KR20190140944A - ErbB-2, ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진 개체의 치료를 위한, ErbB-2 및 ErbB-3의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합하는 항원-결합 부위를 가진 이중특이적 항체 및 ErbB-2 표적화제 - Google Patents
ErbB-2, ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진 개체의 치료를 위한, ErbB-2 및 ErbB-3의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합하는 항원-결합 부위를 가진 이중특이적 항체 및 ErbB-2 표적화제 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 특히 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 항체에 관한 것이다. 상기 항체는 전형적으로 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포 상에서 ErbB3의 리간드-유도 수용체 기능을 감소시킬 수 있다. 또한, ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/3 양성 종양을 가진 대상의 치료 방법 및 영상화 및 치료에서의 상기 항체의 사용 방법이 개시된다.
Description
본 출원은 2017년 3월 31일자로 출원된 EP 출원 No. 17164396.8 및 2017년 3월 31일자로 출원된 US 15/476260에 대한 우선권을 주장하며, 이들의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명은 항체 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 비정상적 세포를 수반하는 질환의 치료를 위한 치료(사람) 항체의 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 ErbB-2 및 ErbB-3에 결합하는 항체 및 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포, 특히 종양 세포의 결합에서의 이들의 용도에 관한 것이다.
사람 표피 성장인자 수용체 패밀리(HER, ErbB 신호화 네트워크라고도 함)는 경막 수용체 티로신 키나아제(RTK)의 패밀리이다. 이 패밀리는 ErbB-1(또는 HER1)라고도 알려진 표피 성장인자 수용체(EGFR), 및 상동성 수용체 ErbB-2(HER2), ErbB-3(HER3) 및 ErbB-4(HER4)를 포함한다. 이 수용체들은 상피 세포 상에서 널리 발현된다(Yarden and Pines 2012). HER 수용체 또는 이들의 리간드, 예컨대 헤레굴린(HRG) 또는 표피 성장인자(EGF)의 상향조절은 사람의 암에서 빈번히 발생하는 이벤트이다(Wilson, Fridlyand et al. 2012). ErbB-1 및 ErbB-2의 과발현은 특히 상피 종양에서 발생하며 종양 침범, 전이, 화학요법에 대한 내성, 및 불량한 예후와 관련된다(Zhang, Berezov et al. 2007). 정상 유방에서 ErbB-3은 루미날 상피의 성장 및 분화에 중요하다고 밝혀졌다. 예를 들어, ErbB-3의 상실/억제는 루미날 상피 위 기저의 선택적 확장을 가져온다(Balko, Miller et al. 2012).
RTK의 세포외 도메인과 리간드의 결합은 동일한 수용체 서브타입(호모다이머화)과 상이한 수용체 서브타입(헤테로다이머화) 간에 수용체 다이머화를 유도한다. 다이머화는 세포내 티로신 키나아제 도메인을 활성화할 수 있고, 자가인산화를 거친 후, 미토겐-활성화 단백질 키나아제(MAPK) 및 친생존(prosurvival) 경로 AkT에 의해 매개된 것들을 포함하여 많은 하류 전-증식 신호화 경로를 활성화할 수 있다(Yarden 및 Pines, 2012). ErbB-2에 대한 특이적인 내인성 리간드는 확인되지 않았으며, 통상 헤테로다이머화를 통해 신호화하는 것으로 가정된다(Sergina, Rausch et al. 2007). ErbB-3는 리간드와의 연계에 의해 활성화될 수 있다. 이들 리간드는 제한은 아니지만 뉴레굴린(NRG) 및 헤레굴린(HRG)을 포함한다.
ErbB 수용체 패밀리 신호의 다양한 활성화 모드가 확인되었다. 이들 중 리간드 의존적 신호 활성화 및 리간드 독립적 신호 할성화가 있다. 과발현된 ErbB-2는 ErbB-3 리간드가 부재할 때조차도 ErbB-2:ErbB-3 헤테로다이머를 통해서 종양형성 신호를 생성할 수 있다(Junttila, Akita et al. 2009). ErbB-2 활성은 ErbB-2 특이적 항체에 의해 억제될 수 있다. 이러한 ErbB-2 특이적 항체는, 예를 들어 ErbB-2 양성(HER2+) 종양의 치료에 사용된다. 이러한 치료가 가진 문제는 주로 종양이 ErbB-2 특이적 치료에 효과를 보이지 않아서 억제 항체의 존재하에서도 계속 성장한다는 점이다. 유방, 난소, 자궁경부 및 위 종양과 같은 ErbB-2 양성 종양은 상향조절된 ErbB-3 발현(Ocana, Vera-Badillo et al. 2013) 및/또는 ErbB-3 리간드 발현(Wilson, Fridlyand et al. 2012)을 나타내는 종양 세포의 아집단의 선택적 파생물에 의한 치료에 효과를 보이지 않는다. 또한, ErbB-3 수용체에서 돌연변이의 활성화가 확인되었다.
항-ErbB-2 모노클로날 항체 트라스투주맙(헤르셉틴) 및 ErbB-1 특이적 세툭시맙(에르비툭스)이 임상 용도로서 승인된 몇몇 모노클로날 항체이다. 트라스투주맙은 전이성 유방암에서 검증된 생존 이득을 가진다(Arteaga, Sliwkowski et al. 2011). 트라스투주맙의 정확한 작용 기전은 명확하게 밝혀지지 않았다. 제안된 작용 방식은 RTK 신호의 억제 및 항체 의존적 세포독성(ADCC)의 동원이다. 다른 작용 기전은 ErbB-2 세포외 도메인의 단백질 가수분해 절단의 차단, 혈관형성 인자의 억제 및 수용체 엔도사이토시스의 증진을 포함한다. ErbB-2 신호화를 방해하는 다른 제제들도 승인되었거나 유방암 및 다른 ErbB-2 과발현 암의 치료를 위해 개발중이다. 예를 들어, 화학적 화합물인 라파티닙은 ErbB-1과 ErbB-2 티로신 키나아제 활성을 모두 억제하며, ErbB-2 증폭 유방암의 치료에 우선 사용된다.
HER2+ 전이성 유방암을 가진 환자에서, 단일 제제로서 또는 화학요법과 조합된 상태에서 트라스투주맙에 대한 내성이 치료를 시작하고 수 개월 내에 통상적으로 발생한다. HER2+ 전이성 유방암 환자의 일부만이 단일 제제 트라스투주맙에 반응하며, 이는 진행된 암에서 내성의 신규 기전을 제안한다. 이들 기전은 특히 수용체의 다른 HER 패밀리로부터의 신호화 및 HER 패밀리 외부의 RTK로부터의 상보성 신호화를 포함한다(Thery et al., Resistance to human epidermal growth factor receptor type 2-targeted therapies, Eur J Cancer (2014), Vol. 50, Issue 5, pages 892-901(ttp://dx.doi.org/10.1016/j.ejca.2014.01.003)). 예를 들어, HER2와 함께 HER3 또는 그것의 리간드의 과발현은 HER-2/HER-3 헤테로다이머를 형성시키고 트라스투주맙에 대한 내성을 초래한다. 따라서, 항체 트라스투주맙은 ErbB-3 리간드 유래 신호의 차단에는 비효과적인 것으로 생각된다(Wehrman, Raab et al. 2006, Junttila, Akita et al. 2009, Thery et al. 2014).
최근, 모노클로날 항체 퍼투주맙은 5개월 더 연장된 비진행 생존 이득에 근거하여 트라스투주맙과의 병용 용도로 승인되었다(Baselga, Cortes et al. 2012). 상기 퍼투주맙은 트라스투주맙과는 상이한 위치에서 ErbB-2에 결합한다. ErbB-2 양성 종양을 치료하기 위한 다른 전략은 ErbB-3과 관련된다. ErbB-3 결합 모노클로날 항체는 전임상 연구에서 활성을 나타냈다(Schoeberl, Faber et al. 2010). 일부 ErbB-3 결합 모노클로날 항체는 다양한 암의 증식 및 성장을 억제할 수 있다.
또 다른 전략은 ErbB-2 및 ErbB-3 수용체의 결합을 수반한다. 분자 MM-111은 ErbB-2 및 ErbB-3에 결합하는 2개의 단쇄 Fv(scFv)를 함유하는 인공의 생물학적 분자이다. 이 2개의 scFv는 돌연변이된 사람 혈청 알부민(HSA) 단백질과 회합되어 분자의 반감기를 증가시킨다. 전임상 테스트에서 이 분자는 ErbB-3 신호화 및 증식을 억제하는 것으로 나타났다. 이 효과는 상대적으로 많은 양의 ErbB-2를 발현했던 ErbB-3 양성 셀라인에 대해 우선적으로 측정되었다.
본 발명은 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 제공하며, 이 항체는 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포 상에서 ErbB-3의 리간드-유도 수용체 기능을 감소시킬 수 있다. 상기 제1 항원-결합 부위는 바람직하게 도 16A(16a-16k) 또는 도 16E(16s-16z)에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF2926; MF2930; MF1849; MF2973; MF3004; MF3958(사람화된 MF2971); MF2971; MF3025; MF2916; MF3991(사람화된 MF3004); MF3031; MF2889; MF2913; MF1847; MF3001; MF3003 또는 MF1898의 아미노산 서열을 가진 VH 사슬을 포함하는 가변 도메인에 존재한다. 상기 제2 항원-결합 부위는 바람직하게 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 아미노산 서열을 가진 VH 사슬을 포함하는 가변 도메인에 존재한다. 가변 도메인의 면역글로불린 경쇄는 바람직하게 도 16C(16g)의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 항체는, 특별한 언급이 없는 한, 바람직하게 이중특이적 항체이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다.
또한, 표지, 바람직하게는 생체내 영상화를 위한 표지를 더 포함하는 본 발명에 따른 항체가 제공된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 유해한 세포를 포함하는 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 세포, 또는 종양을 가진 대상 또는 상기 종양을 가질 위험이 있는 대상의 치료를 위한 방법을 제공한다.
또한, ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가지거나 가질 위험이 있는 대상의 치료용으로 사용되는 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 제공된다.
또한, 본 발명은 ErbB-2 양성 종양을 가지거나 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양이 발생할 위험이 있는 개체의 치료 방법을 제공하며, 이 방법은, ErbB-2의 억제제 또는 결합제를 포함하는, ErbB-2 표적화제, 예를 들어 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 2가 단일특이적 항체, 및 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위와 ErbB-3의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가지거나 상기 종양이 발생할 위험이 있는 개체의 치료 방법에서 사용하기 위한, ErbB-2의 억제제 또는 결합제를 포함하는, ErbB-2 표적화제, 예를 들어 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 2가 단일특이적 항체, 및 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위와 ErbB-3의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체의 조합이 또한 제공된다.
더 나아가, ErbB-2의 억제제 또는 결합제를 포함하는, ErbB-2 표적화제, 예를 들어 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 2가 단일특이적 항체 및 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위와 ErbB-3의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 포함하는 제약학적 조성물이 제공된다.
또한, ErbB-2의 억제제 또는 결합제를 포함하는, ErbB-2 표적화제, 예를 들어 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 2가 단일특이적 항체, 및 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위와 ErbB-3의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 포함하는 키트가 제공된다.
또한, 뇌에서 ErbB-2 양성 및 ErbB-3 양성 종양을 가지거나 뇌에서 ErbB-2 양성 및 ErbB-3 양성 종양이 발생할 위험이 있는 개체의 치료 방법이 제공되며, 이 방법은 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위와 ErbB-3의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또한, 뇌에서 ErbB-2 양성 및 ErbB-3 양성 종양을 가지거나 뇌에서 ErbB-2 양성 및 ErbB-3 양성 종양이 발생할 위험이 있는 개체의 치료용으로 사용하기 위한, ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위와 ErbB-3의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체가 제공된다.
본 발명은 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 제공하며, 이러한 이중특이적 항체는 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포에 대한 ErbB-3의 리간드-유도 수용체 기능을 감소시키거나 감소시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항원-결합 부위"는 항원에 결합할 수 있는 이중특이적 항체로부터 유래되고 바람직하게 이중특이적 항체 상에 존재하는 부위를 말한다. 미변형 항원-결합 부위는 전형적으로 항체의 가변 도메인에 의해 형성된다. 가변 도메인은 상기 항원-결합 부위를 함유한다. 항원에 결합하는 가변 도메인은 항원에 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 가변 도메인이다.
한 구체예에서, 본 발명의 항체 가변 도메인은 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 항원-결합 부위는 조합된 VH/VL 가변 도메인에 존재할 수 있거나, 단지 VH 영역에만 또는 단지 VL 영역에만 존재할 수 있다. 항원-결합 부위가 가변 도메인의 두 영역 중 단지 하나에만 존재할 때, 대응 가변 영역은 결합 가변 영역의 접힘 및/또는 안정성에 기여할 수 있지만, 항원 자체의 결합에는 유의하게 기여하지 않는다.
본원에서 사용된 항원-결합은 항체와 그것의 항원에 대한 항체의 전형적인 결합 능력을 말한다. ErbB-2에 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 항체는 ErbB-2에 결합하며, 다른 동일한 조건에서, 같은 종의 동종성 수용체 ErbB-1 및 ErbB-4에 적어도 100배 더 적게 결합한다. ErbB-3에 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 항체는 ErbB-3에 결합하며, 다른 동일한 조건에서, 같은 종의 동종성 수용체 ErbB-1 및 ErbB-4에는 결합하지 않는다. ErbB-패밀리가 세포 표면 수용체의 패밀리인 것을 고려하면, 이 결합은 전형적으로 수용체(들)를 발현하는 세포에서 평가된다. 항체와 항원의 결합은 다양한 방식으로 평가될 수 있다. 한 가지 방식은 항체를 항원(바람직하게는 항원을 발현하는 세포)과 함께 인큐베이션하고, 미결합 항체를 제거하고(바람직하게는 세척 단계에 의해), 결합된 항체에 결합하는 표지된 항체에 의해 결합된 항체를 검출하는 것이다.
항체에 의한 항원 결합은 전형적으로 항체의 상보성 영역 및 항원과 가변 도메인 모두의 특이적 3-차원 구조를 통해서 매개되며, 이들 두 구조는, 항체의 무작위 비-특이적 점착과는 달리, 정확히 함께 결합할 수 있다(자물쇠-열쇠와 유사한 상호작용). 항체는 전형적으로 항원의 에피토프를 인식하고, 이러한 에피토프는 다른 화합물에도 또한 존재할 수 있으므로, ErbB-2 및/또는 ErbB-3에 결합하는 본 발명에 따른 항체는 다른 단백질이 동일한 에피토프를 함유한다면 이러한 다른 단백질도 역시 인식할 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "결합하는"은 동일한 에피토프를 함유하는 다른 단백질 또는 단백질(들)과 항체의 결합을 배제하지 않는다. 이러한 다른 단백질(들)은 사람 단백질이 아닌 것이 바람직하다. 본 발명에서 정의된 ErbB-2 항원-결합 부위 및 ErbB-3 항원-결합 부위는 전형적으로 출산 후, 바람직하게는 성인 사람에서 세포의 막 상의 다른 단백질에는 결합하지 않는다. 아래 더 상세히 개략된 대로, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 전형적으로 적어도 1x10e-6 M의 결합 친화성으로 ErbB-2 및 ErbB-3에 결합할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "결합을 방해한다"는 항체가 ErbB-3 상의 에피토프에 대해 지정되고 그 항체가 ErbB-3와의 결합에 대해 리간드와 경쟁한다는 것을 의미한다. 항체는 리간드 결합을 감쇠시킬 수 있거나, ErbB-3에 이미 결합되었을 때는 리간드를 대신할 수 있거나, 입체 장해를 통해서 리간드가 ErbB-3에 결합할 수 있는 것을 적어도 부분적으로 방지할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항체"는 단백질 분자로서, 바람직하게는 단백질의 면역글로불린 부류에 속하고, 항원 상의 에피토프에 결합하는 하나 이상의 가변 도메인을 함유하는 것이며, 이러한 도메인은 항체의 가변 도메인으로부터 유래되거나 그것과 서열 상동성을 공유한다. 치료 용도의 항체는 바람직하게 치료될 대상의 천연 항체에 가깝다(예를 들어, 사람 대상의 경우 사람 항체). 결합한 항체는 특이성 및 친화성의 측면에서 발현될 수 있다. 특이성은 항원 또는 그것의 에피토프가 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합되는 것을 결정한다. 친화성은 특정 항원 또는 에피토프에 대한 결합 강도의 척도이다. 특이적 결합은 적어도 1x10e-6 M, 바람직하게 1x10e-7 M, 더 바람직하게 1x10e-9 M 초과의 친화성(KD)을 가진 결합으로서 정의된다. 전형적으로, 치료 용도의 항체는 최대 1x10e-10 M 또는 그 이상의 친화성을 가진다. 항체, 예컨대 본 발명의 이중특이적 항체는 천연 항체의 불변 도메인(Fc 부분)을 포함한다. 본 발명의 항체는 전형적으로 이중특이적 전장 항체, 바람직하게 사람 IgG 하위부류의 것이다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 사람 IgG1 하위부류의 것이다. 본 발명의 이러한 항체는 우수한 ADCC 특성을 가지며, 사람에게 생체내 투여시 좋은 반감기를 가지고, 클로날 세포에서의 공-발현시 호모다이머에 비해 헤테로다이머를 우선적으로 형성하는 변형된 중쇄를 제공할 수 있는 CH3 조작 기술이 존재한다.
본 발명의 항체는 바람직하게 "전장" 항체이다. 본 발명에 따른 용어 "전장" 항체는 본질적으로 완전한 항체를 포함하지만 무손상 항체의 모든 기능을 반드시 갖지는 않는 것으로서 정의된다. 전장 항체는 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 함유한다. 각 사슬은 불변(C) 영역과 가변(V) 영역을 포함하며, 이들은 CH1, CH2, CH3, VH, 및 CL, VL로 지정된 도메인들로 조각날 수 있다. 항체는 Fab 부분에 함유된 가변 도메인을 통해서 항원에 결합하며, 결합 후 불변 도메인을 통해서, 주로 Fc 부분을 통해서 면역 시스템의 분자 및 세포와 상호작용할 수 있다. 용어 '가변 도메인", 'VH/VL 쌍', 'VH/VL'은 본 명세서에서 상호 교환하여 사용된다. 본 발명에 따른 전장 항체는 원하는 특징을 제공하는 돌연변이가 존재할 수 있는 항체도 포함한다. 이러한 돌연변이는 영역들 중 어느 것의 실질적인 부분의 결실은 아니어야 한다. 그러나, 항체의 결합 특징을 본질적으로 변형시키지 않는, 하나 또는 몇몇 아미노산 잔기가 결실된 항체도 "전장 항체"에 포함된다. 예를 들어, IgG 항체는 1-20개 아미노산 잔기 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 불변 영역 내에 가질 수 있다. 예를 들어, 항체의 불변 영역을 약간 변형함으로써 항체 자체가 낮은 ADCC 활성을 가질 때 항체의 ADCC 활성이 개선될 수 있다(Junttila, T. T., K. Parsons, et al. (2010). "Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer." Cancer Research 70(11): 4481-4489)
유리한 반감기 및 면역원성의 이유로 완전한 자가(사람) 분자에 가까운 상태로 있어야 하는 필요성 때문에 전장 IgG 항체가 바람직하다. 본 발명의 항체는 이중특이적 IgG 항체, 바람직하게 이중특이적 전장 IgG1 항체이다. IgG1은 사람에서 긴 순환 반감기 때문에 유리하다. 사람에서 면역원성을 방지하기 위해, 본 발명에 따른 이중특이적 IgG 항체는 사람 IgG1인 것이 바람직하다.
용어 '이중특이적'(bs)은 항체의 한 부분이 항원 상의 하나의 에피토프에 결합하고 다른 부분은 상이한 에피토프에 결합한다는 것을 의미한다. 상이한 에피토프는 전형적으로 상이한 항원에 존재한다. 본 발명에 따라서, 상기 제1 및 제2 항원은 실제로 2개의 상이한 단백질이다. 바람직한 이중특이적 항체는 2개의 상이한 모노클로날 항체 부분을 포함하고 결과적으로 2개의 상이한 종류의 항원에 결합하는 항체이다. 이중특이적 항체의 한쪽 팔은 전형적으로 한 항체의 가변 도메인을 함유하고, 나머지 팔은 또 다른 항체의 가변 도메인을 함유한다. 본 발명의 이중특이적 항체의 중쇄 가변 영역은 전형적으로 서로 상이하지만, 경쇄 가변 영역은 바람직하게 본 발명의 이중특이적 항체에서 동일하다. 상이한 중쇄 가변 영역들이 동일한, 또는 공통의 경쇄와 회합된 이중특이적 항체는 공통 경쇄를 가진 이중특이적 항체로 언급된다. 따라서, 양쪽 팔이 공통 경쇄를 포함하는 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 더 제공된다.
바람직한 이중특이적 항체는 2개의 상이한 중쇄와 공통 경쇄가 단일 세포에서 함께 발현됨으로써 얻어질 수 있다. 야생형 CH3 도메인이 사용되었을 때, 2개의 상이한 중쇄와 공통 경쇄의 공-발현은 3개의 상이한 종, AA, AB 및 BB를 가져올 것이다. 원하는 이중특이적 생성물(AB)의 비율을 증가시키기 위해 CH3 조작이 이용될 수 있거나, 아래 정의된 바와 같은, 양립성 헤테로다이머화 도메인을 가진 중쇄를 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 '양립성 헤테로다이머화 도메인'은 조작된 도메인 A'가 조작된 도메인 B'와 헤테로다이머를 우선적으로 형성하고(반대의 경우도 가능), A'-A' 및 B'-B' 사이의 호모다이머화는 감쇠되도록 조작된 단백질 도메인을 말한다.
본 발명에 따른 용어 '공통 경쇄'는 동일할 수 있거나 전장 항체의 결합 특이성에 영향을 미치지 않는 일부 아미노산 서열 차이를 가질 수 있는 경쇄를 말한다. 예를 들어, 보존적 아미노산 변화, 중쇄와 페어링되었을 때 결합 특이성에 기여하지 않거나 부분적으로 기여하는 영역의 아미노산 변화 등을 도입하고 시험함으로써, 동일하지는 않지만 기능적으로는 동등한 경쇄를 제조하거나 찾는 것이 가능하다. 용어 '공통 경쇄', '공통 VL', '단일 경쇄', '단일 VL'은 단독으로 또는 용어 '재배열된'과 함께 모두 상호 교환하여 사용된다. 본 발명의 양태는 기능적 항원 결합 도메인을 가진 항체를 형성하기 위해 상이한 중쇄와 조합할 수 있는 사람 경쇄를 공통 경쇄로 사용하는 것이다(WO2004/009618, WO2009/157771, Merchant et al. 1998 및 Nissim et al. 1994). 바람직하게, 공통 경쇄는 점라인 서열을 가진다. 바람직한 점라인 서열은 사람 레퍼토리에서 자주 사용되며 우수한 열역학적 안정성, 수율 및 용해성을 가진 경쇄 가변 영역이다. 바람직한 점라인 경쇄는 012이고, 바람직하게는 재배열된 점라인 사람 카파 경쇄 IgVκ-39*01/IGJκ*01 또는 그것의 단편 또는 기능적 등가물(즉, 동일한 IgVκ-39 유전자 세그먼트와 상이한 IGJκ 유전자 세그먼트)이다(imgt.org 월드와이드 웹의 IMGT 데이터베이스에 따라서 명명). 따라서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 더 제공되며, 상기 공통 경쇄는 점라인 경쇄, 바람직하게 IgVKl-39 유전자 세그먼트를 포함하는 재배열된 점라인 사람 카파 경쇄, 가장 바람직하게 재배열된 점라인 사람 카파 경쇄 IgVKl-39*01/IGJKl*01이다. 용어 재배열된 점라인 사람 카파 경쇄 IgVκ-39*01/IGJκ*01, IGKV1-39/IGKJ1, huVκ-39 경쇄 또는 간단히 huVκ-39는 본 출원 전체적으로 상호 교환하여 사용된다. '공통'이 아미노산 서열이 동일하지 않은 경쇄의 기능적 등가물을 의미한다는 것은 당업자에게 자명하다. 기능적 결합 영역의 형성에는 실질적으로 영향을 미치지 않는 돌연변이(결실, 치환, 부가)가 존재하는 상기 경쇄의 많은 변이체가 존재한다. 본 발명의 경쇄는 또한 1-5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 경쇄일 수 있다.
또한, VH가 제1 항원을 특이적으로 인식할 수 있고, 면역글로불린 가변 도메인에서 VH와 페어링되는, VL이 제2 항원을 특이적으로 인식할 수 있는 항체가 고려된다. VH/VL 쌍은 항원 1 또는 항원 2에 결합할 것이다. 예를 들어, WO 2008/027236, WO 2010/108127 및 Schaefer et al(Cancer Cell 20, 472-86, October 2011)에 개시된 '투-인-원' 항체는 본 발명의 이중특이적 항체와는 상이하며, '투-인-원' 항체라고 더 언급된다. 이러한 '투-인-원' 항체는 동일한 팔을 가지며, 본 발명의 항체가 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 'ErbB-2'는 사람에서 ERBB-2 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 말한다. 이 유전자 또는 단백질에 대한 다른 명칭은 CD340; HER-2; HER-2/neu; MLN 19; NEU; NGL; TKR1을 포함한다. ERBB-2 유전자는 흔히 HER2(사람 상피 성장 인자 수용체 2로부터)라고 불린다. ErbB-2가 본 명세서에 언급된 경우, 기준은 사람 ErbB-2를 말한다. ErbB-2에 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 항체는 사람 ErbB-2에 결합한다. ErbB-2 항원-결합 부위는 사람과 다른 포유류 동원체 사이의 서열 및 3차 구조 유사성으로 인해 이러한 동원체에도 결합하지만 반드시 그렇지는 않다. 사람 ErbB-2 단백질 및 그것을 암호화하는 유전자에 대한 데이터베이스 기탁 번호는 NP_001005862.1, NP_004439.2, NC_000017.10, NT_010783.15, NC_018928.2이다. 기탁 번호는 표적으로서 ErbB-2를 확인하는 추가의 방법을 제공하기 위해 주로 주어지며, 항체에 결합된 ErbB-2 단백질의 실제 서열은, 예를 들어 일부 암 등에서 발생하는 것들과 같은 암호화 유전자의 돌연변이 때문에 변할 수 있다. ErbB-2 항원 결합 부위는 ErbB-2 및 그것의 다양한 변이체들, 예컨대 일부 ErbB-2 양성 종양 세포에 의해 발현된 것들에 결합한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "ErbB-2의 결합제"는 ErbB-2에 결합할 수 있는 임의의 분자 또는 화합물을 말한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "ErbB-2의 억제제"는 ErbB-2의 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 감소 또는 약화시킬 수 있는 임의의 분자 또는 화합물을 말한다. 이러한 억제제는 소 분자일 수 있거나 또는 생물학적 제제, 예를 들어 항체일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 'ErbB-3'는 사람에서 ERBB-3 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 말한다. 이 유전자 또는 단백질에 대한 다른 명칭은 HER3; LCCS2; MDA-BF-1; c-ErbB-3; c-erbb-3; erbb-3-S; p180-Erbb-3; p45-sErbb-3; 및 p85-sErbb-3이다. ErbB-3이 본 명세서에 언급된 경우, 기준은 사람 ErbB-3을 말한다. ErbB-3에 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 항체는 사람 ErbB-3에 결합한다. ErbB-3 항원-결합 부위는 사람과 다른 포유류 동원체 사이의 서열 및 3차 구조 유사성으로 인해 이러한 동원체에도 결합하지만 반드시 그렇지는 않다. 사람 ErbB-3 단백질 및 그것을 암호화하는 유전자에 대한 데이터베이스 기탁 번호는 NP_001005915.1, NP_001973.2, NC_000012.11, NC_018923.2, NT_029419.12이다. 기탁 번호는 표적으로서 ErbB-3을 확인하는 추가의 방법을 제공하기 위해 주로 주어지며, 항체에 결합된 ErbB-3 단백질의 실제 서열은, 예를 들어 일부 암 등에서 발생하는 것들과 같은 암호화 유전자의 돌연변이 때문에 변할 수 있다. ErbB-3 항원 결합 부위는 ErbB-3 및 그것의 다양한 변이체들, 예컨대 일부 ErbB-3 양성 종양 세포에 의해 발현된 것들에 결합한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "ErbB-3의 결합제"는 ErbB-3에 결합할 수 있는 임의의 분자 또는 화합물을 말한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "ErbB-3의 억제제"는 ErbB-3의 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 감소 또는 약화시킬 수 있는 임의의 분자 또는 화합물을 말한다. 이러한 억제제는 항체, 예를 들어 파트리투맙, MM-121(세리반투맙), 룸레투주맙일 수 있다.
ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 본 발명의 이중특이적 항체는 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포 상에서 ErbB-3의 리간드-유도 수용체 기능을 감소시킬 수 있거나 감소시킨다.
과잉의 ErbB-2의 존재하에, ErbB-2/ErbB-3 헤테로다이머는 이 헤테로다이머에서 ErbB-3 사슬에 대한 검출가능한 리간드의 부재하에 발현 세포에 성장 신호를 제공할 수 있다. 이 ErbB-3 수용체 기능은 본 명세서에서 ErbB-3의 리간드-독립적 수용체 기능이라고 언급된다. ErbB-2/ErbB-3 헤테로다이머는 또한 ErbB-3 리간드의 존재하에 발현 세포에 성장 신호를 제공한다. 이 ErbB-3 수용체 기능은 본 명세서에서 ErbB-3의 리간드-유도 수용체 기능이라고 언급된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "ErbB-3 리간드"는 ErbB-3에 결합하여 활성화하는 폴리펩타이드를 말한다. ErbB-3 리간드의 예들은, 제한은 아니지만 뉴레굴린 1(NRG) 및 뉴레굴린 2, 베타셀룰린, 헤파린-결합 상피 성장 인자, 및 에피레굴린을 포함한다. 이 용어는 자연 발생 폴리펩타이드의 생물학적 활성 단편 및/또는 변이체를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, ErbB-3의 리간드-유도 수용체 기능은 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포의 ErbB-3 리간드-유도 성장이다. 바람직한 구체예에서, 상기 세포는 MCF-7 세포(ATCC®HTB-22™); SKBR3 세포(ATCC®HTB-30™); NCI-87 세포(AhTCC®CRL-5822™); BxPC-3-luc2 세포(Perkin Elmer 125058), BT-474 세포(ATCC®HTB-20™) 또는 JIMT-1 세포(DSMZ no.: ACC 589)이다.
바람직한 구체예에서, ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포는 세포 표면 상에 적어도 50,000개의 ErbB-2 수용체를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 적어도 100,000개의 ErbB-2 수용체가 존재한다. 한 바람직한 구체예에서, ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포는 세포 표면 상에 적어도 1,000,000개의 ErbB-2 수용체를 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서, ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포는 세포 표면 상에 1,000,000개 이하의 ErbB-2 수용체를 포함한다. 트라스투주맙(허셉틴) 및 퍼투주맙를 사용하는 현재의 치료법은 임상 반응을 얻기 위해 세포 표면에 1,000,000개를 넘는 악성 ErbB-2 양성 세포를 가진 환자에 대해서만 처방된다. 세포 표면에 1,000,000개를 넘는 ErbB 수용체를 가진 ErbB-2 양성 종양 세포를 가진 환자는 전형적으로 ErbB-2[+++]로 분류된다. 환자는, 예를 들어 면역조직화학 또는 형광 인시튜 혼성화를 사용하여 분류된다. HercepTest™ 및/또는 HER2 FISH(pharm Dx™)이 Dako Denmark A/S에 의해 시판되고 있으며, HERmark®는 Monogram Biosciences에 의해 시판되고 있다. 트라스투주맙 및 퍼투주맙은 ErbB-2[+++] 환자에만 처방되는데, 이는 낮은 ErbB-2 농도를 가진 환자는 전형적으로 트라스투주맙 및 퍼투주맙으로 치료되었을 때 충분한 임상 반응을 나타내지 않기 때문이다. 본 발명은 트라스투주맙과 비교하여, 낮은 ErbB-2 수용체 농도를 가진 세포에 대해서도 개선된 결합 친화성을 가진 이중특이적 항체를 제공한다. 실시예에 제시된 대로, 낮은 ErbB2 발현을 가진 이러한 세포의 증식이 본 발명에 따른 항체로 효과적으로 상쇄된다. 이러한 ErbB-2 수용체의 농도는 ErbB-2[++] 또는 ErbB-2[+]로 분류된 환자의 악성 세포 상에 낮다. 또한, 재발된 ErbB-2 양성 종양이 주로 세포 당 1,000,000개 수용체 미만의 ErbB-2 수용체 농도를 가진다. 따라서, 이러한 ErbB-2[++] 또는 ErbB-2[+] 환자, 뿐만 아니라 재발된 ErbB-2 양성 종양을 가진 환자가 바람직하게 본 발명에 따른 이중특이적 항체로 치료된다. 또한, ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체가 제공되며, 이러한 항체는 1,000,000개 미만의 ErbB-2 세포-표면 수용체를 가진 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포의 리간드-유도 성장을 감소시킬 수 있다. 또한, ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가지거나 상기 종양을 가질 위험이 있는 대상의 치료를 위한 방법이 제공되며, 상기 종양은 세포 당 1,000,000개 미만의 ErbB-2 세포-표면 수용체를 가지고, 이 방법은 본 발명에 따른 이중특이적 항체 또는 제약학적 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가지거나 가질 위험이 있는 대상의 치료용으로 사용하기 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 또한 제공되며, 상기 종양은 세포 당 1,000,000개 미만의 ErbB-2 세포-표면 수용체를 가진다. 본 발명에 따른 상기 항체는 전형적으로 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포 상에서 ErbB-3의 리간드-유도 수용체 기능, 바람직하게 리간드 유도 성장을 감소시킬 수 있다. 본 발명에 따른 상기 항체는 바람직하게 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3의 도메인 III에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함한다. 한 바람직한 구체예에서, ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원-결합 부위의 친화성은 ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원-결합 부위의 친화성과 같거나 더 높으며, 이것은 이후 더 상세히 설명된다. ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원-결합 부위의 친화성은 2.0 nM 이하, 바람직하게 1.39 nM 이하, 더 바람직하게 0.99 nM 이하이다. ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원-결합 부위의 친화성은 5.0 nM 이하, 바람직하게 4.5 nM이하, 더 바람직하게 4.0 nM 이하이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 상기 항체는 T144, T164, R166, P172, G179, S180 및 R181로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-2의 도메인 I의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원-결합 부위, 및 T144, T164, R166, P172, G179, S180 또는 R181로부터의 약 5개 아미노산 위치 내에 위치된 표면-노출된 아미노산 잔기를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 상기 항체는 바람직하게 R426으로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-3의 도메인 III의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원-결합 부위 및 자생 ErbB-3 단백질에서 R426으로부터 11.2Å 내에 위치된 표면-노출된 아미노산 잔기를 포함한다.
종양이 ErbB-3에 대해 양성인지를 확립하기 위해, 예를 들어 ErbB-3 증폭 및/또는 면역조직화학 염색을 사용할 수 있다. 생검 중 적어도 10% 종양 세포가 나타나면 양성이다. 생검은 또한 20%, 30% 40% 50% 60% 70% 또는 그 이상의 양성 세포를 함유할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 리간드-유도 수용체 기능은 적어도 20%, 바람직하게 적어도 30, 40, 50 60, 또는 적어도 70%까지 감소되며, 특히 바람직한 구체예에서 리간드-유도 수용체 기능은 80%까지, 더 바람직하게 90%까지 감소된다. 이러한 감소는 바람직하게 본 발명의 이중특이적 항체의 존재하에 리간드-유도 수용체 기능을 결정하고, 그것을 다른 조건은 동일한 상태에서 항체의 부재하에서의 동일한 기능과 비교함으로써 측정된다. 조건은 적어도 ErbB-3 리간드의 존재를 포함한다. 존재하는 리간드의 양은 바람직하게 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 셀라인의 최대 성장의 절반을 유도하는 양이다. 이 테스트를 위한 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 셀라인은 바람직하게 MCF-7 셀라인(ATCC® HTB-22™), SKBR3 셀라인(ATCC® HTB-30™), JIMT-1 셀라인(DSMZ ACC 589) 또는 NCI-87 셀라인(ATCC® CRL-5822™)이다. ErbB-3 리간드-유도 수용체 기능을 결정하기 위한 테스트는 바람직하게 실시예에 명시된 것과 같은 ErbB-3 리간드-유도 성장 감소에 대한 테스트이다.
ErbB-2 단백질은 몇 개 도메인을 함유한다(Landgraf, R Breast Cancer Res. 2007; 9(1): 202의 도 1 참조). 세포외 도메인은 도메인 I-IV로 언급된다. 본 명세서서에서 제시된 항체의 항원-결합 부위의 각 도메인에 대한 결합 위치가 맵핑되었다(실시예 참조). ErbB-2(제1 항원-결합 부위)의 도메인 I 또는 도메인 IV에 결합하는 항원-결합 부위(제1 항원-결합 부위)를 가진 본 발명의 이중특이적 항체는 다양한 경쇄와 조합되었을 때 ErbB-2에 대한 유의한 결합 특이성 및 친화성을 유지하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. ErbB-2(제1 항원-결합 부위)의 도메인 I 또는 도메인 IV에 결합하는 항원-결합 부위(제1 항원-결합 부위) 및 ErbB-3에 대한 항원-결합 부위(제2 항원-결합 부위)를 가진 이중특이적 항체는 ErbB-2의 다른 세포외 도메인에 결합하는 항원-결합 부위(제1 항원-결합 부위)를 포함하는 이중특이적 항체와 비교했을 때 ErbB-3의 리간드-유도 수용체 기능을 감소시키는데 더 효과적인 것으로 판명되었다. ErbB-2에 결합하는 항원-결합 부위(제1 항원-결합 부위)를 포함하며, 상기 항원-결합 부위는 ErbB-2의 도메인 I 또는 도메인 IV에 결합하는 이중특이적 항체가 바람직하다. 바람직하게, 상기 항원-결합 부위는 ErbB-2의 도메인 IV에 결합한다. ErbB-2에 결합하고 ADCC를 더 포함하는 항원-결합 부위(제1 항원-결합 부위)를 가진 이중특이적 항체는 특히 생체내에서 유의한 ADCC 활성을 갖지 않았던 다른 ErbB-2 결합 항체보다 더 효과적인 것으로 판명되었다. 따라서, ADCC를 나타내는 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 바람직하다. 상기 제1 항원-결합 부위가 ErbB-2의 도메인 IV에 결합하는 항체는 고유한 ADCC 활성을 가진다는 것이 밝혀졌다. 고유의 낮은 ADCC 활성을 가진 도메인 I 결합 ErbB-2 결합 항체는 대식세포, 자연살해 세포, B-세포 및 호중구와 같은 면역 이펙터 세포 상의 상이한 수용체들과 결합시킴으로써 ADCC 활성 Fc 영역 매개 항체 기능이 증진되도록 조작될 수 있다. 이들 수용체 중 일부, 예컨대 CD16A(FcγIIIA) 및 CD32A(FcγIIA)는 항원에 대한 반응을 구축하도록 세포를 활성화한다. CD32B와 같은 다른 수용체는 면역 세포의 활성화를 억제한다. 더 큰 선택성으로 활성화 수용체와 결합하는 Fc 영역을 조작함으로써(아미노산 치환의 도입을 통해서), 항암 Mab에 의해 원하는 세포독성 활성을 매개할 수 있는 더 큰 능력을 가진 항체가 생성될 수 있다.
항체의 ADCC를 증진시키기 위한 한 가지 기술은 에이푸코실화이다(예를 들어, Junttila, T. T., K. Parsons, et al. (2010). "Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer." Cancer Research 70(11): 4481-4489 참조). 따라서, 에이푸코실화된 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 제공된다. 또는, 다수의 다른 전략이 ADCC 증진을 달성하기 위해 사용될 수 있으며, 이들은 예를 들어 글리코엔지니어링(Kyowa Hakko/Biowa, GlycArt(Roche) 및 Eureka Therapeutics) 및 돌연변이유발(Xencor 및 Macrogenics)을 포함하고, 이들 모두 저-친화성 활성화 FcγIIIa에 대한 Fc 결합을 개선하고, 및/또는 저-친화성 억제성 FcγIIb에 대한 결합을 감소시킨다.
ADCC를 도출하는데 있어서 항체 또는 이펙터 세포의 효능을 결정하기 위한 몇몇 시험관내 방법이 존재한다. 예를 들어, 크로뮴-51[Cr51] 방출 분석, 유로퓸[Eu] 방출 분석, 및 황-35[S35] 방출 분석이 있다. 일반적으로, 특정한 표면-노출 항원을 발현하는 표지된 표적 셀라인이 그 항원에 특이적힌 항체와 함께 인큐베이션된다. 세척 후, Fc 수용체 CD16을 발현하는 이펙터 세포가 전형적으로 항체-표지 표적 세포와 함께 공-인큐베이션된다. 이어서, 표적 세포 용해액이 전형적으로 세포내 표지의 방출에 의해, 예를 들어 섬광 카운터 또는 분광광도법에 의해 측정된다. 바람직한 테스트는 실시예에 상세히 설명된다.
본 발명의 한 가지 이점은 본 발명에 따른 항체의 결합, 예를 들어 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포에 PB4188의 결합이 트라스투주맙과 비교하여 동일한 정도로 내재화를 가져온다는 사실이다. 트라스투주맙과 퍼투주맙의 조합이 사용된 경우, 이들 항체의 내재화가 증진된다. 그러나, 이 증진된 내재화는 감소된 ADCC를 가져온다. 따라서, 트라스투주맙과 비교하여 본질적으로 동일한 정도로 내재화를 가져오는 본 발명에 따른 항체는 이러한 항체에서 ADCC 활성이 보다 잘 유지되기 때문에 트라스투주맙과 퍼투주맙의 조합에 비해 바람직하다.
ErbB-3에 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 본 발명의 항체는 ErbB-3 리간드와 ErbB-3의 결합을 방해한다. 이러한 항체는, 특히 ErbB-2에 결합하는 항원-결합 부위를 또한 포함하는 이중특이적 항체와 관련하여, ErbB-2 및 ErbB-3 양성 셀라인에서 ErbB-3의 리간드-유도 수용체 기능을 감소시키는데 더 효과적이다.
본 발명의 바람직한 구체예들은 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 제공하며, 상기 제1 항원-결합 부위는 ErbB-2의 도메인 I에 결합한다. 실시예에 나타낸 대로, 이런 특징을 가진 이중특이적 항체는 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포에 잘 결합할 수 있고, 이들의 활성(예컨대 ErbB-3의 리간드-유도 수용체 기능 및 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포의 리간드-유도 성장)을 상쇄할 수 있다. 더욱이, ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원-결합 부위를 포함하는 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 트라스투주맙과 퍼투주맙이 ErbB-2의 상이한 도메인에 결합하기 때문에 트라스투주맙 및 퍼투주맙 같은 기존 항-ErbB-2 요법과 병용하여 사용하기에 특히 적합하다. 트라스투주맙은 ErbB-2의 도메인 IV에 결합하고, 퍼투주맙은 ErbB-2의 도메인 II에 결합한다. 따라서, ErbB-2의 도메인 I에결합하는 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 이들이 트라스투주맙 및 퍼투주맙과 동일한 에피토프에 대해 경쟁하지 않기 때문에 바람직하다.
다른 바람직한 구체예는 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 제공하며, 상기 제2 항원-결합 부위는 ErbB-3의 도메인 III에 결합한다. 본 발명에 따른 이러한 항체는 ErbB-3의 도메인 I에 결합하는 MM-121(Merrimack Pharmaceuticals; #Ab6) 및 RG7116(Roche)과 같은, ErbB-3의 도메인 III에 결합하지 않는 현재 사용되는 항-ErbB-3 결합 분자와의 조합 요법에 특히 적합한데, 이는 이 상이한 결합 분자들이 동일한 에피토프에 대해 서로 경쟁하지 않기 때문이다.
바람직하게, ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체가 제공되며, 상기 제1 항원-결합 부위는 ErbB-2의 도메인 I에 결합하고, 상기 제2 항원-결합 부위는 ErbB-3의 도메인 III에 결합한다. 본 발명에 따른 이러한 항체는 트라스투주맙 및 퍼투주맙과 같은 ErbB-2의 도메인 I에 결합하지 않는 항-ErbB-2 결합 분자, 및 MM-121(#Ab6) 및 RG7116과 같은 ErbB-3의 도메인 III에 결합하지 않는 항-ErbB-3 결합 분자와의 조합 치료에 특히 적합하다.
한 바람직한 구체예는 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 제공하며, 상기 제1 항원-결합 부위는 ErbB-2의 도메인 I에 결합하고, 상기 제2 항원-결합 부위는 ErbB-3의 도메인 III에 결합하며, 상기 항체는 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포에서 ErbB-3의 리간드-유도 수용체 기능을 감소시킬 수 있다. 상기 항체는 바람직하게 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포의 리간드-유도 성장을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 추가의 구체예는 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 제공하며, ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원-결합 부위의 친화성(KD)은 ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원-결합 부위의 친화성과 같거나 더 높다. ErbB-3에 대해서보다 ErbB-2에 대해 더 높은 친화성을 가진, 예를 들어 Merrimack Pharmaceuticals로부터의 MM-111과 같은 선행기술의 이중특이적 화합물과 달리, 본 발명은 세포 상의 ErbB-2에 대한 ErbB-2-특이적 팔의 친화성보다 높은 세포 상의 ErbB-3에 대한 친화성을 가진 ErbB-3-특이적 팔을 가진 이중특이적 항체를 제공한다. 이러한 이중특이적 항체는 ErbB-3의 낮은 세포 표면 농도에도 불구하고 ErbB-3에 보다 잘 결합할 수 있다. 이것은 ErbB-3에 대항하는 기능적 활성이 선행기술의 화합물과 비교하여 증진된다는 이점을 제공하며, 이는 본 발명에 따른 이런 이중특이적 항체가 ErbB-3 활성(예컨대 리간드-유도 성장)을 보다 잘 상쇄할 수 있음을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "친화성"은 KD 값을 말한다.
ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원-결합 부위의 친화성(KD)은 2.0 nM 이하, 바람직하게 1.5 nM 이하, 더 바람직하게 1.39 nM 이하, 더욱 더 바람직하게 0.99 nM 이하이다. 한 바람직한 구체예에서, SK-BR-3 세포 상의 ErbB-3에 대한 상기 제2 항원-결합 부위의 친화성은 2.0 nM 이하, 바람직하게 1.5 nM 이하, 더 바람직하게 1.39 nM 이하, 더욱 더 바람직하게 0.99 nM 이하이다. 한 구체예에서, 상기 친화성은 1.39-0.59 nM의 범위 내이다. 한 바람직한 구체예에서, BT-474 세포 상의 ErbB-3에 대한 상기 제2 항원-결합 부위의 친화성은 2.0 nM 이하, 바람직하게 1.5 nM 이하, 더 바람직하게 1.0 nM 이하, 더욱 더 바람직하게 0.5 nM 이하, 보다 더 바람직하게 0.31 nM 이하, 가장 바람직하게 0.23 nM 이하이다. 한 구체예에서, 상기 친화성은 0.31-0.15 nM의 범위 내이다. 상기 언급된 친화성은 바람직하게 정류 상태 세포 친화성 측정을 사용하여 측정된 것이며, 이 경우 실시예에 설명된 대로, 세포가 방사성활성 표지된 항체를 사용하여 4℃에서 인큐베이션되고, 세포-결합된 후, 방사성활성이 측정된다.
ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원-결합 부위의 친화성(KD)은 5.0 nM 이하, 더 바람직하게 4.5 nM 이하, 더욱 더 바람직하게 3.9 nM 이하이다. 한 바람직한 구체예에서, SK-BR-3 세포 상의 ErbB-2에 대한 상기 제1 항원-결합 부위의 친화성은 5.0 nM 이하, 바람직하게 4.5 nM 이하, 더 바람직하게 4.0 nM 이하, 더욱 더 바람직하게 3.5 nM 이하, 보다 더 바람직하게 3.0 nM 이하, 가장 바람직하게 2.3 nM 이하이다. 한 구체예에서, 상기 친화성은 3.0-1.6 nM의 범위 내이다. 한 바람직한 구체예에서, BT-474 세포 상의 ErbB-2에 대한 상기 제1 항원-결합 부위의 친화성은 5.0 nM 이하, 바람직하게 4.5 nM 이하, 더 바람직하게 3.9 nM 이하이다. 한 구체예에서, 상기 친화성은 4.5-3.3 nM의 범위 내이다. 상기 언급된 친화성은 바람직하게 정류 상태 세포 친화성 측정을 사용하여 측정된 것이며, 이 경우 실시예에 설명된 대로, 세포가 방사성활성 표지된 항체를 사용하여 4℃에서 인큐베이션되고, 세포-결합된 후, 방사성활성이 측정된다.
한 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 제공되며, BT-474 세포에 대한 상기 이중특이적 항체의 친화성(KD)은 5.0 nM 이하, 바람직하게 4.5 nM 이하, 더 바람직하게 4.0 nM 이하, 더욱 더 바람직하게 3.5 nM 이하, 보다 더 바람직하게 3.7 nM 이하, 가장 바람직하게 3.2 nM 이하이다. 한 구체예에서, 상기 친화성은 3.7-2.7 nM의 범위 내이다. 한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 이중특이적 항체가 제공되며, SK-BR-3 세포에 대한 상기 이중특이적 항체의 친화성은 5.0 nM 이하, 바람직하게 4.5 nM 이하, 더 바람직하게 4.0 nM 이하, 더욱 더 바람직하게 3.5 nM 이하, 보다 더 바람직하게 3.0 nM 이하, 보다 더욱 바람직하게 2.5 nM 이하, 가장 바람직하게 2.0 nM 이하이다. 한 구체예에서, 상기 친화성은 2.4-1.6 nM의 범위 내이다. 상기 언급된 친화성은 바람직하게 정류 상태 세포 친화성 측정을 사용하여 측정된 것이며, 이 경우 실시예에 설명된 대로, 세포가 방사성활성 표지된 항체를 사용하여 4℃에서 인큐베이션되고, 세포-결합된 후, 방사성활성이 측정된다.
본 발명의 더 바람직한 구체예는 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 제공하며, ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원-결합 부위의 친화성(KD)은 ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원-결합 부위의 친화성과 같거나 더 높고, 상기 항체는 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포에서 ErbB-3의 리간드-유도 수용체 기능을 감소시킬 수 있다. 상기 항체는 바람직하게 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포의 리간드-유도 성장을 감소시킬 수 있다.
ErbB-3에 대한 높은 친화성을 가진 본 발명에 따른 상기 항체는 바람직하게 ErbB-2의 도메인 I 및/또는 ErbB-3의 도메인 III에 결합한다. 따라서, ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 제공되며, ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원-결합 부위의 친화성(KD)은 ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원-결합 부위의 친화성과 같거나 더 높다. 또한, ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3의 도메인 III에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 제공되며, ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원-결합 부위의 친화성은 ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원-결합 부위의 친화성과 같거나 더 높다. 특히 바람직한 구체예에서, ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3의 도메인 III에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 제공되며, ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원-결합 부위의 친화성은 ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원-결합 부위의 친화성과 같거나 더 높다.
상기 제2 항원-결합 부위는 바람직하게 ErbB-3의 도메인 III에 결합하고 2.0 nM 이하, 바람직하게 1.5 nM 이하, 더 바람직하게 1.39 nM 이하, 더욱 더 바람직하게 0.99 nM 이하인 ErbB-3 양성 세포에 대한 친화성(KD)을 가진다. 한 바람직한 구체예에서, 상기 제2 항원-결합 부위는 ErbB-3의 도메인 III에 결합하고 2.0 nM 이하, 바람직하게 1.5 nM 이하, 더 바람직하게 1.39 nM 이하, 더욱 더 바람직하게 0.99 nM 이하인 SK-BR-3 세포 상의 ErbB-3에 대한 친화성을 가진다. 한 구체예에서, 상기 친화성은 1.39-0.59 nM의 범위 내이다. 한 바람직한 구체예에서, 상기 제2 항원-결합 부위는 ErbB-3의 도메인 III에 결합하고 2.0 nM 이하, 바람직하게 1.5 nM 이하, 더 바람직하게 1.0 nM 이하, 더욱 더 바람직하게 0.5 nM 이하, 보다 더 바람직하게 0.31 nM 이하, 가장 바람직하게 0.23 nM 이하인 BT-474 세포 상의 ErbB-3에 대한 친화성을 가진다. 한 구체예에서, 상기 친화성은 0.31-0.15 nM의 범위 내이다.
상기 제1 항원-결합 부위는 바람직하게 ErbB-2의 도메인 I에 결합하고 5.0 nM 이하, 바람직하게 4.5 nM 이하, 더 바람직하게 3.9 nM 이하인 ErbB-2 양성 세포에 대한 친화성(KD)을 가진다. 한 바람직한 구체예에서, 상기 제1 항원-결합 부위는 ErbB-2의 도메인 I에 결합하고 5.0 nM 이하, 바람직하게 4.5 nM 이하, 더 바람직하게 4.0 nM 이하, 더욱 더 바람직하게 3.5 nM 이하, 보다 더 바람직하게 3.0 nM 이하, 보다 더욱 바람직하게 2.5 nM 이하, 가장 바람직하게 2.3 nM 이하인 SK-BR-3 세포 상의 ErbB-2에 대한 친화성을 가진다. 한 구체예에서, 상기 친화성은 3.0-1.6 nM의 범위 내이다. SK-BR-3 세포에 대한 상기 이중특이적 항체의 친화성은 5.0 nM 이하, 바람직하게 4.5 nM 이하, 더 바람직하게 4.0 nM 이하, 더욱 더 바람직하게 3.5 nM 이하, 보다 더 바람직하게 3.0 nM 이하, 보다 더욱 바람직하게 2.5 nM 이하, 보다 더 더욱 바람직하게 2.4 nM 이하, 가장 바람직하게 2.0 nM 이하이다. 한 구체예에서, 상기 친화성은 2.4-1.6 nM의 범위 내이다.
한 바람직한 구체예에서, 상기 제1 항원-결합 부위는 ErbB-2의 도메인 I에 결합하고 5.0 nM 이하, 바람직하게 4.5 nM 이하, 더 바람직하게 3.9 nM 이하인 BT-474 세포 상의 ErbB-2에 대한 친화성(KD)을 가진다. 한 구체예에서, 상기 친화성은 4.5-3.3 nM의 범위 내이다. BT-474 세포에 대한 상기 이중특이적 항체의 친화성은 5.0 nM 이하, 바람직하게 4.5 nM 이하, 더 바람직하게 4.0 nM 이하, 더욱 더 바람직하게 3.7 nM 이하, 보다 더 바람직하게 3.2 nM 이하이다. 한 구체예에서, 상기 친화성은 3.7-2.7 nM의 범위 내이다. 상기 언급된 친화성은 바람직하게 정류 상태 세포 친화성 측정을 사용하여 측정된 것이며, 이 경우 실시예에 설명된 대로, 세포가 방사성활성 표지된 항체를 사용하여 4℃에서 인큐베이션되고, 세포-결합된 후, 방사성활성이 측정된다.
다른 바람직한 구체예는 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 제공하며, 상기 이중특이적 항체는 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포 상에서 ErbB-3의 리간드-유도 수용체 기능을 감소시킬 수 있고, 심근세포의 생존에 유의하게 영향을 미치지 않는다. 심장독성은 ErbB-2 표적화 요법에서 알려진 위험 요인이며, 트라스투주맙이 심장 스트레스를 유발하는 안트라사이클린 요법과 함께 사용되었을 때는 합병증의 빈도가 증가된다. 예를 들어, 독시사이클린(DOX)과 트라스투주맙의 조합은 심한 심장 부작용을 유발한다. 임상 연구는 유방암의 애쥬번트 환경에서 트라스투주맙을 투여받은 환자의 5% 내지 10%에서 심장 기능부전이 발생한다고 추정했다(Guarneri et al., J Clin Oncol., 1985, 3:818-26; Ewer MS et al., Nat Rev Cardiol 2010;7:564-75). 그러나, 소급 연구에서, 트라스투주맙이 DOX와 함께 애쥬번트 환경에서 사용될 때 무증상 심장 기능부전이 발생할 위험은 실제로 약 25% 정도로 높다는 것이 증명되었다(Wadhwa et al., Breast Cancer Res Treat 2009;117:357-64). 실시예에 나타낸 대로, 트라스투주맙 및 퍼투주맙과 비교하여 심근세포의 생존에 유의하게 더 적은 정도로 영향을 미치거나 영향을 미치지 않는 항체가 본 명세서에 제시된다. 본 발명의 항체는 심장독성을 감소시키는 중요한 이점을 제공한다. 본 발명의 항체는 이미 손상된 심장 기능으로 고통받고 있지 않는 사람, 및 심지어 더욱이 손상된 심장 기능으로 고통받고 있는 사람, 또는 그럴 위험이 있는 사람, 예컨대 울혈성 심부전(CHF), 좌심실 기능부전(LVD) 및/또는 ≥ 10% 감소된 좌심실 구축율(LVEF)로 고통받고 있는 대상, 및/또는 심근경색을 앓았던 적이 있는 대상에게도 유익하다. 따라서, 심근세포의 생존에 유의하게 영향을 미치지 않는 본 발명에 따른 항체가 바람직하다. 시험관내에서, 심근세포의 기능은, 예를 들어 심근세포의 생육성 결정, BNP(B-타입 심방나트륨이뇨 펩타이드, 심장 바이오마커) 결정, QT 연장 결정, 및/또는 미토콘드리아 막 전위 결정에 의해 확인된다.
본 발명에 따른 상기 항체는 바람직하게 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3의 도메인 III에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함한다. 한 구체예는 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는, 심근세포의 생존에 유의하게 영향을 미치지 않는 본 발명에 따른 항체를 제공하며, ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원-결합 부위의 친화성은 ErbB-2 양성 세포에 대한 제1 항원-결합 부위의 친화성과 같거나 더 높다. ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원-결합 부위의 친화성은 2.0 nM 이하, 바람직하게 1.39 nM 이하, 더 바람직하게 0.99 nM 이하이다. ErbB-2 양성 세포에 대한 제1 항원-결합 부위의 친화성은 5.0 nM 이하, 바람직하게 4.5 nM 이하, 더 바람직하게 4.0 nM 이하이다.
한 바람직한 구체예에서, 심근세포의 생존에 유의하게 영향을 미치지 않는 상기 항체는 다음을 포함한다:
- 도 16A(16a-16k)또는 도 16E(16s-16z)에 나타낸 것과 같은 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 및 MF1898로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열, 바람직하게 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 또는 적어도 중쇄 가변 영역 서열, 또는 인용된 중쇄 가변 영역 서열과 최대 15개 아미노산, 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산이 차이가 있는 중쇄 가변 영역 서열; 및/또는
- 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 및 MF6074로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열, 바람직하게 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 또는 적어도 중쇄 가변 영역 서열, 또는 인용된 중쇄 가변 영역 서열과 최대 15개 아미노산, 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산이 차이가 있는 중쇄 가변 영역 서열. 한 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 PB4188이다.
본 발명의 다른 양태는 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는, 본 발명에 따른 항체를 제공하며, 상기 항체는 T144, T164, R166, P172, G179, S180 및 R181로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-2의 도메인 I의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원-결합 부위, 및 T144, T164, R166, P172, G179, S180 또는 R181로부터의 약 5개 아미노산 위치 내에 위치된 표면-노출된 아미노산 잔기를 포함한다. 아미노산 잔기 넘버링은 Protein Data Bank(PDB) ID #1S78을 따른다. 실시예에 나타낸 대로, ErbB-2의 도메인 I의 이 영역에 결합하는 항체는 특히 우수한 결합 특징을 나타내며, 이들은 ErbB-2 양성 세포의 활성(예컨대 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포 상에서 ErbB-3의 리간드-유도 수용체 기능, 및/또는 이러한 세포의 리간드-유도 성장)을 상쇄할 수 있다. 더욱이, 이러한 항체는 ErbB-2의 상이한 도메인에 결합하기 때문에 트라스투주맙(ErbB-2의 도메인 IV에 결합) 및 퍼투주맙(ErbB-2의 도메인 II에 결합)과 같은 현재 알려진 항-ErbB-2 모노클로날 항체와의 조합 요법에 특히 적합하다. 따라서, 이들 항체는 동일한 에피토프에 대한 경쟁 없이 동시에 사용될 수 있다. 용어 "T144, T164, R166, P172, G179, S180 또는 R181로부터 약 5개 아미노산 위치 내에 위치된 표면-노출된 아미노산 잔기"는 인용된 잔기에 인접한 대략 처음 5개의 아미노산 잔기 내에 위치된 주 아미노산 서열에 있고 단백질의 바깥쪽으로 적어도 부분적으로 노출된 아미노산 잔기를 말하며, 이로써 이들은 항체에 의해 결합될 수 있다(예를 들어 도 21B 참조). 바람직하게, T144, T164, R166, P172, G179, S180 또는 R181로부터 약 5개 아미노산 위치 내에 위치된 상기 아미노산 잔기는 L139, C140, Y141, Q142, D143, I145, L146, W147, K148, D149, L159, T160, L161, I162, D163, N165, S167, R168, A169, C170, H171, C173, S174, P175, M176, C177, K178, C182, W183, G184, E185 및 S186로 구성되는 군으로부터 선택된다. 바람직하게, 상기 항체는 T144, T164, R166, P172, G179, S180 및 R181로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-2의 도메인 I의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원-결합 부위, 및 T144, T164, R166, P172, G179, S180 또는 R181로부터의 약 5개 아미노산 위치 내에 위치된 표면-노출된 아미노산 잔기를 포함한다.
한 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 제공되며, 상기 항체는 ErbB-2의 도메인 I의 적어도 T144, R166 및 R181에 결합하는 항원-결합 부위를 포함한다. 다른 구체예는 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 제공하며, 상기 항체는 ErbB-2의 도메인 I의 적어도 T144, R166, P172, G179 및 R181에 결합하는 항원-결합 부위를 포함한다. 다른 구체예는 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 제공하며, 상기 항체는 ErbB-2의 도메인 I의 적어도 T144, T164, R166, P172, G179, S180 및 R181에 결합하는 항원-결합 부위를 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 R426로부터 선택된 ErbB-3의 도메인 III의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원-결합 부위 및 자생 ErbB-3 단백질에서 R426으로부터 11.2Å 내에 위치된 표면-노출된 아미노산 잔기를 포함한다. 아미노산 잔기 넘버링은 Protein Data Bank(PDB) ID #4P59를 따른다. 실시예에 나타낸 대로, ErbB-3의 도메인 III의 이 영역에 결합하는 항체는 특히 우수한 결합 특징을 나타내며, 이들은 ErbB-3 양성 세포의 활성(예컨대 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포 상에서 ErbB-3의 리간드-유도 수용체 기능, 및/또는 이러한 세포의 리간드-유도 성장)을 상쇄할 수 있다. 용어 "자생 ErbB-3 단백질에서 R426으로부터 11.2Å 내에 위치된 표면-노출된 아미노산 잔기"는 R426으로부터 11.2Å 내에 위치된 ErbB-3 단백질의 3차 구조 내에 있고 단백질의 바깥쪽으로 적어도 부분적으로 노출된 아미노산 잔기를 말하며, 이로써 이들은 항체에 의해 결합될 수 있다. 바람직하게, R426으로부터 11.2Å 내에 위치된 상기 아미노산 잔기는 L423, Y424, N425, G427, G452, R453, Y455, E480, R481, L482, D483 및 K485로 구성되는 군으로부터 선택된다(예를 들어 도 21C 및 표 15 참조). 한 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 제공되며, 상기 항체는 ErbB-3의 도메인 III의 적어도 R426에 결합하는 항원-결합 부위를 포함한다.
본 발명의 이중특이적 항체는 바람직하게 ADCC 활성을 증진시키기 위해 에이푸코실화된다. 본 발명의 이중특이적 항체는 바람직하게 정상 CHO 세포에서 생성된 동일한 항체와 비교하여, Fc 영역에 N-결합 탄수화물 구조의 푸코실화의 감소된 양을 포함한다.
본 발명의 이중특이적 항체는 바람직하게 사람에게 사용된다. 이를 위해서, 본 발명의 이중특이적 항체는 바람직하게 사람 항체 또는 사람화된 항체이다.
폴리펩타이드에 대한 사람의 관용성은 많은 상이한 측면에 의해 통제된다. 면역은 T-세포 매개된 것이나 B-세포 매개된 것이나 또는 다른 것이든 폴리펩타이드에 대한 사람의 관용성에 포함되는 변수들 중 하나이다. 본 발명의 이중특이적 항체의 불변 영역은 바람직하게 사람 불변 영역이다. 불변 영역은 자연 발생 사람 항체의 불변 영역과 하나 이상, 바람직하게 10개 이하, 더 바람직하게 5개 이하의 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 불변 부분은 자연 발생 사람 항체로부터 완전히 유래되는 것이 바람직하다. 생성된 다양한 항체는 사람 항체 가변 도메인 라이브러리로부터 유래된다. 이와 같이, 이들 가변 도메인은 사람의 것이다. 독자적인 CDR 영역은 사람으로부터 유래될 수 있거나, 합성될 수 있거나, 또는 다른 유기체로부터 유래될 수 있다. 가변 영역은 CDR 영역을 제외하고 자연 발생 사람 항체의 가변 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 가질 때 사람 가변 영역으로 간주된다. ErbB-2 결합 VH, ErbB-3 결합 VH, 또는 본 발명의 항체의 경쇄의 가변 영역은 CDR 영역의 아미노산 서열에서의 차이를 고려하지 않을 때, 자연 발생 사람 항체의 가변 영역과 하나 이상, 바람직하게 10개 이하, 더 바람직하게 5개 이하의 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 이러한 돌연변이는 또한 체세포 초돌연변이와 관련하여 자연에서 발생한다.
항체는 적어도 중쇄 가변 영역 서열과 관련하여 다양한 동물 종으로부터 유래될 수 있다. 이러한, 예를 들어 뮤린 중쇄 가변 영역을 사람화하는 것이 통상적인 관례이다. 이것은 다양한 방식으로 달성될 수 있으며, 특히 뮤린 중쇄 가변 영역의 3D 구조와 일치하는 3D 구조를 가진 사람 중쇄 가변 영역에 CDR-접목하기; 바람직하게는 뮤린 중쇄 가변 영역으로부터 기지의 또는 의심되는 T- 또는 B-세포 에피토프를 제거함으로써 행해지는, 뮤린 중쇄 가변 영역의 탈면역화가 있다. 제거는 전형적으로 에피토프 내의 아미노산 중 하나 이상을 다른 (전형적으로 보존성) 아미노산으로 치환함으로써 행해지며, 이로써 에피토프의 서열은 더 이상 T- 또는 B-세포 에피토프가 아닌 것으로 변형된다.
이러한 탈면역화된 뮤린 중쇄 가변 영역은 원래의 뮤린 중쇄 가변 영역보다 사람에게 덜 면역원성이다. 바람직하게, 본 발명의 가변 영역 또는 도메인은 더 사람화되며, 예컨대 베니어링된다. 베니어링 기술을 사용함으로써, 면역 시스템과 마주치기 쉬운 외부 잔기가 사람 잔기로 선택적으로 대체되며, 이로써 약한 면역원성 또는 실질적으로 무 면역원성의 베니어링된 표면을 포함하는 혼성체 분자가 제공된다. 본 발명에서 사용된 동물은 바람직하게 포유류, 더 바람직하게 영장류, 가장 바람직하게 사람이다.
본 발명에 따른 이중특이적 항체는 바람직하게 사람 항체의 불변 영역을 포함한다. 이들의 중쇄 불변 도메인의 차이에 따라서, 항체는 5개 부류, 또는 이소타입: IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE로 그룹화된다. 이들 부류 또는 이소타입은 상기 중쇄 중 적어도 하나를 포함하며, 이것은 상응하는 그리스 문자로 명명된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체를 제공하며, 상기 불변 영역은 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE 불변 영역의 그룹으로부터 선택되며, 더 바람직하게 상기 불변 영역은 IgG 불변 영역, 바람직하게 IgG1 불변 영역, 더 바람직하게 돌연변이된 IgG1 불변 영역을 포함한다. 예를 들어 알로타입 G1m1, 17 및 G1m3과 같은 IgG1의 불변 영역에 일부 변형이 자연에서 생기고, 및/또는 얻어진 항체의 면역학적 특성은 변화되지 않는다. 전형적으로, 약 1-10개 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합이 불변 영역에서 허용된다.
한 구체예에서, 본 발명은 ErbB-2에 결합하는 가변 도메인을 포함하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 도 16A(16a-16k) 또는 도 16E(16s-16z)에 나타낸 것과 같은 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 및 MF1898로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열을 포함하고, 상기 항체는 도 16A(16a-16k) 또는 도 16E(16s-16z)에 나타낸 것과 같은 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 및 MF1898로 구성되는 군으로부터 선택된 VH의 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게 최대 2개, 더 바람직하게 1개 이하의 아미노산이 차이가 있는 중쇄 CDR3 서열을 포함한다. 상기 항체는 바람직하게 MF1849, MF2971, MF3958, MF3004 또는 MF3991의 적어도 CDR3 서열, 가장 바람직하게 MF3958의 적어도 CDR3 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명은 ErbB-2에 결합하는 가변 도메인을 포함하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 도 16A(16a-16k) 또는 도 16E(16s-16z)에 나타낸 것과 같은 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 및 MF1898로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 상기 항체는 도 16A(16a-16k) 또는 도 16E(16s-16z)에 나타낸 것과 같은 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 및 MF1898로 구성되는 군으로부터 선택된 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게 최대 2개, 더 바람직하게 1개 이하의 아미노산이 차이가 있는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. 상기 항체는 바람직하게 MF1849, MF2971, MF3958, MF3004 또는 MF3991의 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 가장 바람직하게 MF3958의 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명은 ErbB-3에 결합하는 가변 도메인을 포함하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 및 MF6074로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열을 포함하고, 상기 항체는 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 및 MF6074로 구성되는 군으로부터 선택된 VH의 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게 최대 2개, 더 바람직하게 1개 이하의 아미노산이 차이가 있는 중쇄 CDR3 서열을 포함한다. 상기 항체는 바람직하게 MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 또는 MF6065의 적어도 CDR3 서열, 가장 바람직하게 MF3178의 적어도 CDR3 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명은 ErbB-3에 결합하는 가변 도메인을 포함하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 및 MF6074로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 상기 항체는 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 및 MF6074로 구성되는 군으로부터 선택된 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게 최대 2개, 더 바람직하게 1개 이하의 아미노산이 차이가 있는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. 상기 항체는 바람직하게 MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 또는 MF6065의 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 가장 바람직하게 MF3178의 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명은 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 제공하며, 상기 제1 항원-결합 부위는 도 16A(16a-16k) 또는 도 16E(16s-16z)에 나타낸 것과 같은 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 및 MF1898로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열, 또는 도 16A(16a-16k) 또는 도 16E(16s-16z)에 나타낸 것과 같은 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 및 MF1898로 구성되는 군으로부터 선택된 VH의 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게 최대 2개, 더 바람직하게 1개 이하의 아미노산이 차이가 있는 중쇄 CDR3 서열을 포함하며, 상기 제2 항원-결합 부위는 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 및 MF6074로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열, 또는 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 및 MF6074로 구성되는 군으로부터 선택된 VH의 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게 최대 2개, 더 바람직하게 1개 이하의 아미노산이 차이가 있는 중쇄 CDR3 서열을 포함한다. 상기 제1 항원-결합 부위는 바람직하게 MF1849, MF2971, MF3958, MF3004 또는 MF3991의 적어도 CDR3 서열, 가장 바람직하게 MF3958의 적어도 CDR3 서열을 포함하고, 상기 제2 항원-결합 부위는 바람직하게 MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 또는 MF6065의 CDR3 서열, 가장 바람직하게 MF3178의 적어도 CDR3 서열을 포함한다.
상기 제1 항원-결합 부위는 도 16A(16a-16k) 또는 도 16E(16s-16z)에 나타낸 것과 같은 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 및 MF1898로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 또는 도 16A(16a-16k) 또는 도 16E(16s-16z)에 나타낸 것과 같은 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 및 MF1898로 구성되는 군으로부터 선택된 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게 최대 2개, 더 바람직하게 1개 이하의 아미노산이 차이가 있는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 상기 제2 항원-결합 부위는 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 및 MF6074로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 또는 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 및 MF6074로 구성되는 군으로부터 선택된 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게 최대 2개, 바람직하게 1개 이하의 아미노산이 차이가 있는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. 상기 제1 항원-결합 부위는 바람직하게 MF1849, MF2971, MF3958, MF3004 또는 MF3991의 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 가장 바람직하게 MF3958의 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 상기 제2 항원-결합 부위는 바람직하게 MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 또는 MF6065의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 가장 바람직하게 MF3178의 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다.
한 바람직한 구체예는 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 제공하며, 상기 제1 항원-결합 부위는 MF3958의 적어도 CDR3서열, 또는 MF3958의 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게 최대 2개, 더 바람직하게 1개 이하의 아미노산이 차이가 있는 CDR3 서열을 포함하고, 상기 제2 항원-결합 부위는 MF3178의 적어도 CDR3 서열, 또는 MF3178의 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게 최대 2개, 더 바람직하게 1개 이하의 아미노산이 차이가 있는 CDR3 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명은 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 제공하며, 상기 제1 항원-결합 부위는 MF3958의 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3서열, 또는 MF3958의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게 최대 2개, 더 바람직하게 최대 1개 아미노산이 차이가 있는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 상기 제2 항원-결합 부위는 MF3178의 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 또는 MF3178의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게 최대 2개, 더 바람직하게 최대 1개 아미노산이 차이가 있는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명은 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 제공하며, 상기 제1 항원-결합 부위는 MF3958의 적어도 CDR3 서열을 포함하고, 상기 제2 항원-결합 부위는 MF3178의 적어도 CDR3 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명은 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 제공하며, 상기 제1 항원-결합 부위는 MF3958의 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 상기 제2 항원-결합 부위는 MF3178의 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다.
CDR 서열은, 예를 들어 최적화 목적을 위해, 바람직하게는 항체의 결합 효능 또는 안정성을 개선하기 위해 변화된다. 최적화는, 예를 들어 돌연변이유발 과정에 의해 수행되며, 이후 얻어진 항체의 안정성 및/또는 결합 친화성이 바람직하게 테스트되고, 개선된 ErbB-2 또는 ErbB-3-특이적 CDR 서열이 바람직하게 선택된다. 당업자는 본 발명에 따른 적어도 하나의 변형된 CDR 서열을 포함하는 항체 변이체를 잘 생성할 수 있다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환이 적용된다. 보존적 아미노산 치환의 예들은 이소로이신, 발린, 로이신 또는 메티오닌과 같은 하나의 소수성 잔기의 다른 소수성 잔기로의 치환, 및 하나의 극성 잔기의 다른 극성 잔기로의 치환, 예컨대 아르기닌의 리신으로의 치환, 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환, 또는 글루타민의 아스파라긴으로의 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명은 ErbB-2에 결합하는 가변 도메인을 포함하는 항체를 제공하며, 상기 가변 도메인의 VH 사슬은 도 16A(16a-16k) 또는 도 16E(16s-16z)에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF2926; MF2930; MF1849; MF2973; MF3004; MF3958(사람화된 MF2971); MF2971; MF3025; MF2916; MF3991(사람화된 MF3004); MF3031; MF2889; MF2913; MF1847; MF3001, MF3003 또는 MF1898의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 도 16A(16a-16k) 또는 도 16E의 상기 VH 사슬 서열과 관련하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16A(16a-16k) 또는 도 16E(16s-16z)에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF2926; MF2930; MF1849; MF2973; MF3004; MF3958(사람화된 MF2971); MF2971; MF3025; MF2916; MF3991(사람화된 MF3004); MF3031; MF2889; MF2913; MF1847; MF3001, MF3003 또는 MF1898의 아미노산 서열을 포함한다. ErbB-2에 결합하는 가변 도메인의 VH 사슬은 바람직하게 아래의 아미노산 서열을 포함한다:
도 16A(16a-16k)에 나타낸 것과 같은,
- MF1849;
- MF2971 또는 그것의 사람화된 버전, 상기 사람화된 버전은 바람직하게 MF3958의 아미노산 서열을 포함한다; 또는
- MF3004 또는 그것의 사람화된 버전, 상기 사람화된 버전은 바람직하게 MF3991의 아미노산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, ErbB-2에 결합하는 가변 도메인의 VH 사슬은 VH 사슬 MF1849; 또는 MF2971 또는 그것의 사람화된 버전의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 사람화된 버전은 바람직하게 MF3958; 또는 MF3004 또는 그것의 사람화된 버전의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 사람화된 버전은 바람직하게 MF3991의 아미노산 서열을 포함하고, 인용된 VH 서열은 도 16A(16a-16k)에 나타낸 각각의 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진다. 바람직한 구체예에서, ErbB-2에 결합하는 가변 도메인의 VH 사슬은 MF3958의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 VH 사슬 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16A(16a-16k)에 나타낸 MF3958의 아미노산 서열을 포함한다. ErbB-2에 결합하는 가변 도메인을 포함하는 항체는 바람직하게 ErbB-3에 결합하는 가변 도메인을 더 포함하는 이중특이적 항체이다. ErbB-3에 결합하는 가변 도메인의 VH 사슬은 바람직하게 도 16B(16l-16p) 또는 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 도 16B(16l-16p) 또는 도 16E(16s-16z) 또는 도 37의 VH 사슬 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16B(16l-16p) 또는 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 아미노산 서열을 포함한다. ErbB-3에 결합하는 가변 도메인의 VH 사슬은 바람직하게 MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 또는 MF6065의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 도 16B(16l-16p) 또는 도 37에 나타낸 각각의 VH 사슬 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 또는 MF6065의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, ErbB-3에 결합하는 가변 도메인의 VH 사슬은 MF3178의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 VH 사슬 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16B(16l-16p)에 나타낸 MF3178의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 상기 언급된 아미노산 삽입, 결실 및 치환은 CDR3 영역에는 존재하지 않는다. 상기 언급된 아미노산 삽입, 결실 및 치환은 또한 바람직하게 CDR1 및 CDR2 영역에는 존재하지 않는다. 상기 언급된 아미노산 삽입, 결실 및 치환은 또한 바람직하게는 FR4 영역에는 존재하지 않는다.
본 발명은 ErbB-3에 결합하는 가변 도메인을 포함하는 항체를 더 제공하며, 상기 가변 영역의 VH 사슬은 도 16B(16l-16p) 또는 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 상기 VH 사슬 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16B(16l-16p) 또는 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 아미노산 서열을 포함한다. ErbB-3에 결합하는 가변 도메인의 VH 사슬은 바람직하게 MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 또는 MF6065의 VH 사슬의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 상기 VH 사슬 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 또는 MF6065의 VH 사슬의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, ErbB-3에 결합하는 가변 도메인의 VH 사슬은 도 16에 나타낸 MF3178의 VH 사슬의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 VH 사슬 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16B(16l-16p)에 나타낸 MF3178의 VH 사슬의 아미노산 서열을 포함한다. ErbB-3에 결합하는 가변 도메인을 포함하는 항체는 바람직하게 ErbB-2에 결합하는 가변 도메인을 더 포함하는 이중특이적 항체이다. ErbB-2에 결합하는 가변 도메인의 VH 사슬은 바람직하게 도 16A(16a-16k) 또는 도 16E의 VH 사슬의 아미노산 서열을 포함한다. ErbB-2에 결합하는 가변 도메인의 VH 사슬은 바람직하게 MF1849의 아미노산 서열; 또는 MF2971 또는 그것의 사람화된 버전(바람직하게 MF3958의 아미노산 서열을 포함)의 아미노산 서열; 또는 MF3004 또는 그것의 사람화된 버전(바람직하게 도 16A(16a-16k)에 나타낸 것과 같은 MF3991의 아미노산 서열을 포함)의 아미노산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 인용된 ErbB-2 결합 VH 서열은 도 16A(16a-16k)에 나타낸 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진다. 한 바람직한 구체예에서, 도 16A(16a-16k)의 상기 ErbB-2 결합 VH 사슬은 MF3958의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 VH 사슬 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 MF3958의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 상기 언급된 아미노산 삽입, 결실 및 치환은 CDR3 영역에는 존재하지 않는다. 상기 언급된 아미노산 삽입, 결실 및 치환은 또한 바람직하게 CDR1 및 CDR2 영역에는 존재하지 않는다. 상기 언급된 아미노산 삽입, 결실 및 치환은 또한 바람직하게는 FR4 영역에는 존재하지 않는다.
본 발명에 따른 항체가 더 제공되며, 상기 항체는 도 16A(16a-16k) 또는 도 16E(16s-16z)에 나타낸 것과 같은 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 및 MF1898의 중쇄 가변 영역 서열로 구성된 군으로부터 선택된 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역 서열을 포함하거나; 또는 상기 항체는 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 또는 MF1898의 중쇄 가변 영역 서열과 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산이 차이가 있는 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 항체가 더 제공되며, 상기 항체는 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 및 MF6074의 중쇄 가변 영역 서열로 구성된 군으로부터 선택된 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역 서열을 포함하거나; 또는 상기 항체는 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 및 MF6074의 중쇄 가변 영역 서열과 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산이 차이가 있는 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명은 ErbB-2에 결합하는 2개의 항원-결합 부위를 포함하는 항체를 제공하며, 상기 항원-결합 부위 중 적어도 하나는 ErbB-2의 도메인 I에 결합한다. 바람직하게, 두 항원-결합 부위는 모두 ErbB-2의 도메인 I에 결합한다. 본 발명에 따른 이러한 항체는 ErbB-2의 도메인 IV에 결합하는 트라스투주맙 및 ErbB-2의 도메인 II에 결합하는 퍼투주맙과 같은, ErbB-2의 도메인 I에 결합하지 않는 현재 사용되는 항-ErbB-2 결합 분자와의 조합 요법에 특히 적합하며, 그 이유는 상이한 결합 분자들이 동일한 에피토프에 대해 서로 경쟁하지 않기 때문이다.
ErbB-2에 결합하는 2개의 항원-결합 부위를 포함하는 항체가 더 제공되며, 상기 항원-결합 부위 중 적어도 하나는 ErbB-2의 도메인 I에 결합하고, ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 적어도 하나의 항원-결합 부위의 친화성(KD)은 5.0 nM 이하, 바람직하게 4.5 nM 이하, 더 바람직하게 3.9 nM 이하이다. 바람직하게, 두 항원-결합 부위는 모두 ErbB-2의 도메인 I에 결합한다. 한 바람직한 구체예에서, SK-BR-3 세포 상의 ErbB-2에 대한 상기 적어도 하나의 항원-결합 부위의 친화성은 5.0 nM 이하, 바람직하게 4.5 nM 이하, 더 바람직하게 4.0 nM 이하, 더욱 더 바람직하게 3.5 nM 이하, 보다 더 바람직하게 3.0 nM 이하, 가장 바람직하게 2.3 nM 이하이다. 한 구체예에서, 상기 친화성은 3.0-1.6 nM의 범위 내이다. 한 바람직한 구체예에서, BT-474 세포 상의 ErbB-2에 대한 상기 적어도 하나의 항원-결합 부위의 친화성은 5.0 nM 이하, 바람직하게 4.5 nM 이하, 더 바람직하게 3.9 nM 이하이다. 한 구체예에서, 상기 친화성은 4.5-3.3 nM의 범위 내이다.
상기 언급된 친화성은 바람직하게 정류 상태 세포 친화성 측정을 사용하여 측정된 것이며, 세포는 방사성활성 표지된 항체를 사용하여 4℃에서 인큐베이션되고, 이후 세포-결합된 방서성활성이 실시예에 설명된 대로 측정된다.
본 발명은 ErbB-2에 결합하는 2개의 가변 도메인을 포함하는 항체를 제공하며, 상기 가변 도메인의 VH 사슬은 도 16A(16a-16k) 또는 도 16E(16s-16z)에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF2926; MF2930; MF1849; MF2973; MF3004; MF3958(사람화된 MF2971); MF2971; MF3025; MF2916; MF3991(사람화된 MF3004); MF3031; MF2889; MF2913; MF1847; MF3001, MF3003 또는 MF1898의 아미노산 서열; 또는 도 16A 또는 도 16E(16s-16z)에 나타낸 각각의 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16A(16a-16k) 또는 도 16E(16s-16z)에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF2926; MF2930; MF1849; MF2973; MF3004; MF3958(사람화된 MF2971); MF2971; MF3025; MF2916; MF3991(사람화된 MF3004); MF3031; MF2889; MF2913; MF1847; MF3001, MF3003 또는 MF1898의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 VH는 바람직하게 VH 사슬 MF1849; MF2971 또는 그것의 사람화된 버전(바람직하게 MF3958의 아미노산 서열 포함); MF3004 또는 그것의 사람화된 버전(바람직하게 도 16A(16a-16k)에 나타낸 것과 같은 MF3991의 아미노산 서열 포함); VH 사슬 MF1849; MF2971 또는 그것의 사람화된 버전(바람직하게 MF3958의 아미노산 서열 포함); 또는 MF3004 또는 그것의 사람화된 버전(바람직하게 도 16A(16a-16k)에 나타낸 각각의 서열에 대해 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16A(16a-16k)에 나타낸 것과 같은 MF3991의 아미노산 서열 포함)의 아미노산 서열을 포함한다. 항체의 가변 도메인은, 바람직하게는 도 16A 또는 도 16E(16s-16z)에 나타낸 것과 같은 서열을 가진, 동일한 VH 사슬을 포함한다. 동일한 VH 사슬을 가진 가변 도메인을 가진 항체는 이중특이적 항체가 아니다. VH 사슬은 도 16A, 도 16E 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 동일한 VH 사슬 서열, 또는 도 16A, 도 16E 또는 도 37에 나타낸 각각의 서열에 대하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 제외하고 동일한 VH 사슬 서열을 포함한다면 본 발명에 대해 동일하다.
한 구체예에서, 본 발명은 ErbB-3에 결합하는 2개의 항원-결합 부위를 포함하는 항체를 제공하며, 상기 항원-결합 부위 중 적어도 하나는 ErbB-3의 도메인 III에 결합한다. 바람직하게, 두 항원-결합 부위는 모두 ErbB-3의 도메인 III에 결합한다. 본 발명에 따른 이러한 항체는 ErbB-3의 도메인 I에 결합하는 MM-121(#Ab6) 및 RG7116과 같은, ErbB-3의 도메인 III에 결합하지 않는 현재 사용되는 항-ErbB-2 결합 분자와의 조합 요법에 특히 적합하며, 그 이유는 상이한 결합 분자들이 동일한 에피토프에 대해 서로 경쟁하지 않기 때문이다.
ErbB-3에 결합하는 2개의 항원-결합 부위를 포함하는 항체가 더 제공되며, 상기 항원-결합 부위 중 적어도 하나는 ErbB-3의 도메인 III에 결합하고, ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 적어도 하나의 항원-결합 부위의 친화성(KD)은 2.0 nM 이하, 바람직하게 1.5 nM 이하, 더 바람직하게 1.39 nM 이하, 더욱 더 바람직하게 0.99 nM 이하이다. 바람직하게, 두 항원-결합 부위는 모두 ErbB-3의 도메인 III에 결합한다. 한 바람직한 구체예에서, SK-BR-3 세포 상의 ErbB-3에 대한 상기 적어도 하나의 항원-결합 부위의 친화성은 2.0 nM 이하, 바람직하게 1.5 nM 이하, 더 바람직하게 1.39 nM 이하, 더욱 더 바람직하게 0.99 nM 이하이다. 한 구체예에서, 상기 친화성은 1.39-0.59 nM의 범위 내이다. 한 바람직한 구체예에서, BT-474 세포 상의 ErbB-3에 대한 상기 적어도 하나의 항원-결합 부위의 친화성은 2.0 nM 이하, 바람직하게 1.5 nM 이하, 더 바람직하게 1.0 nM 이하, 더욱 더 바람직하게 0.5 nM 이하, 보다 더 바람직하게 0.31 nM 이하, 가장 바람직하게 0.23 nM 이하이다. 한 구체예에서, 상기 친화성은 0.31-0.15 nM의 범위 내이다.
상기 언급된 친화성은 바람직하게 정류 상태 세포 친화성 측정을 사용하여 측정된 것이며, 상기 세포는 방사성활성 표지된 항체를 사용하여 4℃에서 인큐베이션되고, 이후 세포-결합된 방서성활성이 실시예에 설명된 대로 측정된다.
본 발명은 ErbB-3에 각각 결합하는 2개의 가변 도메인을 포함하는 항체를 더 제공하며, 상기 가변 도메인의 VH는 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 상기 VH 사슬 서열 중 어느 것에 대하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 VH 사슬 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 VH는 바람직하게 VH 사슬 MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 또는 MF6065의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 상기 VH 사슬 서열 중 어느 것에 대하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 VH 사슬 MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 또는 MF6065의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 VH는 바람직하게 VH 사슬 MF3178의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 MF3178 VH 사슬 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16B(16l-16p)에 나타낸 VH 사슬 MF3178의 아미노산 서열을 포함한다.
상기 항체의 가변 도메인은, 바람직하게 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 서열을 가진, 동일한 VH 사슬을 포함한다. 동일한 VH 사슬을 가진 가변 도메인을 가진 항체는 이중특이적 항체가 아니다. 상기 VH 사슬은 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 동일한 VH 사슬 서열, 또는 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37의 VH 사슬 서열에 대하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 제외하고 동일한 VH 사슬 서열을 포함한다면 본 발명에 대해 동일하다.
ErbB-3에 특이적인 본 발명에 따른 단일특이적 항체는 이들이, 예를 들어 MM-121(#Ab6)과 같은 선행기술의 화합물과 비교하여, ErbB-3에 대해 보다 나은 기능적 활성을 가진다는 이점을 가지며, 이는 본 발명에 따른 이들 항체가 ErbB-3 활성(예컨대 ErbB-3의 리간드-유도 수용체 기능 및/또는 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포의 리간드-유도 성장)을 더 잘 상쇄할 수 있음을 의미한다. 이것은 표 7 및 도 38에 나타낸다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 ErbB-2에 결합하는 가변 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 제공하며, 상기 가변 도메인의 VH 사슬은:
- VH 사슬 MF1849; MF2971 또는 그것의 사람화된 버전(바람직하게 MF3958의 아미노산 서열을 포함); 또는 MF3004 또는 그것의 사람화된 버전(바람직하게 도 16A(16a-16k)에 나타낸 것과 같은 MF3991의 아미노산 서열을 포함)의 아미노산 서열을 포함하고; 또는
- VH 사슬 MF1849; 또는 MF2971 또는 그것의 사람화된 버전(바람직하게 MF3958의 아미노산 서열을 포함); 또는 MF3004 또는 그것의 사람화된 버전(바람직하게 상기 VH에 대하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16A(16a-16k)에 나타낸 것과 같은 MF3991의 아미노산 서열을 포함)의 아미노산 서열을 포함한다. 이 구체예에 따른 이러한 이중특이적 항체는 바람직하게 ErbB-3에 결합하는 가변 도메인을 더 포함한다. ErbB-3에 결합하는 가변 도메인의 VH 사슬은 바람직하게 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 가장 바람직하게 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37의 상기 VH 사슬 서열 중 어느 것에 대하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 아미노산 서열을 포함한다. ErbB-3에 결합하는 가변 도메인의 VH 사슬은 바람직하게 도 16B(16l-16p)에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF3178의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 도 16B의 VH 사슬 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16B(16l-16p)에 나타낸 VH 사슬 MF3178의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 바람직하게 ErbB-2에 결합하는 가변 도메인과 ErbB-3에 결합하는 가변 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 제공하며, 상기 ErbB-2에 결합하는 가변 도메인의 VH 사슬은:
- 도 16A(16a-16k)에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF3958의 아미노산 서열; 또는
- 상기 VH에 대하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16A(16a-16k)에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF3958의 아미노산 서열;
을 포함하고, 상기 ErbB-3에 결합하는 가변 도메인의 VH 사슬은:
- 도 16B(16l-16p)에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF3178의 아미노산 서열; 또는
- 도 16B의 VH 사슬 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16B(16l-16p)에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF3178의 아미노산 서열;
을 포함한다.
본 발명은 바람직하게 ErbB-2에 결합하는 가변 도메인과 ErbB-3에 결합하는 가변 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 제공하며, 상기 ErbB-2에 결합하는 가변 도메인의 VH 사슬은:
- 도 16A(16a-16k)에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF3991의 아미노산 서열; 또는
- 상기 VH에 대하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16A(16a-16k)에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF3991의 아미노산 서열;
을 포함하고, ErbB-3에 결합하는 가변 도메인의 VH 사슬은:
- 도 16B(16l-16p)에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF3178의 아미노산 서열; 또는
- 도 16B의 VH 사슬 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16B(16l-16p)에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF3178의 아미노산 서열;
을 포함한다.
