BR112019020507A2

BR112019020507A2 - agente de alvejamento de erbb-2 e um anticorpo bispecífico com locais de ligação de antígenos que ligam um epítopo em uma parte extracelular de erbb-2 e erbb-3 para tratamento de um indivíduo com um tumor positivo erbb-2, erbb-2 / erbb-3

Info

Publication number: BR112019020507A2
Application number: BR112019020507-1A
Authority: BR
Inventors: Mark Throsby; Cecilia Anna Wilhelmina Geuijen; David Andre Baptiste Maussang-Detaille; Ton Logtenberg
Original assignee: Merus N.V.
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2018-04-03
Publication date: 2020-08-04
Also published as: IL269655B2; SG11201908833TA; EP3600412A1; CA3058342A1; JP2020515594A; AU2018246872C1; IL269655B1; PH12019550203A1; AU2018246872B2; MX2019011658A; KR20190140944A; JP7304815B2; AU2018246872A1; WO2018182421A1; IL269655A; CN111032081A

Abstract

A invenção se refere, entre outros, a anticorpos compreendendo um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-3. Os anticorpos podem tipicamente reduzir a função de receptor de ErbB-3 induzida por ligante em uma célula positiva ErbB-2 e ErbB-3. Também são descritos métodos para o tratamento e uso de anticorpos em imagens e no tratamento de indivíduos com tumor positivo em ErbB-2, ErbB- 3 ou ErbB-2/3.

Description

AGENTE DE ALVEJAMENTO DE ERBB-2 E UM ANTICORPO BISPECÍFICO

COM LOCAIS DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENOS QUE LIGAM UM EPÍTOPO EM UMA PARTE EXTRACELULAR DE ERBB-2 E ERBB-3 PARA TRATAMENTO DE UM INDIVÍDUO COM UM TUMOR POSITIVO ERBB-2, ERBB-2 / ERBB-3

[001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido EP No. 17164396,8, depositado em 31 de março de 2017, e US 15/476260, depositado em 31 de março de 2017, os conteúdos dos quais são aqui incorporadas por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A invenção relaciona-se com o campo dos anticorpos. Em particular, refere-se ao campo dos anticorpos terapêuticos (humanos) para o tratamento de doenças que envolvem as células aberrantes. Mais em particular, refere- se a anticorpos que se ligam de ErbB-2 e ErbB-3 e a sua utilização na ligação de células positivas ErbB-2 e ErbB-3, em particular, células tumorais.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] A família do receptor do fator crescimento epidérmico humano (HER, também referidos coletivamente como a rede de sinalização de ErbB) é uma família de receptores transmembranares tirosina-quinase (RTK). A família inclui o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), também conhecido como ErbB-1 (ou HER1), e os receptores homólogos erbB-2 (HER2), ErbB-3 (HER3) e ErbB-4 (HER4). Os receptores (revisto em Yarden e Pines 2012) são amplamente expressos em células epiteliais. A super-regulação de receptores HER ou os seus ligantes, tais como a heregulina (HRG) ou fator de crescimento epidérmico (EGF), é um acontecimento frequente em câncer humano (Wilson, Fridlyand et al. 2012).

[004] A super-expressão de ErbB-1 e ErbB-2, em particular, ocorre em tumores epiteliais e está associada com a invasão do tumor, metástase, resistência à quimioterapia, e prognóstico fraco (Zhang, Berezov et al., 2007). Em mama normal, ErbB-3 tem mostrado ser importante para o crescimento e diferenciação do epitélio luminal. Por exemplo, a perda / inibição de ErbB-3 resulta na expansão seletiva basal ao longo do epitélio luminal (Balko, Miller et al. 2012). A ligação do ligante ao domínio extracelular do RTKs induz a dimerização do receptor, tanto entre a mesma (homodimerização) e subtipos diferentes de receptores (heterodimerização). A dimerização pode ativar os domínios da tirosina quinase intracelulares, os quais se submetem a autofosforilação e, por sua vez, pode ativar um número de vias a jusante pró-proliferativas de sinalização, incluindo as mediadas por quinases de proteína ativada por mitogênio (MAPK) e a via de prosobrevivência Akt (revisto em Yarden e Pines, 2012). Nenhum ligante endógeno específico foi identificado por erbB-2, o qual é assumido, por conseguinte, para sinalizar normalmente através de heterodimerização (Sergina, Rausch et al., 2007). ErbB-3 pode ser ativado pelo engate dos seus ligantes. Estes ligantes incluem, mas não estão limitados a neuregulina (NRG) e hereguhn (HRG).

