)에 대해 표적화된 항체를 생산하는 림프구의 생산을 유도하는 것으로 시작한다. 림프구는 또한 시험관 내에서 면역화될 수 있다. 사용된 항원은 펩티드, 단백질, 또는 세포 표면 상에 항원을 표시하는 세포일 수 있다. 림프구를 수집한 후, 대개 모 골수종 세포의 성장 및/또는 생존을 방지하는 조건 하에 화학적 (예를 들어, PEG 사용) 또는 전기적 (예를 들어, 전기융합에 의해) 방법에 의해 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다. 융합된 세포는 배양 배지 내에서 생존을 촉진하는 효소를 함유하기 때문에 성장할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 배양 배지는 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)를 함유하고, 이는 하이포잔틴 퀴닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HPRT)가 결여된 세포의 성장을 방지한다. HPRT는 림프구 파트너에 의해 융합된 세포에 공급되어, 하이브리도마의 생존을 허용하지만 HPRT가 결여되는 모 골수종 세포의 생존을 방지한다.
하이브리도마가 성장되는 배양 배지 (즉, 조건화 배지)를 대개 면역침전 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들어 효소-연결 면역흡착 분석 (ELISA; 문헌 [Engvall E (1977) in Biomedical Applications of Immobilized Enzymes and Proteins, edited by TMS Chang, 2:87-96, Plenum Press] 참조), 방사성 면역 분석 (RIA; 문헌 [Sonksen PH (1974) Brit. Med. Bull. 30:1-103] 참조), 웨스턴 블롯 (Western blot) 또는 유동 세포측정을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 기술에 의해, 항원에 대해 생성된 모노클로날 항체의 생산에 대해 분석한다 ([Voller, et al. (1978) J. Clin. Pathol. 31:507-520] 참조). 하이브리도마로부터의 조건화 배지를 ELISA (도 1), 웨스턴 블롯 (도 2) 및 유동 세포측정 (도 3)을 포함한 일련의 분석으로 프로파일링하였다. 바람직한 실시양태에서, 천연 및 침투화 및 고정시킨 세포를 사용한 연구를 수행하여, 고정된 세포 또는 조직을 사용하는 용도, 예를 들어 면역조직화학 (IHC)에서 잘 수행할 수 있는 항체를 확인한다. 관심있는 클론을 제한 희석 또는 단일 세포 유동 세포측정에 의해 서브클로닝할 수 있다.
당업자가 알 바와 같이, 하이브리도마 클론 (또는 하위클론)에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 정제 절차, 예를 들어 비제한적으로 투석, 친화도 크로마토그래피, 겔 전기영동 또는 단백질 A-세파로스 (또는 단백질 L-아가로스) 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있다.
생성된 하나의 항체, B9A11 (즉, 서열 9 및 11) (Her-3으로부터의 펩티드
Figure pct00011
(서열 6)에 대해 생성됨)을 본원에 기재된 Her3-베라태그® 분석 실험에서 사용하기 위해 선택하였다. 항체 B9A11 및 F9B10을 부다페스트 조약 (Budapest Treaty) 하에 2010년 1월 12일에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 20110 매나싸스 10801 유니버시티 불리바드)에 기탁하였고, ATCC 기탁 번호 PTA-10574 및 PTA-10575를 부여받았다.
많은 방법 및 시약이 분석을 위한 생물학적 샘플을 제조하기 위해 일반적으로 사용된다. 몇몇 방법을 본원에서 개략하거나 언급하고, 다른 많은 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 생체마커로서 사용하기에 적합한 Her-3을 함유하는 샘플은 세포 배양액, 동물 또는 식물 조직, 환자 생검, 혈액 등을 포함한 매우 다양한 공급원으로부터 기원할 수 있다. 바람직하게는, 샘플은 인간 환자 샘플이다. 샘플은 샘플을 취하는 공급원에 따라 결정될 수 있는 통상적인 기술을 이용하여 본 발명의 분석을 위해 준비된다. 생검 및 의료 시료에 대해서, 다음 문헌에 지침에 제공되어 있다 ([Bancroft JD & Stevens A, eds. 1977, Theory and Practice of Histological Techniques, Churchill Livingstone, Edinburgh; Pearse, 1980, Histochemistry. Theory and applied. 4th ed, Churchill Livingstone, Edinburgh].
사용할 수 있는 환자 조직 샘플의 예는 유방, 전립선, 난소, 결장, 폐, 자궁내막, 위, 타액선 또는 췌장의 조직을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 조직 샘플은 외과적 절제, 흡인 또는 생검을 포함한 다양한 절차에 의해 얻을 수 있다. 조직은 신선하거나 동결된 것일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 생물학적 샘플은 시험관 내에서 배양되고 원심분리에 의해 세포 펠렛으로서 수집한 세포일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 샘플은 환자 혈액 샘플 또는 구체적인 혈액 세포 종류 또는 혈액 세포 종류의 하위세트 (예를 들어, 버피 코트 (buffy coat))일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 생물학적 샘플은 엑소좀, 또는 엑소좀을 함유하는 샘플일 수 있다. 엑소좀은 생체 내에서 및 시험관 내에서 종양 세포를 비롯한 대부분의 세포 종류에 의해 분비될 수 있는 작은 (30-200 nm) 소포체이다 (문헌 [Mignot et al. (2006) J Cell. Mol. Med. 10:376-388] 참조). 종양-유래된 엑소좀은 면역계를 피하는 종양의 능력에서 일정 역할을 하는 것으로 생각되고, 진단 및 치료 용도 모두에 대해 가능성이 있고 ([Taylor and Black (1985) J Natl. Cancer Inst. 74:859-867] 참조), 따라서 관심있는 생물학적 샘플이다.
바람직한 실시양태에서, 샘플은 종양 샘플이다. 종양 샘플의 종류의 예는 암, 예를 들어 비제한적으로 암종, 육종, 골수종, 백혈병, 림프종 및 혼합형 암을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 암은 뼈암, 예를 들어, 유잉 (Ewing) 육종, 골육종 및 횡문근육종 및 다른 연조직 육종이다. 또 다른 실시양태에서, 암은 뇌 종양, 예를 들어, 희소돌기신경아교종, 뇌실막종, 수막종, 림프종, 슈반세포종 또는 수모세포종이다. 또 다른 실시양태에서, 암은 유방암이다. 또 다른 실시양태에서, 암은 내분비계 암, 예를 들어, 부신암, 췌장암, 부갑상선암, 뇌하수체암 및 갑상선암이다. 또 다른 실시양태에서, 암은 위장관암, 예를 들어, 항문암, 결장직장암, 식도암, 담낭암, 위암, 간암 및 소장암이다. 또 다른 실시양태에서, 암은 부인과 암, 예를 들어, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁암, 난관암, 임신 영양막 질병, 융모막암종, 난소암, 질암 또는 외음부암이다. 또 다른 실시양태에서, 암은 두경부암, 예를 들어, 후두암, 구인두암, 부갑상선 또는 갑상선암이다. 또 다른 실시양태에서, 암은 흑색종, 편평세포 암종 또는 기초세포 암종이다. 또 다른 실시양태에서, 암은 백혈병 암, 예를 들어, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 털세포 백혈병 또는 골수증식 질환이다. 또 다른 실시양태에서, 암은 폐암, 예를 들어, 중피종 또는 비-소세포 폐암이다. 또 다른 실시양태에서, 암은 림프종, 예를 들어 피부 T 세포 림프종, 호지킨 (Hodgkin) 질병 또는 비-호지킨 질병이다. 또 다른 실시양태에서, 암은 전이성 암이다. 또 다른 실시양태에서, 암은 골수종, 예를 들어, 다발 골수종이다. 또 다른 실시양태에서, 암은 음경암이다. 또 다른 실시양태에서, 암은 전립선암이다. 또 다른 실시양태에서, 암은 고환암이다. 또 다른 실시양태에서, 암은 갑상선암, 예를 들어, 유두상, 소포, 수질 또는 역형성 또는 미분화 갑상선 암종이다. 또 다른 실시양태에서, 암은 요로암, 예를 들어, 방광암, 신장암 또는 요도암이다.
시험관내 배양된 세포를 신선한, 동결된 또는 고정된 샘플으로서 제조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예시적인 방법을 본원에서 설명한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 분석은 고정시키고 파라핀 내에 포매시킨 조직 샘플에 대해 수행하고, 파라핀 제거 단계를 수행할 수 있다. 조직 샘플은 통상적인 방법에 의해 고정할 (즉, 보존될) 수 있다. 예를 들어, 문헌 ([Lee G. Luna, HT (ASCP) Ed., 1960, Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology 3rd edition, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York]; [Ulreka V. Mikel, Ed., 1994, The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.]) 참조. 당업자는 고정제의 선택은 그를 위해 조직을 조직학상 염색하거나 달리 분석하는 목적에 의해 결정됨을 알 것이다. 당업자는 고정의 길이가 조직 샘플의 크기 및 사용된 고정제에 따라 결정됨을 또한 알 것이다.
일반적으로, 조직 샘플을 먼저 고정시킨 후, 상승하는 일련의 알콜을 통해 탈수시키고, 침윤시키고, 조직 샘플을 절편화할 수 있도록 파라핀 또는 다른 절편화 매질로 포매시킨다. 별법으로, 조직을 절편화하고 얻어진 절편을 고정시킬 수 있다. 예로서, 조직 샘플을 통상적인 기술에 따른 통상적인 방법에 의해 또는 본원에 기재된 바와 같이 파라핀 내에 포매하고 처리할 수 있다. 일단 조직 샘플을 포매한 후, 샘플을 통상적인 기술에 따라 박절기 (microtome)에 의해 절편화할 수 있다. 절편은 두께가 약 3 마이크로미터 내지 약 12 마이크로미터 범위, 바람직하게는 약 5 마이크로미터 내지 약 10 마이크로미터일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 절편은 면적이 약 10 mm2 내지 약 1 cm2일 수 있다. 일단 절단되면, 절편을 몇몇 표준 방법에 의해 슬라이드에 부착시킬 수 있다. 슬라이드 접착제의 예는 실란, 젤라틴 및 폴리-L-라이신을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 파라핀-포매된 절편은 양전기로 대전시킨 슬라이드 및/또는 폴리-L-라이신을 코팅한 슬라이드에 부착시킬 수 있다.
파라핀을 포매 물질로서 사용하였으면, 생체마커의 검출에 앞서 조직 절편을 일반적으로 파라핀 제거하고 재수화시킨다. 조직 절편은 몇몇 통상적인 표준 방법에 의해 파라핀 제거할 수 있다. 예를 들어, 자일렌 및 점차 감소하는 일련의 알콜을 본원에 제공된 참조문에 설명되는 통상적인 기술에 따라 사용할 수 있다. 별법으로, 상업상 이용가능한 파라핀 제거 비-유기 물질, 예를 들어 Hemo-De® (CMS, 미국 텍사스주 휴스턴)을 사용할 수 있다.
포유동물 조직 배양 세포 또는 신선한 또는 동결된 조직의 세포 용해물은 통상적인 세포 용해 기술에 의해 제조할 수 있다 (예를 들어, 0.14 M NaCl, 1.5 mM MgCl2, 10 mM Tris-Cl (pH 8.6), 0.5% 노니데트 (Nonidet) P-40, 및 필요한 경우 프로테아제 및/또는 포스파타제 억제제). 신선한 포유동물 조직에 대해, 샘플 제조는 조직 해체 단계, 예를 들어 파쇄, 저미기, 연마 또는 음파처리를 또한 포함할 수 있다.