도 16의 서열과 비교했을 때, VH 사슬의 거동은 전형적으로 도 16에 나타낸 VH 사슬의 아미노산 서열에 대하여 15개를 넘는 아미노산 변화를 가질 때 인식할 수 있는 차이를 나타내기 시작한다. 도 16에 나타낸 VH 사슬에 대하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 VH 사슬은 바람직하게 도 16에 나타낸 VH 사슬에 대하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합, 바람직하게 1, 2, 3 또는 4개의 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합, 더 바람직하게 1, 2 또는 3개의 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합, 더욱 더 바람직하게 1 또는 2개의 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합, 및 가장 바람직하게 1개의 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진다. 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합은 바람직하게 VH 사슬의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역에는 존재하지 않는다. 이들은 또한 바람직하게 FR4 영역에는 존재하지 않는다. 상기 아미노산 치환은 바람직하게 보존적 아미노산 치환이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 도 16D(16r)에 나타낸 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 이중특이적 항체, 또는 도 16D(16r)의 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16D의 이중특이적 항체를 제공하며, 상기 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환은 바람직하게 보존적 아미노산 치환이다. 상기 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합은 VH 사슬의 CDR3 영역, 바람직하게 VH 사슬의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역에는 존재하지 않고, 바람직하게 FR4 영역에는 존재하지 않는다.
사람 내용물에서의 비-사람 잔기의 함량을 최소화하기 위한 합리적인 방법들이 개발되었다. 다른 항체로의 이중특이적 항체의 항원-결합 특성을 성공적으로 접목시키는데 이용될 수 있는 다양한 방법이 있다다. 이러한 항체의 결합 특성은 CDR3 영역의 정확한 서열에 우세하게 남으며, 주로 전체 가변 도메인의 적절한 구조와 조합된 가변 도메인의 CDR1 및 CDR2 영역의 서열에 의해 지원된다. 다른 항체의 적합한 가변 도메인에 CDR 영역을 접목시키는데 현재 이용될 수 있는 다양한 방법이 있다. 이들 방법 중 일부는 문헌(J.C. Almagro1 and J. Fransson (2008) Frontiers in Bioscience 13, 1619-1633)에 제시되었으며, 이것은 본 명세서에 참고로 포함된다. 따라서, 본 발명은 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 사람 또는 사람화된 이중특이적 항체를 더 제공하며, ErbB-2 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 16A 또는 도 16E(16s-16z)에 나타낸 것과 같은 VH CDR3 서열을 포함하고, ErbB-3 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 VH CDR3 영역을 포함한다. ErbB-2 결합 부위를 포함하는 VH 가변 영역은 바람직하게 도 16A 또는 도 16E의 VH 사슬의 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역의 서열을 포함한다. ErbB-3 결합 부위를 포함하는 VH 가변 영역은 바람직하게 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37의 VH 사슬의 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역의 서열을 포함한다. CDR 접목은 또한 도 16 또는 도 37의 VH의 CDR 영역을 가지고 상이한 프레임워크를 가진 VH 사슬을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 상이한 프레임워크는 다른 사람 VH, 또는 상이한 포유류의 것일 수 있다.
상기 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환은 바람직하게 보존적 아미노산 치환이다. 상기 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합은 VH 사슬의 CDR3 영역, 바람직하게 VH 사슬의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역에는 존재하지 않고, 바람직하게 FR4 영역에는 존재하지 않는다.
도 16 또는 도 37에 나타낸 가변 중쇄 서열을 포함하는 가변 도메인의 경쇄는 점라인 경쇄 O12, 바람직하게 재배열된 점라인 사람 카파 경쇄 IgVκ-39*01/IGJκ*01 또는 그것의 단편 또는 기능적 유도체이다(imgt.org 월드와이드 웹의 IMGT 데이터베이스에 따라서 명명). 재배열된 점라인 사람 카파 경쇄 IgVκ-39*01/IGJκ*01, IGKV1-39/IGKJ1, huVκ-39 경쇄 또는 간단히 huVκ-39가 사용된다. 상기 경쇄는 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진다. 상기 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환은 바람직하게 보존적 아미노산 치환이고, 상기 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합은 VL 사슬의 CDR3 영역, 바람직하게 VL 사슬의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역에는 존재하지 않고, 바람직하게 VL 사슬의 FR4 영역에는 존재하지 않는다.
다양한 방법이 이중특이적 항체를 생산하기 위해 이용될 수 있다. 이 중 한 가지 방법은 세포에서 두 상이한 중쇄 및 두 상이한 경쇄를 발현하고, 세포에 의해 생성된 항체를 수집하는 것을 수반한다. 이 방식으로 생성된 항체는 전형적으로 중쇄와 경쇄의 상이한 조합을 가진 항체의 집단을 함유하며, 이들 중 일부가 원하는 이중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 이어서 집단으로부터 정제될 수 있다. 세포에 의해 생성된 다른 항체들에 대한 이중특이적 항체의 비율은 다양한 방식으로 증가될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 이 비율은 세포에서 두 상이한 경쇄가 아니라 본질적으로 동일한 두 경쇄를 발현함으로써 증가된다. 이 개념은 본 분야에서 또한 "공통 경쇄" 방법이라고 언급된다. 본질적으로 동일한 경쇄가 두 상이한 중쇄와 함께 작동할 때, 상이한 항원-결합 부위 및 수반되는 상이한 결합 특성을 가진 가변 도메인을 형성하며, 세포에 의해 생성된 다른 항체에 대한 이중특이적 항체의 비율이 두 상이한 경쇄의 발현에 비해 유의하게 개선된다. 세포에 의해 생성된 이중특이적 항체의 비율은 동일한 두 중쇄의 페어링에 비하여 상이한 두 중쇄의 페어링을 서로 자극함으로써 더 개선될 수 있다. 중쇄의 이러한 헤테로다이머화가 달성되는 다양한 방식이 공개되어 있다. 한 가지 방식은 '놉 인투 홀' 이중특이적 항체를 생성하는 것이다(미국특허출원 No. 20030078385 (Arathoon et al. - Genentech) 참조). 바람직한 다른 방법은 미국 임시출원 No. 61/635,935에 개시되어 있고, 이 내용은 US 정규출원 No. 13/866,747 및 PCT 출원 No. PCT/NL2013/050294(WO 2013/157954 A1)에서 구체화되어 있으며, 이들은 본 명세서에 참고로 포함된다. 상기 방법들 및 수단들은 단일 세포로부터 이중특이적 항체를 생성하기 위해 개시되어 있으므로, 단일특이적 항체의 형성에 비해 이중특이적 항체의 형성을 선호하는 수단이 제공된다. 이들 방법은 또한 본 발명에서 유리하게 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 생성 방법(단일 세포로부터)을 제공하며, 상기 이중특이적 항체는 계면을 형성할 수 있는 두 CH3 도메인을 포함하고, 상기 방법은 상기 세포에서 a) 중쇄를 포함하는 1st CH3 도메인을 암호화하는 제1 핵산 분자, b) 중쇄를 포함하는 2nd CH3 도메인을 암호화하는 제2 핵산 분자를 제공하는 단계를 포함하며, 상기 핵산 분자는 중쇄를 포함하는 상기 1st와 2nd CH3 도메인의 우선적 페어링을 위한 수단과 함께 제공되며, 상기 방법은 상기 숙주 세포를 배양하고, 상기 두 핵산 분자를 발현하며, 배양물로부터 상기 이중특이적 항체를 수거하는 단계를 더 포함한다. 상기 제1 및 제2 핵산 분자는 동일한 핵산 분자, 벡터 또는 유전자 송달 비히클의 일부일 수 있으며, 숙주 세포의 게놈의 동일한 부위에 통합될 수 있다. 또는, 상기 제1 및 제2 핵산 분자는 상기 세포에 따로따로 제공된다.
바람직한 구체예는 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 생성하는 방법(단일 세포로부터)을 제공하며, 상기 이중특이적 항체는 계면을 형성할 수 있는 두 CH3 도메인을 포함하고, 상기 방법은
- a) ErbB-2에 결합하고 1st CH3 도메인을 함유하는 항원 결합 부위를 포함하는 중쇄를 암호화하는 제1 핵산 분자, 및 b) ErbB-3에 결합하고 2nd CH3 도메인을 함유하는 항원 결합 부위를 포함하는 중쇄를 암호화하는 제2 핵산 분자
를 가진 세포를 제공하는 단계를 포함하며, 상기 핵산 분자는 상기 1st와 2nd CH3 도메인의 우선적 페어링을 위한 수단과 함께 제공된다.
상기 방법은 상기 세포를 배양하고, 상기 두 핵산 분자를 발현하며, 배양물로부터 상기 이중특이적 IgG 항체를 수거하는 단계를 더 포함한다.
특히 바람직한 구체예에서, 상기 세포는 또한 공통 경쇄를 암호화하는 제3 핵산 분자를 가진다. 상기 제1, 제2 및 제3 핵산 분자는 동일한 핵산 분자, 벡터 또는 유전자 송달 비히클의 일부일 수 있으며, 숙주 세포의 게놈의 동일한 부위에 통합될 수 있다. 또는, 상기 제1, 제2 및 제3 핵산 분자는 상기 세포에 따로따로 제공된다. 바람직한 공통 경쇄는 O12이며, 바람직하게는 상기 설명된 것과 같은 재배열된 점라인 사람 카파 경쇄 IgVκ39*01/IGJκ*01이다. 상기 1st와 상기 2nd CH3 도메인의 우선적 페어링을 위한 수단은 바람직하게 중쇄 코딩 영역의 CH3 도메인에서의 상응하는 돌연변이이다. 본질적으로 이중특이적 항체만을 생성하는 바람직한 돌연변이는 제1 CH3 도메인의 아미노산 치환 L351K 및 T366K(Kabat에 따라 넘버링) 및 제2 CH3 도메인의 아미노산 치환 L351D 및 L368E이거나, 또는 그 반대이다. 따라서, 이중특이적 항체를 생성하기 위한 본 발명에 따른 방법이 제공되며, 상기 제1 CH3 도메인은 아미노산 치환 L351K 및 T366K(Kabat에 따라 넘버링)을 포함하고, 상기 제2 CH3 도메인은 아미노산 치환 L351D 및 L368E을 포함하며, 상기 방법은 상기 세포를 배양하고, 상기 핵산 분자를 발현하며, 배양물로부터 상기 이중특이적 항체를 수거하는 단계를 더 포함한다. 또한, 이중특이적 항체를 생성하기 위한 본 발명에 따른 방법이 제공되며, 상기 제1 CH3 도메인은 아미노산 치환 L351D 및 L368E(Kabat에 따라 넘버링)를 포함하고, 상기 제2 CH3 도메인은 아미노산 치환 L351K 및 T366K를 포함하며, 상기 방법은 상기 세포를 배양하고, 상기 핵산 분자를 발현하며, 배양물로부터 상기 이중특이적 항체를 수거하는 단계를 더 포함한다.
이들 방법에 의해 생성될 수 있는 항체도 또한 본 발명의 일부이다. CH3 헤테로다이머화 도메인은 바람직하게 IgG1 헤테로다이머화 도메인이다. CH3 헤테로다이머화 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역은 바람직하게 IgG1 불변 영역이다.
한 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산 분자(전형적으로 시험관내, 분리된 또는 재조합 핵산)는 바람직하게 도 16A, 도 16B(16l-16p) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 중쇄 가변 영역, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16A, 도 16B(16l-16p) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 중쇄 가변 영역을 암호화한다. 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 도 16 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 서열을 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 도 16 또는 도 37에 나타낸 핵산과 동일한 아미노산 서열을 암호화하지만, 하나 이상의 상이한 코돈을 암호화하기 때문이 상이한 서열을 가진다. 예를 들어, 이러한 핵산 분자는 항체 생성자 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NS0 세포 또는 PER-C6™ 세포에 최적화된 코돈이다. 본 발명은 또한 도 16D 또는 도 37의 중쇄를 암호화하는 핵산 서열을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 핵산 분자는 전형적으로 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA)이지만 반드시 그런 것은 아니다. 다른 핵산도 이용할 수 있다. 본 발명에 따른 핵산은, 예를 들어 세포에 포함된다. 상기 핵산이 상기 세포에서 발현될 때, 상기 세포는 본 발명에 따른 항체를 생성한다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 및/또는 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 세포를 제공한다. 상기 세포는 바람직하게 동물 세포, 더 바람직하게 포유류 세포, 더욱 바람직하게 영장류 세포, 가장 바람직하게 사람 세포이다. 본 발명의 목적을 위해, 적합한 세포는 본 발명에 따른 항체 및/또는 본 발명에 따른 핵산을 포함하고 바람직하게는 생성할 수 있는 세포이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체를 포함하는 세포를 제공한다. 바람직하게 상기 세포(전형적으로 시험관내, 분리된, 또는 재조합 세포)는 상기 항체를 생성한다. 바람직한 구체예에서, 상기 세포는 하이브리도마 세포, CHO 세포, NS0 세포 또는 PER-C6™ 세포이다. 특히 바람직한 구체예에서, 상기 세포는 CHO 세포이다. 또한, 본 발명에 따른 세포를 포함하는 세포 배양물이 제공된다. 다양한 기관 및 회사에서, 예를 들어 임상 용도를 위한, 대규모 항체 생산을 위한 셀라인을 개발했다. 이러한 셀라인의 비제한적 예들은 CHO 세포, NS0 세포 또는 PER.C6™ 세포이다. 이들 세포는 또한 단백질의 생산과 같은 다른 목적에도 사용된다. 단백질 및 항체의 대량 생산을 위해 개발된 셀라인은 본 명세서에서 산업용 셀라인이라고도 언급된다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 생성을 위한 대규모 항체 생산을 위해 개발된 셀라인의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 세포를 배양하는 단계 및 상기 배양물로부터 상기 항체를 수거하는 단계를 포함하는 항체를 생성하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 세포는 혈청 무함유 배지에서 배양된다. 바람직하게, 상기 세포는 현탁액 성장에 적합하다. 또한, 본 발명에 따른 항체의 생성 방법에 의해 얻어질 수 있는 항체가 제공된다. 상기 항체는 바람직하게 배양물의 배지로부터 정제된다. 바람직하게, 상기 항체는 친화성 정제된다.
본 발명의 세포는, 예를 들어 하이브리도마 셀라인, CHO 세포, NS0 세포 또는 임상 목적을 위한 항체 생성에 대해 적합성이 알려진 다른 세포 타입이다. 특히 바람직한 구체예에서, 상기 세포는 사람 세포이다. 바람직하게, 상기 세포는 아데노바이러스 E1 영역 또는 그것의 기능적 등가물에 의해 형질전환된다. 이러한 셀라인의 바람직한 예는 PER.C6™ 셀라인 또는 그것의 등가물이다. 특히 바람직한 구체예에서, 상기 세포는 CHO 세포 또는 그것의 변이체이다. 바람직하게, 상기 변이체는 항체의 발현을 위한 글루타민 합성효소(GS) 벡터 시스템의 사용을 가능하게 한다.
본 발명은 본 발명에 따른 항체를 포함하는 조성물, 바람직하게 제약학적 조성물을 더 제공한다. 상기 제약학적 조성물은 바람직하게 (제약학적으로 허용되는) 부형제 또는 캐리어를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제약학적 조성물은 5-50 mM 히스티딘, 100-300 mM 트레할로오스, 0.1-03 g/L 폴리소르베이트 20 또는 이들의 조합을 포함한다. pH는 바람직하게 5.5 - 6.5로 설정된다. 바람직한 구체예에서, 상기 제약학적 조성물은 25 mM 히스티딘, 220 mM 트레할로오스, 0.2 g/L 폴리소르베이트 20 또는 이들의 조합을 포함한다. pH는 바람직하게 5.5 - 6.5, 가장 바람직하게 6으로 설정된다.
본 발명의 항체는 표지, 바람직하게는 생체내 영상화를 위한 표지를 더 포함한다. 이러한 표지는 전형적으로 치료 용도에 필요한 것은 아니다. 예를 들어, 진단 환경에서 표지가 도움이 될 수 있다. 예를 들어, 체내에서 표적 세포를 시각화한다. 다양한 표지가 적합하며, 이는 본 분야에 많이 알려져 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 표지는 검출을 위한 방사성활성 표지이다. 다른 바람직한 구체예에서, 상기 표지는 적외선 표지이다. 바람직하게, 적외선 표지는 생체내 영상화에 적합하다. 다양한 적외선 표지를 이용할 수 있다. 바람직한 적외선 표지는, 예를 들어 IRDye 800; IRDye 680RD; IRDye 680LT; IRDye 750; IRDye 700DX; IRDye 800RS IRDye 650; IRDye 700 포스포로아미다이트; IRDye 800 포스포로아미다이트(LI-COR USA; 4647 Superior Street; Lincoln, Nebraska)이다.
본 발명은 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가지거나 상기 종양을 가질 위험이 있는 대상의 치료를 위한 방법을 더 제공하며, 이 방법은 본 발명에 따른 항체 또는 제약학적 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 치료 시작 전에, 이 방법은 바람직하게 상기 대상이 이러한 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가지는지, 또는 가질 위험이 있는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 대상은 ErbB-2에 대해 [+] 또는 [++]로 분류된다. 다른 구체예에서, 상기 대상은 ErbB-2에 대해 [+++]로 분류된다. 본 발명은 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가지거나 가질 위험이 있는 대상의 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 항체를 더 제공한다. 또는, 본 발명은 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양의 치료를 위한 의약 또는 예방제의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 제공한다.
상기 종양은 바람직하게 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 암이다. 바람직하게, 상기 양성 암은 유방암, 예컨대 초기 단계 유방암이다. 그러나, 본 발명은 위암, 결직장암, 결장암, 위식도암, 식도암, 자궁내막암, 난소암, 간암, 비-소세포 폐암을 포함하는 폐암, 투명세포 육종, 침샘암, 두경부암, 뇌암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암, 흑색종 등과 같은 광범위한 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 암에 적용될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 항체는 전형적으로 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포 상에서 ErbB-3의 리간드-유도 수용체 기능, 바람직하게 리간드-유도 성장을 감소시킬 수 있다. 본 발명에 따른 상기 항체는 바람직하게 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3의 도메인 III에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함한다. 한 바람직한 구체예에서, ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원-결합 부위의 친화성(KD)은 ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원-결합 부위의 친화성과 같거나 더 높다. 따라서, ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양, 바람직하게 유방암, 위암, 결직장암, 결장암, 위식도암, 식도암, 자궁내막암, 난소암, 간암, 비-소세포 폐암을 포함하는 폐암, 투명세포 육종, 침샘암, 두경부암, 뇌암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암, 또는 흑색종을 가지거나 가질 위험이 있는 대상의 치료에서 사용하기 위한 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 항체가 더 제공되며, ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원-결합 부위의 친화성은 ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원-결합 부위의 친화성과 같거나 더 높다. ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원-결합 부위의 친화성은 l2.0 nM 이하, 바람직하게 1.39 nM 이하, 더 바람직하게 0.99 nM 이하이다. ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원-결합 부위의 친화성은 바람직하게 5.0 nM 이하, 바람직하게 4.5 nM이하, 더 바람직하게 4.0 nM 이하이다. 한 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 PB4188이다. 한 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 상기 항체는 T144, T164, R166, P172, G179, S180 및 R181로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-2의 도메인 I의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원-결합 부위, 및 T144, T164, R166, P172, G179, S180 또는 R181로부터의 약 5개 아미노산 위치 내에 위치된 표면-노출된 아미노산 잔기를 포함한다. 한 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 상기 항체는 바람직하게 R426로부터 선택된 ErbB-3의 도메인 III의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원-결합 부위 및 자생 ErbB-3 단백질에서 R426으로부터 11.2Å 내에 위치된 표면-노출된 아미노산 잔기를 포함한다.
따라서, ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양, 바람직하게 유방암, 위암, 결직장암, 결장암, 위식도암, 식도암, 자궁내막암, 난소암, 간암, 비-소세포 폐암을 포함하는 폐암, 투명세포 육종, 침샘암, 두경부암, 뇌암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암, 또는 흑색종을 가지거나 가질 위험이 있는 대상의 치료에서 사용하기 위한 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 항체가 더 제공되며, 본 발명에 따른 상기 항체는 T144, T164, R166, P172, G179, S180 및 R181로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-2의 도메인 I의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원-결합 부위, 및 T144, T164, R166, P172, G179, S180 또는 R181로부터의 약 5개 아미노산 위치 내에 위치된 표면-노출된 아미노산 잔기를 포함하고, 및/또는 본 발명에 따른 상기 항체는 바람직하게 R426로부터 선택된 ErbB-3의 도메인 III의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원-결합 부위 및 자생 ErbB-3 단백질에서 R426으로부터 11.2Å 내에 위치된 표면-노출된 아미노산 잔기를 포함한다.
상기 대상은 바람직하게 사람 대상이다. 상기 대상은 바람직하게 트라스투주맙과 같은 ErbB-2 특이적 항체를 사용한 모노클로날 항체 요법에 적격인 대상이다. 바람직한 구체예에서, 상기 대상은 종양, 바람직하게 ErbB-2/ErbB-3 양성 암, 바람직하게 ErbB-2 요법 내성 표현형 및/또는 헤레굴린 내성 표현형, 바람직하게 모노클로날 항체 내성 표현형을 가진 종양/암을 포함한다. 이러한 표현형을 수반하는 종양은 (제한은 아니지만) ErbB-2에 대한 모노클로날 항체 요법과 같은 현재 항-HER2 섭생으로 치료를 벗어날 수 있다.
환자에게 투여되는 본 발명에 따른 항체의 양은 전형적으로 치료 창 내에 있으며, 치료 효과를 얻기 위한 충분한 양이 사용되지만, 허용가능한 부작용 범위를 초래하는 문턱값을 초과하지 않는다. 원하는 치료 효과를 얻기 위해 필요한 항체의 양이 적을수록 치료 창은 전형적으로 더 넓어질 것이다. 따라서, 낮은 용량에서 충분한 치료 효과를 발휘하는 본 발명에 따른 항체가 바람직하다. 상기 용량은 트라스투주맙에 대한 투약 섭생 범위 내이거나 또는 그보다 낮을 수 있다.
본 발명은 ErbB-2 및 ErbB-3 수용체를 표적화하고, 예를 들어 NRG1-β1의 상향조절과 같은 탈출 기전의 존재하에서도, 시험관내 암 셀라인의 강력한 증식 억제 및 생체내 종양 성장 억제를 가져오는 항체를 개시한다. ErbB-2 또는 ErbB-3에 특이적인 사람 및 뮤린 Fab 결합 팔의 광범한 패널이 확인되었다. 이들은 중쇄의 헤테로다이머화를 도출하는 CH3 영역의 돌연변이를 함유하는 상보성 발현 벡터에 클로닝함으로써 이중특이적 항체로서 생성되었다. 500개를 넘는 이중특이적 항체가 소규모로 생성되었고, 상이한 암 셀라인에 대한 결합 및 기능 분석에서 시험되었다. 다양한 이중특이적 항체가 선택되었고, BxPC3 셀라인을 사용하여 동소이식 이종이식편편 모델에서 시험되었다. 이 셀라인은 ErbB-2 및 ErbB-3 수용체를 둘 다 발현하며, 성장을 위해 ErbB-3 리간드에 부분적으로 의존한다. BxPC3 모델은 견고하며 엄격한 스크리닝 모델이다. 또한, 강한 항-종양 생체내 활성이 JIMT-1 셀라인을 사용하여 이종이식편 모델을 사용하여 확인되었다. JIMT-1 세포는 트라스투주맙에 대해 임상적으로 내성인 유방암을 가진 62세 환자의 늑막 전이로부터 유래된다. JIMT-1 세포는 유착성 단층으로 성장하며 누드 마우스에서 이종이식편 종양을 형성한다. JIMT-1 세포는 증폭된 HER-2 암유전자를 가지며, 코딩 서열에서 확인할 수 없는 돌연변이를 나타내지 않았다. JIMT-1 세포는 HER-2 mRNA와 단백질을 과발현하고, HER-1, HER-3, 및 HER-4 mRNA 및 단백질의 수준은 트라스투주맙-감응성 셀라인 SKBR-3와 유사하다(Tanner et al, Mol Cancer Ther 2004).
중요하게도, 보다 나은 항-종양 효과가 현재 사용되는 모노클로날 항체 트라스투주맙 및 퍼투주맙, 뿐만 아니라 화학적 화합물 라파티닙과 비교하여 본 발명에 따른 항체를 사용해서 얻어졌다.
본 발명의 항체는 현탁액 293F 세포 중에서 일시적 형질도입 후 > 50 mg/L 수준으로 생성될 수 있다. 이중특이적 항체는 > 70%의 수율을 보이며 98%를 초과하는 순도로 정제될 수 있다. 분석 특성화 연구는 2가 단일특이적 IgG1과 비슷한 이중특이적 IgG1 항체를 나타낸다. 기능적 활성의 측면에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 시험관내 및 생체내에서 트라스투주맙 + 퍼투주맙과 비교하여 뛰어난 효능을 나타낼 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예는 조합 요법을 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 ErbB-2 억제제 또는 결합제를 포함하는, ErbB-2 표적화제와 조합된다.
ErbB-2, ErbB-3-결합 이중특이적 항체와의 조합 요법에 사용하기 위한 예시적인 ErbB-2 표적화제는 임의의 ErbB-2 표적화제, 예를 들어 ErbB-2의 결합제 또는 억제제를 포함한다. ErbB-2 표적화제는 소 분자 HER2 티로신 키나아제 억제제, 예컨대 라파티닙(Tyverb/Tykerb®), 네라티닙 아파티닙, 튜카티닙 또는 AZD8931일 수 있다.
ErbB-2 표적화제는 항체일 수 있다. 트라스투주맙 또는 퍼투주맙은, 예를 들어 상이한 ErbB-2 에피토프에 결합함으로써, 실시예에 나타낸 대로 본 발명에 따른 항체와 동일한 에피토프에 대해 경쟁하지 않으므로 바람직하다. ErbB-2 표적화제는 항체 약물 콘쥬게이트, 예를 들어 트라스투주맙 엠탄신 또는 DS-8201일 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 MM-121(#Ab6) 또는 RG7116(Roche)와 조합되며, 이들 항체는 상이한 ErbB-3 에피토프에 결합함으로써, 실시예에 나타낸 대로 본 발명에 따른 항체와 동일한 에피토프에 대해 경쟁하지 않는다.
다른 바람직한 구체예에서, ErbB-2 및 ErbB-3에 특이적인 결합 화합물이 PI3키나아제 경로 성분 억제제 및/또는 MAPK 경로 성분 억제제, 예컨대 티로신 키나아제 억제제, PI3Ka 억제제, Akt 억제제, mTOR 억제제 또는 Src 억제제와 조합된다. 한 구체예에서, ErbB-2 및 ErbB-3에 특이적인 결합 화합물이 미세소관 파괴 약물 또는 히스톤 디아세틸라아제(ADAC)의 억제제와 조합된다. 놀랍게도, 본 발명자들은 이들 조합이 사용될 때 상승작용 효과를 발견했다. 따라서, ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가지거나 상기 종양을 가질 위험이 있는 대상의 치료를 위한 방법이 더 제공되며, 이 방법은
- ErbB-2 및 ErbB-3에 특이적인 결합 화합물, 및
- PI3키나아제 경로 성분의 억제제, MAPK 경로 성분의 억제제, 미세소관 파괴 약물 및 히스톤 디아세틸라아제(HDAC)의 억제제로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물
을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 억제제는 바람직하게 티로신 키나아제 억제제, PI3Ka 억제제, Akt 억제제, mTOR 억제제 또는 Src 억제제를 포함한다.
상기 티로신 키나아제 억제제는 바람직하게 아파티닙, 라파티닙 및/또는 네라티닙이다. 상기 PI3Ka 억제제는 바람직하게 BYL719이다. 한 구체예에서, 상기 Akt 억제제는 MK-2206이다. 한 바람직한 구체예에서, 상기 mTOR 억제제는 에베롤리무스이다. 한 바람직한 구체예에서, 상기 Src 억제제는 사라카티닙이다. 한 바람직한 구체예에서, 상기 미세소관 파괴 약물은 파클리탁셀이다. 한 바람직한 구체예에서, 상기 HDAC 억제제는 보리노스타트이다. 한 바람직한 구체예에서, ErbB-2 및 ErbB-3에 특이적인 상기 결합 화합물은 MM-111(Merrimack Pharmaceuticals)이다. 한 바람직한 구체예에서, ErbB-2 및 ErbB-3에 특이적인 상기 결합 화합물은 이중특이적 항체이다. 한 바람직한 구체예에서, ErbB-2 및 ErbB-3에 특이적인 상기 결합 화합물은 본 발명에 따른 이중특이적 항체이다.
따라서, ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가지거나 상기 종양을 가질 위험이 있는 대상의 치료를 위한 방법이 더 제공되며, 이 방법은
- ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체, 및
- PI3키나아제 경로 성분의 억제제, MAPK 경로 성분의 억제제, 미세소관 파괴 약물 및 HDAC의 억제제로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물
을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
또한, ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양의 치료에서 사용하기 위한 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체가 제공되며, 상기 치료는 상기 이중특이적 항체 및 PI3키나아제 경로 성분의 억제제, MAPK 경로 성분의 억제제, 미세소관 파괴 약물 및 HDAC의 억제제로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게, ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3의 도메인 III에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 가진 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 PI3키나아제 경로 성분의 억제제, MAPK 경로 성분의 억제제, 미세소관 파괴 약물 및 HDAC의 억제제로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물과 조합된다. 상기 억제제는 바람직하게 티로신 키나아제 억제제, PI3Ka 억제제, Akt 억제제, mTOR 억제제 또는 Src 억제제를 포함한다. 상기 티로신 키나아제 억제제는 바람직하게 아파티닙, 라파티닙 및/또는 네라티닙이다. 상기 PI3Ka 억제제는 바람직하게 BYL719이다. 한 구체예에서, 상기 Akt 억제제는 MK-2206이다. 한 바람직한 구체예에서, 상기 mTOR 억제제는 에베롤리무스이다. 한 바람직한 구체예에서, 상기 Src 억제제는 사라카티닙이다. 한 바람직한 구체예에서, 상기 미세소관 파괴 약물은 파클리탁셀이다. 한 바람직한 구체예에서, 상기 HDAC 억제제는 보리노스타트이다.
상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양은 바람직하게 유방암, 위암, 결직장암, 결장암, 위식도암, 식도암, 자궁내막암, 난소암, 간암, 비-소세포 폐암을 포함하는 폐암, 투명세포 육종, 침샘암, 두경부암, 뇌암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암, 또는 흑색종이다. 가장 바람직하게, 상기 종양은 유방암이다. 한 구체예에서, 상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양은 종양 세포 당 1,000,000개 미만의 ErbB-2 세포-표면 수용체를 가진다.
한 구체예에서, PI3키나아제 경로 성분의 억제제, MAPK 경로 성분의 억제제, 미세소관 파괴 약물 및 HDAC 억제제로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물, 바람직하게 티로신 키나아제 억제제, PI3Ka 억제제, Akt 억제제, mTOR 억제제, Src 억제제, 보리노스타트 및 파클리탁셀로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물, 더 바람직하게 아파티닙, 라파티닙, 네라티닙, BYL719, MK-2206, 에베롤리무스, 사라카티닙, 보리노스타트 및 파클리탁셀로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물과 조합되는 본 발명에 따른 항체는 전형적으로 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포 상에서 ErbB-3의 리간드-유도 수용체 기능, 바람직하게 리간드-유도 성장을 감소시킬 수 있다. 본 발명에 따른 상기 항체는 바람직하게 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3의 도메인 III에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함한다. 한 바람직한 구체예에서, ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원-결합 부위의 친화성(KD)은 ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원-결합 부위의 친화성과 같거나 더 높다. ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원-결합 부위의 친화성은 2.0 nM 이하, 바람직하게 1.39 nM 이하, 더 바람직하게 0.99 nM 이하이다. ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원-결합 부위의 친화성은 5.0 nM 이하, 바람직하게 4.5 nM 이하, 더 바람직하게 4.0 nM 이하이다.
한 바람직한 구체예에서, PI3키나아제 경로 성분의 억제제, MAPK 경로 성분의 억제제, 미세소관 파괴 약물 및 HDAC 억제제로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물, 바람직하게 티로신 키나아제 억제제, PI3Ka 억제제, Akt 억제제, mTOR 억제제, Src 억제제, 보리노스타트 및 파클리탁셀로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물, 더 바람직하게 아파티닙, 라파티닙, 네라티닙, BYL719, MK-2206, 에베롤리무스, 사라카티닙, 보리노스타트 및 파클리탁셀로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물과 조합되는 본 발명에 따른 항체는 T144, T164, R166, P172, G179, S180 및 R181로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-2의 도메인 I의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원-결합 부위, 및 T144, T164, R166, P172, G179, S180 또는 R181로부터의 약 5개 아미노산 위치 내에 위치된 표면-노출된 아미노산 잔기를 포함한다.
한 바람직한 구체예에서, PI3키나아제 경로 성분의 억제제, MAPK 경로 성분의 억제제, 미세소관 파괴 약물 및 HDAC 억제제로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물, 바람직하게 티로신 키나아제 억제제, PI3Ka 억제제, Akt 억제제, mTOR 억제제, Src 억제제, 보리노스타트 및 파클리탁셀로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물, 더 바람직하게 아파티닙, 라파티닙, 네라티닙, BYL719, MK-2206, 에베롤리무스, 사라카티닙, 보리노스타트 및 파클리탁셀로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물과 조합되는 본 발명에 따른 항체는 R426로부터 선택된 ErbB-3의 도메인 III의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원-결합 부위 및 자생 ErbB-3 단백질에서 R426으로부터 11.2Å 내에 위치된 표면-노출된 아미노산 잔기를 포함한다.
바람직하게, 도 16A 또는 도 16E(16s-16z)에 나타낸 것과 같은 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 및 MF1898로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열, 바람직하게 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 및/또는 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 및 MF6074로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열, 바람직하게 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 PI3키나아제 경로 성분의 억제제, MAPK 경로 성분의 억제제, 미세소관 파괴 약물 및 HDAC 억제제로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물, 바람직하게 티로신 키나아제 억제제, PI3Ka 억제제, Akt 억제제, mTOR 억제제, Src 억제제, 보리노스타트 및 파클리탁셀로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물, 더 바람직하게 아파티닙, 라파티닙, 네라티닙, BYL719, MK-2206, 에베롤리무스, 사라카티닙, 보리노스타트 및 파클리탁셀로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물과 조합된다.
한 바람직한 구체예에서,
- 도 16A 또는 도 16E(16s-16z)에 나타낸 것과 같은 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 및 MF1898의 중쇄 가변 영역 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역 서열, 또는 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 또는 MF1898의 중쇄 가변 영역 서열과 최대 15개 아미노산, 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산에 차이가 있는 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역 서열, 및
- 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 및 MF6074의 중쇄 가변 영역 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역 서열, 또는 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 중쇄 가변 영역 서열과 최대 15개 아미노산, 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산에 차이가 있는 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역 서열
을 포함하는 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 PI3키나아제 경로 성분의 억제제, MAPK 경로 성분의 억제제, 미세소관 파괴 약물 및 HDAC 억제제로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물, 바람직하게 티로신 키나아제 억제제, PI3Ka 억제제, Akt 억제제, mTOR 억제제, Src 억제제, 보리노스타트 및 파클리탁셀로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물, 더 바람직하게 아파티닙, 라파티닙, 네라티닙, BYL719, MK-2206, 에베롤리무스, 사라카티닙, 보리노스타트 및 파클리탁셀로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물과 조합된다. 한 바람직한 구체예에서, 항체 PB4188은 PI3키나아제 경로 성분의 억제제, MAPK 경로 성분의 억제제, 미세소관 파괴 약물 및 HDAC 억제제로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물, 바람직하게 티로신 키나아제 억제제, PI3Ka 억제제, Akt 억제제, mTOR 억제제, Src 억제제, 보리노스타트 및 파클리탁셀로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물, 더 바람직하게 아파티닙, 라파티닙, 네라티닙, BYL719, MK-2206, 에베롤리무스, 사라카티닙, 보리노스타트 및 파클리탁셀로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물과 조합된다.
본 발명의 바람직한 구체예는 헤레굴린 스트레스 상태에서의 본 발명에 따른 항체의 용도를 제공한다. 헤레굴린은 ErbB-3 양성 종양 세포의 성장에 연루된 성장 인자이다. 전형적으로, 종양 세포가 높은 수준의 헤레굴린을 발현할 때(헤레굴린 스트레스라고 함), 트라스투주맙, 퍼투주맙 및 라파티닙과 같은 현재 알려진 치료법은 종양 성장을 더 이상 억제할 수 없다. 이 현상을 헤레굴린 내성이라고 한다. 그러나, 놀랍게도 본 발명에 따른 항체는 또한 높은 수준의 헤레굴린을 발현하는 종양 세포의 성장을 상쇄할 수 있다. 헤레굴린의 발현 수준은 세포가 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레굴린 발현 수준의 적어도 60%, 바람직하게 적어도 70%, 더 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90% 또는 95%인 헤레굴린 발현 수준을 가질 때 높다고 간주된다. 헤레굴린 발현 수준은, 예를 들어 종양 RNA에 의한 qPCR(예를 들어 Shames et al. PLOS ONE, February 2013, Vol.8, Issue 2, pp 1-10 및 Yonesaka et al., Sci. transl. Med., Vol.3, Issue 99 (2011); pp1-11에 제시)을 사용하여, 또는 ELISA와 같은 단백질 검출 방법을 사용하여, 바람직하게 혈액, 혈장 또는 혈청 샘플에서(예를 들어 Yonesaka et al., Sci. transl. Med., Vol.3, Issue 99 (2011); pp1-11에 제시) 측정된다. 따라서, ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가지거나 가질 위험이 있는 대상의 치료에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체가 더 제공되며, 상기 종양의 상기 세포는 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레굴린 발현 수준의 적어도 60%, 바람직하게 적어도 70%, 더 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90% 또는 95%인 헤레굴린 발현 수준을 가진다. 본 발명에 따른 상기 항체는 바람직하게 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원-결합 부위를 포함한다. 또한, ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진 환자의 치료를 위한 방법이 제공되며, 상기 종양의 세포는 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레굴린 발현 수준의 적어도 60%, 바람직하게 적어도 70%, 더 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90% 또는 95%인 헤레굴린 발현 수준을 가지며, 이 방법은 본 발명에 따른 항체 또는 제약학적 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 바람직한 구체예는 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 제공하며, 상기 종양의 세포는 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레굴린 발현 수준의 적어도 60%, 바람직하게 적어도 70%, 더 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90% 또는 95%인 헤레굴린 발현 수준을 가진다. 상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양은 바람직하게 유방암, 위암, 결직장암, 결장암, 위식도암, 식도암, 자궁내막암, 난소암, 간암, 비-소세포 폐암을 포함하는 폐암, 투명세포 육종, 침샘암, 두경부암, 뇌암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암, 또는 흑색종이다. 가장 바람직하게, 상기 종양은 유방암이다. 따라서, 유방암, 위암, 결직장암, 결장암, 위식도암, 식도암, 자궁내막암, 난소암, 간암, 비-소세포 폐암을 포함하는 폐암, 투명세포 육종, 침샘암, 두경부암, 뇌암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암, 또는 흑색종, 바람직하게 유방암을 가지거나 가질 위험이 있는 대상의 치료에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체가 제공되며, 상기 암의 세포는 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레굴린 발현 수준의 적어도 60%, 바람직하게 적어도 70%, 더 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90% 또는 95%인 헤레굴린 발현 수준을 가진다. 본 발명에 따른 상기 항체는 바람직하게 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원-결합 부위를 포함한다.
높은 헤레굴린 수준은 전형적으로 전이(즉, 종양 세포 또는 종양 개시 세포의 이주, 침범, 성장 및/또는 분화) 형성 동안 나타난다. 전형적으로, 종양 개시 세포는, 예를 들어 CD44, CD24, CD133 및/또는 ALDH1과 같은 줄기 세포 마커에 기초하여 확인된다. 따라서, 이들 과정은 트라스투주맙 및 퍼투주맙과 같은 현재 알려진 치료법으로 거의 상쇄될 수 없다. 본 발명에 따른 항체는 높은 수준의 헤레굴린을 발현하는 종양 세포 또는 종양 개시 세포의 성장 및/또는 분화를 상쇄할 수 있으므로, 본 발명에 따른 이러한 항체는 또한 특히 전이 형성을 상쇄하는데 적합한다. 따라서, ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진 대상에서 전이 형성을 상쇄하는 방법이 더 제공되며, 상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양 세포는 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레굴린 발현 수준의 적어도 60%, 바람직하게 적어도 70%, 더 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90% 또는 95%인 헤레굴린 발현 수준을 가지고, 이 방법은 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 전이 형성의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체가 제공되며, 상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양 세포는 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레굴린 발현 수준의 적어도 60%, 바람직하게 적어도 70%, 더 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90% 또는 95%인 헤레굴린 발현 수준을 가진다. 또한, 전이 형성의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 용도가 제공되며, 상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양 세포는 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레굴린 발현 수준의 적어도 60%, 바람직하게 적어도 70%, 더 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90% 또는 95%인 헤레굴린 발현 수준을 가진다. 상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양은 바람직하게 유방암, 위암, 결직장암, 결장암, 위식도암, 식도암, 자궁내막암, 난소암, 간암, 비-소세포 폐암을 포함하는 폐암, 투명세포 육종, 침샘암, 두경부암, 뇌암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암, 또는 흑색종이다. 가장 바람직하게, 상기 종양은 유방암이다. 따라서, 유방암, 위암, 결직장암, 결장암, 위식도암, 식도암, 자궁내막암, 난소암, 간암, 비-소세포 폐암을 포함하는 폐암, 투명세포 육종, 침샘암, 두경부암, 뇌암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암, 또는 흑색종 세포, 바람직하게 유방암 세포의 전이 형성의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 더 제공되며, 상기 세포는 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레굴린 발현 수준의 적어도 60%, 바람직하게 적어도 70%, 더 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90% 또는 95%인 헤레굴린 발현 수준을 가진다. 본 발명에 따른 상기 항체는 전형적으로 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포 상에서 ErbB-3의 리간드-유도 수용체 기능, 바람직하게 리간드-유도 성장을 감소시킬 수 있다. 본 발명에 따른 상기 항체는 바람직하게 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3의 도메인 III에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함한다. 한 바람직한 구체예에서, ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원-결합 부위의 친화성(KD)는 ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원-결합 부위의 친화성과 같거나 더 높다. ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원-결합 부위의 친화성은 바람직하게 2.0 nM 이하, 더 바람직하게 1.39 nM 이하, 더욱 바람직하게 0.99 nM 이하이다. ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원-결합 부위의 친화성은 바람직하게 5.0 nM 이하, 더 바람직하게 4.5 nM이하, 더욱 바람직하게 4.0 nM 이하이다.
한 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 상기 항체는 T144, T164, R166, P172, G179, S180 및 R181로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-2의 도메인 I의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원-결합 부위, 및 T144, T164, R166, P172, G179, S180 또는 R181로부터의 약 5개 아미노산 위치 내에 위치된 표면-노출된 아미노산 잔기를 포함한다.
한 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 상기 항체는 바람직하게 R426로부터 선택된 ErbB-3의 도메인 III의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원-결합 부위 및 자생 ErbB-3 단백질에서 R426으로부터 11.2Å 내에 위치된 표면-노출된 아미노산 잔기를 포함한다.
한 바람직한 구체예는 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진 대상의 치료를 위한 본 발명에 따른 방법을 제공하며, 상기 종양의 세포는 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레굴린 발현 수준의 적어도 60%, 바람직하게 적어도 70%, 더 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90% 또는 95%인 헤레굴린 발현 수준을 가지거나, 또는 이러한 치료에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체를 제공하며, 상기 항체는 도 16A 또는 도 16E(16s-16z)에 나타낸 대로 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 및 MF1898로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열, 바람직하게 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 또는 적어도 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 바람직한 구체예는 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진 대상의 치료를 위한 본 발명에 따른 방법을 제공하며, 상기 종양의 세포는 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레굴린 발현 수준의 적어도 60%, 바람직하게 적어도 70%, 더 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90% 또는 95%인 헤레굴린 발현 수준을 가지거나, 또는 이러한 치료에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체를 제공하며, 상기 항체는 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 대로 MF3178;MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 및 MF6074로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열, 바람직하게 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 또는 적어도 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 한 구체예는 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진 대상의 치료에서 사용하기 위한 항체 PB4188을 제공하며, 상기 종양의 세포는 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레굴린 발현 수준의 적어도 60%, 바람직하게 적어도 70%, 더 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90% 또는 95%인 헤레굴린 발현 수준을 가진다.
이미 설명된 대로, 본 발명에 따른 항체는 세포 표면에 1,000,000개 미만의 ErbB-2 수용체를 가진 ErbB-2 양성 종양 세포를 치료하는데 특히 적합하다. 전형적으로 ErbB-2 [++] 또는 ErbB-2 [+]로 분류되는 이러한 종양을 가진 환자는 원발성 종양뿐만 아니라 재발된 ErbB-2 양성 종양을 가진 환자를 포함한다. 트라스투주맙(허셉틴) 및 퍼투주맙과 같은 현재 사용되는 치료법은 ErbB-2 [+++]로 분류되는 세포 표면에 1,000,000개를 넘는 ErbB-2 수용체를 가진 악성 ErbB-2 양성 세포를 가진 환자에만 처방된다. 따라서, ErbB-2 [++] 또는 ErbB-2 [+]로 분류되는 환자가 바람직하게 본 발명에 따른 항체로 치료된다. 그러므로, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 방법 또는 항체가 제공되며, 상기 대상은 종양 세포 당 1,000,000개 미만의 ErbB-2 세포-표면 수용체를 가진 ErbB-2 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진다. 한 바람직한 구체예는 전이 형성의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 제공하며, 상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양 세포는 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레굴린 발현 수준의 적어도 60%, 바람직하게 적어도 70%, 더 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90% 또는 95%인 헤레굴린 발현 수준을 가지며, 상기 종양 세포는 1,000,000개 미만의 ErbB-2 세포-표면 수용체를 가진다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 손상된 심장 기능을 가지거나 그러한 위험이 있는 대상에서 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 상쇄하기 위해 사용된다. 손상된 심장 기능이란 대상이, 예를 들어 건강한 심장 기능과 비교하여 90% 미만, 바람직하게 85% 미만 또는 80% 미만, 더 바람직하게 75% 미만 또는 70% 미만인 좌심실 구축율(LVEF)과 같은 심장 기능을 가진다는 것을 의미한다. 상기 건강한 심장 기능은, 예를 들어 건강한 집단의 평균 심장 기능(예컨대 평균 LVEF)이다. 또는, 상기 건강한 심장 기능은 본 발명에 따른 항체를 가지고 항-종양 요법을 시작하기 전에 환자에서 측정된 기능(예컨대 LVEF)이다.
심장 기능은, 예를 들어 대상의 신체검사에 의해 또는 LVEF의 검사에 의해 모니터링되며, 예를 들어 심전도나 MUGA 스캔을 사용한다.
ErbB-2는 헤레굴린 수용체 복합체 HER2:HER4를 수반하는 신호화 네트워크의 일부로서 성인 심근세포의 성장, 수선 및 생존에 연루된다. 앞서 설명된 대로, 심장독성은 ErbB-2 표적화 요법에서 알려진 위험 요인이며, 트라스투주맙이 심장 스트레스를 유발하는 안트라사이클린 요법과 함께 사용되었을 때는 합병증의 빈도가 증가된다. 예를 들어, 독시사이클린과 트라스투주맙의 조합은 심한 심장 부작용을 유발한다. 트라스투주맙-유도 심장 기능부전의 임상 사례가 증가하고 있음에도 불구하고, 그것의 작용 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았다. ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양에 대한 현재 알려진 치료법의 심장독성의 측면에서, 본 발명에 따른 항체를 사용하는 것이 특히 유익하다. 실시예에 나타낸 대로, 트라스투주맙 및 퍼투주맙과 비교하여 심근세포의 생존에 유의하게 더 적은 정도로 영향을 미치거나 영향을 미치지 않는 항체가 제공된다. 이 항체는 감소된 심장독성으로 인한 중요한 이점을 제공한다. 이 항체는 이미 손상된 심장 기능으로 고통받고 있지 않는 사람, 및 심지어 더욱이 손상된 심장 기능으로 고통받고 있는 사람, 예컨대 울혈성 심부전(CHF), 좌심실 기능부전(LVD) 및/또는 감소된 좌심실 구축율(LVEF)로 고통받고 있는 대상, 및/또는 심근경색을 앓았던 적이 있는 대상에게도 유익하다. 따라서, ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가지거나 가질 위험이 있는 대상의 치료에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 제공되며, 상기 대상은 건강한 심장 기능과 비교하여 90% 미만, 바람직하게 85% 미만, 더 바람직하게 80% 미만, 더욱 더 바람직하게 75% 미만 또는 70% 미만인 심장 기능을 가진다. 상기 심장 기능은 바람직하게 LVEF를 포함한다.
상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양은 바람직하게 유방암, 위암, 결직장암, 결장암, 위식도암, 식도암, 자궁내막암, 난소암, 간암, 비-소세포 폐암을 포함하는 폐암, 투명세포 육종, 침샘암, 두경부암, 뇌암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암, 또는 흑색종이다. 가장 바람직하게, 상기 종양은 유방암이다. 본 발명에 따른 상기 항체는 바람직하게 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3의 도메인 III에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함한다. 한 바람직한 구체예는 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진 대상의 치료를 위한 본 발명에 따른 방법을 제공하며, 상기 대상은 건강한 심장 기능과 비교하여 90% 미만, 바람직하게 85% 미만, 더 바람직하게 80% 미만, 더욱 바람직하게 75% 미만 또는 70% 미만인 심장 기능을 가지거나, 또는 이러한 치료에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체를 제공하며, 상기 항체는:
- 도 16A 또는 도 16E(16s-16z)에 나타낸 것과 같은 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 및 MF1898로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열, 바람직하게 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 또는 적어도 중쇄 가변 영역 서열, 또는 인용된 중쇄 가변 영역 서열과 최대 15개 아미노산, 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산에 차이가 있는 중쇄 가변 영역 서열; 및/또는
- 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 것과 같은 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 및 MF6074로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열, 바람직하게 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 또는 적어도 중쇄 가변 영역 서열, 또는 인용된 중쇄 가변 영역 서열과 최대 15개 아미노산, 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산에 차이가 있는 중쇄 가변 영역 서열
을 포함한다.
한 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 PB4188이다.
한 구체예에서, 상기 이중특이적 항체는 본 명세서에서 상세히 설명된 바와 같이, 헤레굴린 스트레스 상태에 있는 대상의 치료에서 사용된다. 따라서, ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가지거나 가질 위험이 있는 대상의 치료에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 더 제공되며, 상기 대상은 건강한 심장 기능과 비교하여 90% 미만, 바람직하게 85% 미만, 더 바람직하게 80% 미만, 더욱 바람직하게 75% 미만 또는 70% 미만인 심장 기능을 가지고, 상기 종양의 세포는 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레굴린 발현 수준의 적어도 60%, 바람직하게 적어도 70%, 더 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90% 또는 95%인 헤레굴린 발현 수준을 가진다. 상기 심장 기능은 바람직하게 LVEF를 포함한다. 또한, ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진 대상의 치료를 위한 방법이 제공되며, 상기 대상은 건강한 심장 기능과 비교하여 90% 미만, 바람직하게 85% 미만, 더 바람직하게 80% 미만, 더욱 바람직하게 75% 미만, 더욱 더 바람직하게 70% 미만인 심장 기능을 가지고, 상기 종양의 세포는 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레굴린 발현 수준의 적어도 60%, 바람직하게 적어도 70%, 더 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90% 또는 95%인 헤레굴린 발현 수준을 가지며, 이 방법은 본 발명에 따른 이중특이적 항체 또는 제약학적 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
한 바람직한 구체예는 건강한 심장 기능, 바람직하게 건강한 LVEF와 비교하여 90% 미만, 바람직하게 85% 미만, 더 바람직하게 80% 미만, 더욱 바람직하게 75% 미만 또는 70% 미만인 심장 기능, 바람직하게 LVEF를 가진 대상에서 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 용도를 제공하며, 상기 종양의 세포는 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레굴린 발현 수준의 적어도 60%, 바람직하게 적어도 70%, 더 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90% 또는 95%인 헤레굴린 발현 수준을 가진다.
또한, 전이 형성의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체가 제공되며, 상기 대상은 건강한 심장 기능과 비교하여 90% 미만, 바람직하게 85% 미만, 더 바람직하게 80% 미만, 더욱 바람직하게 75% 미만, 더욱 더 바람직하게 70% 미만인 심장 기능을 가진다. 전이 형성의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 용도가 더 제공되며, 상기 대상은 건강한 심장 기능과 비교하여 90% 미만, 바람직하게 85% 미만, 더 바람직하게 80% 미만, 더욱 바람직하게 75% 미만, 더욱 더 바람직하게 70% 미만인 심장 기능을 가진다. 상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양은 바람직하게 유방암, 위암, 결직장암, 결장암, 위식도암, 식도암, 자궁내막암, 난소암, 간암, 비-소세포 폐암을 포함하는 폐암, 투명세포 육종, 침샘암, 두경부암, 뇌암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암, 또는 흑색종이다. 가장 바람직하게, 상기 종양은 유방암이다. 상기 심장 기능은 바람직하게 LVEF를 포함한다. 한 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 PB4188이다.
다른 구체예에서, 친생존 경로 Akt(PI3 키나아제 경로라고도 함) 및 MAP 키나아제 경로의 다양한 인자들의 인산화를 상쇄하기 위한 본 발명에 따른 항체의 용도가 제공된다. 이들은 HER3의 하류 전-증식 신호화 경로이다. 놀랍게도, 본 발명에 따른 항체는 Akt, ERK1/2 및 S6 리보솜 단백질(S6-RP)의 인산화를 유의하게 억제하지만, 트라스투주맙 및 퍼투주맙은 이러한 강한 항-인산화 효과를 갖지 않는다. 전-증식 PI3 키나아제 및 MAP 키나아제 경로의 인자들의 인산화의 상쇄는 유익한데, 이는 ErbB-3 양성 종양 세포의 성장을 상쇄하기 때문이다. 따라서, Akt, ERK1/2 및/또는 S6-RP의 인산화를 상쇄, 바람직하게 억제하기 위한 본 발명에 따른 항체의 용도가 제공된다. 중요하게도, Akt의 인산화는 실시예에 나타낸 대로 시험관내 및 생체내에서 모두 본 발명의 항체를 가지고 유의하게 감소되거나 또는 심지어 완전히 차단될 수 있다. 따라서, 바람직한 구체예는 Akt의 인산화를 상쇄, 바람직하게 억제하기 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 제공한다. 또한, HER3-p85 복합체의 형성을 상쇄하기 위한 본 발명에 따른 항체의 용도가 제공된다. HER3-p85 복합체의 형성은 Akt 활성화에서 제1 단계이므로, 상기 HER3-p85 복합체의 형성을 상쇄하는 것은 유익하다. 본 발명에 따른 상기 항체는 바람직하게 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3의 도메인 III에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이다. 상기 항체는 바람직하게 T144, T164, R166, P172, G179, S180 및 R181로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-2의 도메인 I의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원-결합 부위, 및 T144, T164, R166, P172, G179, S180 또는 R181로부터의 약 5개 아미노산 위치 내에 위치된 표면-노출된 아미노산 잔기를 포함한다. 추가로, 상기 항체는 바람직하게 F409 및 R426으로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-3의 도메인 III의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원-결합 부위 및 자생 ErbB-3 단백질에서 R426으로부터 11.2Å 내에 위치된 표면-노출된 아미노산 잔기를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 도 16 또는 도 37에 나타낸 것과 같은, 적어도 하나의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 또는 적어도 하나의 VH 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 PB4188이다.
또한, 본 발명은 ErbB-2 양성 종양을 가지거나 ErbB-2 양성 종양이 발생할 위험이 있는 개체의 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 ErbB-2 억제제 또는 결합제를 포함하는 ErbB-2 표적화제, 예컨대 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 2가 단일특이적 항체, 및 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위 및 ErbB-3의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
ErbB-2 억제제가 단일특이적 항체인 경우, 단일특이적 항체와 이중특이적 항체는 바람직하게 ErbB-2 상의 상이한 에피토프에 결합한다. 상이한 ErbB-2 에피토프는 바람직하게 상이한 세포외 ErbB-2 도메인 상에 있다. 단일특이적 항체는 바람직하게 ErbB-2 세포외 도메인 IV, 도메인 II 또는 도메인 III 상의 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 바람직하게 ErbB-2 세포외 도메인 I 상의 에피토프에 결합할 수 있다.
ErbB-2 표적화제는 약물 콘쥬게이트를 포함할 수 있으며, 특히 ErbB-2 억제제가 단일특이적 항체인 경우, 단일특이적 항체는 바람직하게 약물 콘쥬게이트, 예를 들어 아도-트라스투주맙 엠탄신(Kadcyla®)을 포함한다.
또한, 약물 콘쥬게이트가 이중특이적 항체에 또는 이중특이적 항체와 ErbB-2의 표적화제 양쪽에 있을 수 있다. 약물 콘쥬게이트는 바람직하게 엠탄신을 포함한다. 항체-약물 콘쥬게이트 또는 ADC는 암을 가진 사람의 치료를 위한 표적화 요법으로 설계된 고 효능 생물약제학적 약물의 중요한 부류이다. 화학요법과 달리, ADC는 암세포만을 표적화하여 죽이고 건강한 세포는 남기도록 의도된다. 약물 콘쥬게이트는 생물학적으로 활성인 세포독성(항암) 페이로드 또는 약물에 결합된 항체이다. 모노클로날 항체의 독자적인 능력과 세포독성 약물의 암-사멸 능력을 조합함으로써, 항체-약물 콘쥬게이트는 건강한 조직과 병에 걸린 조직을 민감하게 구별한다. 이것은, 종래의 화학치료제와 달리, 항체-약물 콘쥬게이트가 암세포를 표적화해서 공격함으로써, 건강한 세포는 덜 악영향을 받게 된다는 것을 의미한다. 항체 약물 콘쥬게이트는 문헌(DiJoseph et al; Blood. 2004 103(5):1807-14. Mullard A. Nature Reviews Drug Discovery 12, 329-332 (2013); Zolot RS et al; Nature Reviews Drug Discovery 12, 259-260(2013); Merten et al; Bioconjug Chem 2015; 26:2176-2185; Schlom et al; Cancer Res. 1992; 52(5):1067-72; Rohrer T. Journal of Antibody-Drug Conjugates. June 21, 2013)에 제시된다. ADC에 포함되는 약물은 아우리스타틴(튜불린 중합효소 억제제); 메이탄신(튜불린 탈중합화제); 칼리케아미신(DNA 절단제); 듀오카리마이신(DNA 마이너 그루브 알킬화제); PBD 다이머(DNA 마이너 그루브 가교제); 및 α-아마니틴(RNA 중합효소 II 억제제)이다. 바람직한 구체예에서, 상기 약물은 엠탄신이다.
ErbB-2 억제제가 단일특이적 항체인 경우, 단일특이적 항체는 바람직하게 트라스투주맙(CAS 번호 180288-69-1)이다. 이 항체는 퍼투주맙(CAS 번호 380610-27-5)으로 대체되거나 조합될 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 단일특이적 항체는 트라스투주맙-엠탄신(T-DM1, 상표명 Kadcyla®로 시판)이다.
이중특이적 항체는 바람직하게 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하고, 상기 제1 항원-결합 부위는 MF3958의 적어도 CDR3 서열 또는 MF3958의 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게 최대 2개, 바람직하게 최대 1개 아미노산에 차이가 있는 CDR3 서열을 포함하며, 상기 제2 항원-결합 부위는 MF3178의 적어도 CDR3 서열 또는 MF3178의 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게 최대 2개, 바람직하게 최대 1개 아미노산에 차이가 있는 CDR3 서열을 포함한다. 이중특이적 항체는 바람직하게 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하고, 상기 제1 항원-결합 부위는 MF3958의 적어도 CDR3 서열을 포함하며, 상기 제2 항원-결합 부위는 MF3178의 적어도 CDR3 서열을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 이중특이적 항체는 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하고, 상기 제1 항원-결합 부위는 MF3958의 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 또는 MF3958의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게 최대 2개, 바람직하게 최대 1개 아미노산에 차이가 있는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 상기 제2 항원-결합 부위는 MF3178의 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 또는 MF3178의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게 최대 2개, 바람직하게 최대 1개 아미노산에 차이가 있는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 이중특이적 항체는 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하고, 상기 제1 항원-결합 부위는 MF3958의 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 상기 제2 항원-결합 부위는 MF3178의 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 이중특이적 항체는 ErbB-2에 결합하는 가변 도메인 및 ErbB-3에 결합하는 가변 도메인을 포함하며,
ErbB-2에 결합하는 가변 도메인의 VH 사슬은
- 도 16A(16a-16k)에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF3958의 아미노산 서열; 또는
- 상기 VH에 대하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16A(16a-16k)에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF3958의 아미노산 서열
을 포함하고;
ErbB-3에 결합하는 가변 도메인의 VH 사슬은
- 도 16B(16l-16p)에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF3178의 아미노산 서열; 또는
- 상기 VH에 대하여 최대 15개, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16B(16l-16p)에 나타낸 것과 같은 VH 사슬 MF3178의 아미노산 서열
을 포함한다.
상기 이중특이적 항체는 바람직하게 항체 PB4188이다. 상기 치료는 화학요법 약물과 조합될 수 있다. 따라서, 상기 치료는 바람직하게 화학요법 약물을 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 많은 상이한 화학요법 약물이 암의 치료를 위해 개발되었다. 일부 약물은 특정 종양에 대해 다른 약물보다 우수한 활성을 보인다.
화학요법 약물은, 예를 들어 비노렐빈, 파클리탁셀, 도세탁셀, 겜시타빈, 에리불린, 카페시타빈 또는 카보플라틴일 수 있다.
본 발명은 ErbB-2 양성 종양을 가지거나 ErbB-2 양성 종양이 발생할 위험이 있는 개체의 치료 방법에서 사용하기 위한, ErbB-2 억제제 또는 결합제를 포함하는 ErbB-2 표적화제, 예컨대 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 2가 단일특이적 항체; 및 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위 및 ErbB-3의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체의 조합을 더 제공한다.
ErbB-2 억제제 또는 결합제를 포함하는 ErbB-2 표적화제, 예컨대 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 2가 단일특이적 항체 및 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위 및 ErbB-3의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 포함하는 제약학적 조성물이 더 제공된다.
또한, ErbB-2 억제제 또는 결합제를 포함하는 ErbB-2 표적화제, 예컨대 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 2가 단일특이적 항체 및 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위 및 ErbB-3의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명은 뇌에 ErbB-2 양성 및 ErbB-3 양성 종양을 가지거나 뇌에서 ErbB-2 양성 및 ErbB-3 양성 종양이 발생할 위험이 있는 개체의 치료 방법을 더 제공하며, 이 방법은 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위 및 ErbB-3의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 포함하는 항체를 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 종양은 바람직하게 유방 종양의 전이이다. 바람직하게, 상기 항체는 ErbB-2 세포외 도메인 I 상의 에피토프에 결합할 수 있다. 바람직하게, 상기 항체는 ErbB-3 세포외 도메인 III 상의 에피토프에 결합할 수 있다. 상기 방법은 바람직하게 ErbB-2 억제제 또는 결합제를 포함하는 ErbB-2 표적화제, 예컨대 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 가진 단일특이적 2가 항체의 투여를 더 포함한다. 바람직하게, 상기 방법은 ErbB-2 억제제 또는 결합제를 포함하는 ErbB-2 표적화제, 예컨대 ErbB-3의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 가진 단일특이적 2가 항체의 투여를 더 포함한다. ErbB-2 억제제, 예컨대 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프 또는 ErbB-3의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 가진 단일특이적 2가 항체는 약물 콘쥬게이트를 포함할 수 있다. 상기 약물은 바람직하게 엠탄신을 포함한다. ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 가진 단일특이적 2가 항체는 바람직하게 트라스투주맙, 퍼투주맙 또는 동일한 가변 도메인 아미노산 서열을 가진 바이오시밀러이다. ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위 및 ErbB-3의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 포함하는 항체는 바람직하게 이중특이적 항체이다. 상기 이중특이적 항체는 바람직하게 항체 PB4188이다. 뇌에 ErbB-2 양성 및 ErbB-3 양성 종양을 가지거나 뇌에서 ErbB-2 양성 및 ErbB-3 양성 종양이 발생할 위험이 있는 개체의 치료에서 사용하기 위한 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위 및 ErbB-3의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 포함하는 항체가 더 제공된다.
개체가 종양을 가졌던 적이 있고 그 종양이 개체에 제공된 치료에 잘 반응했다면 그 개체는 본 명세서에 나타낸 대로 종양이 발생할 위험이 있다. 특히, 개체가 완전 관해 상태에 진입했을 때는 개체에서 종양 세포의 수가 규칙적인 MRI 또는 CT 스캔 영상과 같은 종래의 기술로 측정불가능하다. 이러한 개체는 불행하게도 원래 종양 부위(재발성 종양)나 먼 부위의 종양(전이성 종양)이 발생할 위험이 휠씬 더 높거나 또는 새로운 기원의 종양(예를 들어 치료 유도된)이 발생한다. 따라서, 위험이 있는 개체는 종양을 가졌던 적이 있고 그것의 완전 관해 상태에 있는 개체이다.
ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체가 제공되며, 상기 항체는 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포 상에서 ErbB-3의 리간드-유도 수용체 기능을 감소시킬 수 있다. 상기 항체는 바람직하게 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포의 리간드-유도 성장을 감소시킬 수 있다. 상기 항체는 바람직하게 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포의 리간드-유도 성장을 감소시킬 수 있으며, 상기 세포는 세포 당 적어도 100,000개의 ErbB-2 세포-표면 수용체를 가진다. 바람직하게, 상기 세포는 MCF-7 세포, SKBR-3 세포, NCI-N87 세포, BxPC-3 세포, BT-474 세포 또는 JIMT-1 세포이다. 상기 제1 항원-결합 부위는 바람직하게 ErbB-2의 도메인 I 또는 도메인 IV에 결합할 수 있다. 상기 제2 항원-결합 부위는 바람직하게 ErbB-3 리간드와 ErbB-3의 결합을 방해한다. 또한, ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체가 제공되며, 상기 제1 항원-결합 부위는 ErbB-2의 도메인 I에 결합하고, 상기 제2 항원-결합 부위는 ErbB-3의 도메인 III에 결합한다. 또한, ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체가 제공되며, ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원-결합 부위의 친화성(KD)은 ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원-결합 부위의 친화성과 같거나 더 높다. 상기 항체는 바람직하게 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포 상에서 ErbB-3의 리간드-유도 수용체 기능을 감소시킬 수 있다. 상기 항체는 바람직하게 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포의 리간드-유도 성장을 감소시킬 수 있다. ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원-결합 부위의 친화성(KD)은 2.0 nM 이하, 바람직하게 1.39 nM 이하, 더 바람직하게 0.99 nM 이하이다. ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원-결합 부위의 친화성(KD)은 5.0 nM 이하, 바람직하게 4.5 nM 이하, 더 바람직하게 4.0 nM 이하이다. BT 474 세포에 대한 상기 이중특이적 항체의 친화성(KD)은 5.0 nM 이하, 바람직하게 4.0 nM 이하, 더 바람직하게 3.2 nM 이하이고 및/또는 SK-BR-3 세포에 대한 상기 이중특이적 항체의 친화성(KD)은 5.0 nM 이하, 바람직하게 3.0 nM 이하, 더 바람직하게 2.0 nM 이하이다. 또한, ErbB-2에 결합하는 2개의 항원-결합 부위를 포함하는 항체가 제공되며, 상기 항원-결합 부위 중 적어도 하나는 ErbB-2의 도메인 I에 결합한다. ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 항원-결합 부위 중 적어도 하나의 친화성(KD)은 5.0 nM 이하, 바람직하게 4.0 nM 이하, 더 바람직하게 4.0 nM 이하이다. 또한, ErbB-3에 결합하는 2개의 항원-결합 부위를 포함하는 항체가 제공되며, 상기 항원-결합 부위 중 적어도 하나는 ErbB-3의 도메인 III에 결합한다. ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 항원-결합 부위 중 적어도 하나의 친화성(KD)은 2.0 nM 이하, 바람직하게 1.39 nM 이하, 더 바람직하게 0.99 nM 이하이다. 상기 ErbB-3 양성 세포 및/또는 상기 ErbB-2 양성 세포는 바람직하게 BT 474 세포 또는 SK BR 3 세포이다. 상기 항체는 바람직하게 T144, T164, R166, P172, G179, S180 및 R181로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-2의 도메인 I의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원-결합 부위, 및 T144, T164, R166, P172, G179, S180 또는 R181로부터의 약 5개 아미노산 위치 내에 위치된 표면-노출된 아미노산 잔기를 포함한다. 상기 항체는 바람직하게 R426로부터 선택된 ErbB-3의 도메인 III의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원-결합 부위 및 자생 ErbB-3 단백질에서 R426으로부터 11.2Å 내에 위치된 표면-노출된 아미노산 잔기를 포함한다. 상기 항체는 바람직하게 도 16A 또는 도 16E(16s-16z)에 나타낸 대로 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 및 MF1898로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열을 포함한다. 상기 항체는 바람직하게 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 대로 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 및 MF6074로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열을 포함한다. 상기 항체는 바람직하게 도 16A 또는 도 16E(16s-16z)에 나타낸 대로 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 및 MF1898로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 또는 상기 항체는 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 또는 MF1898의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과 최대 3개 아미노산, 바람직하게 최대 2개 아미노산, 바람직하게 최대 1개 아미노산에 차이가 있는 CDR 서열을 포함한다. 상기 항체는 바람직하게 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 대로 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 및 MF6074로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 또는 상기 항체는 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과 최대 3개 아미노산, 바람직하게 최대 2개 아미노산, 바람직하게 최대 1개 아미노산에 차이가 있는 CDR 서열을 포함한다. 상기 항체는 바람직하게 도 16A 또는 도 16E(16s-16z)에 나타낸 대로 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 및 MF1898의 중쇄 가변 영역 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역을 포함하며, 또한 상기 항체는 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 또는 MF1898의 중쇄 가변 영역 서열과 최대 15개 아미노산에 차이가 있는 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 상기 항체는 바람직하게 도 16B(16l-16p), 도 16E(16s-16z) 또는 도 37에 나타낸 대로 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 및 MF6074의 중쇄 가변 영역 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역 서열을 포함하거나, 또는 상기 항체는 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 중쇄 가변 영역 서열과 최대 15개 아미노산에 차이가 있는 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 상기 항체는 바람직하게 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)을 나타낸다. 상기 항체는 바람직하게 ADCC를 증진시키기 위해 에이푸코실화된다. 상기 항체는 바람직하게 사람 항체 또는 사람화된 항체이다. 상기 항체는 바람직하게 양립성 헤테로다이머화 도메인을 가진 두 상이한 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 상기 양립성 헤테로다이머화 도메인은 바람직하게 양립성 면역글로불린 중쇄 CH3 헤테로다이머화 도메인이다. 바람직하게, 양쪽 팔은 공통 경쇄를 포함한다. 상기 공통 경쇄는 점라인 경쇄이며, 바람직하게는 IgVKl-39 유전자 세그먼트를 포함하는 재배열된 점라인 사람 카파 경쇄이고, 가장 바람직하게는 재배열된 점라인 사람 카파 경쇄 IgVKl-39*01/IGJKl*01이다. 상기 항체는 표지, 바람직하게 생체내 영상화를 위한 표지를 더 포함한다. 또한, 본 명세서에 제시된 이중특이적 항체를 포함하는 제약학적 조성물이 제공된다. 또한, 본 발명에 따른 항체 또는 제약학적 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가지거나 상기 종양을 가질 위험이 있는 대상의 치료 방법이 제공된다. 더 나아가, ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가지거나 가질 위험이 있는 대상의 치료에서의 사용을 위한 본 발명의 항체가 제공된다. 상기 이중특이적 항체는 바람직하게 심근세포의 생존에는 유의하게 영향을 미치지 않는다. 상기 이중특이적 항체는 건강한 심장 기능과 비교하여 90% 미만의 심장 기능을 가진 대상을 위해 사용된다. 또한, ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가지거나 상기 종양을 가질 위험이 있는 대상의 치료 방법이 제공되며, 이 방법은 대상에게 아래의 약물을 투여하는 단계를 포함한다:
- ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체, 및
- PI3키나아제 경로 성분의 억제제, MAPK 경로 성분의 억제제, 미세소관 파괴제 및 HDAC 억제제로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물, 바람직하게 티로신 키나아제 억제제, PI3Ka 억제제, Akt 억제제, mTOR 억제제, Src 억제제, 보리노스타트 및 파클리탁셀로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물.
또한, ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양의 치료에서 사용하기 위한 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체가 제공되며, 상기 치료는 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진 대상에게 상기 이중특이적 항체 및 PI3키나아제 경로 성분의 억제제, MAPK 경로 성분의 억제제, 미세소관 파괴제 및 HDAC 억제제로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 투여하는 단계, 바람직하게는 상기 이중특이적 항체 및 티로신 키나아제 억제제, PI3Ka 억제제, Akt 억제제, mTOR 억제제, Src 억제제, 보리노스타트 및 파클리탁셀로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 투여하는 단계를 포함한다.
상기 티로신 키나아제 억제제는 바람직하게 아파티닙, 라파티닙 및/또는 네라티닙을 포함한다. 상기 PI3K 억제제는 바람직하게 BYL719이다. 상기 Akt 억제제는 바람직하게 MK 2206이다. 상기 mTOR 억제제는 바람직하게 에베롤리무스이다. 상기 Src 억제제는 바람직하게 사라카티닙이다. 상기 미세소관 표적화 약물은 바람직하게 파클리탁셀이다. 상기 HDAC 억제제는 바람직하게 보리노스타트이다.
또한, ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진 대상에서 전이 형성을 상쇄하는 방법이 제공되며, 상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양 세포는 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레굴린 발현 수준의 적어도 60%, 바람직하게 적어도 70%, 더 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90% 또는 95%인 헤레굴린 발현 수준을 가지며, 이 방법은 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 또한, ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양 세포의 전이 형성의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 ErbB-2에 결합하는 제1 항원-결합 부위 및 ErbB-3에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체가 제공되며, 상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양 세포는 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레굴린 발현 수준의 적어도 60%, 바람직하게 적어도 70%, 더 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90% 또는 95%인 헤레굴린 발현 수준을 가진다. 본 발명에 따른 방법 또는 항체가 제공되며, 상기 대상은 세포 당 1,000,000개 미만의 ErbB-2 세포-표면 수용체를 가진 ErbB-2 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진다. 상기 항체는 바람직하게 본 발명에 따른 항체이다. 상기 종양 세포는 바람직하게 유방암, 위암, 결직장암, 결장암, 위식도암, 식도암, 자궁내막암, 난소암, 간암, 비-소세포 폐암을 포함하는 폐암, 투명세포 육종, 침샘암, 두경부암, 뇌암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암, 또는 흑색종 세포이다. 상기 대상은 바람직하게 건강한 심장 기능과 비교하여 90% 미만의 심장 기능을 가진다. 상기 심장 기능은 바람직하게 좌심심 구축율(LVEF)을 포함한다. 상기 대상은 바람직하게 울혈성 심부전(CHF), 좌심실 기능부전(LVD) 및/또는 ≥ 10% 감소된 좌심실 구축율(LVEF)로 고통받고 있고, 및/또는 심근경색을 앓았던 적이 있는 대상이다. 또한, Akt, ERK 및/또는 S6 리보솜 단백질의 인산화를 상쇄, 바람직하게 억제하기 위한 본 발명의 항체의 용도가 제공된다.
명확하고 간략한 설명을 위하여, 본 발명의 특징들은 동일한 또는 개별적 구체예의 일부로서 본 명세서에 개시되며, 본 발명의 범위는 개시된 특징들의 전부 또는 일부의 조합을 가진 구체예를 포함할 수 있다는 것은 자명하다.
도 1: PG3178의 한쪽 팔과 조합하여 활성 HER2xHER3 이중특이적 항체에 존재하는 HER2 팔의 패널의 모노머 HER2에 대한 항원 적정. HER2 항원 적정 ELISA에서 PG3025를 제외한HER2xHER3 패널의 모든 HER2 모노클로날이 시험되었다.
도 2: 리간드 자극을 가진 또는 갖지 않은 BxPC3 세포에 대한 HER2xHER3 이중특이적 항체의 기능적 활성. 점선은 리간드 자극을 가진 또는 갖지 않은, 이 분석의 기준 항체인 트라스투주맙의 활성을 나타낸다.
도 3: MCF-7 분석에서 HER2 및 HER3 모노클로날 항체(상부 패널) 및 이들의 HER2xHER3 이중특이적 항체(하부 패널)의 적정 곡선
도 4: 동소이식 뮤린 모델에서 제31일에 BxPC3-luc2 종양 크기에 대한 항체 치료 효과. BLI, 바이오루미네슨스에 의해 측정된 종양 크기
도 5: 동소이식 뮤린 모델에서 제31일에 BxPC3-luc2 종양 크기에 대한 항체 치료 효과. BLI, 바이오루미네슨스에 의해 측정된 종양 크기
도 6: MCF-7 및 BxPC3-luc2 HER2 발현 세포에 대한 이중특이적 HER2xHER3 항체 및 그것의 모노클로날 모 항체의 FACS 분석. MFI, 평균 형광 강도
도 7(7a-7f): HP-SEC 및 CIEX-HPLC에 의한 분석 특성. PB4188(상부 패널), 항-HER2 모노클로날 모 항체(중간 패널), 항-RSV 모노클로날 기준 IgG(하부 패널).
도 8: 연속 항체 적정물에 의한 연 한천에서 JIMT-1 세포 증식의 억제
도 9(9a-9b): 연속 항체 적정물에 의한 매트리겔에서 BT-474(상부 패널) 및 SKBR3(하부 패널) 세포 증식의 억제
도 10a: 매트리겔에서 SKBR-3 세포의 HRG 유도 증식 및 분기/침범
도 10b: 모노클로날 모 항체와 다른, PB4188에 의한, 매트리겔에서 SKBR-3 세포의 HRG 유도 증식 및 분기/침범의 억제
도 10c: 항-HER3 모노클로날 항체와 다른, PB4188에 의한, 매트리겔에서 SKBR-3 세포의 HRG 유도 증식 및 분기/침범의 억제
도 10d: 항-HER3 모노클로날 항체와 트라스투주맙의 조합과 다른, PB4188에 의한, 매트리겔에서 SKBR-3 세포의 HRG 유도 증식 및 분기/침범의 억제
도 10e: PB4188 및 PB4188과 트라스투주맙의 조합에 의한, 매트리겔에서 SKBR-3 세포의 HRG 유도 증식 및 분기/침범의 억제
도 11(11a-11b): 100 ng/ml HRG의 존재하에 HER2+++ N87 세포에서 PB4188의 뛰어난 억제 활성
도 12: 용량 적정에서 PB4188 및 PB3448의 ADCC 활성
도 13: 모노클로날 모 항체 또는 이들의 조합과 비교된 이중특이적 항체의 증가된 ADCC 활성
도 14: 낮은(상부 패널) 및 높은(하부 패널) HER2 발현 세포에 대한 트라스투주맙과 비교된 에이푸코실화된 PB4188의 ADCC 활성
도 15(15a-15b): 높은 또는 낮은 FcγR 변이체를 발현하는 리포터 세포의 존재하에 SKBR-3 HER2+++ 세포에 대한 에이푸코실화된 PB4188의 ADCC 활성
도 16(16a-16z): 본 발명의 항체의 VH-사슬, 공통 경쇄 및 중쇄의 핵산 및 아미노산 서열. 이 도면에서는 리더 서열이 표시된 경우, 이것은 VH 사슬이나 항체의 일부는 아니며, 전형적으로 단백질을 생성하는 세포에서 단백질의 가공 동안 절단된다.
도 17(17a-17b): JIMT-1 뮤린 이종이식편 모델에서 종양 크기에 대한 항체 치료 효과. 상이한 치료 그룹의 종양 부피 캘리퍼 측정에 의해 측정된 종양 성장. 상부, 60일 동안의 종양 성장; 하부, 치료 기간 종료(29일)시의 종양 성장 억제(TGI)
도 18: JIMT-1 뮤린 이종이식편 모델에서 상이한 치료 그룹의 Kaplan-Meier 생존 곡선
도 19: N87 리간드 유도 성장의 억제. N87의 HRG 유도 증식은 모 항-HER3 항체와는 달리 PB4188에 의해 광범위한 HRG에 걸쳐서 극복될 수 있다. 데이터는 40 ng/ml의 항체 농도에서 나타낸다.
도 20(20a-20b): BT-474 세포(상부; 3회의 독립적 분석) 및 SK-BR-3 세포(하부; 3회의 독립적 분석)를 향한 125I-표지 IgG HER2xHER3(PB4188)의 정류 상태 세포 친화성 측정. 비-특이적 결합은 표지되지 않은 HER2xHER3를 100배 과량으로 사용하여 결정되었다.
도 21A(21a): 에피토프 맵핑 HER2. 확인된 결정적 잔기는 HER2 결정 구조 상에 검은색 구체로서 표시되고, 확인된 이차적인 결정적 잔기는 회색 구체로서 표시된다(PDB ID #1S78).
도 21B: a)(21b) 연회색 구체로서 검증된 PG3958 에피토프 잔기를, 암회색 구체로서 주변 잔기(+/-5개 아미노산 잔기)를 나타낸 HER2 결정 구조(PDB #1S78). b)(21c) 회색으로 검증된 에피토프 잔기를, 검은색으로 주변 잔기(+/-5개 잔기)를 나타낸 에피토프 영역의 용매 노출된 표면. c)(21d) 연회색으로 검증된 에피토프 잔기를, 암회색으로 주변 잔기(+/-5개 잔기)를 나타낸 에피토프 영역의 상세도. d)(21e) 검증된 에피토프 잔기(회색 밑줄), 주변 잔기(검은색) 및 먼 쪽 잔기(회색 이탤릭체, a, b 및 c에는 도시되지 않음)를 나타낸 HER2 PG3958 에피토프 영역의 주 아미노산 서열. 도면 작성 및 분석은 Yasara(www.yasara.org)에서 이루어졌다.
도 21C: a)(21f) 회색 구체의 에피토프 잔기 Arg426 및 검은색 구체의 Arg426로부터 11.2Å 반경 내에 있는 모든 표면 노출된 잔기를 나타낸 HER3 결정 구조(PDB #4P59). b)(21g) Arg426을 가진 에피토프 영역의 용매 노출된 표면 및 회색으로 나타낸 먼 쪽 잔기 및 검은색으로 나타낸 Arg426로부터 11.2Å 반경 내에 있는 모든 표면 노출된 잔기. c)(21h) 연회색의 에피토프 영역 Arg426에 있는 잔기 및 암회색의 주변 잔기(모두 표지됨). 도면 작성 및 분석은 Yasara(www.yasara.org)에서 이루어졌다.
도 22: HER2에 대한 Fab 팔 3958의 결정적 결합 잔기의 확인. 트라스투주맙이 대조군 항체로 포함되었다. 결합은 FACS 적정에서 결정되었으며, 트라스투주맙 결합과 비교하여 AUC로 표시된다. D143Y는 이 돌연변이에 대한 트라스투주맙의 결합이 차단되므로 3958 에피토프의 일부인 것으로 생각되지 않는다.
도 23: HER3 결정 구조로 표시된 PG3178 결합을 위한 결정적 잔기. PG3178 결합에 대해 확인된 결정적 잔기가 HER3 결정 구조(PDB ID #4P59) 상에 검은색 구체로 표시된다.
도 24: HER3에 대한 PG3175의 결정적 결합 잔기로서 R426의 확인. 2개의 항-HER3 항체가 대조군 항체로 포함되었다. 결합은 FACS 적정에서 결정되었으며, WT HER3에 대한 결합과 비교하여 AUC로 표시된다.
도 25: 시험관내 심장 스트레스 하에서 PB4188 독성의 부재. 3μM의 안트라사이클린 독소루비신의 존재하에 PB4188 또는 단일특이적 벤치마크 항체와 함께 심근세포의 인큐베이션. 심근세포의 생육성이 ATP의 정량에 의해 결정되었으며, 상대 광 단위(RLU)로 표시된다. T, 트라스투주맙; P, 퍼투주맙
도 26: HER 증폭 세포에 대한 트라스투주맙 및 HER3 항체와 비교된 PB4188의 결합. FACS 적정이 상이한 HER2 수준을 발현하는 나타낸 셀라인에 대해 수행되었다. 중위값 PE 신호값의 곡선 밑 면적이 셀라인 당 플롯팅되었다.
도 27: PB4188, 트라스투주맙 또는 음성 대조군 항체의 포화 농도와 함께 사전 인큐베이션된 SKBR-3 세포에 대한 PB4188FITC의 연속 적정물의 결합. PB4188FITC은 트라스투주맙 또는 대조군 항체의 존재하에 SKBR-3에 효과적으로 결합한다.
도 28(28a-28b): 4개의 HER2 도메인에 대해 지정된 동일한 HER3 Fab 팔과 상이한 HER2 팔로 이루어진 HER2xHER3 이중특이적 항체에 의한 HRG 스트레스 상태에서 세포 증식의 억제
도 29: SKBR-3 세포의 성장 및 형태에 대한 PB4188과 라파티닙의 상승작용적 조합. 좌측, 상이한 조건에서 처리된 세포의 현미경 사진; 우측, 처리 조건과 관련하여 그래프로 나타낸 형태적 변화
도 30A(30a-30c) 및 B(30d-30f): 시간 경과 실험에서 PB4188에 의한 N87 및 SKBR-3 세포의 HRG 매개 인산화의 억제. 트라스투주맙 + 퍼투주맙 및 HRG 단독이 대조군으로 포함되었다.
도 31: 시간 경과 실험에서 PB4188에 의한 N87 세포의 HRG 매개 인산화의 억제. 트라스투주맙 + 퍼투주맙 및 라파티닙이 대조군으로 포함되었다.
도 32: Akt 수준 및 Akt 인산화의 변화가 PB4188의 주 4회 용량 중 주 2회 용량 후 4시간째에 평가되었다. 종양 세포용해물에서 인산화 수준은 Luminex 분석에 의해 평가되었다. 분석은 중복하여 수행되었고, 그룹 당 5개의 종양이 분석되었다.
도 33: JIMT-1 종양 물질에 대해 VeraTag 분석에 의해 분석된 HER2:HER3 매개 신호화에 대한 PB4188의 생체내 매개 효과. 종양은 투약 후 4시간째에 분석되었고, PBS 치료된 동물로부터 유래된 종양이 대조군으로 포함되었다.
도 34(34a-34b): PB4188은 세포 주기 진행을 감소시킨다. 분석 배지에 파종된 세포가 표준(1 ng/ml) 또는 고(100 ng/ml) 농도의 HRG의 존재하에 항체의 적정과 함께 인큐베이션되었다. 24시간 후(또는 MCF-7 세포의 경우 48시간 후), 세포는 세포 주기의 상이한 단계에 이들의 분포에 대해 분석되었다(G0/G1, S 또는 G2/M 단계). S 및 G2/M 단계에 있는 세포의 퍼센트와 G0/G1 단계에 있는 세포의 퍼센트 간의 비율로서 증식 지수가 계산되었다. P+T, 퍼투주맙 + 트라스투주맙.
도 35: HER2-과발현 암세포에서 pH-감응성 염료로 표지된 항체의 내재화. 1 ng/ml HRG로 보충된 분석 배지에 파종된 N87(A, B) 및 SKBR-3(C, D)이 100nM pH-감응성 염료-표지된 항체와 함께 24시간 동안 인큐베이션되었다. 수집 후, 세포 표면-결합 항체를 검출하기 위해 APC-표지된 항-사람 IgG 이차 항체로 세포가 염색되었다. 세포는 내재화 결정을 위해 PE(A, C)에서, 그리고 항체의 표면 결합의 결정을 위해 APC(B, D) 채널에서 FACS에 의해 형광에 대해 분석되었다.
도 36: 두 상이한 도너로부터 유래된 세포에서 트라스투주맙 대 트라스투주맙 + 퍼투주맙의 ADCC 활성
도 37(37a-37g): F3178 변이체의 아미노산 및 뉴클레오타이드 정렬. CDR 영역이 표시된다.
도 38: HRG 의존적 N87 분석에서 HER3 모노클로날 항체의 적정 곡선. PG6058, PG6061 및 PG6065는 PG3178의 변이체이다. PG1337은 파상풍 톡소이드에 특이적인 음성 대조군이다. 데이터는 각 플레이트 상에 존재하는 리간드에 의한 기저 증식에 대해 정규화되었다.
도 39(39a-39b): HER3 모노클로날 항체의 CIEX-HPLC 프로파일. PG6058, PG6061 및 PG6065는 PG3178의 변이체이다. VH 영역의 계산된 등전점(pI) 및 주 피크의 체류 시간(tR)이 각 항체에 대해 주어진다.
도 40: HRG 스트레스 농도에 있는(A)(40a-40d) 또는 매트리겔에서 성장된(B)(40e) HER2 증폭 셀라인에 대한 PB4188를 사용한 시험관내 약물 조합 이소보로그램
도 41: 두개내 이식에 사용된 피하 종양(4차 계대)의 종양 성장 곡선
도 42: 뇌 부종 배점 시스템. 뇌 부종의 예들의 대표적인 T2-가중 MR 영상에서 0 내지 4점으로 배점된다. 흰색 화살표는 종양 영역을 표시하고, 황색 화살표는 부종을 가리킨다.
도 43: 그룹 A-D에 마우스가 포함될 때의 체중 및 종양 부피. 체중 또는 종양 부피는 그룹별로 차이를 보이지 않았다(원-웨이 ANOVA, p = 0.43(체중) 및 p = 0.92(종양 부피)).
도 44: 4개 치료 그룹에 대한 치료 개시 후 종양 부피. 평균±SEM이 그래프에 표시된다(N = 8-6/그룹). 각 그룹에 대해, 적어도 6마리의 동물이 살아있을 때까지 종양 부피를 측정하여 표시했다.
도 45: 그램(좌측) 및 포함 체중으로부터의 변화 퍼센트(우측)으로 표시된, 4개 치료 그룹에 대한 치료 개시 후 체중. 단지 평균만이 그래프에 표시된다(N = 8-6/그룹). 각 그룹에 대해, 적어도 6마리의 동물이 살아있을 때까지 체중을 측정하여 표시했다.
도 46: T2-가중 MRI에 의해 측정된 비히클로 치료된 마우스의 개별 종양 부피
도 47: T2-가중 MRI에 의해 측정된 T-DM1로 치료된 마우스의 개별 종양 부피
도 48: T2-가중 MRI에 의해 측정된 MCLA-128로 치료된 마우스의 개별 종양 부피
도 49: T2-가중 MRI에 의해 측정된 T-DM1 + MCLA-128로 치료된 마우스의 개별 종양 부피
도 50: 그룹 A의 한 마리 마우스(M23)의 대표적인 T2-가중 MR 영상. 이 영상은 관상면(상부) 및 축면(하부) 슬라이스를 보여준다.
도 51: 그룹 B의 한 마리 마우스(M35)의 대표적인 T2-가중 MR 영상. 이 영상은 관상면(상부) 및 축면(하부) 슬라이스를 보여준다.
도 52: 그룹 C의 한 마리 마우스(M42)의 대표적인 T2-가중 MR 영상. 이 영상은 관상면(상부) 및 축면(하부) 슬라이스를 보여준다.
도 53: 그룹 D의 한 마리 마우스(MO3)의 대표적인 T2-가중 MR 영상. 이 영상은 관상면(상부) 및 축면(하부) 슬라이스를 보여준다.
도 54: 그램(좌측) 및 포함 체중으로부터의 변화 퍼센트(우측)으로 표시된, 비히클로 치료된 마우스에 대한 개별 체중 측정값
도 55: 그램(좌측) 및 포함 체중으로부터의 변화 퍼센트(우측)으로 표시된, T-DM1로 치료된 마우스에 대한 개별 체중 측정값
도 56: 그램(좌측) 및 포함 체중으로부터의 변화 퍼센트(우측)으로 표시된, MCLA-128로 치료된 마우스에 대한 개별 체중 측정값
도 57: 그램(좌측) 및 포함 체중으로부터의 변화 퍼센트(우측)으로 표시된, T-DM1 + MCLA-128로 치료된 마우스에 대한 개별 체중 측정값
도 58: 각 마우스에 대한 마지막 MR 스캔 상에서 뇌 부종의 배점. 배점시 종양 부피는 그룹마다 상이하며, 종양 부피가 뇌 부종의 수준에 영향을 미칠 수 있다. T-DM1 및 T-DM1 + MCLA-128 치료된 동물의 평균 종양 부피는 비히클 또는 MCLA-128 치료된 동물과 비교하여 더 적었다. 이와 같이, 결과는 주의해서 해석되어야 한다.
도 59: 모든 그룹으로부터의 생존 데이터의 Kaplan-Meier 플롯. 중위값 생존은 비히클, TDM1, MCLA-128 및 T-DM1 + MCLA-128로 각각 치료된 동물에 대해 13, 19.5, 29 및 42일이었다. 생존 곡선은 유의한 차이가 있었다(p<0.0001, Log-rank).
도 60: 페어-와이즈 Kaplan-Meier 플롯. 유의하게 더 긴 중위값 생존이 비히클 치료됨 마우스(13일)와 비교하여 T-DM1(19.5일), MCLA-128(29일), 및 T-DM1 + MCLA-128(42일)로 치료된 마우스에서 관찰되었다. T-DM1 및 MCLA-128로 치료된 마우스에서 중위값 생존의 차이는 보이지 않았다. T-DM1 + MCLA-128로 치료된 마우스는 T-DM1 또는 MCLA-128 단독으로 치료된 마우스와 비교하여 유의하게 더 긴 중위값 생존을 가진다.