상이한 수준의 Her-3을 발현하는 안정한 세포주를 생성하였다. 상이한 수준의 관심있는 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주는 최적 항체 농도, 정확성, 민감도, 재현성, 정밀도, 선형성, 특이성 및 동적 범위와 같은 많은 파라미터에 관하여 새로운 분석, 예를 들어 Her-3 베라태그® 분석을 검증하는데 유용하다. 안정한 Her-3-발현 세포주를 생성하기 위해 HEK 293을 사용하였다. HEK 293 세포는 원래 아데노바이러스 DNA로 형질전환된 인간 배아 신장 세포로부터 유래된 특이적 세포주이다 ([Graham et al. (1977) J Gen. Virol. 36: 59-74] 참조). HEK 293 세포는 배양액 내에 성장시키기 쉽고, 쉽게 형질감염되고, 세포 생물학 연구, 및 생명기술 산업을 위한 단백질 생산에서 오랫동안 널리 사용되어 왔다. Her-3-발현 세포주의 생성을 실시예 1에서 설명하고, 각각의 세포주 내에서 Her-3의 수준을 결정하기 위한 ELISA 분석의 결과를 도 1에 제시한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 근접 프로브는 항체 및 제1 핵산을 포함하고, 결합 화합물은 항체 및 제2 핵산을 포함하고, 여기서 제1 및 제2 핵산은 서로 상보성이고 혼성화할 수 있어서, 유효 근접성을 결정하고 혼성화를 통해 직접 또는 간접적으로 신호를 생성한다. 바람직한 실시양태에서, 근접 프로브 및/또는 결합 화합물은 Her-3에 특이적으로 결합할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 결합 화합물 및/또는 근접 프로브는 항체를 추가로 포함하고, 각각의 항체는 Her-3 상의 상이한 에피토프에 결합한다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 실시예 2에 제시되고 도 2a에 도시된 서열 1-8을 갖는 펩티드 중의 하나에 대해 생성된다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (a) 각각 서열 13, 14 및 15에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 각각 서열 16, 17 및 18에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체; 및/또는 (a) 각각 서열 19, 20 및 21에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 각각 서열 22, 23 및 24에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체 (표 1B)이다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 표 1A에 제시된 서열 9 및 11, 및/또는 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 표 1A에 제시된 서열 10 및 12를 갖는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 조직 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 고정된 샘플, 동결된 샘플 또는 용해물이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 종양 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 동결된 종양 조직 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 종양 용해물을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 본원에 기재된 바와 같은 유방암 샘플을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 FFPE 샘플 또는 가용화된 FFPE 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 혈액, 혈장 또는 림프 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 혈액 또는 혈장 샘플은 순환 종양 세포를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 엑소좀 및/또는 다른 소포체를 함유한다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 세포주를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 측정은 넓은 동적 범위에 걸쳐 정량적일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 넓은 동적 범위는 약 2 로그이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 넓은 동적 범위는 유방암 샘플에서 약 1-1.5 로그이다. 바람직한 실시양태에서, 방법은 Her-3 발현의 정량적 연속체를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 측정 또는 양은 잘 특성화된 세포주 모델 및 교차-검증 기술, 예를 들어 ELISA 및 유동 세포측정을 이용하는 정확도 연구에 의해 결정할 때 적어도 세포당 약 1,000개의 수용체 내지 세포당 약 200,000개의 수용체에 감수성이다. 바람직한 실시양태에서, 측정 또는 양은 적어도 세포당 약 5,000개의 수용체 내지 세포당 약 200,000개의 수용체에 감수성이다. 바람직한 실시양태에서, 측정 또는 양은 적어도 세포당 약 10,000개의 수용체 내지 세포당 약 200,000개의 수용체에 감수성이다. 바람직한 실시양태에서, 측정 또는 양은 적어도 세포당 약 25,000개의 수용체 내지 세포당 약 200,000개의 수용체에 감수성이다. 바람직한 실시양태에서, 측정은 이소형 대조군 항체 및 통상적인 IHC 방법을 사용한 비교를 이용하여 결정할 때 특이적이다. 본원에 제시된 근접 프로브 및 결합 화합물의 예는 예를 들어 임의의 도면을 포함하여 각각 그 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 7,306,904; 7,320,860 및 7,351,528에서 찾을 수 있다.
근접성 분석은 분자 복합체의 생물학적 역할을 이해하기 위해 및 생체마커의 연구에서 유용성이 점점 증가하고 있다. 예를 들어, Her-3 또는 복합체 내의 Her-3에 특이적으로 결합하는 결합 화합물은 Her-3 또는 복합체 내의 Her-3의 존재 및/또는 양을 측정하기 위해 많은 상이한 검출 시스템과 커플링될 수 있다. Her-3 또는 복합체 내의 Her-3의 양을 결정하기 위해 유용한 것으로 당업자에게 공지된 임의의 방법이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 그러한 방법은 포스터 (Foerster) 공명 에너지 전이 (FRET), 생물발광 공명 에너지 전이 (BRET), 이분자 형광 상보, 근접 라이게이션 (ligation) 분석 (PLA), 섬광 근접 분석 (SPA) 및 롤링 써클 증폭 (RCA), 또는 핵산의 상보성 가닥을 갖는 결합 프로브 및 근접 프로브의 근접에 의해 형성된 핵산 이중체를 검출하기 위한 임의의 다른 방법을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 방법을 수행하는데 있어서, 시험되는 샘플, 결합 화합물 및 임의로 근접 프로브를 포함하는 분석 성분들의 조합이 이루어진다. 일반적으로, 분석 성분들은 임의의 순서로 조합될 수 있다. 그러나, 특정 용도에서, 첨가 순서가 관련될 수 있다. 예를 들어, 정량적 분석에서와 같이 경쟁적 결합을 모니터링하는 것을 원할 수 있다. 또는, 조립된 복합체의 안정성을 모니터링하는 것을 원할 수 있다. 그러한 용도에서, 반응은 스테이지에서 조립될 수 있다.
각각의 시약의 양은 일반적으로 경험적으로 결정될 수 있다. 분석에서 사용되는 샘플의 양은 존재하는 표적 복합체의 예측된 수 및 분석의 신호를 모니터링하기 위해 사용된 분리 및 검출 수단에 의해 결정될 것이다. 일반적으로, 결합 화합물 및 근접 프로브의 양은 샘플 내의 표적 분자의 예상된 양에 비해 몰 과량으로, 일반적으로 적어도 약 1.5, 보다 바람직하게는 약 10배 과량, 또는 그 이상의 몰 과량으로 제공될 수 있다. 구체적인 용도에서, 사용된 농도는 결합 화합물 또는 근접 프로브의 친화도 및 단일 세포 상에 존재하는 표적 분자의 예상된 수에 따라 더 높거나 더 낮을 수 있다.
분석 혼합물은 일반적으로 약 10 내지 200 mM 범위의 농도에서 버퍼에 의해 유지된 생리학적 pH (세포가 배양되는 pH에 상당하는)에서 대체로 수성 매질 내에서 세포 표면 분자에 대한 프로브의 결합을 제공하는 조건 하에 조합되고 인큐베이팅될 수 있다. 통상적인 버퍼 및 필요한 경우에 다른 통상적인 첨가제, 예를 들어 염, 성장 배지, 안정화제 등이 사용될 수 있다. 생리학적 및 일정 온도가 보통 사용된다. 인큐베이션 온도는 보통 약 4℃ 내지 70℃, 대체로 약 15℃ 내지 45℃, 보다 대체로 약 25℃ 내지 37℃이다.
바람직한 실시양태에서, 근접 프로브는 절단-유도 모이어티를 갖는 절단 프로브를 포함하고, 적어도 하나의 결합 화합물은 절단가능한 연결에 의해 결합 화합물에 부착된 하나 이상의 분자 태그를 갖고, 여기서 절단가능한 연결은 유효 근접성 내에서 절단될 수 있어서, Her-3의 존재 및/또는 양과 상호관련 있는 신호를 생성한다. 바람직한 실시양태에서, 절단 프로브 및/또는 결합 화합물은 Her-3에 특이적으로 결합할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 결합 화합물 및/또는 근접 프로브는 항체를 추가로 포함하고, 각각의 항체는 Her-3 상의 상이한 에피토프에 결합한다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 실시예 2에 제시되고 도 2a에 도시된 서열 1-8을 갖는 펩티드 중의 하나에 대해 생성된다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (a) 각각 서열 13, 14 및 15에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 각각 서열 16, 17 및 18에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체; 및/또는 (a) 각각 서열 19, 20 및 21에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 각각 서열 22, 23 및 24에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 표 1A에 제시된 서열 9 및 11, 및/또는 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 표 1A에 제시된 서열 10 및 12를 갖는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 조직 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 고정된 샘플, 동결된 샘플 또는 용해물이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 종양 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 동결된 종양 조직 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 종양 용해물을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 본원에 기재된 바와 같은 유방암 샘플을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 FFPE 샘플 또는 가용화된 FFPE 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 혈액, 혈장 또는 림프 샘플이다. 바람직한 실시양태에서, 혈액 또는 혈장 샘플은 순환 종양 세포를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 세포주를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 측정은 넓은 동적 범위에 걸쳐 정량적일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 넓은 동적 범위는 약 2 로그이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 넓은 동적 범위는 유방암 샘플에서 약 1-1.5 로그이다. 바람직한 실시양태에서, 방법은 Her-3 발현의 정량적 연속체를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 측정 또는 양은 잘 특성화된 세포주 모델 및 교차-검증 기술, 예를 들어 ELISA 및 유동 세포측정을 이용하는 정확도 연구에 의해 결정할 때 적어도 세포당 약 1,000개의 수용체 내지 세포당 약 200,000개의 수용체에 감수성이다. 바람직한 실시양태에서, 측정 또는 양은 적어도 세포당 약 5,000개의 수용체 내지 세포당 약 200,000개의 수용체에 감수성이다. 바람직한 실시양태에서, 측정 또는 양은 적어도 세포당 약 10,000개의 수용체 내지 세포당 약 200,000개의 수용체에 감수성이다. 바람직한 실시양태에서, 측정 또는 양은 적어도 세포당 약 25,000개의 수용체 내지 세포당 약 200,000개의 수용체에 감수성이다. 바람직한 실시양태에서, 측정은 이소형 대조군 항체 및 통상적인 IHC 방법을 사용한 비교를 이용하여 결정할 때 특이적이다.
2개의 항체 근접성 분석을 최적화하였다. Ab-6 (랩 비젼; Her-3의 세포질 말단에 에피토프 특이성을 갖는 Her-3-특이적 모노클로날 항체)를 근접 프로브 (Ab-6-Pro11)로서 사용하기 위해 베라태그® 리포터 (Pro 11)에 접합시켰다. 독점소유의 모노클로날 항체, B9A11를 스트렙타비딘-메틸렌 블루 ("분자 가위")와 복합체화될 때 절단 프로브 (B9A11-비오틴)로서 사용하기 위해 비오틴에 접합시켰다. 분석 방법은 실시예 5에 기재되어 있다. 매우 높은 수준 (293H3-클론 1로 불리는, 안정적으로 형질감염된 HEK 293 세포주 중 하나에서) 내지 중등도 내지 낮은 수준 (각각 MDA-MB-468 및 MDA-MB-453) 내지 낮은 내지 검출 불가능한 Her-3 (SKOV3 세포에서)을 포함하는 상이한 수준의 Her-3을 발현한 몇몇 세포주를 최적화 연구에서 사용하였다. 최적화 공정은 동적 범위를 최대화하기 위해 최적 항체 농도를 결정하고 (실시예 7 및 도 6 참조), 분석의 정확성을 결정하고 (실시예 8 및 도 7 참조), 분석의 민감도, 재현성, 및 정밀도를 시험하고 (각각 실시예 9/도 8, 실시예 10/도 9 및 실시예 11/도 10 참조), 상이한 샘플 크기에서 분석의 선형성 (실시예 12 및 도 11 참조), 및 이소형 대조군을 사용하여 비-특이적 결합에 대해 시험함으로써 분석의 특이성 (실시예 13 및 도 12 참조)을 결정하는 것을 포함하였다.
이소형 대조군은 대개 결합 결과가 개별 항체보다는 항체의 특정 이소형으로 인한 것일 가능성을 제거하기 위해 수행된다. 추가로, 당업자는 이소형 대조군에서 보이는 임의의 신호 "노이즈 (noise)"가 총 신호로부터 공제되어, 잠재적으로 보다 정확한 결과를 얻을 수 있을 것임을 알 것이다. 이소형 대조군 실험을 수행할 때, 비-특이적 결합의 기여도는 매우 낮은 거승로 관찰되었다 (도 12 참조).
방출가능한 분자 태그를 이용하여 Her-3 또는 복합체 내의 Her-3을 측정하는 것은 많은 잇점을 제공하고, 여기에는 배경을 크게 감소시키고 민감도를 유의하게 증가시키는 분석 혼합물로부터 방출된 분자 태그의 분리, 및 다중의 수용체 복합체 성분들을 동일한 분석에서 동시에 쉽게 측정할 수 있도록 편리한 다중화 능력을 제공하는 분리 및 검출이 포함된다. 그러한 태그를 사용하는 분석은 다양한 형태를 가질 수 있고, 그 전체가 각각 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 7,105,308; 6,627,400; 7,402,397; 7,402,398 및 7,402,399, 및 국제 특허 출원 공개 WO 2004/011900에 개시되어 있다. 전기영동에 의한 이동성, 분자량, 형상, 용해도, pKa, 소수도, 전하, 비전하, 극성 등을 포함하는, 분리되는 분자들 사이의 하나 이상의 물리적, 화학적 또는 광학적 차이에 기초하여 분자를 구분할 수 있는 매우 다양한 분리 기술이 사용될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 복수조 또는 세트 내의 분자 태그들은 전기영동에 의한 이동성 및 광학적 검출 특성이 상이하고, 전기영동에 의해 분리된다. 또 다른 실시양태에서, 복수조 또는 세트 내의 분자 태그들은 분자량, 형상, 용해도, pKa, 소수도, 전하, 극성이 상이할 수 있고, 정상 또는 역상 HPLC, 이온 교환 HPLC, 모세관 전기크로마토그래피, 질량분광법 또는 기체상 크로마토그래피에 의해 분리된다.