도 61: 조합 요법(이중 및 삼중) 임상 시험을 위한 연구 설계
도 62: 조합 요법 임상 시험에서 이중 치료제 투여
도 63: 조합 요법 임상 시험에서 삼중 치료제 투여
도 2: 리간드 자극을 가진 또는 갖지 않은 BxPC3 세포에 대한 HER2xHER3 이중특이적 항체의 기능적 활성. 점선은 리간드 자극을 가진 또는 갖지 않은, 이 분석의 기준 항체인 트라스투주맙의 활성을 나타낸다.
도 3: MCF-7 분석에서 HER2 및 HER3 모노클로날 항체(상부 패널) 및 이들의 HER2xHER3 이중특이적 항체(하부 패널)의 적정 곡선
도 4: 동소이식 뮤린 모델에서 제31일에 BxPC3-luc2 종양 크기에 대한 항체 치료 효과. BLI, 바이오루미네슨스에 의해 측정된 종양 크기
도 5: 동소이식 뮤린 모델에서 제31일에 BxPC3-luc2 종양 크기에 대한 항체 치료 효과. BLI, 바이오루미네슨스에 의해 측정된 종양 크기
도 6: MCF-7 및 BxPC3-luc2 HER2 발현 세포에 대한 이중특이적 HER2xHER3 항체 및 그것의 모노클로날 모 항체의 FACS 분석. MFI, 평균 형광 강도
도 7(7a-7f): HP-SEC 및 CIEX-HPLC에 의한 분석 특성. PB4188(상부 패널), 항-HER2 모노클로날 모 항체(중간 패널), 항-RSV 모노클로날 기준 IgG(하부 패널).
도 8: 연속 항체 적정물에 의한 연 한천에서 JIMT-1 세포 증식의 억제
도 9(9a-9b): 연속 항체 적정물에 의한 매트리겔에서 BT-474(상부 패널) 및 SKBR3(하부 패널) 세포 증식의 억제
도 10a: 매트리겔에서 SKBR-3 세포의 HRG 유도 증식 및 분기/침범
도 10b: 모노클로날 모 항체와 다른, PB4188에 의한, 매트리겔에서 SKBR-3 세포의 HRG 유도 증식 및 분기/침범의 억제
도 10c: 항-HER3 모노클로날 항체와 다른, PB4188에 의한, 매트리겔에서 SKBR-3 세포의 HRG 유도 증식 및 분기/침범의 억제
도 10d: 항-HER3 모노클로날 항체와 트라스투주맙의 조합과 다른, PB4188에 의한, 매트리겔에서 SKBR-3 세포의 HRG 유도 증식 및 분기/침범의 억제
도 10e: PB4188 및 PB4188과 트라스투주맙의 조합에 의한, 매트리겔에서 SKBR-3 세포의 HRG 유도 증식 및 분기/침범의 억제
도 11(11a-11b): 100 ng/ml HRG의 존재하에 HER2+++ N87 세포에서 PB4188의 뛰어난 억제 활성
도 12: 용량 적정에서 PB4188 및 PB3448의 ADCC 활성
도 13: 모노클로날 모 항체 또는 이들의 조합과 비교된 이중특이적 항체의 증가된 ADCC 활성
도 14: 낮은(상부 패널) 및 높은(하부 패널) HER2 발현 세포에 대한 트라스투주맙과 비교된 에이푸코실화된 PB4188의 ADCC 활성
도 15(15a-15b): 높은 또는 낮은 FcγR 변이체를 발현하는 리포터 세포의 존재하에 SKBR-3 HER2+++ 세포에 대한 에이푸코실화된 PB4188의 ADCC 활성
도 16(16a-16z): 본 발명의 항체의 VH-사슬, 공통 경쇄 및 중쇄의 핵산 및 아미노산 서열. 이 도면에서는 리더 서열이 표시된 경우, 이것은 VH 사슬이나 항체의 일부는 아니며, 전형적으로 단백질을 생성하는 세포에서 단백질의 가공 동안 절단된다.
도 17(17a-17b): JIMT-1 뮤린 이종이식편 모델에서 종양 크기에 대한 항체 치료 효과. 상이한 치료 그룹의 종양 부피 캘리퍼 측정에 의해 측정된 종양 성장. 상부, 60일 동안의 종양 성장; 하부, 치료 기간 종료(29일)시의 종양 성장 억제(TGI)
도 18: JIMT-1 뮤린 이종이식편 모델에서 상이한 치료 그룹의 Kaplan-Meier 생존 곡선
도 19: N87 리간드 유도 성장의 억제. N87의 HRG 유도 증식은 모 항-HER3 항체와는 달리 PB4188에 의해 광범위한 HRG에 걸쳐서 극복될 수 있다. 데이터는 40 ng/ml의 항체 농도에서 나타낸다.
도 20(20a-20b): BT-474 세포(상부; 3회의 독립적 분석) 및 SK-BR-3 세포(하부; 3회의 독립적 분석)를 향한 125I-표지 IgG HER2xHER3(PB4188)의 정류 상태 세포 친화성 측정. 비-특이적 결합은 표지되지 않은 HER2xHER3를 100배 과량으로 사용하여 결정되었다.
도 21A(21a): 에피토프 맵핑 HER2. 확인된 결정적 잔기는 HER2 결정 구조 상에 검은색 구체로서 표시되고, 확인된 이차적인 결정적 잔기는 회색 구체로서 표시된다(PDB ID #1S78).
도 21B: a)(21b) 연회색 구체로서 검증된 PG3958 에피토프 잔기를, 암회색 구체로서 주변 잔기(+/-5개 아미노산 잔기)를 나타낸 HER2 결정 구조(PDB #1S78). b)(21c) 회색으로 검증된 에피토프 잔기를, 검은색으로 주변 잔기(+/-5개 잔기)를 나타낸 에피토프 영역의 용매 노출된 표면. c)(21d) 연회색으로 검증된 에피토프 잔기를, 암회색으로 주변 잔기(+/-5개 잔기)를 나타낸 에피토프 영역의 상세도. d)(21e) 검증된 에피토프 잔기(회색 밑줄), 주변 잔기(검은색) 및 먼 쪽 잔기(회색 이탤릭체, a, b 및 c에는 도시되지 않음)를 나타낸 HER2 PG3958 에피토프 영역의 주 아미노산 서열. 도면 작성 및 분석은 Yasara(www.yasara.org)에서 이루어졌다.
도 21C: a)(21f) 회색 구체의 에피토프 잔기 Arg426 및 검은색 구체의 Arg426로부터 11.2Å 반경 내에 있는 모든 표면 노출된 잔기를 나타낸 HER3 결정 구조(PDB #4P59). b)(21g) Arg426을 가진 에피토프 영역의 용매 노출된 표면 및 회색으로 나타낸 먼 쪽 잔기 및 검은색으로 나타낸 Arg426로부터 11.2Å 반경 내에 있는 모든 표면 노출된 잔기. c)(21h) 연회색의 에피토프 영역 Arg426에 있는 잔기 및 암회색의 주변 잔기(모두 표지됨). 도면 작성 및 분석은 Yasara(www.yasara.org)에서 이루어졌다.
도 22: HER2에 대한 Fab 팔 3958의 결정적 결합 잔기의 확인. 트라스투주맙이 대조군 항체로 포함되었다. 결합은 FACS 적정에서 결정되었으며, 트라스투주맙 결합과 비교하여 AUC로 표시된다. D143Y는 이 돌연변이에 대한 트라스투주맙의 결합이 차단되므로 3958 에피토프의 일부인 것으로 생각되지 않는다.
도 23: HER3 결정 구조로 표시된 PG3178 결합을 위한 결정적 잔기. PG3178 결합에 대해 확인된 결정적 잔기가 HER3 결정 구조(PDB ID #4P59) 상에 검은색 구체로 표시된다.
도 24: HER3에 대한 PG3175의 결정적 결합 잔기로서 R426의 확인. 2개의 항-HER3 항체가 대조군 항체로 포함되었다. 결합은 FACS 적정에서 결정되었으며, WT HER3에 대한 결합과 비교하여 AUC로 표시된다.
도 25: 시험관내 심장 스트레스 하에서 PB4188 독성의 부재. 3μM의 안트라사이클린 독소루비신의 존재하에 PB4188 또는 단일특이적 벤치마크 항체와 함께 심근세포의 인큐베이션. 심근세포의 생육성이 ATP의 정량에 의해 결정되었으며, 상대 광 단위(RLU)로 표시된다. T, 트라스투주맙; P, 퍼투주맙
도 26: HER 증폭 세포에 대한 트라스투주맙 및 HER3 항체와 비교된 PB4188의 결합. FACS 적정이 상이한 HER2 수준을 발현하는 나타낸 셀라인에 대해 수행되었다. 중위값 PE 신호값의 곡선 밑 면적이 셀라인 당 플롯팅되었다.
도 27: PB4188, 트라스투주맙 또는 음성 대조군 항체의 포화 농도와 함께 사전 인큐베이션된 SKBR-3 세포에 대한 PB4188FITC의 연속 적정물의 결합. PB4188FITC은 트라스투주맙 또는 대조군 항체의 존재하에 SKBR-3에 효과적으로 결합한다.
도 28(28a-28b): 4개의 HER2 도메인에 대해 지정된 동일한 HER3 Fab 팔과 상이한 HER2 팔로 이루어진 HER2xHER3 이중특이적 항체에 의한 HRG 스트레스 상태에서 세포 증식의 억제
도 29: SKBR-3 세포의 성장 및 형태에 대한 PB4188과 라파티닙의 상승작용적 조합. 좌측, 상이한 조건에서 처리된 세포의 현미경 사진; 우측, 처리 조건과 관련하여 그래프로 나타낸 형태적 변화
도 30A(30a-30c) 및 B(30d-30f): 시간 경과 실험에서 PB4188에 의한 N87 및 SKBR-3 세포의 HRG 매개 인산화의 억제. 트라스투주맙 + 퍼투주맙 및 HRG 단독이 대조군으로 포함되었다.
도 31: 시간 경과 실험에서 PB4188에 의한 N87 세포의 HRG 매개 인산화의 억제. 트라스투주맙 + 퍼투주맙 및 라파티닙이 대조군으로 포함되었다.
도 32: Akt 수준 및 Akt 인산화의 변화가 PB4188의 주 4회 용량 중 주 2회 용량 후 4시간째에 평가되었다. 종양 세포용해물에서 인산화 수준은 Luminex 분석에 의해 평가되었다. 분석은 중복하여 수행되었고, 그룹 당 5개의 종양이 분석되었다.
도 33: JIMT-1 종양 물질에 대해 VeraTag 분석에 의해 분석된 HER2:HER3 매개 신호화에 대한 PB4188의 생체내 매개 효과. 종양은 투약 후 4시간째에 분석되었고, PBS 치료된 동물로부터 유래된 종양이 대조군으로 포함되었다.
도 34(34a-34b): PB4188은 세포 주기 진행을 감소시킨다. 분석 배지에 파종된 세포가 표준(1 ng/ml) 또는 고(100 ng/ml) 농도의 HRG의 존재하에 항체의 적정과 함께 인큐베이션되었다. 24시간 후(또는 MCF-7 세포의 경우 48시간 후), 세포는 세포 주기의 상이한 단계에 이들의 분포에 대해 분석되었다(G0/G1, S 또는 G2/M 단계). S 및 G2/M 단계에 있는 세포의 퍼센트와 G0/G1 단계에 있는 세포의 퍼센트 간의 비율로서 증식 지수가 계산되었다. P+T, 퍼투주맙 + 트라스투주맙.
도 35: HER2-과발현 암세포에서 pH-감응성 염료로 표지된 항체의 내재화. 1 ng/ml HRG로 보충된 분석 배지에 파종된 N87(A, B) 및 SKBR-3(C, D)이 100nM pH-감응성 염료-표지된 항체와 함께 24시간 동안 인큐베이션되었다. 수집 후, 세포 표면-결합 항체를 검출하기 위해 APC-표지된 항-사람 IgG 이차 항체로 세포가 염색되었다. 세포는 내재화 결정을 위해 PE(A, C)에서, 그리고 항체의 표면 결합의 결정을 위해 APC(B, D) 채널에서 FACS에 의해 형광에 대해 분석되었다.
도 36: 두 상이한 도너로부터 유래된 세포에서 트라스투주맙 대 트라스투주맙 + 퍼투주맙의 ADCC 활성
도 37(37a-37g): F3178 변이체의 아미노산 및 뉴클레오타이드 정렬. CDR 영역이 표시된다.
도 38: HRG 의존적 N87 분석에서 HER3 모노클로날 항체의 적정 곡선. PG6058, PG6061 및 PG6065는 PG3178의 변이체이다. PG1337은 파상풍 톡소이드에 특이적인 음성 대조군이다. 데이터는 각 플레이트 상에 존재하는 리간드에 의한 기저 증식에 대해 정규화되었다.
도 39(39a-39b): HER3 모노클로날 항체의 CIEX-HPLC 프로파일. PG6058, PG6061 및 PG6065는 PG3178의 변이체이다. VH 영역의 계산된 등전점(pI) 및 주 피크의 체류 시간(tR)이 각 항체에 대해 주어진다.
도 40: HRG 스트레스 농도에 있는(A)(40a-40d) 또는 매트리겔에서 성장된(B)(40e) HER2 증폭 셀라인에 대한 PB4188를 사용한 시험관내 약물 조합 이소보로그램
도 41: 두개내 이식에 사용된 피하 종양(4차 계대)의 종양 성장 곡선
도 42: 뇌 부종 배점 시스템. 뇌 부종의 예들의 대표적인 T2-가중 MR 영상에서 0 내지 4점으로 배점된다. 흰색 화살표는 종양 영역을 표시하고, 황색 화살표는 부종을 가리킨다.
도 43: 그룹 A-D에 마우스가 포함될 때의 체중 및 종양 부피. 체중 또는 종양 부피는 그룹별로 차이를 보이지 않았다(원-웨이 ANOVA, p = 0.43(체중) 및 p = 0.92(종양 부피)).
도 44: 4개 치료 그룹에 대한 치료 개시 후 종양 부피. 평균±SEM이 그래프에 표시된다(N = 8-6/그룹). 각 그룹에 대해, 적어도 6마리의 동물이 살아있을 때까지 종양 부피를 측정하여 표시했다.
도 45: 그램(좌측) 및 포함 체중으로부터의 변화 퍼센트(우측)으로 표시된, 4개 치료 그룹에 대한 치료 개시 후 체중. 단지 평균만이 그래프에 표시된다(N = 8-6/그룹). 각 그룹에 대해, 적어도 6마리의 동물이 살아있을 때까지 체중을 측정하여 표시했다.
도 46: T2-가중 MRI에 의해 측정된 비히클로 치료된 마우스의 개별 종양 부피
도 47: T2-가중 MRI에 의해 측정된 T-DM1로 치료된 마우스의 개별 종양 부피
도 48: T2-가중 MRI에 의해 측정된 MCLA-128로 치료된 마우스의 개별 종양 부피
도 49: T2-가중 MRI에 의해 측정된 T-DM1 + MCLA-128로 치료된 마우스의 개별 종양 부피
도 50: 그룹 A의 한 마리 마우스(M23)의 대표적인 T2-가중 MR 영상. 이 영상은 관상면(상부) 및 축면(하부) 슬라이스를 보여준다.
도 51: 그룹 B의 한 마리 마우스(M35)의 대표적인 T2-가중 MR 영상. 이 영상은 관상면(상부) 및 축면(하부) 슬라이스를 보여준다.
도 52: 그룹 C의 한 마리 마우스(M42)의 대표적인 T2-가중 MR 영상. 이 영상은 관상면(상부) 및 축면(하부) 슬라이스를 보여준다.
도 53: 그룹 D의 한 마리 마우스(MO3)의 대표적인 T2-가중 MR 영상. 이 영상은 관상면(상부) 및 축면(하부) 슬라이스를 보여준다.
도 54: 그램(좌측) 및 포함 체중으로부터의 변화 퍼센트(우측)으로 표시된, 비히클로 치료된 마우스에 대한 개별 체중 측정값
도 55: 그램(좌측) 및 포함 체중으로부터의 변화 퍼센트(우측)으로 표시된, T-DM1로 치료된 마우스에 대한 개별 체중 측정값
도 56: 그램(좌측) 및 포함 체중으로부터의 변화 퍼센트(우측)으로 표시된, MCLA-128로 치료된 마우스에 대한 개별 체중 측정값
도 57: 그램(좌측) 및 포함 체중으로부터의 변화 퍼센트(우측)으로 표시된, T-DM1 + MCLA-128로 치료된 마우스에 대한 개별 체중 측정값
도 58: 각 마우스에 대한 마지막 MR 스캔 상에서 뇌 부종의 배점. 배점시 종양 부피는 그룹마다 상이하며, 종양 부피가 뇌 부종의 수준에 영향을 미칠 수 있다. T-DM1 및 T-DM1 + MCLA-128 치료된 동물의 평균 종양 부피는 비히클 또는 MCLA-128 치료된 동물과 비교하여 더 적었다. 이와 같이, 결과는 주의해서 해석되어야 한다.
도 59: 모든 그룹으로부터의 생존 데이터의 Kaplan-Meier 플롯. 중위값 생존은 비히클, TDM1, MCLA-128 및 T-DM1 + MCLA-128로 각각 치료된 동물에 대해 13, 19.5, 29 및 42일이었다. 생존 곡선은 유의한 차이가 있었다(p<0.0001, Log-rank).
도 60: 페어-와이즈 Kaplan-Meier 플롯. 유의하게 더 긴 중위값 생존이 비히클 치료됨 마우스(13일)와 비교하여 T-DM1(19.5일), MCLA-128(29일), 및 T-DM1 + MCLA-128(42일)로 치료된 마우스에서 관찰되었다. T-DM1 및 MCLA-128로 치료된 마우스에서 중위값 생존의 차이는 보이지 않았다. T-DM1 + MCLA-128로 치료된 마우스는 T-DM1 또는 MCLA-128 단독으로 치료된 마우스와 비교하여 유의하게 더 긴 중위값 생존을 가진다.
도 61: 조합 요법(이중 및 삼중) 임상 시험을 위한 연구 설계
도 62: 조합 요법 임상 시험에서 이중 치료제 투여
도 63: 조합 요법 임상 시험에서 삼중 치료제 투여
실시예
실시예
1
방법, 재료 및 항체의 스크리닝
셀라인:
BxPC-3-luc2(Perkin Elmer 125058), N87(ATCC®CRL-5822™), SK-BR-3(ATCC®HTB-30™), BT-474(ATCC®HTB-20™), JIMT-1(DSMZ ACC 589), L929(Sigma Aldrich 85011425), K562(DSMZ ACC10), HEK293T(ATCC®-CRL-11268™), CHO-K1(DSMZ ACC110), MCF-7(DSMZ ACC 115), MDA-MB-468(#300279-513, Cell line services), SK-OV-3(ATCC®HTB-77™), MDA-MB-175(ATCC-HTB-25), MDA-MB-453(ATCC-HTB-131), MDA-MB-361(ATCC-HTB-27), ZR-75-1(ATCC-CRL-1500) 및 MKN-45(DSMZ ACC409) 셀라인을 ATCC, DSMZ 또는 Sigma Aldrich에서 구입했고 10% 열 비활성화된 태아 소 혈청(FBS)으로 보충된 성장 배지에 통상적으로 유지시켰다. HEK293F Freestyle 세포는 Invitrogen에서 얻었고 293 FreeStyle 배지에 통상적으로 유지시켰다.
재조합 사람, 닭, 래트 및 스왑 도메인 벡터의 생성(HER의 클로닝)
사람 HER2 . 전장 사람 HER2를 유방암 셀라인 JIMT-1으로부터 분리된 RNA로부터 유래된 cDNA로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 사람 HER2의 증폭에 사용된 프라이머는 다음과 같았다. 포워드 프라이머: AAGCTGGCTAGCACCATGGAGCTGGCGGCCTTGTGC, 리버스 프라이머: AATAATTCTAGACTGGCACGTCCAGACCCAGG. 이 전장 증폭 생성물을 NheI와 XbaI로 효소절단한 후 pcDNA3.1(Invitrogen)의 상응하는 부위에 클로닝했다.
이 서열을 NCBI 기준 서열 NM_004448.2와 비교하여 검증했다. 형질도입 및 면역화 목적을 위한 사람 HER2 세포외 도메인(ECD)을 단독 발현하는 구성물을 생성하기 위해 HER2 경막 도메인과 ECD를 PCR 증폭하고 pVax1에 다시 클로닝했다. 형질도입 목적을 위해 HER2 ECD 도메인을 증폭하여 pDisplay에서 다른 구성물을 생성했고, 이 구성물에서 HER2 EDC 도메인을 PDGFR 경막 도메인에 융합했다.
사람 HER3. HER3의 전장 사람 cDNA 클론을 Origene으로부터 얻었다. 형질도입 및 면역화 목적을 위한 사람 HER3 ECD 도메인을 단독 발현하는 구성물을 생성하기 위해 HER3 경막 도메인과 ECD를 PCR 증폭하고 pVax1에 다시 클로닝했다. 또한, 다른 구성물을 pVax1에서 생성했고, 이로써 HER3 ECD 도메인이 PDGFR 경막 도메인에 융합되었다. 모든 서열은 NCBI 기준 NM_001982.3과 비교하여 검증했다.
사이노몰거스 HER2 세포외 도메인을 사이노몰거스 cDNA(원숭이 정상 결장 조직)(Biochain)로부터 PCR 증폭시켰다. 사이노몰거스 HER2의 증폭에 사용된 프라이머는 다음과 같았다. 포워드 프라이머: AAGCTGGCTAGCACCATGGAGCTGGCGGCCTGGTAC, 리버스 프라이머: AATAATTCTAGACTGGCACGTCCAGACCCAGG. 이 전장 증폭 생성물을 NheI와 XbaI로 효소절단한 후 pcDNA3.1의 상응하는 부위에 클로닝했다. 상기 클론을 시퀀싱하고 레수스 원숭이(XM_002800451)의 이용가능한 서열과 정렬하여 ErbB-2 클론의 정확성을 체크했다.
사이노몰거스 HER3 세포외 도메인을 사이노몰거스 cDNA(원숭이 정상 결장 조직)(Biochain)로부터 PCR 증폭시켰다. 사이노몰거스 HER3의 증폭에 사용된 프라이머는 다음과 같았다. 포워드 프라이머: AAGCTGGCTAGCACCATGAGGGCGAACGGCGCTCTG, 리버스 프라이머: AATAATTCTAGATTACGTTCTCTGGGCATTAGC. 이 전장 증폭 생성물을 NheI와 XbaI로 효소절단한 후 pcDNA3.1의 상응하는 부위에 클로닝했다. 상기 클론을 시퀀싱하고 레수스 원숭이(ENSMMUP00000027321)의 이용가능한 서열과 정렬하여 HER3 클론의 정확성을 체크했다.
닭 HER2 서열은 기준 서열 NM_001044661.1을 기초로 했다. 키메라 스왑 도메인 구성물을 닭 HER2 서열의 도메인 1에서 IV를 사람 I 도메인 I에서 IV로 스와핑하여 생성했다. myc 택을 함유하는 서열을 포유류 세포에서의 발현에 대해 최적화하고 Geneart에서 합성했다.
래트 HER3 서열은 기준 서열 NM_001044661.1을 기초로 했다. 키메라 스왑 도메인 구성물을 래트 HER3 서열의 도메인 1에서 IV를 사람 I 도메인 I에서 IV로 스와핑하여 생성했다. myc 택을 함유하는 서열을 포유류 세포에서의 발현에 대해 최적화하고 Geneart에서 합성했다.
HER2
및
HER3
과발현
셀라인의
생성
세포 표면에서 HER3를 높은 수준으로 발현하는 셀라인을 생성하기 위해 NotI 및 KpnI 효소절단 의해 전장 HER3을 절제하여 포유류 발현 벡터를 생성했다. 계속해서, 이 단편을 pcDNA3.1(-)/하이그로 벡터의 상응하는 부위에 클로닝했다. 네오마이신 내성 유전자를 암호화하는 전장 HER2 및 HER3 발현 벡터를 사용하여 세포 표면에서 HER2를 높은 수준으로 발현하는 셀라인을 생성했다. 형질도입 전에 플라스미드를 SSpI 및 FspI 효소절단에 의해 선형화했다. 두 벡터를 K562 세포에 따로 형질도입했고, 항생물질 선택 후 안정한 풀을 생성했다. 얻어진 셀라인(K562-HER2 및 K562-HER3)은 세포 표면에서 HER2 및 HER3를 높은 수준으로 발현했다.
면역화
HER2 면역화. 4개의 상이한 면역화 전략을 적용했다. 코호트 #A에 대해, 6마리 C57Bl/6 마우스를 복강내 주사를 통해서 200㎕의 HER2로 일시적으로 형질도입된 2x106 L929 세포로 면역화했다. 계속해서, 마우스를 제14일에 복강내 주사를 통해서 125㎕ Titermax Gold에 용해된 20㎍ Erbb-2-Fc(RND systems) 단백질로 부스트한 후, 제28일 및 제42일에 200㎕의 HER2로 일시적으로 형질도입된 2x106 L929 세포로 부스트했다. 코호트 #C에 대해, 6마리 C57Bl/6 마우스를 복강내 주사를 통해서 HER2로 일시적으로 형질도입된 2x106 L929 세포로 면역화했다. 계속해서, 마우스를 제14일에 복강내 주사를 통해서 200㎕의 HER2로 일시적으로 형질도입된 2x106 L929 세포로 부스트한 후, 제35일에 복강내 주사를 통해서 125㎕ Titermax Gold에 용해된 20㎍ Erbb-2-Fc 단백질로 단백질 부스트하고, 제49일에 복강내 주사를 통해서 200㎕ PBS에 용해된 20㎍ Erbb-2-Fc 단백질로 최종 부스트했다. 코호트 #E에 대해, 6마리 C57Bl/6 마우스를 복강내 주사를 통해서 125㎕ Titermax Gold에 용해된 20㎍ Erbb-2-Fc 단백질로 면역화했다. 계속해서, 제14일 및 제28일에 복강내 주사를 통해서 125㎕ Titermax Gold에 용해된 20㎍ Erbb-2-Fc 단백질로 단백질 부스트하고, 제42일에 복강내 주사를 통해서 200㎕ PBS에 용해된 20㎍ Erbb-2-Fc 단백질로 최종 부스트했다. 코호트 #G에 대해, 6마리의 C57Bl/6 마우스를 해당 프로토콜에 따라 Genovac(Freiburg, 독일)에서 DNA 백신접종에 의해 면역화했다. DNA 백신접종에 사용된 내독소-무함유 제공된 벡터는 pVax1에서 클로닝된 HER2의 경막 부분과 세포외 부분을 암호화했다. 계속해서, DNA 부스트를 제14일, 제28일 및 제66일에 수행했다.
HER3 면역화. 4개의 상이한 면역화 전략을 적용했다. 코호트 #B에 대해, 6마리(C57Bl/6) 마우스를 복강내 주사를 통해서 200㎕의 HER3로 일시적으로 형질도입된 2x106 L929 세포로 면역화했다. 계속해서, 마우스를 제14일, 제28일, 제49일 및 제63일에 200㎕의 HER3로 일시적으로 형질도입된 2x106 L929 세포로 부스트했다. 코호트 #D에 대해, 6마리 C57Bl/6 마우스를 제0일, 제14일 및 제28일에 복강내 주사를 통해서 HER3로 일시적으로 형질도입된 2x106 L929 세포로 면역화했다. 계속해서, 마우스를 제49일에 복강내 주사를 통해서 125㎕ Titermax Gold에 용해된 20㎍ Erbb-3-Fc 단백질로 부스트하고, 제66일에 복강내 주사를 통해서 200㎕ PBS에 용해된 20㎍ Erbb-3-Fc 단백질로 최종 부스트했다. 코호트 #F에 대해, 6마리 C57Bl/6 마우스를 복강내 주사를 통해서 125㎕ Titermax Gold에 용해된 20㎍ Erbb-3-Fc 단백질로 면역화했다. 계속해서, 마우스를 제14일 및 제28일에 복강내 주사를 통해서 125㎕ Titermax Gold에 용해된 20㎍ Erbb-3-Fc 단백질로 부스트하고, 제42일에 복강내 주사를 통해서 200㎕ PBS에 용해된 20㎍ Erbb-3-Fc 단백질로 최종 부스트했다. 코호트 #H에 대해, 6마리 C57Bl/6 마우스를 해당 프로토콜에 따라 Genovac (Freiburg, 독일)에서 DNA 백신접종에 의해 면역화했다. DNA 백신접종에 사용된 내독소-무함유 제공된 벡터는 pVax1에서 클로닝된 PDGFR의 경막 및 HER3의 세포외 부분을 암호화했다. 계속해서, DNA 부스트를 제14일, 제28일 및 제66일에 수행했다.
항체 역가의 결정
면역화된 C57Bl/6 마우스로부터의 혈청에서 항-HER2 역가를 ECD-Erbb-2 단백질(Bendermedsystems)에 대해서는 ELISA에 의해, HER2 음성 K562, HER2 저발현 셀라인 MCF-7 및 HER2 증폭 SKBR-3 및 BT-474 세포에 대해서는 FACS 분석에 의해 결정했다. 동물을 죽이기 전의 HER2 및 HER3에 대한 혈청 역가는 각각 표 1 및 표 2에 제시된다. 모든 코호트의 동물에서 HER2 또는 HER3에 대한 항체 반응이 발생했다.
림프양
조직의 회수
DNA로 백신화된 모든 마우스로부터 비장 및 배액 림프절을 제거했다(코호트 #G 및 #H). 모든 조직으로부터 단일 세포 현탁액을 생성한 후 조직을 Trizol 시약에서 세포용해시켰다. 코호트 #A에서 #F까지 차1 부스트 후 죽은 코호트 #C의 1마리 마우스를 제외하고 모든 마우스에서 비장을 제거했다. 모든 비장으로부터 단일 세포 현탁액을 생성했고, CD19 부화(코호트 #A, E, F) 또는 비-B 세포의 고갈(코호트 #B, C, D)에 의한 MACS 분리 과정을 사용하여 총 B 세포 분획을 분리했다.
면역화 마우스로부터 파지 디스플레이 라이브러리의 생성
하나의 파지 라이브러리를 각 마우스에 대해 구축했다. 이를 위해서, 그룹 당 모든 마우스(그룹 당 5 또는 6마리 마우스)로부터의 물질을 사용하여 다음의 접근법으로 파지 라이브러리를 제조했다. 각 개별 마우스로부터 RNA를 분리하고 cDNA를 합성하고 VH-패밀리 특이적 PCR을 수행했다. 계속해서, 마우스 당 모든 VH-패밀리 PCR 생성물을 정제하고, DNA 농도를 결정하고 효소절단하고, 공통-경쇄를 함유하는 파지 디스플레이에서 라이게이션하여 마우스-사람 키메라 파지 라이브러리를 생성했다. 모든 파지 라이브러리는 >106 클론을 함유했고, 삽입 빈도는 >85%였다.
HER2 및 HER3에 특이적으로 결합한 Fab 단편을 지닌 파지의 선택
항체 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 항체 단편을 선택했다. 면역화 라이브러리와 합성 라이브러리(de Kruif et al. Mol. Biol.(1995), 248, 97-105에 개시)를 선택에 사용했다.
HER2
파지 선택 및 스크리닝
파지 라이브러리를 VCS-M13 헬퍼 파지(Stratagene)로 구제하고 재조합 단백질 코팅된 이뮤노튜브(Nunc)에서 2회차의 라운드 동안 선택했다. 1차 라운드에서는 ECD-Erbb-2 단백질(Bendermedsystems)을 이뮤노튜브 위에 코팅했고, 2차 라운드에서는 Erbb-2-F(RND systems)를 이뮤노튜브 위에 코팅했다. 이뮤노튜브를 4% 비-지방 건조 밀크(ELK)로 차단했다. 파지 항체 라이브러리를 이뮤노튜브에 파지 라이브러리를 첨가하기 전에 4% ELK로 또한 차단했다. 이뮤노튜브의 코팅된 단백질과 파지 라이브러리의 인큐베이션을 회전 조건에서 실온으로 2시간 동안 수행했다. 다음에, 이뮤노튜브를 PBS 중의 0.05% Tween-20으로 5 내지 10회 세척한 후 PBS로 5 내지 10회 세척했다. 결합된 파지를 50mM 글리신(pH 2.2)을 사용하여 용출하고 이. 콜리(E. coli) XL-1 Blue에 첨가하고 37℃에서 인큐베이션했다. 계속해서, 감염된 박테리아를 암피실린, 테트라사이클린 및 글루코오스를 함유하는 아가 플레이트 위에 놓고 37℃에서 하룻밤 인큐베이션했다. 1차 라운드 후, 플레이트에서 콜로니를 긁어내어 조합한 후, 구제하고 증폭하여 부화된 1차 라운드 라이브러리를 제조했다. 다음에, 이 부화된 라이브러리를 상기 설명된 프로토콜을 사용하여 Erbb-2-Fc(RND systems)에 대해 선택했다. 2차 라운드 선택 후, 개별 콜론을 채집하고 구제하여 파지 모노클로날 미니프렙을 제조했다. 다음에, Erbb2에 결합한 양성 파지 콜론을 유방암 셀라인 BT-474와의 결합에 대해 FACS에서 확인했다. 모든 Erbb2 특이적 콜론의 VH 유전자를 시퀀싱했다. VH 유전자 재배열을 VBASE2 소프트웨어를 사용하여 확립해서 독자적 클론을 확인했다. 다음에, 모든 독자적 클론을 HEK293T 세포(음성 대조군), ErbB-2로 일시적으로 형질도입된 HEK293T 세포 및 BT-474 세포에 대한 결합에 대해 FACS에서 파지 포맷으로 테스트했다.
HER3
파지 선택 및 스크리닝
파지 라이브러리를 VCS-M13 헬퍼 파지(Stratagene)로 구제하고 재조합 단백질 코팅된 이뮤노튜브(Nunc)에서 2회차의 라운드 동안 선택했다. 두 선택 라운드에서, Erbb-3-Fc(RND systems)를 이뮤노튜브 위에 코팅했다. 이 융합 단백질의 Fc 부분을 향한 선택 편향을 극복하기 위해 Erbb-3-Fc에 대한 두 선택 라운드를 모두 150㎍/ml 사람 IgG의 존재하에 수행했다. 이뮤노튜브를 4% ELK로 차단했다. 파지 항체 라이브러리를 이뮤노튜브에 파지 라이브러리를 첨가하기 전에 4% ELK로 차단했다. 파지 라이브러리와의 인큐베이션을 회전 조건에서 2시간 동안 수행했다. 다음에, 이뮤노튜브를 PBS 중의 0.05% Tween-20으로 5 내지 10회 세척한 후 PBS로 5 내지 10회 세척했다. 결합된 파지를 50mM 글리신(pH 2.2)을 사용하여 용출하고 이. 콜리 XL-1 Blue에 첨가하고 인큐베이션했다. 계속해서, 감염된 박테리아를 암피실린, 테트라사이클린 및 글루코오스를 함유하는 아가 플레이트 위에 놓고 37℃에서 하룻밤 인큐베이션했다. 1차 라운드 후, 플레이트에서 콜로니를 긁어내어 조합하고, 파지를 구제하고 증폭하여 부화된 1차 라운드 라이브러리를 제조했다. 다음에, 이 부화된 라이브러리를 상기 설명된 프로토콜을 사용하여 Erbb-3-Fc(RND systems)에 대해 선택했다. 2차 라운드 선택 후, 개별 콜론을 채집하고 구제하여 파지 모노클로날 미니프렙을 제조했다. 양성 파지 콜론을 유방암 셀라인 BT-474와의 결합에 대해 FACS에서 확인했다. 모든 양성 클론의 VH 유전자를 시퀀싱했다. VH 유전자 재배열을 VBASE2 소프트웨어를 사용하여 확립해서 독자적 클론을 확인했다. 모든 독자적 클론을 TK562 세포(음성 대조군), 안정한 K562-HER3 세포 및 BT-474 세포에 대한 결합에 대해 FACS에서 파지 포맷으로 테스트했다. 총 36회 선택을 Erbb2 및 Erbb3 항원 포맷에 대해 수행했다. 모든 선택 스크리닝 과정은 HER2에 대해 지정된 89개의 독자적 Fab 클론과 HER3에 대해 지정된 137개의 독자적 Fab 클론을 가져왔다. Fab는 독자적인 VDJ 재조합 사건의 징표인, 독자적인 HCDR3 서열에 기초하여 독자적인 것으로 고려되었다. 일부 경우, HCDR3는 동일하지만 CDR1 및/또는 CDR2에 차이가 있는 클로날 변이체가 얻어졌다. 면역화 마우스 라이브러리로부터 친화성 변이체를 반영하는 VH 유전자에 치환을 함유하는 클로날 변이체들의 클러스터를 선택했다.
항체 선택/특성
모노클로날 항체의 생성
면역화 마우스 파지 라이브러리로부터 유래된, VH 유전자 서열 및 그것의 일부 서열 변이체에 의해 판단된 것과 같은, 독자적 항체의 VH 유전자를 백본 IgG1 벡터에 클로닝했다. 두 상이한 생산 셀라인인 HEK293T 및 293F FreeStyle 세포를 이 과정 동안 사용했다. 유착성 HEK293K 세포를 6-웰 플레이트에서 80% 컨플루언시까지 배양했다. 세포를 개별 DNA-FUGENE 혼합물로 일시적으로 형질도입하고 더 배양했다. 형질도입 후 7일째에 상청액을 수집하고 배지를 새로 교체했다. 형질도입 후 14일째에 상청액을 조합하고 0.22μM(Sartorius)을 통해서 여과했다. 이 멸균 상청액을 4℃에 보관했다. 현탁액 적응된 293F FreeStyle 세포를 T125 플라스크에 넣고 쉐이커 받침대에서 3.0x106 세포/ml의 밀도까지 배양했다. 24-딥 웰 플레이트의 각 웰에 0.3-0.5x106 생육성 세포/ml의 밀도로 세포를 파종했다. 세포를 개별 멸균 DNA:PEI 혼합물로 일시적으로 트랜스펙션하고 더 배양했다. 트랜스펙션 후 7일째에 상청액을 수집하고 0.22μM(Sartorius)을 통해서 여과했다. 이 멸균 상청액을 4℃에 보관했다.
이중특이적
항체의 생성
효과적인 헤테로다이머화 및 이중특이적 항체의 형성을 보장하는 특허등록된 CH3 기술을 사용하여 이중특이적 항체를 생성했다. 이 CH3 기술은 CH3 영역에 전하-기초 점 돌연변이를 사용하며, 이로써 이미 설명된 바와 같이 두 상이한 중쇄 분자가 효과적으로 페어링된다(PCT/NL2013/050294; WO 2013/157954 A1로서 공개).
기능적 스크리닝을 위한
IgG
정제
IgG의 정제를 친화성 크로마토그래피를 사용하여 소규모(< 500㎍), 중간 규모(<10 mg) 및 대규모(>10 mg)로 수행했다. 소규모 정제는 진공 여과를 사용하여 24-웰 필터 플레이트에서 멸균 조건하에 수행했다. 먼저, 배지의 pH를 8.0으로 조정하고, 이어서 소규모 준비물을 600rpm의 쉐이킹 플랫폼(Heidolph 플레이트 쉐이커) 위에서 단백질 A 세파로오스 CL-4B 비드(50% v/v)(Pierce)와 함께 25℃에서 2시간 동안 인큐베이션했다. 다음에, 진공 여과에 의해 비드를 수거했다. 비드를 PBS pH 7.4로 2회 세척했다. IgG를 0.1M 시트레이트 버퍼로 pH 3.0에서 용출시키고, 이 IgG 분획을 트리스 pH 8.0으로 즉시 중화시켰다. 멀티스크린 Ultracel 10 멀티플레이트(Millipore)를 사용하여 원심분리에 의해 버퍼 교환을 수행했다. 샘플은 PBS pH 7.4의 최종 버퍼 중에 존재했다.
HER2
/
HER3
특이적
IgG의
확인
FACS에서 BT 474, HEK293T 및 HEK293T 과발현 HER2 또는 HER3에 대한 결합에 대해 항체를 테스트했다. 따라서, 트립신을 사용하여 세포를 수집하고 FACS 버퍼(PBS/0.5% BSA/0.5mM EDTA) 중에 106 세포/ml로 희석했다. 1-2x105 세포를 U자형 바닥의 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가했다. 세포를 4℃에서 2분 동안 300g으로 원심분리했다. 플레이트(들)를 뒤집어 상청액을 버렸다. 각 IgG 샘플 50㎕를 10㎍/mL의 농도로 첨가하고 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 세포가 일단 원심분리되면 상청액을 제거하고 세포를 FACS 버퍼로 2회 세척했다. 희석된 1:100 마우스 항-사람 IgG PE(Invitrogen)를 50㎕를 첨가하고 암소 조건의 얼음 위에서 30-60분 동안 인큐베이션했다. FACS 버퍼를 첨가한 후, 세포를 일단 원심분리하고 상청액을 제거하고 세포를 FACS 버퍼로 2회 세척했다. HTS 환경에서 FACSCanto 유세포분석기에서 세포를 분석했다. 세포에 대한 항체의 결합을 평균 형광 강도(MFI)에 의해 평가했다.
비-특이적 결합 반응성을 테스트하기 위해 ELISA 분석을 사용했다. HER2 및 HER3 항체를 항원 피브리노겐, 헤모글로불린 및 파상풍 독소에 대한 반응성에 대해 테스트했다. HER2 및 HER3에 대한 특이적 결합을 테스트하기 위해, 항체를 EGFR, HER2, HER3 및 HER4의 정제된 재조합 세포외 도메인과의 결합에 대해 테스트했다. 항원을 MAXISORPTM ELISA 플레이트에 하룻밤 코팅했다. ELISA 플레이트의 웰을 37℃에서 1시간 동안 5% BSA를 함유하는 PBS(pH 7.2)로 차단했다. 선택된 항체를 PBS-2% BSA에 희석된 10㎍/mL의 농도에서 중복 테스트했고, 25℃에서 2시간 동안 결합하도록 했다. 대조를 위해 이 과정은 코팅된 항원에 특이적인 항체 및 음성 대조군 항체와 동시에 수행되었다. ELISA 플레이트를 PBS-T(PBS-0.05% v/v Tween-20)로 5회 세척했다. 결합된 IgG를 1:2000 희석된 HRP-콘쥬게이트(염소 항-마우스 BD)를 가지고 검출했고, 25℃에서 2시간 동안 결합하도록 방치했다. ELISA 플레이트를 PBS-T(PBS-0.05% v/v Tween-20)로 5회 세척했고, 결합된 IgG를 OD492nm 측정에 의해 검출했다.
HER2/HER3 특이적 IgG의 에피토프 그룹화
항-HER2 항체의 패널을 다른 종(마우스, 닭)으로부터 유래 된 HER2 ECD에 대한 반응성 및 HER2 분자의 특이적 도메인, 즉 도메인 I, II, III 및 IV에 대한 결합에 기초하여 키메라 구성물을 사용해서 분류했다.
항-HER3 항체의 패널을 다른 종(사이노몰거스, 래트)으로부터 유래 된 HER3 ECD에 대한 반응성 및 HER3 분자의 특이적 도메인, 즉 도메인 I, II, III 및 IV에 대한 결합에 기초하여 키메라 구성물을 사용해서 분류했다.
이 목적을 위해, CHO-K1 세포를 리포펙타민/DNA 믹스를 사용하여 관련 구성물로 일시적으로 형질도입했다. 키메라 스왑 도메인 구성물에서 닭 HER2 또는 래트 HER3의 도메인을 사람 대응부로 치환했다. 특이적 항체의 결합을 FACS에 의해 측정했다. 이 구성물의 발현을 항-myc 항체를 사용하여 확인했다. 트라스투주맙에 의한 FACS 염색이 도메인 IV에 대한 특이적 결합의 대조군으로 포함되었다. 각 그룹의 항체들은 염색 강도(MFI)에 기초하여 순위를 정할 수 있다.
65개 항체의 HER2 패널이 7개 그룹으로 맵핑될 수 있다(표 3).
1. 도메인 I 특이적(25)
2. 도메인 II 특이적(2)
3. 도메인 III 특이적(23)
4. 도메인 IV 특이적(7)
5. 도메인 IV 특이적이며 마우스에 대해 교차 반응성(2)
6. 모든 구성물에 대해 반응성(2)
7. 사람 HER2에만 반응성(4)
트라스투주맙과의 경쟁
HER2 도메인 IV에 맵핑된 2개의 항체는 SKBR-3 세포의 증식을 억제했다. 이 두 항체는 1개 아미노산 차이를 제외하고 유사한 CDR3을 공유했다. 한 항체 PG1849를 경쟁 ELISA에서 트라스투주맙과 경쟁하는 능력에 대해 조사했다. 이 ELISA에서, 15㎍/ml IgG 항체의 농도로 Fc-HER2를 코팅하고 인큐베이션했다. 15분 인큐베이션 후, 파지를 더 인큐베이션했다. 이후, 파지를 검출했다. 표 4는 ELISA 동안 신호의 상실이 나타나지 않았기 때문에 PG1849와 트라스투주맙이 HER2에 동시에 결합할 수 있음을 나타낸다. 실제 경쟁은 동일한 파지와 항체가 이 분석에서 경쟁되었을 때만 관찰되었다.
124개 항체의 HER3 패널이 5개의 그룹으로 맵핑될 수 있다(표 5):
1. 높은 도메인 III 반응성, 래트 및 마우스 반응성 및 도메인 IV에 대한 경미한 반응성(8)
2. 높은 도메인 III 반응성, 래트, 사람 및 사이노몰거스 반응성, 도메인 IV에 대한 경미한 반응성(8)
3. 래트, 사이노몰거스 및 사람 HER3에만 반응성(43)
4. 사람 HER3에만 반응성(32)
5. 모든 구성물에 대한 반응성(33)
셀라인
증식 분석
SK-BR-3 세포를 L 글루타민 및 10% 열 비활성화 FBS로 보충된 DMEM F/12에서 배양했다. BxPC-3-luc2 세포를 10% 열 비활성화 FBS로 보충된 RPMI1640에서 배양했다. MCF-7 세포를 NEAA 1mM 소듐 피루베이트, 4㎍/ml 인슐린 및 10% 열 비활성화 FBS로 보충된 RPMI1640에서 배양했다.
SK-BR-3 세포의 증식 분석을 위해, 서브컨플루언트 세포 배양물을 PBS로 세척하고, 트립신화하고, 배양 배지를 첨가하여 트립신을 비활성화했다. 세포를 배양 배지 중에 6x104 세포/ml로 희석했다. 항체를 10 및 1㎍/ml의 농도로 희석하고 96-웰 블랙 바닥 플레이트(ABgene AB-0932)에서 100㎕ 부피 중에 첨가했다. 세포를 6000 세포/웰의 밀도로 첨가했다. 세포를 37℃, 5% CO, 95% 상대습도에서 3일 동안 배양했다. 제조자의 지시에 따라서 Alamar Blue™(Invitrogen)를 첨가하고, 암소 조건의 37℃, 5% CO, 95% 상대습도에서 6시간 동안 인큐베이션했다. 550nm 여기 및 590nm 방출 파장에서 형광을 측정했다. 성장 억제 정도를 동일한 농도의 트라스투주맙과 비교했다(표 6).
MCF-7 및 BxPC-3-luc2 세포의 증식 분석을 위해, 서브컨플루언트 세포 배양물을 PBS로 세척하고, 트립신화하고, 배양 배지를 첨가하여 트립신을 비활성화했다. 세포를 다량의 분석 배지(0.05% BSA 및 10㎍/ml Holo-트랜스페린을 함유하는 RPMI 1640)로 2회 세척했다. MCF-7 세포를 배양 배지 중에 5x104 세포/ml로 희석했다. 항체를 10 및 1㎍/ml의 농도로 희석하고 96-웰 블랙 바닥 플레이트(ABgene AB-0932)에서 100㎕ 부피 중에 첨가했다. 세포를 1ng/ml 최종 농도의 사람 재조합 사람 NRG1-베타 1/HRG1-베타 1 EGF 도메인(396-HB-050 RND)의 존재하에 5000 세포/웰의 밀도로 첨가했다. 이후 사람 NRG1-베타 1/HRG1-베타 1 EGF 도메인은 HRG으로 지칭한다. 세포를 37℃, 5% CO, 95% 상대습도에서 5일 동안 배양했다. 제조자의 지시에 따라서 Alamar Blue™(Invitrogen)를 첨가하고, 암소 조건의 37℃, 5% CO2, 95% 상대습도에서 24시간 동안 인큐베이션했다. 550nm 여기 및 590nm 방출 파장에서 형광을 측정했다. 성장 억제 정도를 동일한 농도의 #Ab6과 비교했다(표 7).
BxPC-3-luc-2 증식 분석을 사용하여 이중특이적 항체를 스크리닝했다. BxPC-3-luc-2 세포를 배양 배지 중에 8x104 세포/ml로 희석했다. 항체를 10 및 1㎍/ml의 농도로 희석하고 96-웰 블랙 바닥 플레이트(ABgene AB-0932)에서 100㎕ 부피 중에 첨가했다. 세포를 10ng/ml 최종 농도의 사람 HRG의 부재 또는 존재하에 8000 세포/웰의 밀도로 첨가했다. 세포를 37℃, 5% CO, 95% 상대습도에서 4일 동안 배양했다. 제조자의 지시에 따라서 Alamar Blue™(Invitrogen)를 첨가하고, 암소 조건의 37℃, 5% CO, 95% 상대습도에서 4시간 동안 인큐베이션했다. 550nm 여기 및 590nm 방출 파장에서 형광을 측정했다. 엣지 효과를 최소화하기 위해, 96-웰 플레이트의 바깥쪽 웰은 PBS로 충분히 채웠다.
HER2
특이적
IgG의
친화성 순위
Devash(PNAS, 1990)에 의해 제시된 방법을 사용하여 제한된 항원-ELISA에서 항체의 순위를 결정했다. 감소된 항원 코팅 농도의 사용은 관찰된 교차 반응성 반응을 없애며, 고-친화성/결합성 항체를 검출하는데 사용될 수 있다. 따라서, 고체 지지체 상의 항원 농도를 점진적으로 감소시켜 약한 면역반응성을 조사했다. 2.5㎍/ml에서 시작하여 0.019㎍/ml까지 ECD-Erbb-2 단백질의 연속 적정물을 MAXISORP™ ELISA 플레이트에 하룻밤 코팅했다. ELISA 플레이트의 웰을 37℃에서 1시간 동안 5% BSA를 함유하는 PBS(pH 7.2)로 차단했다. 선택된 항체를 PBS-2% BSA에 희석된 10㎍/ml의 농도에서 중복 테스트했고, 25℃에서 2시간 동안 결합하도록 했다. 대조를 위해 이 과정은 코팅된 항원에 특이적인 항체 및 음성 대조군 항체와 동시에 수행되었다. ELISA 플레이트를 PBS-T(PBS-0.05% v/v Tween-20)로 5회 세척했다. 결합된 IgG를 1:2000 희석된 HRP-콘쥬게이트(염소 항-마우스 IgG, BD Bio-sciences)를 가지고 검출했고, 25℃에서 2시간 동안 결합하도록 방치했다. ELISA 플레이트를 PBS-T(PBS-0.05% Tween-20)로 5회 세척했고, 결합된 IgG를 OD492nm 측정에 의해 검출했다. PG1849, PG2916, PG2926, PG2930, PG2971, PG2973, PG3004 및 PG3031를 HER2 항원 적정 ELISA에서 테스트했다(도 1).
다양한 카파 경쇄를 가진 HER2 VH 유전자의 결합
상이한 파지 디스플레이 라이브러리로부터 유래된 HER2 VH의 결합을 조사하기 위해, HER2 항체의 패널을 다른 VK 카파 사슬의 내용물, 즉 MEHD7945A의 VL에서 클로닝하고 발현했다. 생성된 IgG에 대해 K562 세포 및 안정한 K562-HER2 세포에서 FACS 분석을 수행했다. 조합 라이브러리 및 비-조합 라이브러리로부터 유래된 VH 유전자가 표 8에 기재된다. VH 사슬 MF2971, MF3958, MF2916, MF2973, MF3004, MF3025, MF3031은 모두 공통 경쇄 IGKV1-39와 조합되었을 때 관찰된 것과 같이 유의한 항원 특이성 및 결합의 손실 없이 MEHD7945A 경쇄와 조합될 수 있었다. VH 사슬 MF1849는 변이체 카파 경쇄와 조합될 수 없었고 항원 특이성 및 결합을 보유할 수 없었다.
다른
HER2
및
HER3
항체
HER2 또는 HER3의 기능을 억제하는 항체가 본 분야에 알려져 있다. 추가의 항체를 공개된 정보에 따라서 구성했고 293F Freestyle 세포에서 발현했다. 항-HER2 항체 퍼투주맙 및 트라스투주맙을 US2006/0212956 A1(Genentech)에 개시된 정보에 기초하여 생성했다. 항-HER3 항체 #Ab6은 WO 2008/100624(Merrimack Pharmaceuticals, Inc.)에 개시된 정보에 기초했으며, IgG1 백본 벡터에 다시 클로닝했다. 1-53 및 U1-59 항-HER3 항체의 정보는 US 7,705,103 B2(U3 Pharma AG)에서 얻었다. 항-HER3 LJM716 항체의 정보는 US 2012/0107306에서 얻었다. 투-인-원 항-EGFR 항-HER3 항체 MEHD7945A의 구성을 위한 정보는 WO2010/108127에서 얻었다.
HER2xHER3
이중특이적
항체의 스크리닝
HER2 및 HER3 항체 패널로부터의 VH를 하전 조작된 벡터에 다시 클로닝함으로써, 항체 중쇄의 발현시 중쇄의 헤테로다이머화가 강제되어 형질도입 후 이중특이적 항체가 생성된다. 이중특이적 IgG 포맷으로 HER2 및 HER3 팔을 조합하는데 다음과 같은 3가지 상이한 전략이 사용되었다:
1. HER2(리간드 독립적 성장 차단) x HER3(리간드 독립적 성장 차단)
2. HER2(리간드 독립적 성장 차단) x HER3(리간드 의존적 성장 차단)
3. 상이한 에피토프 상자로부터의 HER2 x HER3(리간드 의존적 성장 차단)
일부 이중특이적 조합에서, 그룹 2 및 3에서 생성된 항체는 그룹 1과 중복되었다.
24-웰 포맷에서 총 495개의 이중특이적 항체를 생성하고 정제했다. 모든 항체를 HER2- 및 HER3-발현 췌장 BxPC-3-luc-2 셀라인(Caliper)의 증식을 억제하는 능력에 대해 테스트했다. 항체의 효능을 블랙 앤 화이트 스크리닝에서 HRG-의존적 및 HRG-독립적 환경에서 결정했으며, 이때 항체는 10 및 1㎍/ml의 농도로 존재한다. 트라스투주맙이 기준 항체로서 포함되었고, 음성 대조군 항체도 동일한 농도로 사용되었다. 1㎍/ml에서 상위 80개 HER2xHER3 이중특이적 항체의 기능적 활성이 도 2에 도시된다(조합된 억제에 기초하여).
양성 대조군 항체와 비교하여 더 높은 억제 활성을 나타낸 항체(총 40개)를 선택하고 재현하고 24-웰 포맷에서 정제했고, 블랙 앤 화이트 BxPC-3-luc-2 스크린에서 10 및 1㎍/ml 농도로 다시 테스트했다. 이들 항체를 HRG-의존적 MCF-7 분석에서 더 적정했고, 트라스투주맙과 퍼투주맙(1:1)의 조합 및 음성 대조군 항체와 비교했다. 도 3은 모 HER3 항체 및 트라스투주맙 + 퍼투주맙의 조합과 비교하여 3개 이중특이적 항체의 적정 곡선의 예를 도시한다. 모노클로날 모 항체는 상부 패널에 도시되고, 이중특이적 항체는 하부 패널에 도시된다(도 3).
이중특이적 항체, 모노클로날 및 비교제 항체의 IC50을 Prism 소프트웨어를 사용하여 비-선형 회귀 분석에 의해 계산했다. Graph Pad 소프트웨어는 MCF-7 분석에서의 이중특이적 항체의 IC50 값과 BxPC3 분석에서의 이들의 억제 활성을 비교를 위해 나열한다. 12개 HER2xHER3 이중특이적 항체의 패널은 트라스투주맙 + 퍼투주맙과 비교하여 더 강력한 억제 활성을 가졌다. 또한, 이중특이적 항체는 모노클로날 모 PG3178과 동등하거나 더 강력했다(표 9).
리간드 의존적 세포 성장을 억제했던 이중특이적 항체들은 HER3 팔 3178, 3163, 3099 및 3176과 조합된 HER2 팔로 이루어졌다. 가장 강력한 이중특이적 항체의 HER2 및 HER3 팔은 둘 다 리간드-독립적 SKBR-3 증식(HER2 및 HER3 팔 둘 다)(표 6) 또는 리간드-의존적 MCF-7 증식(HER3 팔)(표 7)을 또한 억제할 수 있는 2가 모노클로날이었다. 대다수의 강력한 항체는 항-HER3 항체 3178과 조합된 도메인 I을 인식하는 HER2 팔로 이루어졌다.
BxPC-3-luc2 종양 성장의 억제
표 9에 제시된 항체들을 BxPC-3-luc2 췌장 이종이식편 모델에서 테스트했다. BxPC-3-luc2 셀라인은 HER2와 HER3을 둘 다 발현하며, HER2 저 발현 셀라인으로 간주된다. 연구 시작시에 8-10주령인 CB17 SCID 암컷 마우스를 20μl의 1x106 종양 세포로 췌장에서 동소이식 방식으로 이식했다. 이 목표를 위해, 마우스를 마취하고 오른쪽 옆으로 눕혀서 왼쪽 옆을 노출시키고, 좌측 옆구리 영역에 0.5cm 절개부를 만들었다. 췌장과 비장을 적출하고 20μl의 1x106 종양 세포를 췌장 꼬리부의 피막밑 공간에 주사했다. 이식 후 1주째에 바이오루미네슨스(BLI) 데이터를 생성했다. 영상화 15분 전에 모든 마우스에게 150mg/kg 루시페린(D-루시페린-EF 칼륨염, Cat. #E6552, Promega)을 복강내 주사했다. BLI 영상화는 레프트 사이트 뷰를 사용하여 주 1회 또는 2회 수행했다. BLI/종양 부피에 기초하여 벗어난 동물은 제외했고, 마우스를 7마리씩 그룹으로 무작위 분배했다. 실험 8일째에 치료를 시작했다. 항체 치료 그룹의 동물은 30mg/kg 항체를 3주 연속하여 주 1회 투약했다(0, 7, 14 및 21일). 치료 제0일에 동물은 로딩 용량, 즉 60mg/kg 항체를 2회 투여받았다. 최종 영상화는 제31일에 수행했다.
2개의 BxPC-3-luc2 이종이식편 모델을 이중특이적 항체와 모 항체의 상이한 패널에서 작업했다. 첫 번째 BxPC-3-luc2 이종이식편 모델에서(도 4), 한 그룹은 음성 대조군 항-RSV 항체(Ctrl IgG)를 투여받았고, 다른 그룹은 대조군 항체 트라스투주맙을 투여받았고, 또 다른 그룹은 양성 대조군 항체 트라스투주맙 + 퍼투주맙(1:1 v/v)을 투여받았다. 7개의 나머지 그룹은 모노클로날(PG) 또는 이중특이적(PB) 항체 PG3004, PG3178, PB3566, PB3710, PB3443, PB3448 및 PB3441 중 하나를 투여받았다. 이중특이적 항체의 조성에 대한 상세한 내용은 표 9에 나타낸다.
테스트된 모든 5개 이중특이적 항체는 종양 성장을 억제할 수 있었다. 이중특이적 HER2xHER3 항체 치료된 동물의 평균 종양 질량(BLI)은 트라스투주맙 + 퍼투주맙의 조합으로 치료된 동물에서와 유사했다(도 4).
두 번째 BxPC-3-luc2 이종이식편 모델에서(도 5), 한 그룹은 음성 대조군 항-RSV 항체(Ctrl IgG)를 투여받았고, 다른 그룹은 양성 대조군 항체 트라스투주맙 + 퍼투주맙(1:1v/v) 조합을 투여받았다. 5개의 나머지 그룹은 항체 PG3163, PB3986, PB3990, PB4011 및 PB3883 중 하나를 투여받았다. 이중특이적 PB 항체에 대한 상세한 내용은 표 9에 나타낸다. 이들 이중특이적 항체는 동일한 HER2 팔 MF2971과 조합된 3개의 상이한 HER3 결합 팔과 HER3 결합 팔 MF3163과 조합된 추가의 HER2 팔을 함유했다. 이 실험에서, 대조군 그룹의 종양은 동일한 수준의 가속된 성장을 나타내지 않았으며, 이것은 첫 번째 실험의 결과 해석과 마찬가지였다. 그렇지만, 트라스투주맙 + 퍼투주맙과 비교하여, PB3883 및 PB3990 HER2xHER3 이중특이적 항체는 유사한 억제 활성을 가졌다(도 5). 생체내 및 시험관내 데이터에 기초하여, HER2 팔이 MF2971, MF3004, MF1849로 이루어지고 HER3 팔이 MF3178로 이루어진 이중특이적 항체의 패널을 선택했다. MF2971 및 MF3004 팔은 마우스 기원의 것이며 사람화되었다.
모노클로날
모 항체와 비교한
이중특이적
HER2xHER3
항체의 결합
모 대응물과 비교하여 HER2xHER3 이중특이적 항체의 결합을 FACS 분석에 의해 결정했다. FACS를 2.5㎍ g/ml - 0.01㎍ g/ml의 범위의 항체의 연속 적정물을 사용하여 BxPC-3-luc2 세포 및 MCF-7 세포에 대해 수행했다. 테스트된 항체 패널은 이중특이적 항체 PB3566와 그것의 모 항체, 항-HER3 항체 PG3178 및 항-HER2 항체 PG3004로 이루어졌다. MFI 데이터를 플롯팅했으며, 두 셀라인에 대한 그래프는 이중특이적 항체 PB3566이 항-HER3 항체 PG3178 및 항-HER2 항체 PG3004와 비교하여 두 종양 셀라인에 대해 더 효과적으로 결합한다는 것을 보여준다(도 6).
MF2971 및 MF3004의
사람화
MF2971 및 MF3004를 본 분야에 공지된 기술에 따라서 사람화했다. MF2971의 총 7개의 사람화된/탈면역화된 변이체 서열을 모노클로날로서, 그리고 HER3-특이적 항체 MF3178과의 이중특이적 포맷 조합으로 발현, 검증, 및 시험관내 특성화했다. MF3004의 7개 변이체 서열에 대해서도 동일하게 적용했으며, 이들은 7개 MF2971 변이체에서 MF2971의 HCDR3을 MF3004의 HCDR3로 치환하여 생성되었다. 모든 사람화된 변이체의 발현, 완전성, 열 안정성 및 기능적 활성을 분석했다. 제조, 완전성, 안정성 및 기능적 완전성에 기초하여, MF2971(2971-var2)의 변이체를 MF3178을 가진 이중특이적 포맷에서 사용될 수 있는 VH의 최적의 사람화된 변이체로서 선택했다. 이 2971-var2를 MF3958로 명명했다. 이중특이적 HER2xHER3 조합 MF3958xMF3178이 PB4188을 제공했다.
PB4188의 대규모 제조, 정제 및 분석 연구
현탁액 적응된 293F Freestyle 세포를 3.0x106 세포/ml의 밀도가 될 때까지 쉐이커 받침대에서 Erlenmeyer 플라스크에서 배양했다. 세포를 4L Erlen 플라스크에 0.3-0.5x106 생육성 세포/ml의 밀도로 파종했다. 세포를 개별 멸균 DNA:PEl 혼합물로 일시적으로 형질도입하고 더 배양했다. 형질도입 후 7일 뒤에 이중특이적 항체를 함유하는 컨디셔닝 배지를 1000g에서 5분 동안 저속 원심분리한 후, 4000g에서 5분 동안 고속 원심분리하여 수거했다. 수거된 컨디셔닝 배지를 약 600ml로 5 kDa Satorius Hydrosart 카세트 위에서 농축하고, 이어서 4L PBS에서 정용여과했다. 항체를 ~35ml MabSelectSure XL(11℃)로 칼럼에 결합시켰다. 150ml PBS, 1 M NaCl을 함유하는 150ml PBS, 100ml PBS로 역류 방식으로 칼럼을 세척하여 A-특이적으로 결합된 단백질을 제거했다. 결합된 항체를 역류 방식으로 100mM 시트레이트 pH 3.0을 사용하여 용출했고, 5ml 분획을 중화를 위해 4ml Tris pH 8.0을 함유하는 10ml 튜브에 수집했다. 용출된 항체를 Superdex 200 50/1000을 사용하여 겔-여과에 의해 더 정제했다. 정제된 항체를 0.22㎛ 주사기 필터를 사용하여 필터 멸균했다. OD280 측정에 의해 IgG 농도를 결정했고, 아미노산 서열에 기초하여 단백질 농도를 계산했다. 단백질을 응집(HPSEC), 순도(SDS-PAGE, nMS, IEX 및 IEF)에 대해 테스트했다. 단백질 샘플은 -80℃에 보관했다.
분석 및 이종이식편 연구를 위한 IgG 정제
AKTA 100 Explorer에서 HiTrap MabSelect Sure 칼럼 및 HiTrap 탈염 칼럼을 사용하여 중간 규모 정제를 수행했다. 샘플을 5 ml/min로 로딩했다. 칼럼을 2 칼럼 부피의 PBS로 세척했다. 0.1 M 시트레이트 버퍼로 pH 3.0에서 IgG를 용출했다. 다음에, 샘플을 탈염하고 PBS pH 7.4의 최종 버퍼 중에서 마무리했다. IgG를 0.45μM 필터(Sartorius)를 통해서 여과했다. IgG 농도를 단백질 A 센서를 가진 Octet를 사용하여 측정했다. 단백질을 응집(HPSEC), 순도(SDS-PAGE, nMS, IEX 및 IEF)에 대해 테스트했다. 단백질 샘플은 -80℃에 보관했다.
PB4188의 분석 특징
PB4188(MF3958xMF3178)을 HP-SEC 및 CIEX-HPLC(TSK 겔-STAT 7μm 칼럼, 4.6 mm ID x 10cm L)에 의해 분석했다. PB4188의 분석 프로파일은 보통의 단일특이적 IgG1, 예컨대 모 HER2 팔 PG3958 및 항-RSV 모노클로날 대조군 항체와 일반적으로 일치했다(도 7).
친화성 결정
재조합 HER2 및 HER3에 대한 PB4188 및 PB3448의 1가 결합 친화성을 SPR (Biacore T100)에 의해 결정했다. Biacore™ T100(GE Healthcare, Uppsala, 스웨덴)을 사용하여 실험을 수행했다. 센서 표면 제조 및 상호작용 분석은 25℃에서 수행했다. 버퍼 및 Biacore 시약은 GE Healthcare에서 구입했다.
ErbB2-Fc 및 ERbB3-Fc(RND)을 500 RU의 표적 고정 수준으로 포타슘 아세테이트 버퍼(pH 5.5) 중에서 CM5 센서 칩의 표면에 코팅했다. 전개 버퍼는 HBS(hepes-완충 식염수: 10mM HEPES pH 7.4, 150mM NaCl, 0.005% Tween-20; 0.2μm 필터 멸균)였다. 이중특이적 항체를 HBS 중에 100, 50, 20, 10, 1 및 0.1 nM로 희석하고, CM5 센서 칩의 항원-결합 표면 위에서 높은(30μl/min) 유속으로 전개시켰다. BIA 평가 소프트웨어에 의한, 1:1 1가 상호작용에 대한 곡선 피팅 모델을 사용하여 HER2 팔 친화성(1가 상호작용)을 결정할 수 있다. HER3 팔은 로우-오프(low-off) 속도로 인해 친화성이 결정될 수 없었다. HER3 팔의 친화성을 결정하기 위해, PB4188을 500 RU의 표적 고정 수준으로 CM5 센서 칩에 코팅했다. Her2-Fc 및 Her3-Fc 항원을 HBS 중에 100, 50, 20, 10, 1 및 0.1 nM로 희석하고, PB4188 표면 위에서 높은 유속(40μl/min)으로 전개시켰다. kon 및 koff 값을 결정하기 위해, 센서 칩 표면에 1가 분자가 코팅되고 ErbB3-Fc 항원이 2가 분자인 것을 고려한 모델과 함께 BIA 평가 소프트웨어를 사용했다. PB4188 및 PB3448의 친화성은 표 10에 나타낸다.
세포 상에서의 PB4188 친화성 결정
BT-474 및 SK-BR-3 세포를 사용하여 정류 상태 세포 친화성 측정을 통해 결합 친화성을 또한 결정했다. 다음과 같은 4개의 IgG를 분석했다: 1) 항-HER2 항체 3958 및 항-HER3 항체 3178를 함유하는 PB4188(이중특이적 HER2xHER3); 2) 항-HER3 항체 3178 및 항-TT(파상풍 톡소이드) 항체 1337를 함유하는 PB9215(이중특이적 HER3xTT); 3) 항-HER2 항체 3958 및 항-TT 항체 1337를 함유하는 PB9216(이중특이적 HER2xTT); 4) 허셉틴(단일특이적 HER2). IgG를 IODO-GEN® 예비코팅 요오드화 튜브(Pierce) 및 관련 설명서를 사용하여 125I로 방사성활성 표지했다. 표지된 IgG를 25mM Tris-HCl, 0.4M NaCl, 0.25% BSA, 5mM EDTA, 0.05% NaN3 중에 ~1-2 x 108 cpm/ml의 활성으로 희석했다. 단백질 농도를 BCA 단백질 분석 키트(Pierce)를 사용하여 결정했다. BT-474 및 SK-BR-3 세포를 사용한 표지된 및 비-표지 IgG의 유세포분석은 표지화 후 결합에는 감소가 없거나 아주 적은 감소 징후만 있음을 나타냈다. 정류 상태 세포 친화성 측정을 다음과 같이 수행했다. 세포를 96-웰 플레이트에 파종하고 다양한 농도의 표지된 IgG와 함께 4℃에서 인큐베이션했다. 미결합 방사성활성을 4시간 후 제거했고, 세포-결합된 방사성활성을 감마 웰 카운터를 사용하여 측정했다. 수용체-차단 농도(100배 과량)의 비-표지 항체를 첨가하여 비-특이적 결합을 측정했다. 각 조건은 3번 중복하여 테스트했고, 항체 당 3회의 독립적 실험을 수행했다. Prism 6.0d(GraphPad Software)을 사용하여, 비-특이적 결합에 대해 보상된 비-선형 회귀 모델에 기초하여 KD 값을 계산했다. 두 셀라인에 대한 HER2xHER3 IgG(PB4188)의 결합에 대해 피팅 곡선을 포함하는 그래프가 도 20에 제시된다. 평균값을 포함하는, 모든 24회 분석에 대한 KD 데이터는 표 12에 제시된다.
요약하면, BT-474 및 SK-BR-3 세포를 사용하여 결정된 평균 KD 값은 각각 HER2xHER3에 대해 3.2 및 2.0 nM; 허셉틴에 대해 3.7 및 1.3 nM; HER2xTT에 대해 3.9 및 2.3 nM; 및 HER3xTT에 대해 0.23 및 0.99 nM였다. 따라서, PB4188은 HER2와 비교하여 HER3에 대해 더 높은 친화성을 나타내며, 이것은 HER3와 비교하여 더 높은 친화성을 가진 HER2를 표적으로 하는 HER2xHER3 이중특이적 분자 MM-111과 대조적이다.
HER2
증폭된 유방암 세포에 대한 항-증식 활성
연 한천 중
JIMT
-1
PB3448 및 PB4188을 연 한천에서 트라스투주맙 내성 JIMT-1의 성장을 억제하는 효능에 대해 테스트했다. 이 목표를 위해, 96-웰 현탁 세포 배양물 플레이트를 제조했다. 100μL의 연 한천 바닥층(완전 배지 중 0.6% 최종 농도)을 붓고 고화되도록 두었다. 다음에, 10,000 JIMT-1 세포/웰을 함유하는 50μL의 연 한천 상부층(0.4% 최종 농도)을 위에 첨가하여 고화시키고, 이러한 96-웰 플레이트를 37℃, 10% CO2에서 하룻밤 인큐베이션했다. 다음날, 음성 대조군 항체, 퍼투주맙 + 트라스투주맙(1:1 v/v), PB3448 및 PB4188을 10-0,003μg/ml 범위의 반-log 적정물로 DMEM 배지에 첨가했다. 계속해서, 이 분석물을 8일 동안 세포 배양 인큐베이터에서 인큐베이션했다. 마지막으로, 세포를 37℃에서 3-5시간 동안 알라마르 블루와 함께 인큐베이션했고, 형광 강도를 결정했다(여기: 560nm; 방출: 590nm). PB3448 및 PB4188에 의한 JIMT-1 증식의 용량 의존적 억제의 예가 제시된다(도 8).
매트리겔 중 BT-474 및 SKBR-3
PB3448 및 PB4188을 BT-474 및 SKBR-3 세포의 성장을 억제하는 효능에 대해 테스트했다. 세포는 네덜란드의 Leiden에 있는 Ocello에서 시험되었는데, 이 회사에서는 3-차원 매트리겔에서 세포를 성장시키고 주 성분 분석을 사용하여 처리된 세포로부터 미처리 세포를 구별한다. 2000개의 SK-BR-3 또는 2250 BT474 세포를 384-웰 플레이트(Greiner 781091)의 웰 당 15㎕ 매트리겔 중에 파종했다. 다음날, 항체의 10 내지 0.003μg/ml 범위의 반-log 적정물을 5ng/ml HRG의 부재 또는 존재하에 배양 배지에 첨가했다. 테스트 항체는 음성 대조군 항체, 퍼투주맙 + 트라스투주맙(1:1 v/v), PB3448, PB4188 및 이중특이적 항-EGFRxHER3 투-인-원 항체 MEHD7945A를 포함했다. 또한, HRG의 용량-의존적 적정물이 양성 대조군으로 포함되었다. 각 용량을 4번 중복 테스트했다. 세포를 37℃, 10% CO2에서 세포 배양 인큐베이터에서 7일 동안 인큐베이션했다. 다음날, 세포를 고정하고, 세포의 액틴 세포골격을 팔로이딘으로 염색하고, 핵은 Hoechst로 염색했다. 다음에, 겔을 통해 상이한 수준(Z-스택)에서 형광 영상을 촬영했고 영상들을 중첩시켰다. 광범위한 형태적 특징들을 측정했다(총 800개). 배지와 HRG 처리 사이에 차이가 있는 특징들만 분석을 위해 선택했다. 성장, 평균 구체 면적 및 구체 당 핵과 관련된 특징이 배지와 HRG 처리 사이에 가장 유의한 차이였다. 다중 변수 및 단일 변수 분석을 모두 수행했다. 단일 변수 측정에서, t-테스트를 수행하여 처리(HRG 또는 항체)와 배지를 비교했다. 각 포인트에 대한 P-값을 결정했다. 변동성의 대부분을 캡처한 고-차원 데이터의 저-차원 조합을 발견하기 위한 방법인 주 성분 분석(PCA)을 항체 농도와 관련하여 사용했고, 데이터를 플롯팅했다. 도 9는 HRG의 존재하에 퍼투주맙 + 트라스투주맙(1:1 v/v), PB3448 및 PB4188의 효과를 증명한다. HER2 증폭된 두 유방암 셀라인에서, PB4188은 HRG의 존재하에 퍼투주맙 + 트라스투주맙, PB3448 및 투-인-원 항체 MEHD7945A와 비교하여 뛰어난 활성을 나타냈다.
HER2
증폭된 유방암 세포에 대한
HRG의
존재하에 PB4188의 뛰어난 항-증식 활성
10ng/ml HRG의 존재하에 SKBR-3 및 BT-474에 대한 PB4188의 활성을 HER2, HER3 항체 및 이들의 조합의 패널과 비교했다. 이 분석은 상기 설명된 대로 매트리겔에서 수행되었고, 형태적 특징이 분석되었다. 도 10a에 도시된 PCA 데이터는 매트리겔에서 SKBR-3 세포의 HRG-유도 증식 및 분기/침범을 나타낸다. 도 10b는 항체 PB4188이 HRG 유도 표현형을 완전히 반전시킬 수 있지만, 모노클로날 모 항체(PG3958 + PG3178)의 조합은 효과가 없다는 것을 나타낸다. 더욱이, PB4188은 테스트된 모든 항-HER3 항체와 비교하여 훨씬 더 효과적이었다(도 10c). 또한, 개별 항-HER3 항체와 트라스투주맙(전이성 유방암(mBC)의 현재 표준 치료)의 조합도 HRG 유도 표현형을 반전시킬 수 없었다(도 10d). HRG의 존재하에 PB4188에 트라스투주맙의 첨가는 PB4188 단독과 비교하여 SK-BR-3 세포의 증식 및 분기/침범을 감소시켰다(도 10e).
HER2 및 HER3 모노클로날 항체와 비교하여 HER2 증폭 위암 세포에 대한 PB4188의 뛰어난 항-증식 활성
NRG1-β1 상향조절은 HER2 표적화 요법에 대한 핵심 내성 기전이다(Wilson, 2012). NRG1-β1의 상향조절이 PB4188의 항-증식 효능을 방해하는지의 여부를 평가하기 위해, 항체의 패널을 N87(HER2 증폭) 위암 셀라인에 대해 100ng/ml HRG에서 테스트했다. N87 세포를 10% 열 비활성화 FBS로 보충된 RPMI 1640에서 배양했다. 증식 분석을 위해, N87 세포의 서브컨플루언트 세포 배양물을 트립신화된 PBS로 세척하고, 배양 배지를 첨가하여 트립신을 비활성화했다. 세포를 다량의 분석 배지(0.05% BSA 및 10μg/ml Holo-트랜스페린을 함유하는 RPMI 1640 배지)로 2회 세척했다. 항체를 1-0.0001μg/ml에서 변하는 반-log 적정물로 희석했다. 세포를 100ng/ml의 최종 농도의 HRG의 존재하에 10000 세포/웰의 밀도로 첨가했다. 세포를 37℃, 5% CO2, 95% 상대습도에서 3일 동안 배양했했다. 제조자의 지시에 따라서 Alamar Blue™(Invitrogen)를 첨가하고, 암소 조건의 37℃, 5% CO2, 95% 상대습도에서 6일 동안 인큐베이션했다. 550nm 여기 및 590nm 방출 파장에서 형광을 측정했다. PB4188은 항-HER2 또는 항-HER3 모노클로날 항체에 비해 뛰어난 활성을 나타냈다(도 11).
HER2XHER3
이중특이적
항체의
ADCC
유도
ADCC 활성은 암에서 치료 항체의 중요한 항-종양 작용 기전이다. 세툭시맙 및 트라스투주맙과 같은 HER 수용체 패밀리에 대해 지정된 사람 모노클로날 항체는 ADCC를 유도한다. PB4188 및 PB3448의 베이스라인 및 증진된 ADCC 활성을 검증된 시험관내 ADCC 분석에서 결정했다. 이 실험에서는 트라스투주맙 및 음성 대조군 항체를 대조군 항체로 포함시켰다. 전혈 및 PBMC 분획을 건강한 도너로부터 얻었다. 각 항체를 HER2 고(SK-BR-3) 및 HER2 저(MCF-7) 발현 표적 세포에 대해 테스트했다. 표적 세포에 51Cr(Amersham)를 로딩하고 나타낸 항체 농도로 옵소닌화했다. 전혈 또는 PBMC 분획을 RPMI 1640 + 10% 열 비활성화 FCS에서 200㎕ 반응물에 이펙터 세포로 사용했다. 세포를 4시간 동안 함께 인큐베이션하고, γ-신틸레이터를 사용해서 상청액에서 방사성활성을 측정하여 세포용해를 추정했다. 특이적 세포용해의 퍼센트를 다음과 같이 계산했다: (실험 cpm - 기저 cpm)/(최대 cpm - 기저 pm) x 100, 최대 세포용해는 5% Triton X-100의 존재하에 결정되었고, 기저 세포용해는 항체 및 이펙터의 부재하에 결정되었다. 도 12에 나타낸 대로, 이중특이적 항체 PB3448은 퍼투주맙 + 트라스투주맙 조합과 비교하여 유사한 ADCC 활성을 나타냈다. 이중특이적 항체 PB4188은 높은 항체 농도(10㎍/ml)에서 효과적이었다.
모 항체의 조합과 비교한
HER2XHER3
이중특이적
항체의 더 높은
ADCC
상이한 ADCC 셋업에서 ADCC Reporter Bioassay(Promega)를 사용했다. 이 Bioassay는 FcγRIIIa 수용체, V158(고 친화성) 또는 F158(저 친화성) 변이체를 안정하게 발현하는 조작된 Jurkat 세포, 및 반딧불이 루시페라아제의 NFAT 반응 요소 추진 발현을 사용한다. 이 분석을 ADCC Reporter Bioassay에서 얻어진 데이터를 고전적 51Cr 방출 분석과 비교함으로써 검증했다. ADCC 분석을 384 화이트 웰 플레이트를 사용하여 Promega ADCC Bioassay 키트에서 수행했다. 이 실험 셋업에서, 바이오분석 20-24시간 전에 SKBR-3 세포를 30㎕ 분석 배지(4% 저 IgG 혈청을 가진 RPMI)에 1000 세포/웰의 밀도로 평판했다. 다음날, 배양 배지를 제거했다. 다음에, 항체, PB4188 및 그것의 모 항-HER2 PG3958 및 항-HER3 PG3178뿐만 아니라 이들의 조합의 연속 희석물을 중복 생성했다. 10μl 항체 희석물을 웰에 첨가했다. 항체의 출발 농도는 10μg/ml였고, 10 포인트 반-log 배수 연속 희석물을 생성하여 완전한 용량-반응 곡선을 제공했다. 마지막으로, 5μl의 ADCC Bioassay 이펙터 세포(15000 세포/웰, V158)를 첨가했다. 세포를 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션했다. 다음에, 15μl BIO-Glo 루시페라아제 기질을 첨가하고, 5분 후 발광을 플레이트 리더에서 검출했다. 얻어진 데이터는 도 13에 도시된다. PB4188 이중특이적 항-HER2xHER3 항체는 모 HER2 및 HER3 모노클로날 또는 이들의 조합과 비교하여 더 높은 ADCC 효능을 나타냈다.
PB4188의 ADCC 증진
ADCC 활성은 상이한 기술에 의해 증진될 수 있으며, 그 중 하나는 푸코오스의 제거이다. 푸코오스의 제거는 몇몇 생체내 모델에서 증가된 항-종양 활성을 가져왔다(Junttila, 2010). PB4188 활성을 최대화하기 위해 에이푸코실화 기술을 적용했으며(Cheng Liu and andreia Lee. ADCC Enhancement Technologies for Next Generation Therapeutic Antibody. Antibody therapeutics-Trends in Bio/Phar-maceutical Industry 2009 [13-17]), 이로써 Fc 영역에서 N-결합 탄수화물 구조의 푸코실화를 방지했다. 야생형 PB4188와 비교하여 에이푸코실화된 PB4188의 ADCC 효능을 HER2 저 발현 세포(MCF-7) 및 HER2 증폭 세포(SK-BR-3)를 사용하여 ADCC 51Cr 방출 분석에서 결정했다. 두 항체를 모두 연속 희석물에 적용했고, 음성 대조군 항체 및 트라스투주맙이 이 분석에 포함되었다. 도 14는 고 및 저 HER2 발현 세포에서 야생형 버전 및/또는 트라스투주맙과 비교하여 에이푸코실화된 PB4188의 ADCC 효능의 증가를 나타낸다.
저 친화성
FcγRIII
수용체에서의
에이푸코실화된
PB4188의 뛰어난
ADCC
활성
에이푸코실화된 PB4188 활성을 V158(고 친화성) FcγRIIIa 수용체 변이체 또는 F158(저 친화성) FcγRIIIa 수용체 변이체를 함유하는 ADCC 리포터 세포에서 테스트했다. 항체, 즉 대조군 항체, 트라스투주맙 및 에이푸코실화된 PB4188의 연속 적정물을 유착성 SK-BR-3 세포에 상이한 FcγRIIIa 변이체를 숨기고 있는 ADCC 리포터 세포와 조합하여 첨가했다. 루시페라아제 활성을 측정하여 ADCC 활성을 측정했다. 에이푸코실화된 PB4188은 고 친화성 V158 FcγRIIIa 수용체 변이체와 조합하여 트라스투주맙에 비해 동등한 활성을 나타냈다. 대조적으로, 에이푸코실화된 PB4188은 저 친화성 F158 FcγRIIIa 수용체 변이체와 조합하여 트라스투주맙에 비해 뛰어난 ADCC 활성을 나타냈다(도 15).
JIMT
-1
이종이식편
연구
JIMT-1 사람 유방암종 세포를 10% 태아 소 혈청, 100 유닛/mL 페니실린 G 소듐, 100μg/mL 스트렙토마이신 설페이트, 25μg/mL 겐타마이신, 및 2mM 글루타민을 함유하는 DMEM에서 이식할 때까지 성장시켰다. 이식 날, JIMT-1 유방 세포를 log 기 성장 동안 수거하고 차가운 PBS에 재현탁했다. 암컷 CB.17SCID 마우스(Charles River)는 연구 제1일에 8주령이었고, 16.5 내지 20.7g의 체중 범위를 가졌다. 각 마우스의 오른쪽 옆구리에 5 x106 종양 세포(0.2mL 세포 현탁액)를 피하 주사했다. 종양을 2-차원으로 캘리퍼로 측정하여 매주 2번 평균 부피로 크기를 모니터링했다. 일단 종양의 크기가 대략 100-150mm3에 도달했다면 동물을 효능 연구에 등록했다. 제시된 종양 부피의 범위를 벗어난 동물은 제외하고, 마우스를 10마리씩 그룹으로 무작위 분배했다. 마우스에게 4주 기간 동안 주 1회(항체) 또는 매일(라파티닙) 주사했다. 치료 그룹에 대한 상세한 사항은 표 11에 나타낸다.
종양 크기를 캘리퍼 측정에 의해 매주 측정했다. 효능 연구는 두 투약 일정에서 PB4188이 효과적이었고, 라파티닙 또는 퍼투주맙 및 트라스투주맙의 조합보다 더 효능이 있었음을 드러냈다. 이 데이터는 도 17 및 18에 도시된다.
PB4188의
HRG
매개 내성 극복
NRG1-β1 상향조절은 HER2 표적화 요법에 대한 핵심 내성 기전이다(Wilson, 2012). PB4188을 모 항-HER3 모노클로날 항체 PG3178와 비교하여 증가하는 농도의 HRG(NRG1-β1 EGF)의 존재하에 연속 적정물에서 테스트했다. 이 목표를 위해, N87 세포를 10% 열 비활성화 FBS로 보충된 RPMI 1640에서 배양했다. 증식 분석을 위해, N87 세포의 서브컨플루언트 세포 배양물을 트립신화된 PBS로 세척하고, 배양 배지를 첨가하여 트립신을 비활성화했다. 세포를 다량의 분석 배지(0.05% BSA 및 10μg/ml Holo-트랜스페린을 함유하는 RPMI 1640 배지)로 2회 세척했다. 항체를 1 내지 0.0001μg/ml의 범위로 반-log 적정물로 희석했다. 세포를 증가하는 농도의 HRG(0.04-39.5 nM)의 존재하에 10000 세포/웰의 밀도로 첨가했다. 세포를 37℃, 5% CO2, 95% 상대습도에서 3일 동안 인큐베이션했다. 제조자의 지시에 따라서 Alamar Blue™(Invitrogen)를 첨가하고, 암소 조건의 37℃, 5% CO2, 95% 상대습도에서 6일 동안 인큐베이션했다. 550nm 여기, 590nm 방출 파장에서 형광을 측정했다. PB4188은 모 항-HER3 모노클로날 항체와 비교하여 뛰어난 활성을 나타냈다(도 19). 따라서, 예를 들어 NRG1-β1의 상향조절과 같은 탈출 기전의 경우, 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 바람직하다.
HER2/HER3 특이적 IgG의 에피토프 맵핑
샷건 돌연변이유발 실험
알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 사용하여 HER2 및 HER3에 대해 각각 PG3958 및 PG3178의 에피토프를 맵핑했다. 샷건 돌연변이유발 분석에서, HER2/HER3 세포외 도메인(ECD)의 각 아미노산 잔기가 알라닌으로 치환된 클론을 생성한다. 다음에, 역 형질도입에 의해 세포 어레이를 제조했다(특허 US2011/0077163A1). 따라서, 각 클론의 DNA를 리포펙타민과 혼합하고, 혼합물을 384-웰 플레이트의 전용 웰에 배치했다. HEK293T 세포를 각 웰에 첨가하고, 단백질의 발현을 24시간 후에 측정했다. 계속해서, 항체의 반응성을 면역형광 염색에 의해 측정하여 결합 맵을 얻었고, 항체 결합에서 결정적 잔기를 확인했다. HER2 및 HER3 ECD 구성물의 발현 수준을 상업적으로 이용가능한 모노클로날 항체(R&D mAb 1129(HER2) 및 R&D mAb 66223(HER3))를 사용하여 FACS 분석에 의해 검증했다.
HER2
이 분석에서는 HER2 ECD 돌연변이에 대한 1가 PG3958 Fab의 결합을 0.25μg/ml의 농도에서 테스트했고, 엄격한 세척 조건을 사용했다(pH 9.0, 350mM NaCl). 이로써 HER2에서 3개의 '결정적' 잔기(T144, R166, R181)가 확인되었으며, 이들은 대조군 mAb 결합을 보유한 WT HER2와 비교하여 PG3958 Fab의 35% 미만의 잔류 결합을 나타냈다. HER2 구조에서 결정적 잔기 근처에 위치된 2개의 잔기(P172, G179)는 유의성을 나타냈지만, 중대한 결합 손실이 적어서 '이차적인 결정적' 잔기로 지정되었다(표 13 및 도 21A). 이들 표면-노출된 잔기는 HER2의 도메인 I에 위치되며, HER2 분자의 표면에 불연속적 패치를 형성한다.
HER2
에피토프
확인 실험
표 13에 기재된 야생형(WT) HER2 ECD 및 HER2 ECD 변이체를 암호화하는 구성물을 CHO-K1 세포에서 발현했다. 표면 노출되고 구조적으로 결정된 결정적 잔기의 근처에 있는 3개의 도메인 I 잔기를 추가의 분석을 위해 선택했다. 티로신으로의 T164, S180 및 D143 점 돌연변이를 HER2 ECD 구성물에서 생성했고, 얻어진 구성물을 CHO-K1에서 발현했다. L159A HER2 ECD 변이체를 대조군 샘플로서 CHO-K1 세포에서 발현했다.
이중특이적 PG3958xTT 항체를 FACS 적정 실험에서 ECD 변이체에 대한 결합에 대해 테스트했다. HER2의 도메인 IV에 결합하는 항-HER2 항체 트라스투주맙을 사용하여 세포 표면에서 HER2 ECD 발현을 검증했다. 평균 MFI 값을 플롯팅했고, 각 곡선에 대해 GraphPad Prism 5 소프트웨어를 사용하여 AUC를 계산했다. WT HER2 결합을 사용하여 데이터를 정규화했다. FACS 데이터는 T144A, R166A, R181A, P172A, G179A에 더하여, 돌연변이 T164Y 및 S180Y가 PG3958xTT 항체의 결합에 유의한 감소를 가져왔음을 나타냈다(도 22). D143Y 돌연변이는 대조군 mAb의 감소된 결합에 의해 증명된 대로 중대한 발현 손실을 가져오므로, PG3958 에피토프에서 그것의 잠재적 역할은 결정될 수 없었다.
HER3
FACS에서 HER3 ECD 돌연변이에 대한 0.25μg/ml에서의 PG3178 IgG의 결합 분석에서 2개의 '결정적' 잔기(F409, R426)가 확인되었으며, 이들에 대해 알라닌으로의 돌연변이가 WT HER3과 비교하여 실질적인 결합 손실을 야기했고, 대조군 mAb의 결합은 보유되었다(표 14 및 도 23). 두 잔기는 HER3의 도메인 III에 공간적으로 떨어져 위치된다. 더욱이, F409는 HER3 소수성 코어 내에 매장되어 있어서 PG3178 에피토프의 일부가 되기 어렵다.
HER3 에피토프 확인 실험
CHO-K1 세포를 HER3 ECD 돌연변이 구성물(표 14에 기재), WT HER3 ECD 및 2개의 대조군 구성물(H407A 및 Y424A)로 형질도입했다. HER3 ECD 변이체에 대한 PG3178 결합을 FACS 적정 실험에서 테스트했다. HER3의 결합 도메인 I(MM-121) 및 도메인 III(MEHD7945A)인 2개의 대조군 항체는 세포 표면에서 HER3 ECD 발현을 검증하기 위해 포함되었다. 평균 MFI 값을 플롯팅했고, 각 곡선에 대해 GraphPad Prism 5 소프트웨어를 사용하여 AUC를 계산했다. WT HER3 결합을 사용하여 데이터를 정규화했다. R426A 돌연변이는 PG3178 결합에 중요한 것으로 나타났고, F409A에 대한 결합은 세포 표면 발현의 손실로 인해 확인될 수 없었다(도 24).