결합 화합물로부터 방출된 후에 분리 기술에 의해 별개의 밴드 또는 피크로 분리될 수 있는 분자 태그들의 세트가 제공된다. 그러한 피크의 확인 및 정량은 Her-3의 존재 및/또는 양의 측정치 또는 프로필을 제공한다. 세트 내의 분자 태그는 화학적으로 다양할 수 있지만; 편의상, 분자 태그의 세트는 대체로 화학적으로 관련된다. 예를 들어, 이들은 모두 펩티드일 수 있거나, 동일한 기초 빌딩 블록 또는 단량체의 상이한 조합으로 이루어질 수 있거나, 상이한 분리 특징을 부여하는 상이한 치환기를 갖는 동일한 기초 스캐폴드 (scaffold)를 사용하여 합성될 수 있다. 복수조의 분자 태그들의 수는 사용된 분리 방식, 검출을 위해 분자 태그 상에 사용된 표지, 결합 모이어티의 민감도, 및 절단가능한 연결이 절단되는 효율을 포함한 몇몇 인자에 따라 변할 수 있다.
조직 샘플 상에서 직접 이루어진 측정은, 샘플 내의 총 세포수 및/또는 샘플 내의 특정 하위형의 세포의 수를 대표하는 세포 또는 조직 표적 상의 측정을 포함함으로써 표준화될 수 있다 (예를 들어, 임의의 도면을 포함하여 그 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 2009/0191559 참조). 정상 세포의 실질적인 분획을 포함할 수 있는 환자 샘플, 특히 종양 샘플 내의 세포 및 조직 비균질성 때문에 추가의 측정이 바람직할 수 있거나 심지어 필요할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 결합 화합물을 다음 식으로 나타낼 수 있다:
B-(L-E)k
식에서, B는 결합 모이어티이고; L은 절단가능한 연결이고, E는 분자 태그이다. 균질 분석에서, 절단가능한 연결, L은 산화-불안정성 연결일 수 있고, 보다 바람직하게는 일중항 (singlet) 산소에 의해 절단될 수 있는 연결이다. 모이어티 "-(L-E)k"는 단일 결합 화합물이 절단가능한 연결을 통해 부착된 다중의 분자 태그를 가질 수 있음을 나타낸다. 한 측면에서 k는 1보다 크거나 1과 같은 정수이지만, 다른 실시양태에서, k는 수백보다 더 클 수 있고, 예를 들어 100 내지 500일 수 있거나, k는 수백 내지 수천보다 더 크고, 예를 들어 500 내지 5000이다. 대체로 복수의 상이한 종류의 결합 화합물은 각각 상이한 분자 태그, E를 갖는다. 절단가능한 연결, 예를 들어 산화-불안정성 연결, 및 분자 태그, E는 통상적인 화학에 의해 B에 부착된다.
바람직하게는, B는 표적, 예를 들어 Her-3에 특이적으로 결합하는 항체이다. Her-3 에피토프에 특이적인 항체가 본원에 제시된 실시예에 제공된다. 항체 조성물은 매우 다양한 상업상 이용가능한 항체 (모노클로날 또는 폴리클로날)으로부터 또는 본원에 개시된 방법에 의해 쉽게 형성할 수 있다.
절단가능한 연결, L은 구조를 파괴하거나 방출된 분자 태그, E의 검출 특성을 해치지 않는 조건 하에 절단될 수 있는 실질적으로 임의의 화학적 연결기일 수 있다. 절단 프로브를 균질 분석 포맷으로 사용할 때마다, 절단가능한 연결, L은 근접 프로브의 유효 근접성 내의 절단가능한 연결만이 절단되도록 짧은 거리에 걸쳐 작용하는 절단 프로브에 의해 생성된 절단제에 의해 절단된다. 대개, 그러한 물질은 물질이 절단을 수행하도록 절단가능한 연결로 확산하는 수명이 짧은 활성종을 생성하도록 반응 혼합물에 물리적 또는 화학적 변화를 일으킴으로써 활성화되어야 한다.
비-균질 포맷에서, 특이적으로 결합된 결합 화합물은 결합되지 않은 결합 화합물로부터 분리되므로, 사용을 위해 절단가능한 연결 및 절단 물질의 보다 넓은 선택이 이용가능하다. 절단가능한 연결은 국소 작용성 반응성 종, 예를 들어 과산화수소, 일중항 산소 등과의 반응에 불안정성인 연결뿐만 아니라, 반응 혼합물 전체에 작용하는 물질에 불안정성인 연결, 예를 들어 염기-불안정성 연결, 광절단가능한 연결, 환원에 의해 절단가능한 연결, 산화에 의해 절단된 연결, 산-불안정성 연결, 및 특이적 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티드 연결을 또한 포함할 수 있다. 많은 그러한 연결을 설명하고 있는 참고문헌은 각각 그 전체가 본원에 참고로 포함된 문헌 ([Greene and Wuts, 1991, Protective Groups in Organic Synthesis, Second Edition, John Wiley & Sons, New York]; [Hermanson,1996, Bioconjugate Techniques, Academic Press, New York]); 및 미국 특허 5,565,324를 포함한다.
본 발명에서 분자 태그, E는 다음 참조문에 설명된 바와 같은 전기영동 태그를 포함할 수 있고, 여기서 복수의 분자 태그의 분리가 기체 크로마토그래피 또는 질량 분광법에 의해 수행된다: 예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참고로 포함된 문헌 ([Zhang et al., 2002, Bioconjugate Chem. 13:1002-1012]; [Giese, 1983, Anal. Chem. 2:165-168]); 및 미국 특허 4,650,750; 5,360,819; 5,516,931; 및 5,602,273을 참조한다.
분자 태그, E는 바람직하게는 활성종, 특히 일중항 산소에 관하여 안정하고 검출 또는 리포터기를 포함하는 수용성 유기 화합물이다. 달리, E는 크기 및 구조에서 매우 다양할 수 있다. 하나의 실시양태에서, E는 분자량이 약 50 내지 약 2500 달톤, 보다 바람직하게는 약 50 내지 약 1500 달톤 범위이다. E는 전기화학적, 형광 또는 발색 신호를 생성하기 위한 검출기를 포함할 수 있다. 질량에 의한 검출을 이용하는 실시양태에서, E는 검출 목적을 위해 별개의 모이어티를 갖지 않을 수 있다. 바람직하게는, 검출기는 형광 신호를 생성한다.
복수조 내의 분자 태그들은 각각 동일한 복수조의 다른 구성원에 관하여 특유의 분리 특성 및/또는 특유의 광학 특성을 갖도록 선택된다. 하나의 실시양태에서, 크로마토그래피 또는 전기영동 분리 특징은 당업계에 통상적인 표준 분리 조건의 세트, 예를 들어, 전압, 컬럼 압력, 컬럼 종류, 이동상 또는 전기영동 분리 매질 하에 체류 시간이다. 또 다른 실시양태에서, 광학 특성은 주어진 파장 또는 파장의 밴드에서 형광 특성, 예를 들어 방출 스펙트럼, 형광 수명 또는 형광 강도이다. 바람직하게는, 형광 특성은 형광 강도이다. 복수조 내의 분자 태그 중 하나 또는 2 또는 그 이상이 동일한 이동 또는 체류 시간을 가질 수 있지만, 이들은 특유의 형광 특성, 예를 들어 스펙트럼에 의해 분해가능한 방출 스펙트럼을 가질 것이고, 그에 의해 복수조 내의 모든 구성원은 분자 분리 및 형광 측정의 조합에 의해 구분가능하다.
바람직하게는, 방출된 분자 태그는 전기영동 분리 및 검출기의 형광에 의해 검출된다. 그러한 실시양태에서, 실질적으로 동일한 형광 특성을 갖는 분자 태그는 상이한 전기영동에 의한 이동성을 가져서, 분리 조건 하에 전기영동도 내에 별개의 피크가 형성된다. 바람직하게는, 복수의 본 발명의 분자 태그는 통상적인 체 (sieving) 매트릭스의 존재 또는 부재 하에 통상적인 모세관 전기영동 기기에 의해 분리된다. 전기영동 분리 동안 또는 그 후에, 분리된 화합물의 형광 신호 및 이동 시간 (또는 이동 거리)을 기록함으로써 또는 분자 태그의 상대 형광 및 이동 순서의 도면을 제작함으로써 (예를 들어, 전기영동도) 분자 태그를 검출 또는 확인한다. 바람직하게는, 분자 태그의 존재, 부재 및/또는 양은 하나 이상의 표준물을 사용함으로써 측정된다.
"절단-유도 모이어티", 또는 "절단제"는 바람직하게는 산화에 의해 절단가능한 연결을 절단할 수 있는 활성종을 생산하는 기이다. 바람직하게는, 활성종은 그의 절단-유도 효과가 단지 그의 생성 부위 부근에만 이르도록 수명이 짧은 활성을 보이는 화학물질종이다. 활성종은 고유하게 수명이 짧아서, 그의 생성 부근을 넘어서는 유의한 배경을 생성하지 않을 것이거나, 또는 활성종을 효율적으로 청소하는 스캐빈저 (scavenger)가 사용되어서, 그의 생성 부위로부터 짧은 거리를 넘어 절단가능한 연결기와 반응하기 위해 이용가능하지 않게 된다. 예시적인 활성종은 일중항 산소, 과산화수소, NADH 및 히드록실 라디칼, 페녹시 라디칼, 수퍼옥시드 등을 포함한다. 산화를 일으키는 활성종에 대한 예시적인 켄쳐 (quencher)는 폴리엔, 카로테노이드, 비타민 E, 비타민 C; 티로신, 히스티딘 및 글루타티온의 아미노산-피롤 N-접합체를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Beutner et al, 2000, Meth. Enzymol. 319:226-241] 참조).
절단-유도 모이어티 및 절단가능한 연결을 사용한 분석을 설계하는데 1가지 고려사항은 절단-유도 모이어티에 의해 생성된 활성종이 절단가능한 연결을 효율적으로 절단할 수 없기 때문에 지금까지 수용체 복합체에 결합될 때 서로로부터 제거되지 않는 점이다. 하나의 실시양태에서, 절단가능한 연결은 바람직하게는 결합된 절단-유도 모이어티의 약 1000 nm, 바람직하게는 약 20-200 nm 내에 있다. 보다 바람직하게는, 일중항 산소를 생성하는 광감제 절단-유도 모이어티에 대해, 절단가능한 연결은 수용체 복합체 내에서 광감제의 약 20-100 nm 내에 있다. 당업자는 특정 민감제 (sensitizer)의 유효 근접성이 특정 분석 설계의 상세내용에 따라 결정될 수 있고 일상적인 실험에 의해 결정 또는 변형될 수 있음을 알 것이다.
민감제는 반응성 중간체 또는 종, 대체로 일중항 산소를 생성하도록 유도될 수 있는 화합물이다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용되는 민감제는 광감제이다. 본 발명의 범위에 포함되는 다른 민감제는 열, 빛, 이온화 방사선 또는 화학적 활성화에 의한 여기 시에 일중항 산소 분자를 방출할 화합물이다. 상기 클래스의 화합물의 공지된 최상의 구성원은 엔도퍼옥시드, 예를 들어 1,4-비스카르복시에틸-1,4-나프탈렌 엔도퍼옥시드, 9,10-디페닐안트라센-9,10-엔도퍼옥시드 및 5,6,11,12-테트라페닐 나프탈렌 5,12-엔도퍼옥시드를 포함한다. 가열 또는 이들 화합물에 의한 직접적인 광 흡수는 일중항 산소를 방출시킨다. 추가의 민감제는 문헌 ([Di Mascio et al, 1994, FEBS Lett. 355:287] 및 [Kanofsky, 1983, J.Biol. Chem. 258:5991-5993]; [Pierlot et al., 2000, Meth Enzymol. 319:3-20])에 개시되어 있다.
광감제는 항체에 직접적으로 또는 공유 또는 비-공유 연결을 통해 간접적으로 부착될 수 있다. 그러한 조성물을 제작하기 위한 지침은 예를 들어 광역학 치료법, 면역진단학 등의 분야의 문헌에서 이용가능하다. 예시적인 지침은 문헌 ([Ullman et al, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5426-5430]; [Strong et al., 1994, Ann. New York Acad. Sci. 745: 297-320]; [Yarmush et al., 1993, Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Syst. 10: 197-252]); 및 미국 특허 5,709,994, 5,340,716, 6,251,581, 및 5,516,636에서 찾을 수 있다.
일중항 산소를 생성하도록 광감제를 광활성화시키기 위해 매우 다양한 광원이 이용될 수 있다. 광원이 실용적인 기간 동안 충분한 일중항 산소를 생산하기에 충분히 강력한 한 다색 및 단색 광원이 모두 사용될 수 있다. 광조사 길이는 광감제의 특성, 절단가능한 연결의 특성, 조사 광원의 출력, 및 샘플로부터의 거리에 따라 결정된다. 일반적으로, 광조사 기간은 약 1초 미만 내지 약 3시간까지일 수 있고, 대체로 15분 내지 2시간 범위이다. 예시적인 광원은 레이저, 예를 들어 헬륨-네온 레이저, 아르곤 레이저, YAG 레이저, He/Cd 레이저 및 루비 레이저; 광다이오드; 수은, 나트륨 및 제논 증기 램프 및 백열 램프, 예를 들어, 텅스텐 및 텅스텐/할로겐 및 플래시램프를 포함한다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 예시적인 광활성화 장치는 임의의 도면을 포함하여 본원에 참고로 포함된 국제 특허 공개 WO 03/051669에 개시되어 있다. 그러한 실시양태에서, 광활성화 장치는 96-웰 플레이트 내의 모든 웰의 동시 조명을 허용하는 하우징 (housing) 내에 장착된 발광 다이오드 (LED)의 어레이이다.
본 발명에서 사용될 수 있는 광감제의 예는 상기 특성을 갖는 것 및 임의의 도면을 포함하여 그 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,536,834, 5,763,602, 5,565,552, 5,709,994, 5,340,716, 5,516,636, 6,251,581 및 6,001,673; 유럽 특허 출원 공개 0484027; 문헌 ([Martin et al, 1990, Methods Enzymol. 186:635-645] 및 [Yarmush et al, 1993, Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Syst. 10:197-252])에 개시된 것이다. 특정 실시양태에서, 민감제에서 사용할 때, 광감제는 지지체의 표면에 공유 또는 비-공유 부착시킴으로써 또는 지지체의 몸체 내에 포함시킴으로써 고체상 지지체와 회합될 수 있다. 일반적으로, 광감제는 필요량의 일중항 산소를 달성하기 위해 충분한 양으로 지지체와 회합된다. 일반적으로, 광감제의 양은 일상적인 방법에 따라 경험적으로 결정된다.
이어서, 절단 후에, 방출된 분자 태그의 정체를 결정하기 위해 샘플을 분석할 수 있다. 복수의 결합 화합물을 사용하는 분석이 이용되는 경우에, 분자 태그의 분리는 일반적으로 그들의 검출에 앞설 것이다. 분리 및 검출 모두를 위한 방법은 분석을 위한 분자 태그의 설계 공정에서 결정된다. 바람직한 분리 방식은 전기영동을 이용하고, 여기서 다양한 태그가 전기영동에 의한 이동성의 공지의 차이에 기초하여 분리된다.
제2 측면에서, 본 발명은 대상체의 암으로부터의 생물학적 샘플 내에서 Her-3의 양을 측정하는 것을 포함하는, 질병의 시간 경과를 예측하기 위해 및/또는 대상체의 암의 시간 경과에서 유의한 사건의 확률을 예측하기 위해 암이 있는 대상체가 표적화된 요법제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는지를 결정하는 방법에 관한 것이고, 여기서 방법은 Her-3의 수준에 의존적이다.
특정 실시양태에서, Her-3의 수준이 높으면, 환자는 표적화된 요법제에 반응할 가능성이 더 작거나 반응할 가능성이 있지 않다. 특정 실시양태에서, Her-3 수준이 낮으면, 환자는 표적화된 요법제에 반응할 가능성이 더 크다. 특정 실시양태에서, 본원에서 보다 상세히 설명한 바와 같이, 요법제는 Her 작동제이다. 추가의 실시양태에서, 요법제는 HER-2 작동제 또는 HER-3-표적화제 중 적어도 하나이다.
특정 실시양태에서, 유방암은 조기 (즉, 보조) 유방암 또는 전이성 유방암이다. 특정 실시양태에서, 유방암에서 Her-2의 발현 수준은 높다. 특정 실시양태에서, 높은 Her-2 발현은 log10H2T ≥ 약 1.14 - 1.25이다. 특정 실시양태에서, 높은 Her-2 발현은 매우 높은 및/또는 비교적 높은 발현을 포함한다. 특정 실시양태에서, 매우 높은 Her-2 발현은 log10H2T ≥ 약 1.84 - 2.21이다. 또는, 환자 코호트에 따라 다른 범위가 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 시간 경과는 환자의 질병의 경과에서 유의한 사건들 사이의 시간을 결정함으로써 측정되고, 여기서 측정치는 환자가 긴 시간 경과를 갖는지의 예측이다. 바람직한 실시양태에서, 유의한 사건은 일차 진단으로부터 사망으로의 진행이다. 바람직한 실시양태에서, 유의한 사건은 일차 진단으로부터 전이성 질병으로의 진행이다. 바람직한 실시양태에서, 유의한 사건은 일차 진단으로부터 재발로의 진행이다. 바람직한 실시양태에서, 유의한 사건은 수술로부터 사망으로의 진행이다. 바람직한 실시양태에서, 유의한 사건은 수술로부터 재발로의 진행이다. 바람직한 실시양태에서, 유의한 사건은 수술로부터 전이로의 진행이다. 바람직한 실시양태에서, 유의한 사건은 전이성 질병으로부터 사망으로의 진행이다. 바람직한 실시양태에서, 유의한 사건은 전이성 질병으로부터 재발로의 진행이다. 바람직한 실시양태에서, 유의한 사건은 재발로부터 사망으로의 진행이다. 바람직한 실시양태에서, 시간 경과는 전체 생존율, 질병 진행까지의 시간에 관하여 및/또는 RECIST 또는 다른 반응 기준을 이용하여 측정된다.
Her-3 베라태그® 분석을 사용하여 국제 혈청 Her-2/neu 연구군 시험으로부터의 환자의 코호트에서 Her-3 수준을 검사하였다. 이들 환자 (n=105)는 주로 중심 지역에서 1명의 병리학자가 수행한 Her-2 양성에 대해 IHC에 의해 선택하고, 모두 트라스투주맙을 투여하였다. Her-2 과다발현 종양 (HercepTest에 의해 결정할 때 종양 세포의 >10%가 IHC 3+임) 및/또는 ErbB2-증폭된 (모든 IHC 2+ 사례에 의무적인 양성 FISH 시험으로) 전이성 유방암이 있는 환자만을 본 연구에 포함시켰다 (추가의 상세사항은 실시예 14 참조). Her3 베라태그® 분석을 이들 환자 샘플에 대해 수행하고, 분석을 수행한 105개의 샘플 중에서, 85개는 검출 한계를 넘는 측정가능한 Her-3 수준을 보였다 (8개는 검출가능한 종양이 없었고, 1개의 샘플은 플루오레세인이 실패하였고, 8개의 샘플은 검출 한계 미만이고 분석에서 낮은/음성으로 간주되었다). 결과를 도 13에 도시한다.
Her-3 수준 및 특히 Her-2 양성 종양에서 Her-3 수준은 질병 진행의 시간 경과 및 전체 생존뿐만 아니라 치료법에 대한 반응에 관하여, 특히 EGFR-패밀리-표적화된 치료제로부터의 도피에 관하여 예후적 가치를 가짐을 시사하였다. 문헌 ([Sergina et al. (2007) Nature 445:437-441], [Osipo et al. (2007) Int J Oncol. 30:509-520], [De Alava et al. (2007) Clinical Oncol. 25:2656-2663], [Ma and Bose (2008) E-Updates in HER1 and HER2 Targeting in Breast Cancer, Volume 2], [Tovey et al. (2006) J Pathol. 210:358-362], [Menendez and Lupu (2007) Breast Cancer Res. 9:111], [Fuchs et al. (2006) Anticancer Res. 26:4397-4402], [Lee-Hoeflich et al. (2008) Cancer Res. 68:5878-5886])을 참조한다.
Her-3 발현을 EGFR 패밀리 구성원에 대해 표적화된 치료제 (예를 들어, 트라스투주맙, 페르투주맙, 라피티닙, 세툭시맙, 게피티닙 및 에를로니팁) 및 화학치료제로 치료된 환자의 종양을 포함한 많은 암에서 조사하였다. Her-패밀리 구성원 수준을 임상 성과와 비교할 때, 데이타는 Her-3 발현 및/또는 Her-2 및 Her-3의 상대적인 양이 난소암 ([Amier et al. (2008) J Clin. Oncol. 26:abstract 5552], [Amier et al. (2008) Meeting: 2008 Molecular Markers, abstract 25] 및 [Xu et al. (1999) Clin. Cancer Res. 5:3652-3660]) 및 비-소세포 폐암 (Cappuzzo et al. (2005) Brit. J. Cancer 93:1334-1340)에서 예후 및 예측 진단 생체마커로서 유용할 수 있음을 구체적으로 제안한다. 바람직한 실시양태에서, 방법은 Her-2-양성 환자의 샘플군을 다량의 Her-3을 갖는 하나의 하위군 및 소량의 Her-3을 갖는 적어도 하나의 다른 하위군을 포함하는 적어도 2개의 하위군으로 나눔으로써 Her-3의 수준이 높은지 또는 낮은지를 결정하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 Her-3이 낮으면, 환자는 Her-2-표적화된 요법제에 반응할 가능성이 있고, 질병의 시간 경과는 길 가능성이 있고, 환자는 유의한 사건을 보일 가능성이 없다. 바람직한 실시양태에서, 대상체의 암은 유방암, 결장직장암, 난소암, 방광암, 전립선암, 비-소세포 폐암, 흑색종, 인두암, 췌장암, 식도암, 신경아교종, 담낭 암종, 담도 암종, 담관암, 위암, 자궁내막암, 담낭암, 편평세포 암종 또는 기초세포 암종이다. 바람직한 실시양태에서, 대상체의 암은 유방암, 흑색종, 결장직장암 또는 난소암이다. 바람직한 실시양태에서, 대상체의 암은 Her-2 양성 유방암이다. 바람직한 실시양태에서, 유방암은 조기 (즉, 보조) 유방암 또는 전이성 유방암이다.
바람직한 실시양태에서, 표적화된 요법제는 적어도 하나의 Her 패밀리-표적화제이다. 바람직한 실시양태에서, Her 패밀리-표적화제는 다중- 또는 단일-표적화제이다. 바람직한 실시양태에서, 다중-표적화제는 이중 키나제 억제제 또는 이중특이적 항체이다. 바람직한 실시양태에서, Her 패밀리 표적화제는 트라스투주맙, 라파티닙 또는 페르투주맙이다. 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 Her 패밀리-표적화제는 적어도 2가지 물질이고, 여기서 적어도 2가지 물질은 하나 이상의 Her-2-표적화 모노클로날 항체 및/또는 EGFR-표적화 모노클로날 항체 및/또는 EGFR 및 Her-2 이중 키나제 억제제이다. 바람직한 실시양태에서, 모노클로날 항체는 트라스투주맙이다. 바람직한 실시양태에서, EGFR-표적화 모노클로날 항체는 세툭시맙 또는 파니투무맙이다. 바람직한 실시양태에서, EGFR-표적화 모노클로날 항체는 잘루투주맙, 니모투주맙, 및 마투주맙이다. 바람직한 실시양태에서, 이중 키나제 억제제는 라파티닙, 에를로니팁 또는 게피티닙이다. 바람직한 실시양태에서, 표적화된 요법제는 Her-3 또는 Her-3 신호전달 경로 작용제이다. 바람직한 실시양태에서, Her-3 또는 Her-3 신호전달 경로 표적화제는 Her-3 모노클로날 항체, Her-3 이량체화 억제제, Her-3 인산화 억제제, 및/또는 PI3K, Akt, mTOR, ERK1/2 또는 PYK2로 이루어지는 군 중에서 선택되는 Her-3 신호전달 경로 구성원의 억제제이다. 바람직한 실시양태에서, 반응할 가능성, 긴 시간 경과를 가질 가능성 및/또는 유의한 사건을 가질 가능성은 전체 생존율로서, 질병 진행까지의 시간으로서, 무병 생존으로서, 무진행 생존으로서, 및/또는 RECIST 기준을 이용한 객관적인 종양 반응으로서 측정된다. 신호 전달은 세포가 한 종류의 신호를 다른 종류로 전환시키는 임의의 공정을 나타낸다. 대개, 이것은 세포 표면 상의 몇몇 종류의 신호 (예를 들어, 세포 표면 수용체에 대한 리간드의 결합)에 이어, 세포 내부의 생화학적 반응의 캐스케이드가 이어지고, 이것은 효소에 의해 수행되어, 신호 전달 경로 또는 신호전달 경로를 생성시키고, 다수의 세포 기능을 수행하는 것을 수반한다. 52티로신 키나제 수용체의 EGFR 패밀리의 경우에, 패밀리 내의 4개의 수용체는 각각 이량체화 도메인 및 리간드-결합 도메인을 모두 포함하는 세포외 도메인뿐만 아니라, 막횡단 도메인 및 티로신 키나제 활성을 갖는 세포내 도메인을 갖는다 ([Burgess et al. (2003) Mol. Cell. 12:541-542] 참조). Her-3에서, 키나제 도메인은 기능성이지 않지만, 다른 패밀리 구성원과의 이량체화를 통해 Her-3은 유의한 신호전달 경로 효과를 발휘할 수 있다. 증거는 다수의 ErbB 수용체 및 리간드의 협력이 세포 형질전환의 개시에 필요함을 제안한다. 활성화될 때, 상기 수용체 패밀리는 신호전달 경로의 복합 네트워크를 유지시킨다. 모든 EGFR 패밀리 구성원은 다양한 암에서 발현 및/또는 변경되는 것으로 밝혀졌고, 증식, 세포자멸 및 전이를 비롯한 종양 발생에서 유의한 역할을 수행할 수 있다 (문헌 ([Burgess (2008) Growth Factors 26:263-274] 및 [Normanno et al. (2006) Gene 366:2-16]) 참조). EGFR 패밀리 구성원 ([Bianco et al. (2007) Int. J. Biochem. Cell. Biol. 39:1416-1431] 참조), 특히 EGFR 및 Her-2의 표적화에 대한 강한 관심으로 몇몇 승인된 표적화된 치료제가 개발되었다. 시험관내 및 생체내 시험 모델 모두에서의 유망한 전임상 데이타에 기초하여, 임상 시험 결과는 다소 실망스러웠고, 따라서 다른 패밀리 구성원, 예를 들어 Her-3, 및 하류 신호전달 경로 구성원에 대한 관심이 증가하게 되었다.