심근세포에
대한
시험관내
PB4188 활성
HER2는 헤레굴린 수용체 복합체 HER2:HER4를 수반하는 신호화 네트워크의 일부로서 성인 심근세포의 성장, 수선 및 생존에 수반된다. 심장독성은 HER2 표적화의 알려진 위험 요인이며, 트라스투주맙이 안트라사이클린과 함께 사용될 때 합병증의 빈도가 증가하여, 심장 스트레스를 유발한다. 사람 줄기세포 유래 심근세포에 기초한 모델 시스템을 사용하여 PB4188의 잠재적 독성을 테스트했고, 안트라사이클린 독소루비신의 존재하에 트라스투주맙 및 트라스투주맙과 퍼투주맙의 조합에 대해 벤치마크했다. 사람 줄기세포 유래 심근세포(Pluriomics BV)를 평탄한 바닥의 화이트 분석 플레이트(corning 655098)에서 20,000개 웰의 농도로 파종했다. 배양 5일째에 배지를 10ng/ml HRG로 보충된 글루코오스 및 갈락토오스 무함유 배양 배지로 교체했다. 시험 7일째에 항체를 독소루비신(3μM)과 조합하여 첨가했다. 9일째에 Promega Cell titer Glo 분석을 사용하여 세포 생육성을 분석했다. 단일특이적 항체는 68nM의 단일 농도에서 테스트했고, PB4188은 3μM 독소루비신의 존재하에 3가지 농도에서 테스트했다. 도 25는 심근세포의 생육성이 시험된 모든 PB4188 농도에서 영향을 받지 않았음을 나타낸다. 대조적으로, 트라스투주맙 및 트라스투주맙과 퍼투주맙의 조합은 모두 심근세포의 세포 생육성을 감소시켰다.
상이한
HER2
수준에서 세포에 대한 PB4188 결합
트라스투주맙 및 HER3 항체 U1-59와 비교하여 PB4188의 결합을 상이한 수준의 HER2를 발현하는 유방암 및 위암 셀라인에 대해 FACS에 의해 분석했다. 세포는 100만개의 HER2 카피를 발현하고 HER2 유저자 증폭된다면 HER2+++로 간주된다. 다음의 셀라인이 사용되었다: MCF-7(HER 2+); MDA-MB-468(HER2+, MKN-45(HER2+), MDA-MB-175(HER2+), MDA-MB-453(HER2++), MDA-MB-361(HER2++), ZR-75-1(HER2++), JIMT-1(HER2+++), BT-474(HER2+++), SKBR-3(HER2+++), SK-OV-3(HER2+++), N87(HER2+++). 지수 성장된 배양물의 세포를 트립신에 의해 수거하고 FACS 버퍼(PBS/0.5% BSA/0.5mM EDTA)에서 106 세포/ml로 희석했다. 1-2x105 세포를 U자형 바닥의 96-웰 플레이트에서 각 웰에 첨가했다. 세포를 4℃에서 300g에서 2분 동안 원심분리했다. 플레이트(들)를 뒤집어 상청액을 버린 후, 한 번 가볍게 쳤다. 각 IgG 샘플을 50μL를 3.16ng-10μg/ml의 연속 희석물에 첨가하고 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 일단 세포를 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 FACS 버퍼로 2회 세척했다. 희석된 1:100 마우스 항 사람 IgG 감마 PE(Invitrogen)를 50μL를 첨가하고, 암소 조건의 얼음 위에서 30-60분 동안 인큐베이션했다. 일단 세포를 원심분리하고, 상청액을 제거하고, FACS 버퍼로 2회 세척했다. 세포를 HTS 환경에서 FACSCanto 유세포분석기에서 분석했다. 결합된 항체의 양을 중위값 형광에 의해 평가했다. 데이터를 플롯팅하고, 곡선 밑 면적(AUC, 중위값 형광 강도의 누적 측정값)을 테스트된 셀라인마다 각 항체에 대해 결정했다(도 26).
이 실험으로부터, PB4188이 트라스투주맙과 비교하여 HER2+++ 세포, HER++ 세포 및 HER+ 세포에 대해 더 높은 결합 친화성을 가진다는 결론이 내려진다.
트라스투주맙과의 동시 결합
HER2와의
결합에 대한 PB4188과 트라스투주맙의 비경쟁
PB4188은 HER2 단백질의 도메인 I에 결합하며, 트라스투주맙의 결합 에피토프는 도메인 IV에 결합한다. 두 항체가 HER2 결합에 대해 경쟁하지 않는다는 것을 증명하기 위해, HER2 증폭 SKBR-3 유방 세포를 사용한 결합 분석을 수행했다. 먼저, 표지되지 않은 항체를 포화 농도에서 SKBR-3에 결합하도록 두었다. 다음에, FITC-표지된 PB4188을 적정 범위로 첨가했고, FACS에 의해 형광을 측정했다. 도 27은 PB4188FITC가 트라스투주맙 또는 음성 대조군의 존재하에 세포에 효과적으로 결합되었음을 보여준다. PB4188과 함께 SKBR-3 세포의 사전 인큐베이션은 PB4188FITC이 결합하는 것을 방지했다. 따라서, 트라스투주맙과 PB4188은 HER2와의 결합에 대해 경쟁하지 않는다.
HER2xHER3
이중특이적
분자에 의한
HER2의
도메인 I의
표적화로
인한
헤레
굴린 내성 극복
HER2xHER3 다이머 상에서 PB4188의 배향이 HRG 스트레스 상태에서 세포 증식을 억제하는데 바람직했는지의 여부를 테스트하기 위해 도메인 I, II, III 또는 IV를 표적화하는 3178 HER3 팔과 HER2 팔로 이루어진 이중특이적 항체를 생성했다. HER2 도메인 I-IV의 각각에 대해 2개의 HER2xHER3 이중특이적 항체를 생성했다. HER2 팔은 도메인 I를 표적화하는 MF3958 및 MF3003; 도메인 II를 표적화하는 MF-2889 및 MF2913; 도메인 III를 표적화하는 MF1847 및 MF3001; 및 도메인 IV를 표적화하는 MF1849 및 MF1898을 포함했다. 각 HER2 Fab 팔을 3178 HER3 Fab 팔과 조합했고, 고 농도의 헤레굴린의 존재하에 세포 증식을 억제하는 효능에 대해 테스트했다. HER2 저발현 MCF-7 세포와 HER2 과발현 N87 및 SK-BR-3 세포에 대해 항체 적정을 수행했다. N87, SK-BR-3, 및 MCF-7 세포의 서브컨플루언트 세포 배양물을 트립신화딘 PBS로 세척하고, 배양 배지를 첨가하여 트립신을 비활성화시켰다. 다량의 분석 배지(0.05% BSA 및 10㎍/ml Holo 트랜스페린을 함유하는 RPMI 1640 배지)로 세포를 2회 세척했다. 항체를 반-log 적정물 상태로 희석했다. 세포를 실험적으로 규정된 스트레스 농도의 HRG(10nM SK-BR-3, 100nM N87 및 MCF-7)의 존재하에 10000 세포/웰(N87, SKB-BR-3) 및 5000 세포/웰 MCF-7의 밀도로 첨가했다. 세포를 37℃, 5% CO2, 95% 상대습도에서 3-4일 동안 배양했다. Alamar Blue™(Invitrogen)을 첨가하여 증식을 평가했다. 550nm 여기 파장과 590nm 방출 파장에서 흡광도를 측정했다. 테스트된 모든 분석에서, 단지 HER2의 도메인 I을 표적화하는 이중특이적 항체만이 높은 헤레굴린 농도의 존재하에 증식을 억제할 수 있었다(도 28).
PB4188과의
시험관내
약물 조합
소 분자 약물과 PB4188을 조합할 수 있는 가능성을 조사하기 위해, PB4188을 PI3K 또는 MAPK 경로를 상이한 수준으로 방해하는 약물과 조합했다. 더욱이, 화학치료 약물 및 사이클린 억제제와의 조합을 테스트했다. 매트리겔 중의 HRG의 존재하에(SK-BR-3 및 BT-474) 또는 HRG 스트레스 농도의 존재하에(증식 분석에 설명된 것과 같은 N87 및 SK-BR-3) 성장한 HER2 과발현 세포에 대해 조합을 테스트했다. 약물 조합의 억제 효과를 앞서 설명된 대로 알라마르 블루를 사용하여 증식을 측정하거나 영상화함으로써 테스트했다. 먼저, PB4188 및 테스트된 약물의 EC20을 결정했다. 다음에, PB4188 및 약물을 가지고 체커보드 적정을 수행했다. 티로신 키나아제 억제제(아파티닙, 라파티닙, 네라티닙), PI3Ka 억제제 BYL719, Akt 억제제 MK-2206, mTOR 억제제 에베롤리무스, Src 억제제 사라카티닙, 미세소관 파괴제 파클리탁셀, 및 HDAC 억제제 보리노스타트(도 40에서는 "보로니스타트"로 기재)로 테스트된 모든 셀라인에서 상승작용이 관찰되었다. 도 29는 매트리겔에서 성장된 SKBR-3 세포에 대한 PB4188과 라파티닙의 상승작용적 조합의 예를 도시하며, 결과적으로 형태학적 변화 및 세포 성장 감소가 얻어진다. 각 조합에서 얻어진 성장 억제의 범위가 계산되었다. 효능은 이소보로그램(Greco et al 1995)을 사용하여 나타낼 수 있으며, 이것은 해당 효과에 도달하는데 필요한 단일 제제와 비교하여 원하는 수준을 달성하기 위해 조합에서 얼마나 더 적은 약물이 필요한지 보여준다. 조합 실험의 억제값을 CHALICE™ 분석장치 소프트웨어에서 사용하여 이소보로그램을 생성했다. HER2 증폭 세포에 대한 상이한 약물 조합의 이소보로그램은 도 40에 도시된다. 이소보로그램 분석은 PB4188이 아파티닙, 라파티닙, 네라티닙, BYL719, MK-2206, 에베롤리무스, 사라카티닙, 보리노스타트 및 파클리탁셀과 상승작용적 약물 조합을 나타냈음을 시사했다.
이들 데이터는 PI3K 경로에 작용하는 약물이 PB4188과 조합하여 특히 효과적임을 증명한다. 또한, 티로신 키나아제 억제제와의 조합도 효과적이다. 더욱이, 성장 및 이주/침입 약물 사라카티닙과의 조합은 전이성 환경에서 유리할 수 있다.
PB4188의
시험관내
인산화 억제
지수 성장된 배양물의 세포를 수거하고 6-웰 플레이트(N87에 대해 3.75x106 세포 및 SKBR-3에 대해 1.5x106 세포)에서 기아 배지(N87 세포: RPMI-1640, 0.05% BSA, 10㎍/ml Holo-트랜스페린; SKBR-3 세포: DMEM/F-12, 2mM L-글루타민, 0.05% BSA, 10㎍/ml Holo-트랜스페린) 중에 파종하고 37℃, 5% CO2, 95% 상대습도에서 하룻밤 인큐베이션했다. 다음날, 항체를 5nM의 최종 농도로 첨가하고, 세포를 37℃, 5% CO2, 95% 상대습도에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 다음에, HRG를 100ng/ml의 최종 농도로 첨가했다. 37℃, 5% CO2, 95% 상대습도에서 1, 3, 6 또는 24시간 후, 플레이트를 얼음 위에 놓고 세포를 차가운 PBS로 2회 세척했다. 계속해서, 얼음으로 차게 한 세포용해 버퍼 0.3mL를 첨가하고, 세포를 얼음 위에서 최소 30분 동안 용해시켰다. 다음에, BCA(Pierce #23235)를 사용하여 단백질 농도를 측정했다. 단백질 농도를 세포용해 버퍼를 가지고 2mg/mL로 조정했다. 다음에, 세포용해물을 PathScan RTK 신호화 항체 어레이(Cell signaling #7949) 또는 PathScan 세포내 신호화 항체 어레이에 적용했다. 모든 인큐베이션은 실온의 궤도형 쉐이커에서 밀봉된 웰을 사용하여 수행했다. 세포용해물(75㎕)을 프로테아제 억제제 칵테일로 보충된 75㎕ 어레이 희석 버퍼를 사용하여 0.8mg/mL 농도로 2배 희석하고 얼음 위에 놓아 두었다. 어레이 웰을 15분 동안 100㎕ 어레이 차단 버퍼로 차단했다. 차단 버퍼를 제거하고 세포용해물을 웰에 적용하여 2시간 동안 인큐베이션했다. 세포용해물을 흡인하고 웰을 100㎕ 세척 버퍼로 4회 세척했다. 다음에, 100㎕ 검출 항체 칵테일을 각 웰에 적용하고 1시간 동안 인큐베이션했다. 항체 칵테일을 흡인하고 웰을 100㎕ 세척 버퍼로 4회 세척했다. 75㎕ Dylight80™ 스트렙타비딘을 각 웰에 첨가했다. Dylight80™ 스트렙타비딘을 흡인하고 웰을 100㎕ 세척 버퍼로 4회 세척했다. 멀티-개스킷을 제거하고, 슬라이드를 탈이온수 10mL 중에서 10초 동안 세척했다. 슬라이드를 건조시키고 Odysee®Clx에서 영상화를 진행했다. 스팟 형광 강도를 Image Studio 소프트웨어를 사용하여 계산했다.
N87 및 SKBR-3에서, PB4188은 트라스투주맙 + 퍼투주맙의 조합과 달리, 인큐베이션의 처음 6시간 동안 AKT 인산화를 완전히 차단한다. 또한, 트라스투주맙 + 퍼투주맙의 조합과 달리, ERK 및 S6 인산화에서도 강한 억제가 관찰된다. PB4188은 HER2의 인산화를 억제하지 않는다(도 30).
웨스턴 블롯 분석
PTK 및 세포내 Pathscan 어레이에서 관찰된 인산화 억제를 검증하기 위해, 스트레스 농도의 HRG의 존재하에 PB4188, 퍼투주맙과 트라스투주맙의 조합 및 대조군 항체로 처리된 세포에서 웨스턴 블롯을 수행했다. 지수 성장된 배양물의 세포를 수거하고 10cm 접시(N87에 대해 20x106 세포 및 SKBR-3에 대해 7x106 세포)에서 기아 배지(N87 세포: RPMI-1640, 0.05% BSA, 10㎍/ml Holo-트랜스페린; SKBR-3 세포: DMEM/F-12, 2mM L-글루타민, 0.05% BSA, 10㎍/ml Holo-트랜스페린) 중에 파종했다. 다음날, 항체를 5nM의 최종 농도로 첨가하고 세포를 1시간 동안 인큐베이션했다. 다음에, HRG를 100ng/ml의 최종 농도로 첨가했다. 1, 3, 6 또는 24시간 후, 접시를 얼음 위에 놓고, 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고, 에펜드로프 튜브로 옮기고, 250㎕의 RIPA 세포용해 버퍼(20mM Tris-HCl pH 7.5, 150mM NaCl, 1mM Na2EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40, 1% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 2.5mM 소듐 피로포스페이트, 1mM 베타-글리세로포스페이트, 1mM Na3VO4, 1㎍/ml 류펩틴)로 용해시켰다. 얼음 위에서 30분 동안 세포용해를 진행했다. 세포용해물을 원심분리하고 상청액을 새로운 에펜트로프 튜브에 수집했다. BCA법(Pierce)을 사용하여 단백질 농도를 결정했다. 세포용해물 30㎍을 4-12% Bis-Tris NuPage 겔(Invitrogen) 상에서 분리했고, 겔 상의 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 5% BSA를 함유하는 TBS-T로 1시간 동안 막을 차단하고 제조자(Cell Signaling Technology)의 지시에 따라 지정된 항체로 염색했다. 다음에, 막을 HRP-콘쥬게이트 2차 항체와 함께 인큐베이션하고, ECL 기질과 함께 인큐베이션하고, 엑스선 필름(Amersham)을 사용하여 오토래디오그래피를 행했다. 모든 검출 항체는 Cell Signaling Technology에서 구했다: 포스포-Akt(ser 473) #4060, 전체 Akt #4691, 포스포-HER2(Tyr 1221/1222) #2243, 전체 HER2 #2242, 포스포-HER3(Tyr 1289) #4791, 전체 HER3 #4754, 포스포-ERK1/2(Thr 202/Tyr 204) #4377, 전체 ERK1/2 #4695, 포스포-S6 RP(Ser 235/236) #2211, 전체 S6 RP #2217, 염소 항-토끼 HRP-결합 #7074.
이 결과는 PB4188이 HER3 인산화의 억제를 나타내므로, MAPK 및 PI3 키나아제 경로의 억제와 AKT 인산화 억제에 대한 상당한 효과를 가져온다는 것을 보여준다(도 31).
PB4188의
생체내
약역학
Luminex에 의한 인단백질 분석
PB4188 2회 용량 및 PB4188 4회 용량으로 치료된 JIMT-1 이식 마우스의 종양(100mm3)을 투약 후 24시간 뒤에 제거했다. 종양을 급속 냉동시키고 분말로 가공했다. 냉동된 분말 샘플에 차가운 BioRad 세포용해 버퍼(0.4% BioRad Factor 1, 0.2% BioRad Factor 2, 및 2mM PMSF로 보충된)를 사용하여 50mg 종양/mL의 농도로 종양 세포용해물을 제조했고, 60분 동안 로커에서 4℃로 인큐베이션하여 완전한 세포용해물을 확보했다. 샘플을 10분 동안 4℃에서 16000x g로 원심분리하고 알리쿼트로 나누었다. 제조자의 지시에 따라서 Biorad DC 단백질 분석 시약을 사용하여 총 단백질을 결정했다. Luminex 분석: JIMT-1 종양 세포용해물 샘플을 제조하고, Millipore로부터 상업적으로 이용가능한 Luminex 키트를 사용하여 전체 AKT, AKT(Ser473) 및 AKT(Thr308)에 대해 분석했다(Cat #48-618MAG(Lot No. 2532050), 46-645MAG(Lot No. 46645M-1K)). 각 샘플을 중복 테스트했다. 전체 및 인산화된 분석물질 결정에 대해 모두 웰 당 대략 25㎍ 단백질의 표적이 포함되도록 샘플 희석제 중에 희석물을 제조했다. Millipore 키트는 제조자의 규격에 따라서 사용했다.
PB4188로 치료된 종양은 치료되지 않은 종양과 비교하여 Akt 발현에 증가를 나타냈다. 주 2회 용량 및 주 4회 용량의 1회 용량 후 PB4188에 의해 AKT의 인산화가 완전히 억제되었다(도 32).
VeraTag 분석에 의한 인단백질 분석
PB4188 1회 또는 2회 용량으로 치료된 JIMT-1 이식 마우스의 종양(100mm3 또는 400mm3)을 제거하고 10% 중성 완충 포르말린에 고정시켰다. 100mm3 종양을 지닌 마우스는 단일 PB4188 용량(25mg/kg) 투여 후 24시간 뒤에 죽였고, 400mm3 종양을 지닌 마우스는 25mg/kg 용량을 주 1회씩 두 번 투여 받았고 투여 후 4시간 뒤에 죽였다. 다음에, 샘플을 파라핀 포매시켰다. 두께 7um의 절편을 마이크로톰(LEICA)으로 슬라이스하고, 일련번호가 표지된 양으로 하전된 유리 슬라이드(VWR) 위에 놓았다. 슬라이드를 30분 동안 공기 건조시킨 다음, 60℃로 설정된 가열된 오븐에서 구웠다. 다음에, 샘플에 상이한 VeraTag 분석을 진행했다(미국특허출원 No. 12/340,436에 따른 총 HER2 분석(HT2), 미국특허 No. 8,349,574; 미국특허출원 No. 2013/0071859에 따른 총 HER3 분석(H3T), 및 국제특허출원 No. PCT/US2014/033208에 따른 HER2-HER3 헤테로다이머(H23D), HER3pY1289(H3pY1289) 및 HER3-PI3 키나아제(H3PI3K) 분석). 두 투약 섭생에서, 치료되지 않은 대조군과 비교하여 HER2:HER3 다이머의 유의한 PB4188 매개 감소가 분명히 나타났다. PB4188 치료된 종양과 대조군 간에 총 HER2, HER3 또는 인산화된 HER3는 차이가 관찰되지 않았다. PB4188 투약 후 4시간 뒤 분석한 종양은 치료되지 않은 대조군과 비교하여 HER3-p85(PI3K)에 유의한 감소를 나타냈다.
PB4188에 의한
HRG
-자극 암세포에서의 세포 주기 진행 감소
다양한 단백질 수준의 HER2를 발현하는 암 셀라인에서 세포 주기 진행에 영향을 미치는 PB4188의 능력을 조사했다. HER2+(MCF-7), HER2+++(JIMT-1, SK-BR-3 및 N87) 세포를 분석 배지(MCF-7 세포: RPMI-1640, 0.05% BSA, 10㎍/ml Holo-트랜스페린, 1mM 소듐 피루베이트, MEM NEAA; JIMT-1: DMEM, 0.05% BSA, 10㎍/ml Holo-트랜스페린; SK-BR-3 세포: DMEM/F-12, 2mM L-글루타민, 0.05% BSA, 10㎍/ml Holo-트랜스페린; N87 세포: RPMI-1640, 0.05% BSA, 10㎍/ml Holo-트랜스페린) 중에 파종했다. 24-웰 플레이트의 웰 당 300,000개 MCF-7, 400,000개 N87, 150,000개 SK-BR-3 또는 150,000개 JIMT-1 세포를 1mL 분석 배지에 파종하고 37℃, 5% CO2, 95% 상대습도에서 하룻밤 인큐베이션했다. 다음날, PB4188 또는 퍼투주맙 + 트라스투주맙 또는 PG3178 또는 PG1337을 1 또는 100ng/mL의 HRG의 최종 농도의 존재하에 세포에 첨가했다. 37℃, 5% CO2, 95% 상대습도에서 인큐베이션한지 24시간(JIMT-1, N87 또는 SK-BR-3 세포에 대해) 또는 48시간(MCF-7 세포에 대해) 후, 수집 전에 세포를 EdU(10μM 최종 농도)로 2시간 동안 보충하고, 제조자의 지시에 따라서 Click-iT EdU AlexaFluor488 키트를 사용하여 EdU 통합에 대해 염색했다(LifeTechnologies, cat.no. C10425). FACSCanto에서 유세포분석법에 의해 세포를 분석하기 적어도 30분 전에 200nM FxCycle 파 레드 염료(LifeTechnologies, cat.no. F10348) 및 100㎍/ml RNAse A(LifeTechnologies, cat.no. 12091-039)와 함께 세포를 인큐베이션했다. AlexFluor488 채널(EdU 검출) 및 APC 채널(FxCycle 염료에 의한 총 DNA 염색)에서 이벤트를 획득했다. FSC-너비 대 FSC-높이 스캐터 플롯 상에서 단일 세포를 게이팅(gating)하고, PC 대 AlexaFluor488 스캐터 플롯 상에서 세포 주기의 G0/G1, S 및 G2M 단계를 서브게이팅(sub-gating)함으로써 데이터를 분석했으며, 이들은 각각 EdUnegAPClow, EdUpos 및 EdUnegAPChigh 모집단으로 나타낸다.
S 및 G2/M 단계에서의 세포의 비율을 G0/G1 단계에서의 세포의 비율로 나누어 계산된 증식 지수로서 데이터가 표시된다. 도 34는 PB4188이 표준(1ng/ml) 또는 고(100ng/ml) 농도의 HRG에 의해 유도된 증식을 억제하는데 있어서 PG3178 또는 퍼투주맙 + 트라스투주맙보다 일정하게 더 효능이 있다는 것을 보여준다. 고 농도의 HRG에서도 HRG PB4188은 세포 주기 진행을 억제한다.
PB4188에 의한 수용체 내재화 유도
pH-감응성 염료를 사용하여 항체의 내재화 패턴을 측정했다. 이것은 WO2013134686 A1에 개시되었으며, 이러한 염료는 항체와 결합되었을 때 낮은 pH에 노출되면 증가된 형광 신호를 나타낸다. 이것은 염료-결합된 항체가 표적 세포의 표면으로부터 약산성(pH 6-6.5) 엔도솜으로 들어가 산성(pH 5.5 미만) 리소좀까지 내재화되었을 때 발생한다. PB4188이 암세포에 내재화되는지의 여부를 조사하기 위해, 항체를 제조자의 지시에 따라서 석신이미딜 에스테르 반응성 기를 가진 pH 센서 염료(Promega, cat.no. CS1783A01)와 결합시켰다. 비교제로서, 항-HER2(트라스투주맙, 퍼투주맙, PG3958), 항-HER3(PG3178, #Ab6) 및 음성 대조군(항-파상풍 독소, PG1337) 염료 표지된 항체를 사용하였다.
지수 성장된 배양물의 HER2-과발현 SKBR-3 및 N87 암세포를 수거하고 96-웰 플레이트에서 1ng/ml HRG를 함유하는 100㎕ 분석 배지(N87 세포: RPMI-1640, 0.05% BSA, 10㎍/ml Holo-트랜스페린; SKBR-3 세포: DMEM/F-12, 2mM L-글루타민, 0.05% BSA, 10㎍/ml Holo-트랜스페린) 중에 파종하고(웰 당 15x103 세포), 37℃, 5% CO2, 95% 상대습도에서 하룻밤 인큐베이션했다. 다음날, 20㎕ pH-감응성 염료-표지된 항체를 최종 농도가 100nM가 되도록 첨가하고, 세포를 37℃, 5% CO2, 95% 상대습도에서 하룻밤 인큐베이션했다. 다음날, 비-유착 세포를 수집하고 유착 세포를 트립신화하여 세포를 수거했다. 세포를 FACS 버퍼(PBS 0.5% BSA 0.1% 소듐 아지드)로 세척한 후, 세포를 APC-표지된 항-사람 IgG(Jackson Immunoresearch, cat.no. 109-136-098, 1:100 희석)로 염색했다. 세포를 FACSCanto(BD Biosciences)에서 유세포계수법에 의해 분석하여 PE 및 APC 채널의 중위값 형광 강도(MFI)를 측정하고, 항체의 내재화 및 잔류 표면 결합을 결정했다. 도 35에 나타낸 데이터는 PB4188이 트라스투주맙과 동일한 정도로 내재화하며, 트라스투주맙 + 퍼투주맙 조합은 증진된 내재화를 초래한다는 것을 보여준다. 트라스투주맙 + 퍼투주맙의 조합은 트라스투주맙 단독과 비교하여 ADCC를 더 감소시킨다(도 36). 따라서, PB4188 내재화의 수준은 ADCC에 영향을 미치지 않는다는 것이 확인된다.
항-
HER3
항체 3178
변이체의
생성 및 특성
항-HER3 항체 MF3178의 변이체를 항체 특성을 개선하는 것을 목표로 설계했다. 돌연변이를 VH 유전자 프레임워크 영역 1(FR1), 상보성 결정 영역 1(CDR1), FR2, CDR2 및/또는 FR3에 도입했고, CDR3 및 FR4는 변형되지 않았다. 이 설계는, 제한은 아니지만, 후-번역 변형(PTM) 모티프를 제거하거나(예를 들어, 탈아미드화 모티프 NS를 NQ로 변화시킴에 의함), 표면 소수성을 감소시키거나(예를 들어, I를 T로 변화시킴에 의함) 또는 등전점(pI; 예를 들어, Q를 K로 변화시킴에 의함)을 증가시키기 위해 도입된 돌연변이를 포함했다. 모든 20개 변이체(도 37 참조)를 파상풍 톡소이드(TT) 팔과 조합된 이중특이적 항체로서 발현했고, MCF-7 기능적 분석에서 테스트했다. 모든 20개 변이체는 이 포맷에서 MF3178 항체와 유사한 효능을 가졌다. 모든 20개 변이체는 또한 MCF-7와의 결합에 대해 적정물에서 FACS에서 이 포맷으로 테스트되었고, 모든 변이체는 매우 유사한 결합 프로파일을 가졌으며, 이것은 모든 변이체의 친화성이 유사함을 시사한다. 추가의 실험을 위해 3개의 선도 변이체 MF6058, MF6061 및 MF6065를 선택했으며, 이들은 각각 10개, 3개 및 7개 아미노산 돌연변이를 함유한다(도 16E 및 도 37의 서열 참조). 상응하는 단일특이적 IgG1 PG6058, PG6061 및 PG6065를 대규모로 생성하고 정제했다. 도 38에 나타낸 대로, HRG-의존적 N87 셀라인 증식 분석에서 이 3개 변이체의 억제 활성은 PG3178과 유사하다. 도 39에 나타낸 대로, 3개 변이체의 CIEX-HPLC 프로파일은 하전 비균질성뿐만 아니라 피크 너비 및 대칭성의 측면에서 PG3178과 유사했다. 주 피크의 체류 시간(tR)은 항체의 pI와 관련성이 있으며, 높은 pI는 더 긴 체류 시간을 가져왔다. 이중특이적 항체 또는 항체의 혼합물의 설계에서, 최적 tR을 가진 항체의 선택은 가치가 있는데, 이는 CIEX를 사용한 원하는 항체 성분의 정제가 용이해질 수 있기 때문이다.
실시예
2
두개내 PDX 종양을 가진 마우스에서 HER2 및 HER3에 대해 지정된 이중특이적 항체 MCLA-128의 효능을 결정했다. MCLA-128의 효능을 T-DM1과 비교했다. 또한, MCLA-128과 T-DM1의 조합을 단일 제제 치료와 비교했다.
동물
이 연구는 프랑스 Janvier Labs에서 구입한 43마리(11마리 여분) 암컷 NMRI 누드 마우스(1주 시간 단위로 주령이 일치하는 순서로, 약 6주령)에서 수행했다.
동물 사육 및 취급
건강 모니터링:
'코펜하겐 대학교 실험의학과'(빌딩 10.3)에 도착했을 때 '동물 단위 표준 과정'에 따라서 마우스를 임상적으로 검사했다. 수의과 감독하에 교육받은 직원이 마우스를 취급했다. 모든 동물은 건강했고 동물복지를 준수하였다.
적응:
실험 과정을 시작하기 전 14일의 적응 기간을 두었다.
사육 및 환경:
동물은 동물 방/실험실에 수용되었다. 동물 방은 12시간 빛/12시간 어둠의 주기로 조명되었다. 조명은 06:00시부터 18:00시까지 켜두었다. IVC 타입 III 케이지, Techniplast(820cm2, 높이 15.5cm, 케이지 당 최대 8마리/최소 2마리 마우스)에 마우스를 가두어 두었다. 동물 기술자가 매일 동물을 모니터링했고, 수의사는 격월로 또는 기술자가 요청할 때 동물 시설을 모니터링했다. 각 케이지는 적어도 연구 ID, 그룹 및 동물 수와 테스트 화합물로 표지했다. 두개내 종양 이식 후 일회용 플라스틱 삽입물을 케이지에 장착했다.
잠자리:
잠자리는 Brogarden/Finn Tapvei Oy, FIN-73620(Kortteinen, 핀란드)에서 구한 포플러 나무였다. 잠자리는 격주로 교체했다.
환경 농축:
잠자리를 교환할 때마다 둥지 재료인 Brogarden를 동물에 제공했다. 또한, 각 케이지에는 Brogarden/Finn Tapvei Oy, FIN-73620(Kortteinen, 핀란드)로부터 구한 목재 스틱과 맞춤 제작된 투명한 적색 플라스틱 은신처를 넣어 주었다.
식이 및 음용수:
동물은 래트와 마우스를 위한 유지식인 펠릿형 완전식 "Altromin 1319"를 마음대로 섭취할 수 있었고 14일마다 교환해주었다. 동물은 수돗물을 자유롭게 섭취했으며 매주 교환해주었다. 두개내 종양 이식 후 음용수를 에스트로겐으로 보충했다.
인도적 종말
동물은 인도적으로 안락사되었다. 동물을 죽이는 인도적 이유는, 제한은 아니지만, 동물이 지속적 고통, 통증 또는 발열의 징후를 나타내는 경우를 포함했다. 연구를 위한 구체적인 인도적 종말은 표 16에 기재된 배점 시스템에 의해 관리된다. 해당 마우스를 경추파열하여 안락사시켰다.
방법
연구 타임라인은 표 17에 제시된다.
두개내
종양 이식
NMRI 누드 마우스에서 성장된 피하 ST1360B PDX 종양(제4차 계대)을 수거했다(종양 성장 곡선에 대해 도 41 참조). 종양 이식 후 ST1360B 종양을 지닌 마우스를 에스트로겐으로 보충했다. 종양을 PBS로 세척하고 표면의 잔류 결합 조직을 정리했다. 종양을 작은 조각으로 자르고 아큐타아제 및 콜라게나아제 IV로 효소절단하여 단일 세포 현탁액을 얻었다. 태아 소 혈청을 함유하는 배지를 첨가하여 효소절단을 중지하고, 세포 현탁액을 100μm 필터를 통해서 여과하고 PBS로 세척하고 PBS에 재현탁했다. 트리판 블루 염색에 의해 종양 세포의 생육성을 체크했으며, 최종 농도는 mL 당 18,000,000개의 생육성 세포였다. 총 세포 생육성은 90%를 초과했다. 기저 세포와 종양 세포 간에 차이는 없었고, 용액은 일부 세포 파편도 함유한다. ST1360B는 높은 종양 세포충실성을 나타낸다. 접종 때까지 세포를 얼음에서 보관했다.
마우스를 힙놈/미다졸람(1mL/100g 체중)으로 마취하고 정위틀에 놓고 머리를 고정시켰다. 두피를 길이방향으로 절제하여 두개관을 노출했다. 마이크로-드릴을 사용하여 두개골 시상봉합부 우측 1.5mm, 브레그마 전방 0.5mm에 구멍을 뚫었다. 세포 현탁액 10㎕(180,000개 세포)를 마이크로 인퓨젼 펌프에 장착한 25-게이지 바늘을 가진 100㎕ 주사기를 사용하여 60 nl/sec의 속도로 2-2.5mm의 깊이에서 주사했다. 바늘은 3분 동안 방치한 후 제거했다. 부피바카인(0.2mg/100g 체중) 및 리도카인(1mg/100g 체중)을 절개 부위에 투여하여 국소 바취하고, 봉합사를 사용하여 피부를 봉합했다. 식별을 위해 마우스의 귀를 펀칭하고 각자의 케이지로 돌려보냈으며, 마취에서 완전히 회복될 때까지 모니터링했다. 종양 접종 후 적어도 주 2회 체중 및 임상 징후를 모니터링했으며, 임상 징후나 체중 감소가 나타났다면 더 자주 모니터링했다.
MR 영상화
T2-가중 MR 영상화(축면 및 관상면)에 의해 주 2회 종양 발생을 모니터링했다. 최초 영상화 과정은 종양 접종 후 19일 뒤였다. 동물은 MR 영상화 과정 동안 마취시켰다(세보플루란, 대략 4:1 비율로 100% O2로 보충된 주변 공기 중 2-4%).
연구 등록은 종양 성장 및 약 10-20mm3의 종양 부피를 나타내는 2건의 병리학적 MR 스캔을 기준으로 했다. 등록 기준을 만족하는 마우스를 4개의 그룹 중 하나에 무작위로 분배했다. 포함 기준을 만족한 최초의 32마리 마우스가 연구에 등록되었다. 마우스를 무작위화했고, 치료 개시 시에 모든 그룹은 동일한 평균 종양 부피를 나타냈다.
치료법
표 18에 따라서 비히클, MCLA-128, T-DM1 또는 MCLA-128 + T-DM1을 마우스에 투약했다. 약물은 각 투약 전 멸균 식염수에 희석되었다. 가능한 빠르고 쉽게 과정을 마치기 위해 테스트 화합물을 주사하기 전에 마우스를 대략 5-10분 동안 가열 램프 아래에 두었다. 마우스를 꼬리 고정 상자에 넣고 테스트 화합물을 외측 꼬리 정맥에 단일 정맥내(i.v.) 볼루스 용량으로 투약했다. 투약 용량은 5.0mL/kg였다.
치료 후 MR 영상화 및 가중
모니터링
치료 개시 후 최초 2주 동안 그리고 치료 후 6주까지 매주 T2-가중 MR 영상화(축면 및 관상면)에 의해 주 2회 종양 성장을 모니터링했다. 동물은 MR 영상화 과정 동안 마취시켰다(세보플루란, 대략 4:1 비율로 100% O2로 보충된 주변 공기 중 2-4%). 인도적 종말(표 16)에 근거해 개별 기준에 따라 동물을 경추파열하여 안락사시켰다. 종양이 있는 뇌를 절제하고 24-48시간 동안 4% 포름알데하이드에 보존하고 70% 에탄올로 옮겼다. 고정액:조직 비율은 적어도 20:1이었다.
영상 분석
개별 슬라이스 상에 관심 영역(ROI)을 그리고 ROI의 부피를 계산하여 영상에서 종양 부피를 측정했다. ROI를 축면 및 관상면에서 모두 그리고 두 평면에서 종양 부피의 평균을 종양 부피로서 사용했다. 뇌의 부종은 0-4점까지 배점했으며, 0점은 뇌 부종이 없는 상태이며, 4점은 거대한 뇌 부종을 나타낸다(도 42 참조). 영상 분석은 Horos를 사용하여 수행했다(Horos Project(2017). DICOM 영상 보기 및 측정. [Horos]. http://www.horosproject.org/).
결과
포함 및 무작위화
제1 동물은 두개내 종양 이식 후 연구 23일째에 포함되었다. 모든 동물의 포함일 및 포함 종양 부피는 표 19에 기재된다. 포함시 그룹 A-D에서 마우스의 체중 및 종양 부피는 도 43에 도시된다. 그룹 간 체중이나 종양 부피에 차이는 보이지 않았다(원-웨이 ANOVA, p = 0.43(체중) 및 p = 0.92(종양 부피). 도 43: 그룹 A-D에서 마우스의 포함시 체중 및 종양 부피. 그룹 간 체중이나 종양 부피에 차이는 보이지 않았다(원-웨이 ANOVA, p = 0.43(체중) 및 p = 0.92(종양 부피).
후-치료
모니터링
T2-가중 MRI를 치료 개시 후 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35 및 42일에 수행하여 두개내 종양 부피를 측정했다. 각 그룹에 대해 치료 개시 후 평균 종양 부피가 도 44에 도시된다. 각 그룹에서 동물의 개별 종양 부피는 도 46-49에 도시된다. 마우스의 대표적인 T2-가중 이미지는 도 50-53에 도시된다. 부형제 치료된 마우스와 비교하여 T-DM1 및 T-DM1 + MCLA-128로 치료된 마우스에서는 종양 성장이 억제되었고, MCLA-128로 치료된 마우스에서는 종양 성장 지연이 관찰되었다. 치료 후 제10일에 종양 부피에 유의한 차이는 없었고(p=0.009, 원-웨이 ANOVA), T-DM1 및 T-DM1+ MCLA-128 치료된 마우스의 평균 종양 부피는 부형제 치료된 마우스와 비교하여 유의하게 더 적었다(p<0.05, 다중 비교를 위해 수정됨; Tukey).
마우스의 체중을 치료 개시 후 밀착 모니터링하였다. 상이한 군에서의 마우스의 평균 체중이 도 45에 도시된다. 상이한 군에서의 각 마우스에 대한 체중 측정값은 도 54-57에 그램 단위 및 포함시의 체중에 대한 변화 비율로 도시된다. 개별 체중 측정값으로부터 대부분의 마우스가 인도적 종말 기준이 충족되기 전에 체중이 감소되었다는 것이 확인된다.
뇌 부종의 배점
그룹 B 및 D의 동물에서 종양 정지상태(성장 없는 종양)가 보였다. 희생 시점에 가장 가까운 MR 영상은 일부 동물이 뇌 부종을 나타냈음을 보였다. 이것은 마우스의 상태가 악화되고 안락사 필요가 있음을 나타내다. 뇌의 부종은 0-4점까지 배점되었으며, 0점은 뇌 부종이 없음을 나타내고, 4점은 거대한 뇌 부종을 나타낸다(표 20 및 도 58). T-DM1로 치료된 그룹(그룹 B 및 D)에서는 부종의 증가 경향을 보였다. 그러나, 그룹 간 뇌 부종에는 유의한 차이가 발견되지 않았다(비-변량 Kruskal-Wallis 테스트). 부종 점수 배점은 동시에 또는 안락사 시에 수행되지 않았기 때문에 결과를 해석할 때 주의를 기울여야 한다. 또한, 그룹 간 종양 부피에 차이가 있었으며, 이것은 뇌 부종에 영향을 미칠 수 있다. 이와 같이, 이 연구는 치료 및 뇌 부종의 영향을 상세히 조사하도록 설계되지는 않았다.
생존 분석
표 16에 따라서 인도적 종말에 근거해 마우스를 안락사시켰다. 모니터링에 주위했음에도 불구하고 4마리의 마우스는 연구 동안 케이지에서 죽은 채로 발견되었다. 케이지에서 죽은 채 발견된 동물로부터 종양 물질은 생체외 보존되지 않았다. 모든 동물에 대한 생존 데이터의 Kaplan-Meier 플롯이 도 59에 도시된다. 생존 곡선들은 유의하게 차이가 있었다(p<0.0001, Log-rank). 비히클, T-DM1, MCLA-128 및 T-DM1 + MCLA-128 동물에 대한 중위값 생존은 각각 치료 개시 후 13, 19.5, 29 및 42일이었다. 페어-방식 Kaplan-Meier 플롯이 도 60에 도시된다. 유의하게(Log-rank) 더 긴 중위값 생존이 T-DM1 대 비히클(19.5일 대 13일, p=0.020), MCLA-128 대 비히클(29일 대 13일, p<0.0001), 및 T-DM1+MCLA-128 대 비히클(42일 대 13일, p<0.0001)에서 관찰되었다. MCLA-128 대 T-DM1(29일 대 19.5일, p=0.10, Log-rank)에서 중위값 생존에는 차이가 크게 보이지 않았다. T-DM1 + MCLA-128로 치료된 마우스는 T-DM1(42일 대 19.5일, p=0.0005) 또는 MCLA-128(42일 대 29일, p=0.013)로 치료된 마우스와 비교하여 유의하게(Log-rank) 더 긴 중위값 생존을 나타냈다.
고찰
T-DM1 및 T-DM1 + MCLA-128은 종양 성장을 억제했지만, MCLA-128은 T2-가중 MRI에 의해 결정된 종양 성장 지연을 나타냈다. 비히클, T-DM1, MCLA-128 및 T-DM1 + MCLA-128 치료된 마우스의 중위값 생존은 각각 치료 개시 후 13, 19.5, 29 및 42일이었다. MCLA-128로 치료된 마우스는 비히클 치료된 동물과 비교하여 유의하게 더 긴 생존을 나타냈고(29일 대 13일, p<0.0001), T-DM1 + MCLA-128로 치료된 마우스는 T-DM1(42일 대 19.5일, p=0.0005) 또는 MCLA-128(42일 대 29일, p=0.013)로 치료된 마우스와 비교하여 유의하게 더 긴 중위값 생존을 나타냈다. T-DM1(그룹 B 및 D)로 치료된 그룹에서는 부종이 증가되는 경향이 관찰되었다. 그러나, 그룹 간 뇌 부종의 유의한 차이는 발견되지 않았다(비-변량 Kruskal-Wallis 테스트). 결론적으로, MCLA-128은 단일 제제와 T-DM1과의 조합에서 모두 두개내 ST1360BPDX 종양을 가진 마우스의 생존에 대해 효능을 나타냈다.
실시예
3: 전이성 유방암(MBC)에서
MCLA
-128-기초 조합의
제2상
연구:
HER2
-양성 MBC에서
MCLA
-128/트라스투주맙/화학요법
이 실시예는 MCLA-128/트라스투주맙/화학요법의 투여를 설명하지만, 이 특정 치료제의 사용에만 제한되는 것은 아니며, 억제제, 및 화학요법을 포함하는, ErbB-2 결합제와 조합하여, 개시된 ErbB-2 및 ErbB-3 결합 이중특이적 항체에도 적용된다.
목표
HER2-양성/증폭된 MBC: MCLA-128 + 트라스투주맙 ± 비노렐빈
1차 목표:
· 트라스투주맙과 퍼투주맙, 및 HER2 항체 약물 콘쥬게이트(ADC)를 포함한 사전 HER2-지향 요법을 진행한 HER2-양성/증폭된 MBC 환자에서 RECIST 1.1(조사자 검토에 따름)에 기초하여 제24주에 임상 이득율(CRB)의 측면에서 트라스투주맙 ± 비노렐빈과 조합된 MCLA-128의 효능 평가
이차 목표:
· 중앙 검토에 따라 RECIST 1.1에 기초하여 제24주에 CBR 평가
· 진행 없는 생존 평가(PFS; 조사자 및 중앙 검토에 따름)
· RECIST 1.1에 기초하여 전체 반응율(ORR) 평가(조사자 및 중앙 검토)
· RECIST 1.1에 기초하여 반응 지속기간(DoR) 평가(조사자 및 중앙 검토)
· 전체 생존(OS) 평가
· 트라스투주맙 ± 비노렐빈과 조합된 MCLA-128의 안전성 및 관용성 평가
· 트라스투주맙 ± 비노렐빈과 조합된 MCLA-128의 약동학(PK) 특성
· 트라스투주맙과 조합된 MCLA-128의 면역원성 특성화
조사 목표:
· 종양 또는 혈액 샘플 중의 바이오마커(HER2, HER3, HER2:HER3 다이머, 헤레굴린 및 다른 바이오마커들)와 항종양 활성 사이의 관련성 평가
연구 설계
HER2-양성/증폭된 두 전이성 유방암(MBC) 집단에서 MCLA-128-기초 조합의 효능을 평가하기 위한 2상, 오픈-라벨, 멀티센터 국제 연구가 수행된다. 두 조합 치료는 미국과 유럽의 7개 국가의 15-20개 장소에서 평가된다.
양성 형광 인시튜 혼성화(FISH)와 조합된 면역조직화학(IHC) 3+ 또는 IHC 2+에 의해 HER2 과발현이 확인된 HER2-양성/증폭된 MBC를 가진 환자로, RECIST v1.1에 따라 애쥬번트/네오애쥬번트에서 2-4 라인의 HER2-지향 요법을 진행한 환자에서 퍼투주맙 및 HER2 ADC와 함께 트라스투주맙을 포함하는 비절제 국소 진행/전이성 환경에 있는 환자가 적격하다. 등록을 위한 HER2 상태는 의료 기록에 근거하며, 적격성은 중앙 실험실 검토에 의해 가능한 빨리 확인된다. 확인 후 비적격으로 판명된 환자는 1차 목표에 대해 평가될 수 없고 대체될 수 있다. 이전 치료 라인에서 질환 진행의 문서화된 영상 증거가 있다면 이용될 수 있다.