Her-3 신호전달은 암과 연관되었고, 특히, Her-2/Her-3 이량체 형성은 Her-2를 과다발현하는 종양에서 침습 증가를 위해 중요할 수 있고, 따라서 이량체 형성 및 Her-3에 의해 활성화되는 하류 경로를 억제하는 표적화된 치료제에 대한 관심을 유발하였다. Her-3은 차례로 단백질 키나제 B (AKT로도 불림)를 활성화시키는 포스포이노시티드 3'-키나제 (PI3K)를 위한 6개의 결합 부위를 갖기 때문에 신호전달에서 특히 능숙하다. "PI3K/AKT" 신호전달 경로는 신규한 표적화된 치료제를 생성하도록 또는 현재의 EGFR-패밀리 표적화된 치료제의 치료적 가치를 강화하도록 Her-3 및 하류 신호전달 경로 구성원 모두를 표적화하는데 관심을 불러 일으키는, 세포 활성의 극도로 다양한 어레이 (특히 세포 증식 및 생존)를 위해 요구되는 것으로 나타났다 (검토를 위해, 문헌 ([Stern (2008) J Mammary Gland Biol Neoplasia 13:215-223], [Sithanandam and Anderson (2008) Cancer Gene Ther. 15:413-448] 및 [Arkin and Moasser (2008) Curr. Opin. Investig. Drugs 9:1264-1276]) 참조).
바람직한 실시양태에서, 암이 Her-2 양성인지 여부는 IHC, FISH, CISH, 정량적 mRNA, 혼성화 어레이 또는 베라태그®에 의해 결정한다. 바람직한 실시양태에서, Her-3 수준의 결정은 IHC, FISH, CISH, 정량적 mRNA, 혼성화 어레이 또는 베라태그®을 이용하여 수행한다. 바람직한 실시양태에서, 방법은 대상체의 암 내의 Her-3의 양을 소정의 컷오프와 비교함으로써 Her-3 단백질의 양이 낮은지 결정하는 것을 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 방법은 Her-2-양성 환자의 샘플군을 다량의 Her-3을 갖는 하나의 하위군 및 소량의 Her-3을 갖는 적어도 하나의 다른 하위군을 포함한 적어도 2개의 하위군으로 나눔으로써 Her-3의 수준을 결정하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 Her-3이 높으면, 환자는 Her-2-표적화된 요법제에 반응할 가능성이 있지 않고/않거나, 질병의 시간 경과는 짧을 가능성이 있고/있거나, 환자는 유의한 사건을 보일 가능성이 있다.
바람직한 실시양태에서, 방법은 대상체가 본 발명의 방법에 따른 치료에 반응할 가능성이 있지 않은 Her-2 양성 암에 걸렸는지 결정한 후, 의료 전문인에게 대상체에게 유효량의 상이한 치료제를 투여하는 치료 선택사항을 조언하는 것을 추가로 포함한다.
제3 측면에서, 본 발명은 Her-3에 결합하는 정제된 항체에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 실시예 2에 제시되고 도 2a에 도시된 서열 1-8을 갖는 펩티드 중의 하나에 대해 생성된다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (a) 각각 서열 13, 14 및 15에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 각각 서열 16, 17 및 18에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체; 및/또는 (a) 각각 서열 19, 20 및 21에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 각각 서열 22, 23 및 24에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체 (표 1B)이다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 표 1A에 제시된 서열 9 및 11, 및/또는 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 표 1A에 제시된 서열 10 및 12를 갖는 아미노산 서열을 갖는 항체이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 항체를 코딩하는 DNA에 관한 것이다. 당업자에게 일반적으로 공지된 기술을 이용하여, 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA를 단리하고 서열을 결정한다. 단리한 후에, DNA를 발현 벡터 내로 라이게이팅하고, 배양된 세포로부터 재조합 항체를 얻기 위해 적절한 숙주 세포 내로 형질감염시킬 수 있다 ([Plueckthun (1992) Immunological Rev. 130: 151-188] 참조).
당업자는 항체의 아미노산 서열이 변형될 수 있고, 변형이 치료, 분석 또는 진단 용도를 위해 항체의 특성을 향상시키기 위해 바람직할 수 있음을 이해할 것이다. 추가로, 이들 항체 내의 하나 이상의 아미노산은 항체의 결합 특성을 눈에 띄게 감소시키지 않으면서 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변화될 수 있음을 이해할 것이다. 예시적인 아미노산 변화는 유사한 분자 특성을 갖는 아미노산을 사용한 치환 (즉, 보존적 치환, 예를 들어, 방향족 아미노산, 산성 아미노산, 염기성 아미노산, 또는 아미드 또는 황 함유 아미노산의 하위군 내의 아미노산의 변화)일 것이다. 다른 비-보존적 치환 또는 삽입은 분자 일체성 또는 결합 특성을 눈에 띄게 변경하지 않으면서 이루어질 수 있다. 또한, 몇몇 아미노산 변화 또는 일군의 아미노산 변화는 보다 우수한 결합 친화도, 보다 큰 안정성 (예를 들어, 프로테아제에 대한 내성), 선택성 및/또는 생산 용이성을 포함하고 이로 제한되지 않는 항체의 특성을 향상시킬 것이다. 아미노산 서열의 변화 및/또는 보다 우수한 특성을 갖는 분자의 선택 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 바람직하게는, 무손상 항체에서, 변형 후 서열 동일성 정도는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 적어도 90-95%이다. 이들 항체는 각각 고려되는 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
바람직한 실시양태에서, Her-3에 대해 표적화된 항체는 추가의 Her-3 표적화된 분자를 개발하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 항체의 변형은 효과기 기능 증가, 면역원성 감소, 안정성 증가, 약리적 특성, 예를 들어 혈청 반감기의 개선, 및 생산의 용이성과 수율 증가를 포함하고 이로 제한되지 않는 특성의 개선에 바람직할 수 있다. 이들 표적화된 분자는 각각 고려되는 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
바람직한 실시양태에서, 인간 프레임워크 내에 본원에 기재된 항체의 항원 결합 영역 (표 1A 참조)을 포함하는 인간화 항체가 치료 용도를 위해 사용될 수 있다. 항체의 인간화를 위한 몇몇 방법이 보고되었다 (문헌 ([Jones et al. (1986) Nature 321:522-525], [Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327] 및 [Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536]) 참조). 일반적으로, 가변 도메인의 비-인간 서열을, 설치류 서열에 가장 가까운 인간 가변 프레임워크 서열을 찾기 위해 인간 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 서열의 전체 레퍼토리에 대해 컴퓨터에 의해 스크리닝한다 (문헌 ([Sims et al.(1993) J. Immunol. 151:2296-2308], [Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 186:901-917])). 별법으로, 컨센서스 프레임워크를 사용할 수 있다 (문헌 ([Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289] 및 [Presta et al. (1993) J. Immunol. 151:2623-2632]) 참조). 바람직한 실시양태에서, 컴퓨터-보조 디자인을 이용하여, 안정성을 부여하고 결합 특성을 보유 또는 개선하는 서열을 선택한다. 이들은 각각 고려되는 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
또 다른 실시양태에서, Her-3 내의 동일한 에피토프에 결합하지만 천연 항체가 아닌 프레임워크 내에 함유되는 표적화된 결합 분자를 생성하기 위해 항체 CDR을 사용할 수 있다. 예를 들어, 당업자는 프레임워크가 항체의 일부, 예를 들어, scFv 또는 F(ab')2일 수 있는 결합 분자를 생성하기 위한 방법이 이용가능함을 알 것이다 (각각 본원에 참고로 포함된 WO 93/16185 및 문헌 [Carter et al. (1992) Bio/Technology 10:163-167] 참조). 또한, 당업자는 완전히 관련되지 않은 단백질 (예를 들어, 세균 베타-락타마제)이 결합 화합물을 형성하기 위해 결합 도메인(들)을 적절한 표시할 수 있음을 알 수 있다. 이러한 의미에서, 본원에 규정된 관련 항체는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
항체는 단지 결합을 통해 또는 다른 특성 (예를 들어, 효소적 활성 또는 독성 탄두 (warhead))을 통해 치료를 위해 작용할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 표적화된 단백질은 치료 효과, 또는 항원-의존 세포-매개 세포독성 (ADCC) 또는 보체-의존 세포독성 (CDC)을 통한 보다 큰 치료 효과를 발휘하도록 변경될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 독소가 항체 또는 표적화된 단백질에 접합될 수 있다. 예시적인 소분자 독소는 메이탄신, 칼리케아미신 및 CC-1065를 포함하고 이로 제한되지 않는다 (예를 들어, 문헌 [Carter and Senter (2008) Cancer J. 14:154-169] 참조). 추가로, 방사성 표지가 표적화된 치료제를 생성하기 위해 항체에 연결될 수 있다. 생물학적 독소가 또한 표적화된 단백질에 연결될 수 있고, 이는 디프테리아 독소, 슈도모나스 (Pseudomonas) 외독소, 아브린 및 리신을 포함하고 이로 제한되지 않는다 (문헌 [Kreitman (2006) AAPSJ. 18:E532-551] 참조).
추가의 실시양태에서, 표적화된 항체 (또는 그의 단편)은 항체-지향성 효소 전구약물 치료법에 사용하기 위해 효소에 융합될 수 있다 (ADEPT; 문헌 ([Bagashawe (1987) Br. J. Cancer 58:700-703] 및 [Senter et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4842-4846]) 참조). 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 표적화된 단백질은 약리적 특성, 예를 들어 혈청 반감기를 향상시키는 분자, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜에 융합될 수 있다 (문헌 [Harris and Chess (2003) Nat. Rev. DrugDiscov. 2:214-221] 참조).
실시예
본 발명은 다음 비-제한적인 실시예를 참조하여 보다 잘 이해될 수 있다.
실시예 1: 다양한 수준의 HER3 단백질을 발현하는 안정한 세포주의 생성
전장 HER3 (NM_001982.2)에 대한 상업상 이용가능한 cDNA (오리젠 테크놀로지스, 인크. (Origene Technologies, Inc.))를 제한 효소 NotI 및 XbaI로 소화시키고, 생성되는 단편을 pcDNA 3.1 제오신 (Zeocin) 선택가능한 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다. 생성되는 플라스미드를 세균 내로 형질전환시키고, 정확한 삽입체를 확인하기 위해 스크리닝하였다. 양성 클론의 서열을 확인하고, 세균 내에서 팽창시키고, 퀴아젠 (Qiagen) Maxi-prep 키트를 사용하여 플라스미드를 정제하였다. 인간 배아 신장 세포 (HEK-293)를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 구입하고, 10% FBS, 1x 페니실린-스트렙토마이신 (100X는 10,000 U/ml 페니실린-G 및 10,000 ㎍/ml 스트렙토마이신임), 및 글루타맥스 (Glutamax) (깁코 (GIBCO))를 보충한 DMEM 내에서 37℃에서 5% CO2 내에 유지하였다. 형질감염 전일에, 세포를 약 25-30% 융합상태 (confluence)로 쪼개고, 페니실린-스트렙토마이신이 없는 배지 내에서 철야 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포를 제조자의 지시에 따라 Fugene HD (로슈 (Roche))로 형질감염시켰다. 다음날, 배지를 신선한 완전 배지로 교체하고, 세포를 48시간 동안 인큐베이팅한 후, 완전 배지 내의 400 mg/mL 제오신 (인비트로겐 (Invitrogen))을 첨가하였다. 형질감염된 플라스미드를 함유하지 않은 야생형 293 세포에 대해 가변 농도의 제오신을 사용하여 치사 곡선을 수행함으로써 제오신의 농도를 결정하였다. 클로닝 고리 (ring)를 이용하여 약 16개의 제오신-내성 클론을 단리하고 액체 질소 내에 동결시켰다. 원래의 클론의 하위세트를 성공적으로 팽창시키고, 제조사의 지시에 따라 HER3-특이적 ELISA 키트 (R&D 시스템즈, 인크.)를 사용하여 시험하고, HER3을 과다발현하는 것으로서 확인할 수 있었다 (도 1). ELISA에 의해 입증할 때 높은 수준의 HER3 발현을 갖는 하나의 클론 (293-H3 클론 1)을 최적화된 분석에 사용하기 위한 대조군으로서 선택하였다.