처음에는 MCLA-128이 트라스투주맙과 함께 투여된다(이중 조합). 안전성은 '독립 데이터 모니터링 위원회'(IDMC)에서 검토된다. 이 이중 조합의 안전성이 평가된 후, MCLA-128 + 트라스투주맙 + 비노렐빈(삼중 조합)이 이중 조합과 병행하여 평가된다(도 61 참조).
이중 및 삼중 조합은 모두 IDMC에 의해 검토된 4 내지 6명의 환자에서 초기 안전성 평가 후 코호트 효능 확장의 두 단계로 평가되며, 이것은 아래 설명된다. 삼중 조합의 진행/비진행 결정은 IDMC에 의한 환자의 이중 안전성 평가 후 이루어진다. 두 조합의 효능 확장은 병행하여 계속된다.
안전성 평가 : 4-6명의 환자가 적어도 2회의 MCLA-128 + 트라스투주맙의 치료 사이클(6주)을 거친 후, IDMC에 의해 안전성 검토가 수행된다. 이중 조합이 안전하다고 간주되면, 삼중 조합에 대한 안전성 평가가 개시된다. 삼중 조합의 안전성은 4-6명의 환자가 MCLA-128 + 트라스투주맙 + 비노렐빈의 적어도 2회의 사이클(6주)을 거친 후 IDMC에 의해 평가된다.
처음 4-6명의 환자에서 관찰된 안전성(부작용[AE], 중증 부작용[SAE], 연구 약물과의 관계, 및 다른 임상적으로 관련된 변수[예를 들어, 실험실 변수], 이용가능한 PK, 면역원성, 및 사이토카인 데이터)에 기초하여, IDMC, 조사자 및 스폰서는 각 조합(즉, 이중 조합 및 삼중 조합)에 대한 추가적인 평가 기간을 결정한다.
확장 : 안전성 평가 후, IDMC에 의해 관용성이 있다고 간주된 각 조합 치료는 효능에 대해 평가 가능한 총 최대 40명의 환자로 확장된다.
연구 집단
포함 기준
환자는 연구에 참여하기 위해 아래의 요건을 만족해야 한다:
1. 임의의 연구 과정 개시 전 서면동의서에 서명
2. 전이성 또는 국소적으로 진행된 질환으로서 조직학적으로 또는 세포학적으로 확인된 유방암을 가지며 치유 의도가 있지만 임의의 국소 요법에는 적합하지 않은 여성:
a. 스크리닝 전 12개월 이내에 수집된 또는 수집 보관된 최근 종양(바람직하게 전이성, 또는 원발성) 생검에 대한 국소 분석에 기초한, 면역조직화학(IHC) 3+ 양성, 또는 양성 형광 인시튜 혼성화(FISH)와 조합된 IHC 2+에 의해 정의된 것과 같은, 문서화된 HER2 과발현/증폭
b. 애쥬번트/네오애쥬번트, 비절제 국소 진행/전이성 환경에서 투여된 2-4 라인의 HER2-지향 요법에 대한 문서화된 질환 진행(조사자 평가에 의함); 트라스투주맙 + 퍼투주맙 및 HER2 항체 약물 콘쥬게이트(예를 들어, T-DM1)은 모두 앞서 투여되었어야 함(어느 순서로든).
3. 최근 치료 라인 도중에 또는 후에 방사선법에 의한 RECIST 버전 1.1에 의해 정의된 것과 같은 측정가능한 질환
4. 서면동의서에 서명한 18세 이상
5. 동부 종양학 협력 그룹(ECOG) 성취 상태 0 또는 1
6. 조사자에 따른 12주 이상의 생존 예상
7. 심전도(ECHO) 또는 다중 게이트 획득 스캔(MUGA)에 의한 50% 이상의 좌심실 구축율(LVEF)
8. 충분한 장기 기능:
a. 절대 호중구 수(ANC) ≥ 1.5 x 109/L
b. 헤모글로빈 ≥ 9 g/dL
c. 혈소판 ≥ 100 x 109/L
d. 정상 범위 내의 혈청 칼슘(또는 보충물로 보정)
e. 알라닌 아미노트랜스페라아제(ALT), 아스파르테이트 아미노트랜스페라아제(AST) ≤ 2.5 x 정상의 상한(ULN) 및 총 빌리루빈 ≤ 1.5 x ULN(간 포함의 경우, ALT/AST ≤ 5 x ULN 및 정상 범위 내의 총 빌리루빈이 허용됨)
f. Cockroft 및 Gault 식 또는 65세 초과 환자에 대해 MDRD 식에 따라서 계산된 혈청 크레아티닌 ≤ 1.5 x ULN 또는 크레아티닌 클리어런스 ≥ 60 mL/분
g. 혈청 알부민 > 3.0 g/dL
조사 및 동반 요법
MCLA - 128: 2시간에 걸쳐 750mg 정맥내 평탄 용량, 3주마다 제1일에(q3w).
파라세타몰/아세크아미노펜, 항히스타민 및 코르티코스테로이드로의 사전약물치료(표준 관행에 따름)는 모든 MCLA-128 주입마다 의무적으로 행한다.
트라스투주맙: 사이클 1의 제1일에 90분에 걸쳐서 8 mg/kg을 정맥내 선도 용량 투여한 후, 사이클 2부터 각 사이클의 제1일(q3w)에 30-90분에 걸쳐 6 mg/kg을 정맥내 투여한다. 안전성 평가 환자의 경우, 트라스투주맙은 사이클 1에서 제2일로 지연된다.
비노렐빈: 3주마다 제1일 및 제8일에 10분에 걸쳐서 25 mg/m2을 정맥내 투여한다. 안전성 평가 환자의 경우, 비노렐빈은 사이클 1에서 제2일 및 제9일로 지연된다.
치료 섭생
모든 조합에 대한 사이클은 3주로 설정한다. 초기 MCLA-128 및/또는 트라스투주맙 투여에 대해 주입 시작 후 6시간 관찰하고, 모든 후속 투여에 대해 2시간 관찰한다.
이중 조합(도 62 참조):
· 안전성 평가(4-6명 환자): 사이클 1에 대해, MCLA-128이 제1일에 투여되고, 제2일에 트라스투주맙이 투여된다. 사이클 2부터 트라스투주맙은 제1일에 MCLA-128의 투여 완료 후 30분 뒤에 투여된다.
· 확장: 모든 사이클에 대해, 트라스투주맙은 제1일에 MCLA-128의 투여 완료 후 30분 뒤에 투여된다.
삼중 조합(도 63 참조):
· 안전성 평가(4-6명 환자): 사이클 1에 대해, MCLA-128이 제1일에 투여된 후 트라스투주맙이 30분 뒤에 투여되고, 비노렐빈은 제2일 및 제9일에 투여된다. 사이클 2에 대해, 비노렐빈이 제1일에 트라스투주맙 후 30분 뒤 투여되고, 제8일에 투여된다.
· 확장: 모든 사이클에 대해, MCLA-128이 제1일에 투여된 후 트라스투주맙이 30분 뒤에 투여된 후, 비노렐빈이 트라스투주맙 주입 종료 후 30분 뒤에 투여된다.
이중 및 삼중 조합 모두에 대해, 개별 환자가 같은 날 모든 약물을 관용하지 않는다면, 안전성 평가 사이클 1 투약 일정이 해당 환자에 대해 유지된다.
치료 배정: 스폰서는, 조합에 따라 이용가능한 안전성 평가 또는 확장 중에, 이중 또는 삼중 조합에 적격한 환자를 교대로 배정한다.
치료 적응
· MCLA-128 또는 트라스투주맙의 용량은 감소시키지 않는다.
· 비노렐빈 용량은 SPC에 따라서 호중구 수가 감소되거나 빌리루빈 수준이 증가된 경우 감소되거나 중단되고, 등급 ≥ 2 신경독성(NCI-CTCAE v. 4.03)이 발생한 경우 중지된다.
· MCLA-128 주입은 주입-관련 반응(IRR) 이벤트가 있을 때 중단되고, 심각한 IRR의 경우 즉시 중지되어야 한다. 경증 내지는 중증 이벤트의 경우, 주입은 50% 주입 속도로 재개될 수 있고 주입 지속기간은 4시간으로 연장된다.
· MCLA-128 및 트라스투주맙의 투여는 AE, 구체적으로 임상적으로 유의한 LVEF 감소, 울혈성 심부전의 징후 또는 지속적 등급 2 또는 등급 3-4 설사를 관리하기 위해 주입 사이에 최대 6주 동안 지연될 수 있다.
치료 지속기간
치료는 진행성 질환 확인(PECIST 1.1에 따라), 허용되지 않는 독성, 동의의 철회, 환자의 비순응, 조사자의 결정(예를 들어, 임상적 악화), 치료 중단 > 연속 6주, 약물의 부작용이 있을 때까지 지속된다. 환자는 최종 약물 투여 후 적어도 35±5일 동안 그리고 관련 독성의 회수/안정화가 있을 때까지, 그리고 질환 진행 및 생존 상태의 경우 12개월 동안 안전성에 대해 추적된다.
예방 및 병용 약물
허용:
· 파라세타몰/아세트아미노펜, 항히스타민 및 코르티코스테로이드의 투여는 모든 MCLA-128 투여에서 의무적으로 행해진다. IRR 또는 과민성 이벤트가 있을 때 환자는 임상적으로 나타낸 대로, 국소 임상 관례에 따라 관리된다.
· 증상 및 AE의 지원 치료 또는 동반 상태의 표준 치료를 포함하여, 환자의 안정에 필요하고 연구 약물의 평가를 방해할 것으로 예상되지 않는 모든 약물치료는 조사자의 판단하에 수행된다.
금지:
· 동반한 만성 경구 코르티코스테로이드(> 10 mg/일, 프레드니손 등가물), TNF-알파 억제제, 항-T-세포 항체(면역억제의 위험으로 인함).
· 연구 도중이나 연구 치료의 최초 용량 투여 4주 전의 임의의 약물
· 연구 도중이나 연구 치료의 최초 용량 투여 3주 이내의 전신 항암 요법 또는 황열병 백신
안전성/관용성 평가
· AE(CTCAE 버전 4.03), SAE
· 실험실 변수: 혈액학, 생화학, 응고, 소변검사, 사이토카인
· ECG, MUGA/ECHO
· 병력, 바이탈 사인, 성취 상태 및 신체 검사
· 동반 약물치료
· 용량 변형(감소, 중단, 지연), 독성으로 인한 중지
효능 평가
종양 평가는 치료 시작 후 6주마다 RECIST 1.1에 따라서 콘트라스트가 있는 CT/MRI에 기초하여 수행한다. 목표 반응은 1차 관찰 후 적어도 4주 뒤에 확인되어야 한다. 독립적 방사선사(들)에 의한 영상의 중앙 검토가 모든 환자(스크리닝 및 연구 중인)에 대해 수행된다. 뼈 전이를 가진 환자에 대해, 베이스라인이나 연구 중인 의심 병소에서 임상적으로 나타낸 대로 뼈 스캔이 수행된다.
종양 마커(CA15-3, CEA, CA27-29)는 매 사이클마다 제1일에 평가된다.
바이오마커
후보 조사 바이오마커가 종양 조직(스크리닝, 12주 후 선택적 및 EOT) 및 혈액(4사이클마다 제1일에 전-용량 및 치료 종료)에서 평가된다.
종양: HER2, HER3, HER2:HER3 다이머화, 하류 신호화 단백질(예를 들어 PIK-3CA), 헤레굴린, HER2의 인산화, MAPK 및 AKT 신호화 경로의 HER3 및 단백질, PTEN과 같은 억제제의 발현, HER2 및 HER3 신호화를 포함하는 암-관련 유전자의 돌연변이, 헤레굴린-유전자 융합.
혈액: Fc 수용체 다형성, 혈장 순환 종양 DNA 돌연변이, 조사중인 혈청 바이오마커(예를 들어 가용성 HER2, 헤레굴린).
약동학
혈액 샘플을 수거하여 혈청 MCLA-128 및 트라스투주맙 노출을 측정한다. 비노렐빈에 대해서는 PK 샘플링을 수행하지 않는다.
PK 샘플링은 아래의 시점에 수행된다:
이중 및 삼중 조합: MCLA-128
· 사이클 1: 제1일, 전-용량, EOI, 및 EOI 후 2, 4 및 22시간 후, 제8일의 아무 때나(또는 안전성 평가 중인 삼중 조합 환자의 경우 제9일)
· 사이클 2: 제1일, 전-용량, EOI(평가 및 확장), 및 EOI 후 2, 4 및 22시간 후, 제8일의 아무 때나(평가 중에만)
· 사이클 3 및 5: 제1일, 전-용량 및 EOI
· 이후 모든 4회 사이클: 전-용량
이중 조합: 트라스투주맙
· 사이클 1 제1일: 전-용량 및 EOI(확장 중에만)
· 사이클 1 제2일: 전-용량 및 EOI(평가 중에만)
· 사이클 2 제1일: 전-용량 및 EOI(평가 및 확장)
삼중 조합: 트라스투주맙
· 사이클 1 및 2, 제1일: 전-용량 및 EOI(평가 및 확장)
면역원성
모든 환자에서 혈액 샘플(5mL)을 수거하여 사이클 1, 3, 5, 이후 4회 사이클, 및 치료 종료 동안 제1일 전-용량시 항-MCLA-128 항체 전-용량의 혈청 역가를 평가한다.
사이토카인
혈액 샘플을 수거하여 혈청 사이토카인 패널(TNFα, IFNγ, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10)을 다음과 같이 안전성 평가 환자에서 분석한다:
이중 조합(평가 중에만):
· 사이클 1: 제1일, 전-용량, MCLA-128의 주입 종료(EOI) 후 2, 4 및 22시간
· 사이클 1: 제2일, 전-용량, 트라스투주맙의 후-EOI 2시간
· 사이클 2: 제1일, 전-용량, MCLA-128의 후-EOI 2, 4 및 22시간
삼중 조합(평가 중에만):
사이클 1 및 2: 제1일, 전-용량, MCLA-128의 후-EOI 2, 4 및 22시간
통계적 고려사항
샘플 크기
안전성 평가: 안전성 평가에 들어간 4 내지 6명의 환자는 80 내지 90%의 검정력을 가지며, 이때 실제 발생률은 33%이다.
효능 확장: 이중 또는 삼중 조합 치료에 들어간 40명의 평가가능한 환자는 30%를 배제할 수 있는 충분한 정확도를 가진다(90% CI의 하한 > 30%). 24주째 CBR 비율의 역치는 PFS가 5개월(임상적으로 관련 있음) 및 3.5개월(임상적으로 관련 없음)의 중위값에서 지수 분포에 따른다는 가정에 기초하여 한정된다.
환자의 최종 숫자는 연구 동안의 안전성 및 효능 성과에 의존한다. 최대 약 130명의 환자를 조사할 수 있으며, 이중 총 40명의 환자는 두 계획된 조합 섭생에 적용 가능하고 약 10% 비율의 환자는 평가 불가능하다.
정의
모든 효능 종점은 RECIST 1.1에 의한 종양 평가에 기초하여 정의되고 분석된다.
CBR: CR, PR 또는 SD ≥ 24주의 최상의 전체 반응을 가진 환자의 비율
ORR: CR 또는 PR의 최상의 전체 반응을 가진 환자의 비율
PFS: 치료 시작부터 방사선 상의 진행 또는 어떤 원인으로 인한 사망까지의 시간
PFS 비: 이전 섭생의 PFS 대 연구 치료에 대한 PFS의 비
DoR: 반응(CR 또는 PR)에서부터 진행 또는 기저 암으로 인한 사망까지의 시간
OS: 치료 시작부터 어떤 원인으로 인한 사망까지의 시간
종점
1차
24주째 조사자의 방사선 상의 검토에 따른 CBR
핵심 2차
중앙 검토에 따라 24주째의 CBR, 및 조사자 및 중앙 검토에 따라 ORR, PFS, 및 DoR
다른 2차
안전성: AE의 발병, 중증도 및 관계, 실험실 비정상, SAE, ECG 및 LVEF 측정 및 바이탈 사인
관용성: AE로 인한 중단, AE로 인한 용량 변형, 면역원성, 및 사이토카인 평가
다른 효능: OS
약동학: MCLA-128에 대한 Cmax, C0h, AUC, CL, Vss, tmax 및 t1/2, 및 트라스투주맙에 대한 CEOI 및 C0h.
분석 집단
치료 집단: MCLA-128의 적어도 1회 용량을 받은 환자
효능에 대해 평가가능한 환자: 적어도 2회의 완료된 치료 사이클(6주)을 받고 베이스라인 평가와 연구 중인 종양 평가를 수행한 환자, 또는 질환 진행으로 인해 조기 중단한 환자.
분석
환자 배치 및 인구통계가 치료 집단에서 분석되며, 효능이 효능 집단에 대해 평가가능한 상태에서 분석되고, 안전성이 치료 집단에서 분석된다. 정량 변수는 기술 통계학을 사용하여 요약된다. 연속 변수는 N, 평균 및/또는 중위값, 표준 편차, 범위로서 표시된다. 범주 변수는 빈도 및 퍼센트를 사용하여 표시된다.
성공적 1차 종점을 위한 기준: 5개월의 중위값 PFS가 관련 있는 것으로 가정되며, 제24주에 CBR에 대한 활성 역치는 45%로 설정된다.
CBR 및 ORR은 90% 정확한 이항 CI와 함께 요약된다.
PFS, OS 및 DoR의 경우, 생존 기능은 Kaplan-Meier 결과 제한법을 사용하여 추산된다. 확률 추산치 및 90% CI가 명시된 시점에 제공되고, 중위값 지속기간 및 90% CI가 또한 제공된다. DoR은 반응자에 대해서만 추산된다.
AE는 '규제 행위를 위한 의학 사전(MedDRA®)'의 바람직한 용어 및 발병 및 중증도에 따른 기관 부류에 의해 표로 정리된다. AE의 중증도는 CTCAE 4.03에 기초한다.
PK, 면역원성, 사이토카인 및 바이오마커가 주로 분석되고 개별적으로 보고된다.
표:
FACS에 의해 결정된 면역화 마우스의 상이한 코호트의 혈청 역가. D = 항체 역가 결정일. 표 1: HER2에 대한 반응. 표 2: HER3에 대한 반응. 사용된 셀라인이 표시된다(MCF7, SKBR3, BT474). 상이한 마우스들이 칼럼에 표시된다.
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<120> Antibody that binds ErbB-2 and ErbB-3
<130> P115065PC00
<140> PCT/NL2018/050205
<141> 2018-04-03
<150> EP 17164396.8
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<150> US 15/476,260
<151> 2017-03-31
<160> 162
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 370
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MF2926
<220>
<221> CDS
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<400> 1
ggcccagccg gccatggcc cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg 52
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu
1 5 10
gtg aaa cct ggg gct tca gtg atg att tcc tgc aag gct tct ggt tac 100
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Met Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
15 20 25
tca ttc act ggc tac cac atg aac tgg gtg aag caa agt cct gaa aag 148
Ser Phe Thr Gly Tyr His Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Lys
30 35 40
agc ctt gag tgg att gga gac ata aat cct agc att ggt acg act gcc 196
Ser Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Asn Pro Ser Ile Gly Thr Thr Ala
45 50 55
cac aac cag att ttc agg gcc aag gcc aca atg act gtt gac aaa tcc 244
His Asn Gln Ile Phe Arg Ala Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser
60 65 70 75
tcc aac aca gcc tac atg cag ctc aag agc ctg aca tct gaa gac tct 292
Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
80 85 90
gga gtc ttt tac tgt gtt aga aga ggg gac tgg tcc ttc gat gtc tgg 340
Gly Val Phe Tyr Cys Val Arg Arg Gly Asp Trp Ser Phe Asp Val Trp
95 100 105
ggc aca ggg acc acg gtc acc gtc tcc agt 370
Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
110 115
<210> 2
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Met Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
His Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Ser Ile Gly Thr Thr Ala His Asn Gln Ile Phe
50 55 60
Arg Ala Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Gly Val Phe Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Arg Gly Asp Trp Ser Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 3
Gly Tyr His Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Lys Ser Leu Glu
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 4
Asn Gln Ile Phe Arg Ala
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MF2926 CDR3
<400> 5
Arg Gly Asp Trp Ser Phe Asp Val
1 5
<210> 6
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<212> DNA
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<220>
<223> MF2930
<220>
<221> CDS
<222> (20)..(379)
<400> 6
ggcccagccg gccatggcc gag gtc cag ctg cag cag tct ggg gct gaa ctg 52
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu
1 5 10
gtg aag cct gga gcc tca gtg atg atg tcc tgt aag gtt tct ggc tac 100
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Met Met Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr
15 20 25
acc ttc act tcc tat cct ata gcg tgg atg aag cag gtt cat gga aag 148
Thr Phe Thr Ser Tyr Pro Ile Ala Trp Met Lys Gln Val His Gly Lys
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Tyr Asn Glu Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Glu Lys Ser
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tct agc aca gtc tac ttg gag ctc agc cga tta aca tct gat gac tct 292
Ser Ser Thr Val Tyr Leu Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Ser
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gct gtt tat tac tgt gca aga agt aac cca tta tat tac ttt gct atg 340
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asn Pro Leu Tyr Tyr Phe Ala Met
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gac tac tgg ggt caa gga acc tcg gtc acc gtc tcc agt 379
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
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<220>
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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Met Met Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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<220>
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<210> 9
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> MF2930 CDR2
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Asn Glu Asn Phe Lys Gly
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MF2930 CDR3
<400> 10
Ser Asn Pro Leu Tyr Tyr Phe Ala Met Asp Tyr
1 5 10
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<400> 11
ggcccagccg gccatggcc cag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg 52
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val
1 5 10
gtc cag cct ggg agg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc 100
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
15 20 25
acc ttc agt agc tat ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag 148
Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
30 35 40
ggg ctg gag tgg gtg gca gtt ata tca tat gat gga agt aat aaa tac 196
Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr
45 50 55
tat gca gac tcc gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc 244
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
60 65 70 75
aag aac acg ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aga gct gag gac acg 292
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
80 85 90
gcc gtg tat tac tgt gca aaa ggt gac tac ggt tct tac tct tct tac 340
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Asp Tyr Gly Ser Tyr Ser Ser Tyr
95 100 105
gcc ttt gat tat tgg ggc caa ggt acc ctg gtc acc gtc tcc agt 385
Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115 120
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Asp Tyr Gly Ser Tyr Ser Ser Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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Ser Tyr Gly Met His
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<213> Artificial Sequence
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Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> MF1849 CDR3
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Gly Asp Tyr Gly Ser Tyr Ser Ser Tyr Ala Phe Asp Tyr
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ggcccagccg gccatggcc cag gtg cag ctg aag cag tct ggg gct gag ctg 52
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu
1 5 10
gtg agg cct ggg gct tca gtg aag ttg tcc tgc aag gct tct ggc tac 100
Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
15 20 25
att ttc act ggc tac tat ata aac tgg ttg agg cag agg cct gga cag 148
Ile Phe Thr Gly Tyr Tyr Ile Asn Trp Leu Arg Gln Arg Pro Gly Gln
30 35 40
gga ctt gaa tgg att gca aaa att tat cct gga agt ggt aat act tac 196
Gly Leu Glu Trp Ile Ala Lys Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr
45 50 55
tac aat gag aag ttc agg ggc aag gcc aca ctg act gca gaa gaa tcc 244
Tyr Asn Glu Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Glu Glu Ser
60 65 70 75
tcc agc act gcc tac atg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct 292
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
80 85 90
gct gtc tat ttc tgt gca aga ggg ccc cac tat gat tac gac ggc ccc 340
Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Pro His Tyr Asp Tyr Asp Gly Pro
95 100 105
tgg ttt gtt tac tgg ggc caa ggg act ctg gtc acc gtc tcc agt 385
Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115 120
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
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Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Leu Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Lys Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Asn Glu Lys Phe Arg Gly
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Gly Pro His Tyr Asp Tyr Asp Gly Pro Trp Phe Val Tyr
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ggcccagccg gccatggcc cag gtg cag ctg aag cag tct ggg gct gag ctg 52
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu
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gtg agg cct ggg gct tca gtg aag ctg tcc tgc aag gct tct ggc tac 100
Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
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Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln
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gga ctt gag tgg att gca agg att tat cct gga agt ggt tat act tac 196
Gly Leu Glu Trp Ile Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Tyr Thr Tyr
45 50 55
tac aat gag aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg act gca gaa gaa tcc 244
Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Glu Glu Ser
60 65 70 75
tcc agc act gcc tac atg cac ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct 292
Ser Ser Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
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gct gtc tat ttc tgt gca aga ccc cac tat ggt tac gac gac tgg tac 340
Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Pro His Tyr Gly Tyr Asp Asp Trp Tyr
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<223> Synthetic Construct
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Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
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Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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aagtggctat acttactaca atgagatttt caagggcagg gccacactga ctgcagacga 240
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Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu
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Val Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
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Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln
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Gly Leu Glu Trp Ile Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Tyr Thr Tyr
45 50 55
tac aat gag aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg act gca gaa gaa tcc 244
Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Glu Glu Ser
60 65 70 75
tcc aac act gcc tat atg cac ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct 292
Ser Asn Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
80 85 90
gct gtc tat ttc tgt gca agg ccc cac tat ggt tac gac gac tgg tac 340
Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Pro His Tyr Gly Tyr Asp Asp Trp Tyr
95 100 105
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Phe Ala Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
110 115 120
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
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Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Glu Glu Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Pro His Tyr Gly Tyr Asp Asp Trp Tyr Phe Ala Val Trp Gly
100 105 110
Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<213> Artificial Sequence
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Gly Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu
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Asn Glu Lys Phe Lys Gly
1 5
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<212> PRT
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<221> CDS
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ggcccagccg gccatggcc cag gtc cag ctg cag cag tct ggg gct gag ctg 52
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu
1 5 10
gtg agg cct ggg gct tca gtg aag ctg tcc tgc aag gct tct ggc tac 100
Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
15 20 25
act ttc act ggc tac tat ata aac tgg gtg aag cag agg cct gga cag 148
Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln
30 35 40
gga ctt gag tgg att gca agg att tat cct ggc agt ggt cat act tcc 196
Gly Leu Glu Trp Ile Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly His Thr Ser
45 50 55
tac aat gag aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg act aca gaa aaa tcc 244
Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Glu Lys Ser
60 65 70 75
tcc agc act gcc tac atg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct 292
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
80 85 90
gct gtc tat ttc tgt gca aga cct atc tac ttt gat tac gca ggg ggg 340
Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Pro Ile Tyr Phe Asp Tyr Ala Gly Gly
95 100 105
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Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Arg Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
110 115 120
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<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 36
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly His Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Glu Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
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Ala Arg Pro Ile Tyr Phe Asp Tyr Ala Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp
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Gly Thr Arg Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> MF2916 CDR3
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Pro Ile Tyr Phe Asp Tyr Ala Gly Gly Tyr Phe Asp Val
1 5 10
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<211> 382
<212> DNA
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<223> MF3958
<220>
<221> CDS
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<400> 38
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
1 5 10
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Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
15 20 25
acc ttc acc gcc tac tac atc aac tgg gtc cga cag gcc cca ggc cag 148
Thr Phe Thr Ala Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
30 35 40
ggc ctg gaa tgg atc ggc aga atc tac ccc ggc tcc ggc tac acc agc 196
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Tyr Thr Ser
45 50 55
tac gcc cag aag ttc cag ggc aga gcc acc ctg acc gcc gac gag agc 244
Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser
60 65 70 75
acc agc acc gcc tac atg gaa ctg agc agc ctg cgg agc gag gat acc 292
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
80 85 90
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Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Pro Pro Val Tyr Tyr Asp Ser Ala Trp
95 100 105
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Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115 120
<210> 39
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Pro Val Tyr Tyr Asp Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<213> Artificial Sequence
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<223> MF3958 CDR2
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1 5 10 15
Gly
<210> 42
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MF3958 CDR3
<400> 42
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1 5 10
<210> 43
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 43
ggcccagccg gccatggccc aggtccagct gcagcagtct ggggctgagc tggtgaggcc 60
tggggcttca gtgaagctgt cctgcaaggc ttctggctac actttcactg cctactatat 120
aaactgggtg aagcagaggc ctggacaggg acttgagtgg attgcaaaga tttatcctgg 180
aagtggttat acttactaca atgagaattt caggggcaag gccacactga ctgcagaaga 240
atcctccagt actgcctaca tacaactcag cagcctgaca tctgaggact ctgctgtcta 300
tttctgtgca agaggcgtct atgattacga cggggcctgg tttgcttact ggggccaagg 360
gactctggtc accgtctcca gt 382
<210> 44
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> MF3031 CDR1
<400> 44
Ala Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu
1 5 10 15
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> MF3031 CDR3
<400> 46
Gly Val Tyr Asp Tyr Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 47
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MF3991
<220>
<221> CDS
<222> (20)..(382)
<400> 47
ggcccagccg gccatggcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggc gcc gaa gtg 52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
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aag aaa cct ggc gcc agc gtg aag ctg agc tgc aag gcc agc ggc tac 100
Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
15 20 25
acc ttc acc gcc tac tac atc aac tgg gtc cga cag gcc cca ggc cag 148
Thr Phe Thr Ala Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
30 35 40
ggc ctg gaa tgg atc ggc aga atc tac ccc ggc tcc ggc tac acc agc 196
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Tyr Thr Ser
45 50 55
tac gcc cag aag ttc cag ggc aga gcc acc ctg acc gcc gac gag agc 244
Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser
60 65 70 75
acc agc acc gcc tac atg gaa ctg agc agc ctg cgg agc gag gat acc 292
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
80 85 90
gcc gtg tac ttc tgc gcc aga ccc cac tac ggc tac gac gac tgg tac 340
Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Pro His Tyr Gly Tyr Asp Asp Trp Tyr
95 100 105
ttc ggc gtg tgg ggc cag ggc acc ctg gtc acc gtc tcc agt 382
Phe Gly Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115 120
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<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Pro His Tyr Gly Tyr Asp Asp Trp Tyr Phe Gly Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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1 5 10 15
Gly
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MF3991 CDR3
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
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aag aag cct ggg gcc tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga tac 100
Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
15 20 25
acc ttc acc ggc tac tat atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa 148
Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
30 35 40
ggg ctt gag tgg atg gga tgg atc aac cct aac agt ggt ggc aca aac 196
Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn
45 50 55
tat gca cag aag ttt cag ggc agg gtc acg atg acc agg gac acg tcc 244
Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser
60 65 70 75
atc agc aca gcc tac atg gag ctg agc agg ctg aga tct gac gac acg 292
Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr
80 85 90
gct gtg tat tac tgt gca aga gat cat ggt tct cgt cat ttc tgg tct 340
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp His Gly Ser Arg His Phe Trp Ser
95 100 105
tac tgg ggc ttt gat tat tgg ggc caa ggt acc ctg gtc acc gtc tcc 388
Tyr Trp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
110 115 120
agt 391
Ser
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<212> PRT
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<220>
<223> Synthetic Construct
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
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Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
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Ala Arg Asp His Gly Ser Arg His Phe Trp Ser Tyr Trp Gly Phe Asp
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Gly
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
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Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
15 20 25
acc ttt agc agc tat gcc atg agc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag 148
Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
30 35 40
ggg ctg gag tgg gtc tca gct att agt ggt agt ggt ggt agc aca tac 196
Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr
45 50 55
tac gca gac tcc gtg aag ggc cgg ttc acc atc tcc aga gac aat tcc 244
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
60 65 70 75
aag aac acg ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg 292
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
80 85 90
gct gtg tat tac tgt gca aga gat tgg tgg tac ccg ccg tac tac tgg 340
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Trp Trp Tyr Pro Pro Tyr Tyr Trp
95 100 105
ggc ttt gat tat tgg ggc caa ggt acc ctg gtc acc gtc tcc agt 385
Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<223> Synthetic Construct
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75 80
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<213> Artificial Sequence
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Gly
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gcactgggtg cgacaggccc ctggacaagg gcttgagtgg atgggatgga tcaaccctaa 180
cagtggtggc acaaactatg cacagaagtt tcagggcagg gtcacgatga ccagggacac 240
gtccatcagc acagcctaca tggagctgag caggctgaga tctgacgaca cggccgtgta 300
ttactgtgca aaagattctt actctcgtca tttctactct tggtgggcct ttgattattg 360
gggccaaggt accctggtca ccgtctccag t 391
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
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Gly
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<213> Artificial Sequence
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Asp Ser Tyr Ser Arg His Phe Tyr Ser Trp Trp Ala Phe Asp Tyr
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ggcccagccg gccatggcc gag gtc cag ctg cag cag cct ggg gct gag ctg 52
Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu
1 5 10
gtg agg cct ggg act tca gtg aag ttg tcc tgc aag gct tct ggc tac 100
Val Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
15 20 25
acc ttc acc agc tac tgg atg cac tgg gta aag cag agg cct gga caa 148
Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln
30 35 40
ggc ctt gag tgg atc gga att ctt gat cct tct gat agt tat act acc 196
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ile Leu Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Thr
45 50 55
tac aat caa aag ttc aag ggc aag gcc aca tta aca gta gac aca tcc 244
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser
60 65 70 75
tcc agc ata gcc tac atg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct 292
Ser Ser Ile Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
80 85 90
gcg ctc tat tac tgt gca aga ggg gga gat tac gac gag gga ggt gct 340
Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Asp Glu Gly Gly Ala
95 100 105
atg gac tac tgg ggt caa gga acc tcg gtc acc gtc tcc agt 382
Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
110 115 120
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<211> 121
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
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Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
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Gly Ile Leu Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
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<213> Artificial Sequence
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Ile Leu Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
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Gly
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<400> 69
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<223> MF3307
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<221> CDS
<222> (20)..(391)
<400> 70
ggcccagccg gccatggcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg 52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
1 5 10
aag aag cct ggg gcc tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga tac 100
Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
15 20 25
acc ttc acc ggc tac tat atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa 148
Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
30 35 40
ggg ctt gag tgg atg gga tgg atc aac cct aac agt ggt ggc aca aac 196
Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn
45 50 55
tat gca cag aag ttt cag ggc agg gtc acg atg acc agg gac acg tcc 244
Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser
60 65 70 75
atc agc aca gcc tac atg gag ctg agc agg ctg aga tct gac gac acg 292
Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr
80 85 90
gcc gtg tat tac tgt gca aga ggt tct cgt aaa cgt ctg tct aac tac 340
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Arg Lys Arg Leu Ser Asn Tyr
95 100 105
ttc aac gcc ttt gat tat tgg ggc caa ggt acc ctg gtc acc gtc tcc 388
Phe Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
110 115 120
agt 391
Ser
<210> 71
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 71
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Ser Arg Lys Arg Leu Ser Asn Tyr Phe Asn Ala Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MF3307 CDR2
<400> 72
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Gly
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MF3307 CDR3
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Gly Ser Arg Lys Arg Leu Ser Asn Tyr Phe Asn Ala Phe Asp Tyr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IGKV1-39/jk1 common light chain
<400> 74
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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50 55 60
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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<210> 75
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain for erbB-2 binding
<400> 75
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr
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Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
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Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Asp Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Glu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
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385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 76
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain for erbB-3 binding
<400> 76
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp His Gly Ser Arg His Phe Trp Ser Tyr Trp Gly Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Lys Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
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Ser Leu Ser Pro Gly
450
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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu
1 5 10
gta agg cct ggg act tca gtg aag gtg tcc tgc aag gct tct gga tac 100
Val Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
15 20 25
gcc ttc act aat tat ttg ata gag tgg gta aag cag agg cct ggc cag 148
Ala Phe Thr Asn Tyr Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln
30 35 40
ggc ctt gag tgg att gga gtg att tat cct gaa ggt ggt ggt act atc 196
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Tyr Pro Glu Gly Gly Gly Thr Ile
45 50 55
tac aat gag aag ttc aag ggc aag gca aca ctg act gca gac aaa tcc 244
Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser
60 65 70 75
tcc agc act gcc tac atg cag ctc agc ggc ctg aca tct gag gac tct 292
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser
80 85 90
gcg gtc tat ttc tgt gca aga gga gac tat gat tac aaa tat gct atg 340
Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Asp Tyr Asp Tyr Lys Tyr Ala Met
95 100 105
gac tac tgg ggt caa gga acc tcg gtc acc gtc tcc agt 379
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
110 115 120
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<223> Synthetic Construct
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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Tyr Pro Glu Gly Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
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Ala Arg Gly Asp Tyr Asp Tyr Lys Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
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Gly
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Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu
1 5 10
gtg aag cct ggc gct tca gtg aag ata tcc tgc aag gct tct ggt tac 100
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
15 20 25
tca ttc act gac tac aaa atg gac tgg gtg aag cag agc cat gga aag 148
Ser Phe Thr Asp Tyr Lys Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys
30 35 40
agc ctc gaa tgg att gga aat att aat cct aac agt ggt ggt gtt atc 196
Ser Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Val Ile
45 50 55
tac aac cag aag ttc agg ggc aag gtc aca ttg act gtt gac agg tcc 244
Tyr Asn Gln Lys Phe Arg Gly Lys Val Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser
60 65 70 75
tcc agc gca gcc tac atg gag ctc cgc agc ctg aca tct gag gac act 292
Ser Ser Ala Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr
80 85 90
gca gtc tat tat tgt tca aga gga ctg tgg gat gct atg gac tcc tgg 340
Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Gly Leu Trp Asp Ala Met Asp Ser Trp
95 100 105
ggt caa gga acc tcg gtc acc gtc tcc agt 370
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
110 115
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<223> Synthetic Construct
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Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
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Lys Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Val Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ser Arg Gly Leu Trp Asp Ala Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
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Asn Gln Lys Phe Arg Gly
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val
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Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
15 20 25
acc ttc agt agc tat ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag 148
Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
30 35 40
ggg ctg gag tgg gtg gca gtt ata tca tat gat gga agt aat aaa tac 196
Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr
45 50 55
tat gca gac tcc gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc 244
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
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aag aac acg ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aga gct gag gac acg 292
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
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Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Trp Trp His Pro Leu Leu Ser Gly
95 100 105
ttt gat tat tgg ggc caa ggt acc ctg gtc acc gtc tcc agt 382
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115 120
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<223> Synthetic Construct
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
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Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly
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Gly Trp Trp His Pro Leu Leu Ser Gly Phe Asp Tyr
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ggcccagccg gccatggcc gag gtc cag ctg cag cag tct ggg gct gaa ctg 52
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu
1 5 10
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Ala Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr
15 20 25
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Asn Phe Pro Ile Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg
30 35 40
ggt ctg gaa tgg att gga tac att aat cct agt act ggt tat att aag 196
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Ile Lys
45 50 55
aac aat cag aag ttc aag gac aag gcc acc ttg act gca gac aaa tcc 244
Asn Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser
60 65 70 75
tcc aac aca gcc tac atg cag ctg aac agc ctg aca tat gag gac tct 292
Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Glu Asp Ser
80 85 90
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Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Gly Ile Thr Gly Phe Thr Tyr Trp
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<223> Synthetic Construct
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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Asn Phe Pro Ile Tyr
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Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
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50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
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100 105 110
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Asn Gln Lys Phe Lys Asp
1 5
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val
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Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
15 20 25
acc ttc agt agc tat ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag 148
Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
30 35 40
ggg ctg gag tgg gtg gca gtt ata tca tat gat gga agt aat aaa tac 196
Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr
45 50 55
tat gca gac tcc gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc 244
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
60 65 70 75
aag aac acg ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aga gct gag gac acg 292
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
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gcc gtg tat tac tgt gca aaa gat ggt ttc cgt cgt act act ctg tct 340
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Gly Phe Arg Arg Thr Thr Leu Ser
95 100 105
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Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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Asp Gly Phe Arg Arg Thr Thr Leu Ser Gly Phe Asp Tyr
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Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Glu Leu
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Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp
15 20 25
gca ttc agt tac tcc tgg atg aac tgg gtg aag cag agg cct gga aag 148
Ala Phe Ser Tyr Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys
30 35 40
ggt ctt gag tgg att gga cgg att tat cct gga gat gga gat att aac 196
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ile Asn
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tac aat ggg aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg act gca gac aaa tcc 244
Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser
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Ser Ser Thr Ala His Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
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<223> Synthetic Construct
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<400> 104
Gly Gln Leu Gly Leu Glu Ala Trp Phe Ala Tyr
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<223> MF6058
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<221> CDS
<222> (20)..(391)
<400> 105
ggcccagccg gccatggcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gac gtg 52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Asp Val
1 5 10
aag aag cct ggg gcc tca gtg aag gtc acg tgc aag gct tct gga tac 100
Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Thr Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
15 20 25
acc ttc acc ggc tac tat atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa 148
Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
30 35 40
gct ctt gag tgg atg gga tgg atc aac cct caa agt ggt ggc aca aac 196
Ala Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Gln Ser Gly Gly Thr Asn
45 50 55
tat gca aag aag ttt cag ggc agg gtc tct atg acc agg gag acg tcc 244
Tyr Ala Lys Lys Phe Gln Gly Arg Val Ser Met Thr Arg Glu Thr Ser
60 65 70 75
aca agc aca gcc tac atg cag ctg agc agg ctg aga tct gac gac acg 292
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr
80 85 90
gct acg tat tac tgt gca aga gat cat ggt tct cgt cat ttc tgg tct 340
Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp His Gly Ser Arg His Phe Trp Ser
95 100 105
tac tgg ggc ttt gat tat tgg ggc caa ggt acc ctg gtc acc gtc tcc 388
Tyr Trp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
110 115 120
agt 391
Ser
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<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 106
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Asp Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Thr Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Gln Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Lys Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Ser Met Thr Arg Glu Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp His Gly Ser Arg His Phe Trp Ser Tyr Trp Gly Phe Asp
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Gly
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MF6061
<220>
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Claims (36)
- ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가지거나 상기 종양이 발생할 위험이 있는 개체의 치료 방법에서 사용하기 위한, ErbB-2 표적화제; 및 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위 및 ErbB-3의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체의 조합.
- 제 1 항에 있어서, 상기 ErbB-2의 표적화제는 ErbB-2 결합제인 것을 특징으로 하는 사용을 위한 조합.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 ErbB-2의 표적화제는 ErbB-2 억제제인 것을 특징으로 하는 사용을 위한 조합.
- 제 3 항에 있어서, 상기 ErbB-2의 억제제는 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 2가 단일특이적 항체인 것을 특징으로 하는 사용을 위한 조합.
- 제 4 항에 있어서, 상기 단일특이적 항체와 이중특이적 항체는 ErbB-2 상의 상이한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 사용을 위한 조합.
- 제 5 항에 있어서, 상기 상이한 ErbB-2 에피토프는 상이한 세포외 ErbB-2 도메인 상에 있는 것을 특징으로 하는 사용을 위한 조합.
- 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 단일특이적 항체는 ErbB-2 세포외 도메인 IV, 도메인 III 및/또는 도메인 II 상의 에피토프에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 사용을 위한 조합.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 ErbB-2 세포외 도메인 I 상의 에피토프에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 사용을 위한 조합.
- 제 4 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일특이적 항체는 약물 콘쥬게이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 사용을 위한 조합.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 약물 콘쥬게이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 사용을 위한 조합.
- 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 상기 약물 콘쥬게이트는 엠탄신을 포함하는 것을 특징으로 하는 사용을 위한 조합.
- 제 4 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일특이적 항체는 트라스투주맙인 것을 특징으로 하는 사용을 위한 조합.
- 제 4 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일특이적 항체는 트라스투주맙 엠탄신인 것을 특징으로 하는 사용을 위한 조합.
- 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 항체 PB4188을 포함하는 것을 특징으로 하는 사용을 위한 조합.
- 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료를 필요로 하는 개체에게 화학요법 약물을 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 사용을 위한 조합.
- ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가지거나 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양이 발생할 위험이 있는 개체의 치료 방법으로서,
치료를 필요로 하는 개체에게 ErbB-2의 표적화제 및 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위 및 ErbB-3의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- ErbB-2의 표적화제 및 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위 및 ErbB-3의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 포함하는 제약학적 조성물.
- ErbB-2의 표적화제 및 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위 및 ErbB-3의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 포함하는 키트.
- 제 16 항, 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 상기 ErbB-2의 표적화제는 ErbB-2의 결합제 또는 억제제인 것을 특징으로 하는 치료 방법, 제약학적 조성물 또는 키트.
- 제 19 항에 있어서, 상기 ErbB-2의 결합제 또는 억제제는 라파티닙 또는 네라티닙인 것을 특징으로 하는 치료 방법, 제약학적 조성물 또는 키트.
- 제 16 항, 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 상기 ErbB-2의 표적화제는 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 2가 단일특이적 항체인 것을 특징으로 하는 치료 방법, 제약학적 조성물 또는 키트.
- 뇌에 ErbB-2 양성 및 ErbB-3 양성 종양을 가지거나 뇌에서 ErbB-2 양성 및 ErbB-3 양성 종양이 발생할 위험이 있는 개체의 치료에서 사용하기 위한, ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위 및 ErbB-3의 세포외 부분 상에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체.
- 제 22 항에 있어서, 상기 종양은 전이성 뇌 종양인 것을 특징으로 하는 사용을 위한 이중특이적 항체.
- 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 ErbB-2 세포외 도메인 I 상의 에피토프에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 사용을 위한 이중특이적 항체.
- 제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 ErbB-3 세포외 도메인 III 상의 에피토프에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 사용을 위한 이중특이적 항체.
- 제 22 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 ErbB2의 표적화제의 투여를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 사용을 위한 이중특이적 항체.
- 제 26 항에 있어서, 상기 ErbB-2의 표적화제는 라파티닙 또는 네라티닙인 것을 특징으로 하는 사용을 위한 이중특이적 항체.
- 제 26 항에 있어서, 상기 ErbB-2의 표적화제는 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 포함하는 2가 단일특이적 항체인 것을 특징으로 하는 사용을 위한 이중특이적 항체.
- 제 22 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 ErbB-3의 표적화제의 투여를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 사용을 위한 이중특이적 항체.
- 제 29 항에 있어서, 상기 ErbB-3의 표적화제는 파트리투맙, MM-121(세리반투맙), 또는 룸레투주맙과 같은 항체인 것을 특징으로 하는 사용을 위한 이중특이적 항체.
- 제 29 항에 있어서, 상기 ErbB-2의 억제제는 ErbB-3의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 2가 단일특이적 항체인 것을 특징으로 하는 사용을 위한 이중특이적 항체.
- 제 28 항 또는 제 31 항에 있어서, 상기 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프 또는 ErbB-3의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 가진 2가 단일특이적 항체는 약물 콘쥬게이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
- 제 32 항에 있어서, 상기 약물은 엠탄신을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
- 제 28 항에 있어서, ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 가진 2가 단일특이적 항체는 트라스투주맙, 퍼투주맙 또는 동일한 가변 도메인 아미노산 서열을 가진 바이오시밀러인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
- 제 22 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 항체 PB4188인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
- 뇌에 ErbB-2 양성 및 ErbB-3 양성 종양을 가지거나 뇌에서 ErbB-2 양성 및 ErbB-3 양성 종양이 발생할 위험이 있는 개체의 치료 방법으로서,
치료를 필요로 하는 개체에게 ErbB-2의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위 및 ErbB-3의 세포외 부분 상의 에피토프에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
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