실시예 2: HER3 에 대한 항체의 생성 및 스크리닝
HER3의 세포질 말단에 에피토프 특이성을 갖는 HER3-특이적 모노클로날 항체 (Ab-6)는 랩 비젼으로부터 구입하였다. 이전에 설명된 프로토콜에 따라, 베라태그® 리포터 (Pro11) 및 스트렙타비딘-접합된 메틸렌 블루 ("분자 가위")를 합성하고 정제하였다 (예를 들어, 상기, 및 임의의 도면을 포함한 본원에 참고로 포함된 미국 특허 7,105,308 참조). 항체-베라태그® 및 항체-비오틴 접합체, 즉, Ab6-Pro11 및 B9A11-비오틴을 제조자의 프로토콜에 따라 술포-NHS-LC-LC-비오틴 (피어스 (Pierce))을 링커로서 제조하고, 접합 생성물을 HPLC (애질런트 (Agilent))에 의해 정제하였다. 일련의 독점소유의 항체를 다음과 같이 생성하였다. 마우스를 고정된 293 클론 13 세포, 또는 HER3 단백질의 C-말단 영역 내에 포함된 상이한 에피토프를 나타내는 일련의 펩티드로 면역화시켰다 (도 2a). 면역화 기간 동안, 각각의 마우스를 4주 기간에 걸쳐 수회 면역화시켰다. 하이브리도마가 생산되고, 제한 희석을 이용하여 클론을 단리하였다. 개별 클론으로부터 조건화 배지를 CellSpot™ 또는 ELISA 스크리닝을 포함한 일련의 분석에 의해 프로파일링하고, 이어서 스케일-업 (scale-up)시킨 후, 면역조직화학 (IHC)에 의해 추가로 스크리닝한 후 (도 2b), 마지막으로 화학 방출 방법 (메틸렌 블루) (도 2c) 또는 이중-항체 광 방출 방법 (도 2d)을 이용하는 베라태그® 기술을 수행하였다. 이들 방법을 이용하여 잘 수행되는 몇몇 항체를 도 2a에 제시한다. 하나, 특히, B9A11이 가장 강건하고, 최상의 동적 범위 및 민감도를 제공하고, 아래 실시예 5에 기재된 바와 같이 최종 분석 포맷을 개발하기 위해 진척되었다.
실시예 3: FACS 및 ELISA 에 의해 상이한 수준의 HER3 을 발현하는 세포주의 패널로부터 블록 및 FFPE 섹션의 생성.
HER3 단백질, MDA-MB-453, MDA-MB-468 및 SKOV-3을 상이하게 발현하는 3가지 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 구입하였다. MDA-MB-453 및 MDA-MB-468 세포주를 둘베코 개질 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)), 10% FBS, 1x 페니실린-스트렙토마이신 및 1x 글루타맥스 내에서 37℃ 및 5% CO2에서 유지하였다. SKOV3 세포를 10% FBS, 1x 페니실린-스트렙토마이신 및 1x 글루타맥스 (깁코)를 보충한 맥코이 (McCoy)의 5a 배지 내에서 37℃ 및 5% CO2에서 유지하였다. 293-H3 클론 1 세포를 10% FBS, 1x 페니실린-스트렙토마이신 및 1x 글루타맥스를 보충한 DMEM 내에서 37℃ 및 5% CO2에서 유지하였다. 세포를 각각의 세포주에 대해 적어도 10개의 500 mm 배양 플레이트 상에서 거의 융합상태로 성장시켰다. 배지 제거 후에, 세포를 차가운 1x PBS로 1회 세척하고, 15 mL의 1x 펜-픽스 (Pen-fix) (써모 사이언티픽 (Thermo Scientific))를 각각의 플레이트에 첨가하였다. 세포를 스크래핑하고, 세포 용액을 4℃에서 철야 (>16시간) 고정시켰다. 철야 고정 후에, 세포를 3200 x g에서 15 min 동안 원심분리하였다. 세포 펠렛을 고무 O-링에 옮기고, 여과지로 싸고, 처리 카세트에 넣었다. 처리를 위해 자동 Tissue-Tek 프로세서 (processor)를 사용하였다. 간단히 설명하면, 세포 펠렛을 증가하는 농도의 알콜, 클리어-라이트 (Clear-rite) (자일렌 대체물) 및 파라핀에 노출시켰다. 처리 후에, 펠렛을 파라핀 포매 스테이션을 사용하여 블록 내에 포매하였다. 세포 펠렛 처리를 위해 사용된 모든 용매는 리챠드-알렌 사이언티픽 (Richard-Allen Scientific)으로부터 입수하였다. 다음 방법에 의해 유동 세포측정을 이용하여 동일한 로트의 세포의 비율을 HER3 수용체수에 대해 시험하였다. 상업상 이용가능한 ELISA 키트를 사용하고 제조자의 권고에 따라 (Human ErbB3-DuoSet ELISA; R&D 시스템즈), HER3 수용체 수준을 정량하기 위한 세포의 제제로부터 전체 세포 용해물을 제조하였다. 두께 7 ㎛의 절편을 박절기 (LEICA)로 슬라이싱하고, 양전기로 대전시킨 유리 슬라이드 (VWR) 상에 놓았다. 슬라이드를 30 min 동안 공기-건조시킨 후, 가열 오븐 내에서 70℃에서 1.5 hr 동안 구웠다. 모든 샘플 슬라이드를 향후 분석을 위해 4℃에서 저장하였다. ELISA, 유동 세포측정, IHC 및 베라태그® 비교의 결과를 도 3에 제시한다.
실시예 4: 상업상 이용가능한 유방암 FFPE 절편으로부터 절편의 생성
FFPE 유방암 블록을 아스터란드 (Asterand)로부터 구입하였다. 두께 5 ㎛의 절편을 박절기 (LEICA)로 슬라이싱하고, 양전기로 대전시킨 유리 슬라이드 (VWR) 상에 놓았다. 절편을 30 min 동안 공기-건조시킨 후, 오븐 내에서 70℃에서 1.5 hr 동안 구웠다. 모든 샘플 슬라이드를 향후 분석을 위해 4℃에서 저장하였다. 임상 물질로부터의 앞서 절편화된 유방 종양을 또한 이들 연구를 위해 사용하였다. 유리 슬라이드 상의 H & E 염색된 종양의 예를 도 4에 제시한다.
실시예 5: 포르말린 고정되고 파라핀 포매된 ( FFPE ) 세포주 및 유방 조직에서 Her -3 베라태그® 분석
FFPE 샘플을 파라핀 제거하고 일련의 용매를 사용하여 재수화시켰다. 간단히 설명하면, 슬라이드를 자일렌 (2x, 5 min), 100% 에탄올 (2x, 5 min), 70% 에탄올 (2x, 5 min) 및 탈이온수 (2x, 5 min) 내에 순차적으로 흡수시켰다. 재수화시킨 샘플의 열-유도된 에피토프 회복은 압력솥 (바이오케어 (Biocare))을 사용하여 250 mL의 1x DAKO (pH 9.0) (랩 비젼)을 담은 슬라이드 홀더 내에서 수행하였다. 30 min 동안 실온에서 냉각시킨 후에, 슬라이드를 탈이온수로 1회 세정하였다. 슬라이드 상에 시약을 보유시키기 위해 소수성 펜 (자이메드 (Zymed))을 사용하여 슬라이드 상에 소수성 원을 그렸다. 이어서, 샘플을 1% 마우스 혈청, 1.5% BSA, 및 1x PBS 중 프로테아제 및 포스파타제 억제제 (로슈)의 칵테일을 함유하는 차단 버퍼로 1시간 동안 차단하였다. 흡인을 이용한 차단 버퍼의 제거 후에, 차단 버퍼 내에 제조된 베라태그®-접합된 (Ab-6: 랩 비젼, 1 ㎍/mL) 및 비오틴-접합된 (B9A11; 모노그램 프로프리어터리 (Monogram proprietary), 2 ㎍/mL) 항체의 혼합물을 첨가하고, 결합 반응물을 진팅하면서 4℃에서 가습 챔버 내에서 철야 인큐베이팅하였다. 항체 혼합물을 흡인시키고, 샘플을 1x PBS 내에 0.25% TritonX-100을 함유하는 세척 버퍼로 세척하고 스트렙타비딘-접합된 메틸렌 블루를 1x PBS 내에 2.5 ㎍/mL의 농도로 첨가하였다. 실온에서 1 hr 인큐베이팅 후에, 과잉의 스트렙타비딘-메틸렌 블루 시약을 흡인시키고, 샘플을 세척 버퍼 내에 1회 세척한 후, 탈이온수로 3회 교환하였다. 0.01x PBS 내의 3 pM 플루오레세인 및 2개의 CE 내부 마커 (MF 및 ML)를 함유하는 조명 버퍼를 샘플 절편 상에 첨가하였다. 결합된 베라태그®를 전자 냉각기 블록 (토레이 파인 사이언티픽 (Torrey Pine Scientific))가 장치된 사내 LED 어레이 일루미네이터를 사용하여 광활성화된 절단에 의해, ~4℃에서 방출시켰다. 조명 후에, 베라태그® 중간체를 수소화붕소나트륨의 첨가에 의해 정량가능한 형태로 환원시킨다. 방출된 베라태그® 리포터를 함유하는 CE 샘플을 슬라이드 상의 상기 조직 절편으로부터 수집하고, CE 샘플 내의 방출된 베라태그® 리포터를 분리하고 30℃에서 6 kV 및 50초의 CE 주입 조건 하에 ABI3130 CE 기기 (22-cm 모세관 어레이; 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems)) 상에서 검출하였다. 임상 실험실에서 H3T 분석의 전반적 흐름도를 도 5에 예시한다.
실시예 6: CE 피크 분석, 종양 영역 표준화 및 배치 표준화
베라태그® 인포머 (Informer) 소프트웨어를 이용하여 베라태그®의 확인 및 정량을 수행하였다 (예를 들어, 미국 특허 공개 2007-0203408-A1 참조). 비처리 CE 전기영동도에서 베라태그® 신호를 분석하기 위해, 2개의 CE 내부 마커, MF (제1 마커) 및 ML (마지막 마커)을 사용하여, 2개의 마커에 비해 그들의 전기영동에 의한 이동성 또는 이동 시간, t에 따라 베라태그® 피크를 확인하였다. 즉, [t(베라태그®)-t(MF)]/[t(ML)-t(MF)]. 이어서, 확인된 베라태그® 피크를 각각의 베라태그®에 대해 피크 면적 계산에 의해 정량하였다. 조직 절편으로부터 베라태그® 회수의 가변성, 및 모세관 어레이에 가로질러 CE 주입 효율 및/또는 검출 민감도에서 실행 가변성에 대해 교정하기 위해, 플루오레세인 (3 pM)을 조명 버퍼 내에 포함시키고, 각각의 샘플 실행에서 내부 참조 대조물로서 동시-전기영동하였다. 이어서, 내부 플루오레세인 피크 (플루오레세인 피크 면적/3 pM)에 대한 베라태그® 피크 (베라태그® 피크 면적)의 면적 표준화에 의해, 각각의 베라태그® 피크의 면적을 RFU 또는 RPA로서 보고하였다. 이것은 가변적인 종양 샘플에 대해 RPA*IB vol/TA (= [상대 피크 면적 x 샘플 절편 상에 로딩된 조명 버퍼 부피 (IB)]÷종양 면적 (mm2) (RPA*IB vol/TA = pmole/L*L/mm2 = pmole/mm2)로서 정량되었다. 구체적으로, 베라태그® 리포터의 CE 형광 신호 강호, 또는 피크 면적 (PA베라태그 ®)이 시간에 걸쳐 통합된 상대 형광 단위 (신호 높이)로서 주어진다 (RFU-S/S). 상대 피크 면적 (RPA베라태그 ®은 베라태그® 피크 면적 (PA베라태그 ®)을 공지의 농도의 내부 플루오레세인 표준물 (PAF)에 관하여 표준화함으로써 측정되고, 따라서 측정되는 분석물의 초기 농도에 비례한다. 베라태그®분석 신호는 종양 함량과 비례하는 정량적 판독치이고, 임상 샘플을 가로질러 베라태그® 분석 신호의 정확한 비교에는 상기 파라미터의 차이에 대한 조정을 필요로 한다. 따라서, 종양 함량은 샘플 베라태그® 분석 신호 데이타 수집에 대해 측정하고, 종양 함량은 베라태그® 분석 결과를 표준화하기 위해 사용된다. 종양 샘플이 매우 작거나 매우 큰 경우에, 반응 부피 (즉, 항체, 스트렙타비딘-접합된 메틸렌 블루 및 조명 버퍼 시약의 부피)가 조정되고, 상기 조정은 종양 함량 표준화에 반영됨을 알아야 한다. 이동 시간, 플루오레세인, 조명 버퍼 및 종양 영역에 대해 베라태그® 피크 면적을 조정한 후, 대조군 및 샘플을 그들의 조정된 피크 면적에 각각의 계산된 배치 표준화 인자 (BNF)를 곱함으로써 표준화한다. 각각의 조정된 RPA 값에 각각의 BNF를 곱하여 표준화된 RPA 값을 얻는다. 상기기 표준화된 RPA 값은 정의상 단위가 없기 때문에, 그의 값을 베라태그® 단위로서 언급한다. 주어진 샘플에 대한 모든 보고가능한 (실패하지 않은, 및 포화되지 않은) 표준화된 값을 평균하여 그 샘플에 대한 최종 값을 결정한다.
데이타가 최고 품질인 것을 보장하기 위해 다양한 품질 관리 점검사항을 개발하였다.
1. 범위 밖의 플루오레세인. 범위 밖의 플루오레세인을 갖는 샘플 흔적 (trace)은 실패이다. 플루오레세인 범위는 조정된 플루오레세인 값의 중앙값 +/- XX%를 이용하여 계산한다. XX% 값 (대개 20-40%)은 조정가능하고, 개별 템플레이트와 연관된다. 피크의 절대 높이가 >7000 단위이면 샘플 피크는 실패이고, 이를 포화된 피크로서 칭한다.
2. RPA는 0.03보다 더 크거나 같아야 한다.
3. RPA <0.03 때문에 희석되지 않은 전환된 피크 샘플이 실패인 경우에, 모든 상응하는 전환된 피크 희석된 샘플은 또한 실패이다.
4. 적어도 2개의 전환된 피크 대조군은 전환된 피크 배치 표준화가 진행하기 위한 값을 불러야 한다.
5. 불량한 흔적 품질을 갖는 샘플 또는 대조군은 실패이다.
6. 조명 버퍼 단독의 대조군이 오염이 있는 경우에, 흔적 품질이 영향을 받을 수 있으면, 예를 들어, 오염 피크가 방출된 피크와 겹치면 샘플은 실패일 수 있다.
7. 불량한 배치 표준화를 갖는 배치는 실패이다.
8. 비정상적으로 높은 배치 표준화 인자를 갖는 배치는 실패이다.
각각의 샘플에 대해, 베라태그® 분석 후에, 종양 세포의 존재를 보장하기 위해 및 종양 영역의 평가를 가능하게 하기 위해 H&E (헤마톡실린 및 에오신) 염색 및 평가를 수행한다. 표준 절차를 이용하여 이들 슬라이드를 파라핀 제거하고, 수화시키고, 염색한 후 탈수하고, 장착한 후 현미경 조사를 수행한다.
실시예 7: 동적 범위의 증가를 위한 항체 농도의 최적화
Ab-6 및 B9A11 항체의 최적 농도는 분석의 전체 동적 범위에 걸쳐있는 세포주 패널 (293H3-클론 1, MDA-MB-453, MDA-MB-468, 및 SKOV3)에 대해 베라태그® 총 HER3 분석 (상기 설명함)에서 최종 농도를 변화시킴으로써 결정하였다. 이어서, 이들 결과를 동일한 세포주 FFPE 블록 제제로부터의 HER3 유동 세포측정 및 ELISA 결과에 기초한 예상된 배수 변화와 비교하였다. 도 6에 제시된 바와 같이 상기 동일한 세포주 세트에서 ELISA 및 유동 세포측정에 의한 예상된 배수 변화에 비해 HER3의 정확한 검출에 기초하여 수행을 위해 2 mg/mL B9A11-비오틴 및 1 mg/mL의 Ab-6 Pro-11의 최적 농도를 선택하였다 (여기서, 2:1 비의 B9A11 대 Ab-6에 원을 그렸다).
실시예 8: 총 HER3 베라태그 ® 분석의 정확성
4개의 잘 특성화된 세포주 (293H3-클론 1, MDA-MB-453, MDA-MB468, MDA-MB-231 및 SKOV3)로부터 3개의 성공적인 복제물을 이용하여 총 HER3 베라태그® 분석의 하나의 배치를 수행한 후, 베라태그® 측정의 정확성에 대해 사내 생성된 유동 세포측정 및 ELISA 데이타와 비교하였다. 결과의 100%가 293H3-클론 1 > MDA-MB-453 > MDA-MB-468 > SKOV3인 점에서 유동 세포측정 및 ELISA로부터의 사내 데이타와 일치하였다. 임의의 4개의 세포주 샘플에 대한 신호 수준들 사이에서 오버랩은 관찰되지 않았고, 즉, 각각의 세포주는 완전히 분리되었다. 총 HER3 수준에 대한 내부 데이타세트는 ELISA 및 유동 세포측정 모두에 의해 생성되었다. 4개의 정확성 세포주에 대한 결과를 도 7에 제시한다. HER3 유동 세포측정의 결과는 동일한 순위 순서 (rank order) 보존이 이들 교차-검증 기술을 이용함으로써 입증된 점에서 HER3 ELISA의 결과와 매우 유사하였다.
실시예 9: 총 HER3 베라태그 ® 분석의 민감도
총 HER3 베라태그® 분석의 민감도는 낮은 HER3 발현 대조군 세포주, MDA-MB-468의 8개의 복제물을 함유하는 하나의 배치를 낮은/음성 HER3 발현 대조군 세포주, SKOV3의 8개의 복제물과 비교함으로써 결정하였다. MDA-MB-468의 각각의 복제물에 대한 값을 쌍별 비교에 의해 SKOV3 복제물과 비교하여, 민감도를 결정하였다. MDA-MB-468 및 SKOV3 사이의 100% (64/64)의 쌍별 비교로 MDA-MB-468 > SKOV3을 얻었다 (도 8).
실시예 10: 총 HER3 베라태그 ® 분석의 재현성
상이한 기기 (CE, 일루미네이터), 몇몇 오퍼레이터를 사용하고 4주 기간에 걸쳐 분석을 수행하여, 4개의 잘 특성화된 세포주 (293H3-클론 1, MDA-MB-453, MDA-MB-468 및 SKOV3)에 대해 상기 설명한 바와 같은 총 HER3 베라태그® 분석의 8개의 별개의 배치를 수행함으로써 분석간 재현성을 결정하였다. 배치 표준화 절차 후에, 8개의 배치를 걸쳐 데이타를 비교하여 재현성을 결정하였다. 동적 범위 전체에서 재현성은 8-15%이었다 (도 9 참조).
실시예 11: 총 HER3 베라태그 ® 분석의 정밀도
분석내 재현성은 총 HER3 베라태그® 분석의 1 배치/세포주를 수행하고, 각각의 3개의 대조군 세포주 (293H3-클론 1, MDA-MB-453, MDA-MB-468)의 15개의 복제물의 수행을 비교함으로써 결정하였다. 각각의 배치에서 15개의 복제물의 쌍별 비교를 수행하여 분석의 정밀도를 결정하였다. 293H3-클론 1 데이타의 95%가 1.2배 내에 있고, MDA-MB-453 데이타의 100%가 1.23배 내에 있고, MDA-MB-468 데이타의 95%가 1.37배 내에 있었다. 결과를 도 10에 제시한다.
실시예 12: 총 HER3 베라태그 ® 분석의 선형성.
HER3 베라태그® 결과의 선형성은 잘 특성화된 세포주 대조군 (293H3-클론 1, MDA-MB-453, MDA-MB-468)을 취하고, 1, 1/2, 1/4, 1/16의 치수를 갖는 FFPE 절편을 생성하기 위해 연속적인 "컷-다운 (cut-down)" 실험을 수행함으로써 결정하였다. 이어서, 이들 "컷-다운" 절편을 H3T 베라태그® 분석으로 실행하고, 절편 크기에 관하여 분석의 선형성을 이해하기 위해 최종 절편 면적 표준화된 데이타를 쌍별 방식으로 비교하였다 (도 11). MDA-MB-453은 낮은 쪽으로 원래 절편 크기의 약 1/16까지 선형인 반면, MDA-MB-468은 낮은 쪽으로 원래 절편 크기의 1/2까지 선형이었다. 결과를 도 11에 제시한다.
실시예 13: 총 HER3 베라태그 ® 분석의 특이성
환자 유래의 종양 샘플 및 세포주 대조군을 베라태그® 총 HER3 분석을 이용하고 이소형 대조군 항체를 사용하여 실행하였다. HER3 Ab-6-Pro11에 대해, 매칭된 이소형 대조군은 IgG1-Pro11이었다. HER3 B9A11-비오틴에 대해, 매칭된 이소형 대조군은 또한 IgG1-비오틴이었다. 이들 반응으로부터의 신호는 항원-특이적이 아니고, 비-특이적 배경을 나타낼 것이다. 샘플을 다음 3가지 포맷의 각각으로 실행하고, 동일한 배치 내에서 나란히 실행하였다:
포맷 1: HER3 Ab6-Pro11/B9A11-비오틴 (정상 포맷)
포맷 2: HER2 Ab6-Pro11/IgG1-비오틴
포맷 3: IgG1-Pro11/B9A11-비오틴.
각각의 IgG1 포맷 (포맷 2 및 포맷 3)으로부터의 샘플 결과를 각각의 배치 내에 존재하는 음성 대조군, SKOV3에 비교하였다 (비교 파라미터 A). 샘플 결과를 또한 각각의 실제 총 HER3 신호 (포맷 1)에 비교하였다. 결과를 도 12에 제시한다.
실시예 14: 임상 유방 종양 및 동적 범위의 측정
연구 집단은 1999년 내지 2006년 사이에 단일 시설에서 트라스투주맙-기반 치료법 동안 전향적으로 관찰한 환자 (n=105)를 포함하였다 (국제 혈청 Her-2/neu 연구군 시험). HER-2/neu-과다발현 (HercepTest에 의해 결정할 때 종양 세포의 >10%가 IHC 3+임; 다코 다이아그노스틱스 (DAKO Diagnostics, 오스트리아)) 및/또는 ERBB2-증폭된 (모든 IHC 2+ 사례에 의무적인 양성 FISH 시험으로) MBC이 있는 외래환자 (ECOG PS 0-2, >18세 이상, 추정 평균 여명 >12주)만이 포함되었다. 또한, 환자는 트라스투주맙-나이브 (naive)이고 치료의 개시 전 4주 이내에 2차원으로 측정가능한 질병 진행을 갖는 것이 요구되었다 (앞서 방사선조사된 병변 제외). 상기 연구군 시험으로부터의 샘플을 8개의 별개의 배치에서 H3T 베라태그® 분석으로 실행하였다. 각각의 배치에 대해, CE 피크 분석 및 종양 영역 분석을 수행하고, 그에 따라 배치를 표준화하였다. 분석에서 실행된 105개의 환자 샘플 중에서, 85개의 샘플은 검출 한계를 넘는 측정가능한 H3T 수준을 보였고, 8개의 환자 샘플에는 검출가능한 종양이 없었고, 1개의 샘플은 데이타를 제외한 플루오레세인 실패를 나타냈고, 마지막으로 8개의 환자 샘플은 분석의 검출 한계 미만이고 H3T 발현에서 낮은/음성인 것으로 간주되었다. 결과를 도 13에 제시한다.
실시예 15: 트라스투주맙 반응에 대한 최적의 컷오프의 결정
위치 스캐닝 분석을 이용하여, 통계상 유의한 컷오프 위의 환자는 상기 컷오프 아래에 있는 환자에 비해 불리한 질병 진행까지의 시간 (TTP)을 갖는 (도 14), 최적의 컷오프를 결정하였다. 컷오프는 시험된 집단의 결과의 대략 중앙값이었다 (0.158, HR=2.3, p=0.0004). TTP는 트라스투주맙-함유 치료의 개시로부터 진행 (SWOG) 또는 중도절단시까지의 시간으로서 규정되고, OS는 트라스투주맙-함유 치료의 개시로부터 사망 또는 중도절단시까지의 시간으로서 규정되었다. 상기 환자 집단에서 전체 생존을 검토할 때, 유의한 컷오프가 결정되지 않을 수 있지만, OS에서 0.158 컷오프를 사용하는 경향이 있었다 (HR=1.7; p=0.059).
실시예 16: TTP 에 대한 카플란- 마이어 ( KM ) 분석
앞서 보고된 H2T 컷오프 (logH2T ≥ 1.14)를 사용하여 환자를 HER2-정상군 (N=26, 중앙 TTP = 4.1 mos) 및 HER2-과다발현군 (N=55, 중앙 TTP = 11.1 mos, HR=0.43, p=0.0002)으로 세분하였다. HER2-과다발현군에서, 위치 스캐닝에 의해 규정될 때 최적의 컷오프 위의 H3T 발현의 수준 (H3T > 0.158; 도 14)은 컷오프 아래의 H3T 발현 (N=30, 중앙 TTP=13.1 mos, HR=2.7, p=.0002)에 비해 더 짧은 중앙 질병 진행까지의 시간 (N=25, 중앙 TTP = 6.1 mos)을 예측하였다. HER2-과다발현 하위군을 검사하는 단변량 Cox 비례 위험 분석으로 H3T (특정 컷오프 위 대 아래)을 TTP의 가장 유의한 예측인자로서 확인하였다 (HR=2.98, p=0.0004). 이들 결과를 도 15에 제시한다.
실시예 17: 다른 악성종양에서 베라태그 ®에 의한 HER3 총 발현
H3T 베라태그® 분석을 유방암 이외의 많은 상이한 악성종양, 예를 들어 결장 종양, 난소 종양, 활막 종양에 대해 수행하였다 (도 16). 이들 모든 암에 대해 다음 순위 순서 범위로 유사한 동적 범위가 관찰되었다: 난소 암종 > 활막 암종 >/= 결장 암종. 이들 종양에서 동적 범위는 암에 따라 0.5-1.5 로그이다.
실시예 18: P95 와 함께 HER3 의 측정 및 트라스투주맙 반응과의 상관성
앞서 보고된 P95 컷오프 (미국 특허 출원 12/629,037)를 사용하여, 상기 설명된 HER-2 과다발현 환자를 그들의 HER3 수준에 기초한 초기 세분화 후에 추가로 계층화하여, 도 17에 제시된 바와 같은 4개의 환자 하위군을 생성하였다. 위치 스캐닝에 의해 예측된 최적의 컷오프 미만으로서 규정된 낮은 수준의 P95 및 HER3을 갖는 환자는 임의의 다른 하위군보다 더 긴 중앙 질병 진행까지의 시간 (TTP=15.0 mos)을 가졌다 (경향에 대한 로그 순위 검정 p<0.0001). 높은 수준의 P95 및 HER3을 갖는 환자는 최단 중앙 진행까지의 시간 (TTP=3.2 mos)을 가졌다. 결과를 도 17에 제시한다.
실시예 19: HER2 , HER3 및 P95 의 측정 및 트라스투주맙 반응과의 상관성
실시예 17의 환자 집단을 도 18에 제시된 바와 같이 HER2, P95 및 HER3의 수준에 의해 세분하였다. 위치 스캐닝 방법에 의해 규정될 때 HER2-높은, P95-낮은 및 HER3-낮은 환자는 높은 수준의 HER2 및 높은 수준의 HER3 또는 P95 또는 둘 모두를 갖는 환자보다 질병 진행까지의 시간이 더 길었고, 후자는 H2T 베라태그® 분석에 의해 결정할 때 낮은 HER2 값을 갖는 환자와 유사한 질병 진행까지의 시간을 보여준다. 정상 HER2 발현 수준을 갖는 하위군 (H2Tlo) 내에서, FISH-양성 및 FISH-음성군은 유사한 진행까지의 시간을 경험하였다.
본원에서 설명되는 모든 간행물 및 다른 물질은 본 발명을 예시하기 위해 사용되거나 또는 실행에 대한 추가의 상세한 설명을 제공하고, 그 전체가 참고로 포함된다.
ATCC PTA-10574,PTA-10575 20100112
SEQUENCE LISTING <110> Laboratory Corporation of America Holdings Bates, Michael Cook, Jennifer W. Diedrich, Gundo Goodman, Laurie Mukherjee, Ali Parry, Gordon Sperinde, Jeff Williams, Stephen J. <120> METHODS OF DETERMINING PATIENT RESPONSE BY MEASUREMENT OF HER-3 <130> 57618-386600 <150> US 61/145,029 <151> 2009-01-15 <150> US 61/176,630 <151> 2009-05-08 <150> US 61/187,962 <151> 2009-06-17 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Note: Artificial = synthetic construct <400> 1 Leu Gly Ser Ala Leu Ser Leu Pro Val Leu Asn Arg Pro Arg Gly Thr 1 5 10 15 Gly Ser Gln Ser Leu Leu Ser Pro 20 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Note: Artificial = synthetic construct <400> 2 Ser Ala Tyr His Ser Gln Arg His Ser Leu Leu Thr Pro Val Thr Pro 1 5 10 15 Leu Ser Pro <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Note: Artificial = synthetic construct <400> 3 Val Gly Ser Asp Leu Ser Ala Ser Leu Gly Ser Thr Gln Ser Cys Pro 1 5 10 15 Leu His Pro Val Pro Ile 20 <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Note: Artificial = synthetic construct <400> 4 Cys Gln Gly Pro Gly His Gln Ala Pro His Val His Tyr Ala Arg Leu 1 5 10 15 Lys Thr Leu Arg Ser 20 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Note: Artificial = synthetic construct <400> 5 Leu Glu Glu Val Glu Leu Glu Pro Glu Leu Asp Leu Asp Leu Asp Leu 1 5 10 15 Glu Ala Glu <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Note: Artificial = synthetic construct <400> 6 Cys Phe Asp Asn Pro Asp Tyr Trp His Ser Arg Leu Phe Pro Lys Ala 1 5 10 15 Asn Ala <210> 7 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Note: Artificial = synthetic construct <400> 7 Cys Pro Asp Tyr Trp His Ser Arg Leu Phe Pro Lys Ala Asn Ala Gln 1 5 10 15 Arg Thr <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Note: Artificial = synthetic construct <400> 8 Cys Phe Pro Lys Ala Asn Ala Gln Arg Thr 1 5 10 <210> 9 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Note: Artificial = synthetic construct <400> 9 Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys 130 <210> 10 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Note: Artificial = synthetic construct <400> 10 Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ile Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Gly Ala Pro Ser Val Pro 20 25 30 Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser 35 40 45 Leu Leu Gln Asn Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe 85 90 95 Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Gly Leu Lys 130 <210> 11 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Note: Artificial = synthetic construct <400> 11 Met Glu Cys Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Thr Ser Gly 1 5 10 15 Val Tyr Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Val Leu Ala Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Arg Asp Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Glu Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser 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Artificial = synthetic construct <400> 13 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Note: Artificial = synthetic construct <400> 14 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Note: Artificial = synthetic construct <400> 15 Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Trp Thr 1 5 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Note: Artificial = synthetic construct <400> 16 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Note: Artificial = synthetic construct <400> 17 Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Arg Asp Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Note: Artificial = synthetic construct <400> 18 Tyr Tyr Phe Asp Gly Ala Gly Tyr Phe Asp Phe 1 5 10 <210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Note: Artificial = 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Claims (31)

  1. 샘플을 제공하고, 샘플 내에서 Her-3 및/또는 복합체 내의 Her-3의 존재 및/또는 양을 결정하는 것을 포함하는, 환자로부터의 샘플 내에서 Her-3 또는 복합체 내의 Her-3의 존재 및/또는 양을 측정 및/또는 정량하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, Her-3의 수준이 높으면, 환자가 표적화된 요법제에 반응할 가능성이 더 작은 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, Her-3의 수준이 낮으면, 환자가 표적화된 요법제에 반응할 가능성이 더 큰 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 샘플이 종양 샘플인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 샘플이 FFPE 또는 가용화된 FFPE 샘플인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 샘플이 유방암 샘플을 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 측정이 넓은 동적 범위 (dynamic range)에 걸쳐 정량적일 수 있는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 샘플을 결합 화합물과 혼합하고, Her-3 및/또는 복합체 내의 Her-3에 결합된 결합 화합물의 존재 및/또는 양을 결정하는 것을 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 결합 화합물이 Her-3에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 결합 화합물이 항체를 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 항체가 서열 1-8을 갖는 펩티드 중의 하나에 대해 생성되는 것인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 항체가 (a) 각각 서열 13, 14 및 15에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 각각 서열 16, 17 및 18에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체; 또는 (a) 각각 서열 19, 20 및 21에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 각각 서열 22, 23 및 24에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체 중의 적어도 하나인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 항체가 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 서열 9 및 11, 또는 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 표 1에 제시된 서열 10 및 12를 갖는 아미노산 서열을 갖는 항체 중의 적어도 하나인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 방법이 (i) Her-3 및/또는 복합체 내의 Her-3을 함유할 수 있는 샘플; (ii) Her-3에 결합할 수 있는, 유효 근접성을 갖는 근접 (proximity) 프로브; 및 (iii) Her-3에 결합할 수 있고 하나 이상의 신호전달 분자가 부착된 적어도 하나의 결합 화합물을 혼합하는 것을 포함하고, 여기서 유효 근접성 내에서 근접 프로브 및 결합 화합물의 결합은 Her-3 및/또는 복합체 내의 Her-3의 존재 및/또는 양과 상호관련 있는 분자 태그로부터의 신호를 생성하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 근접 프로브 및/또는 결합 화합물이 Her-3 또는 적어도 하나의 다른 분석물에 특이적으로 결합할 수 있는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 근접 프로브 및/또는 결합 화합물이 항체를 추가로 포함하고, 각각의 항체가 Her-3 상의 특이적 에피토프에 결합할 수 있는 것인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 근접 프로브가 절단-유도 모이어티를 갖는 절단 프로브를 포함하고, 적어도 하나의 결합 화합물이 절단가능한 연결에 의해 결합 화합물에 부착된 하나 이상의 분자 태그를 갖고, 여기서 절단가능한 연결이 유효 근접성 내에서 절단될 수 있어서, Her-3의 존재 및/또는 양과 상호관련 있는 신호를 생성하는 것인 방법.
  18. 대상체의 암으로부터의 생물학적 샘플 내에서 Her-3의 양을 측정하는 것을 포함하고 Her-3의 수준에 의존적인, 질병의 시간 경과를 예측하기 위해 및/또는 대상체의 암의 시간 경과에서 유의한 사건의 확률을 예측하기 위해 암이 있는 대상체가 표적화된 요법제를 사용한 치료에 반응할 가능성이 있는지를 결정하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, Her-3의 수준이 높으면, 환자가 표적화된 요법제에 반응할 가능성이 더 작은 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, Her-3의 수준이 낮으면, 환자가 표적화된 요법제에 반응할 가능성이 더 큰 것인 방법.
  21. 제18항에 있어서, 대상체의 암이 유방암, 결장직장암, 난소암, 비-소세포 폐암 또는 위암인 방법.
  22. 제18항에 있어서, 대상체의 암이 조기 (즉, 보조 (adjuvant)) 및 전이성 유방암 중 적어도 하나인 방법.
  23. 제18항에 있어서, 표적화된 요법제가 적어도 하나의 Her 패밀리-표적화제인 방법.
  24. 제23항에 있어서, Her 패밀리-표적화제가 다중- 또는 단일-표적화제인 방법.
  25. 제23항에 있어서, Her 패밀리-표적화제가 이중 키나제 억제제 또는 이중특이적 항체인 방법.
  26. 제23항에 있어서, Her 패밀리-표적화제가 트라스투주맙, 라파티닙 또는 페르투주맙인 방법.
  27. 제18항에 있어서, 반응할 가능성, 긴 시간 경과를 가질 가능성 및/또는 유의한 사건을 가질 가능성이 전체 생존율로서, 질병 진행까지의 시간으로서, 무병 생존으로서, 무진행 생존으로서, 및/또는 RECIST 기준을 이용한 객관적인 종양 반응으로서 측정되는 것인 방법.
  28. 제18항에 있어서, 대상체가 본 발명의 방법에 따른 치료에 반응할 가능성이 있지 않은 Her-2 양성 암에 걸렸는지 결정한 후, 의료 전문인에게 대상체에게 유효량의 상이한 치료제를 투여하는 치료 선택사항을 조언하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  29. 서열 1-8을 갖는 펩티드 중의 하나에 대해 생성된 항체.
  30. 제29항에 있어서, 항체가 (a) 각각 서열 13, 14 및 15에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 각각 서열 16, 17 및 18에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체; 또는 (a) 각각 서열 19, 20 및 21에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 (b) 각각 서열 22, 23 및 24에 제시된 서열을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체 중의 적어도 하나인 항체.
  31. 제29항에 있어서, 항체가 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 서열 9 및 11, 또는 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 서열 10 및 12를 갖는 아미노산 서열을 갖는 항체인 항체.
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