[005] Vários modos de ativação de sinalização da família de receptores ErbB foram identificados. Entre estes estão a ativação independente do ligante e o ligante dependente de sinalização. Superexpressão ErbB-2 é capaz de gerar sinalização oncogênica, através do heterodímero ErbB-

2:ErbB-3, mesmo na ausência do ligante ErbB-3 (Junttila, de Akita et al., 2009). A atividade de ErbB-2 pode ser inibida por anticorpos específicos de ErbB-2. Tais anticorpos específicos de ErbB-2 são, por exemplo, utilizados no tratamento de erbB-2 positivos (tumores HER2 +). Um problema com estes tratamentos é que frequentemente os tumores escapam ao tratamento específico de ErbB-2 e continuam a crescer mesmo na presença do anticorpo inibidor. Tem sido observado que tumores ErbB-2 positivos, tais como os da mama, ovário, colo uterino e tumores gástricos pode escapar ao tratamento pelo crescimento seletivo de uma subpopulação de células tumorais que apresentam superregução da expressão ErbB-3 (Ocana, Vera-Badillo et al. 2013) e / ou expressão ao ligante ErbB-3 (Wilson, Fridlyand et al. 2012). Também mutações ativadoras no receptor ErbB-3 foram identificadas.

[006] O anticorpo monoclonal trastuzumab anti-ErbB- 2 (Herceptin) e o cetuximab específico ErbB-1 (Erbitux) estão entre os vários anticorpos monoclonais aprovados para aplicação clínica. Trastuzumab tem um benefício comprovado de sobrevivência no câncer da mama metastático (Arteaga, Sliwkowski et al. 2011). O mecanismo de ação preciso do trastuzumab não foi inequivocamente estabelecido. Os modos de ação sugeridos são a inibição da sinalização RTK e o recrutamento de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Outros mecanismos de ação que foram descritos incluem bloquear a clivagem proteolítica do domínio extracelular de ErbB-2, a inibição de fatores angiogênicos e realce de endocitose do receptor. Outros agentes que interferem com a sinalização de ErbB-2 têm sido aprovados ou estão em desenvolvimento para o tratamento de câncer da mama e outros cânceres de superexpressão de erbB-

2. Por exemplo, o composto químico lapatinib inibe tanto a atividade de tirosina quinase ErbB- 1 e ErbB-2 e é usado em tratamento de primeira linha de ErbB-2 do câncer da mama amplificado.

[007] Em pacientes com câncer da mama metastático HER2+, resistência à trastuzumab ou como agente único ou em combinação com quimioterapia, geralmente ocorre meses após o início da terapia. Apenas uma fração de pacientes com câncer da mama metastático HER2+ respondem ao único agente trastuzumab, sugerindo novos mecanismos de resistência em cânceres avançados. Estes mecanismos incluem, entre outros, a sinalização a partir de outra família de receptores HER e sinalização compensatória a partir de RTKs fora da família HER (Thery et al., Resistance to human epidermal growth factor receptor type 2-targeted therapies, Eur J Cancer (2014), Vol. 50, Issue 5, pages 892-901 (http://dx.doi.org/10.1016/j.ejca.2014.01.003 )). Por exemplo, a super-expressão de HER3 ou os seus ligantes, juntamente com HER2, conduz à formação de heterodímeros HER- 2 / HER-3 e resistência adquirida ao trastuzumab. Assim, o anticorpo trastuzumab pensa-se ser ineficaz no bloqueio da sinalização acionado por ErbB-3 (Wehrman, Raab et al. 2006, Junttila, Akita et al. 2009, Thery et al. 2014).

[008] Recentemente, o anticorpo monoclonal pertuzumabe foi aprovado para utilização em combinação com trastuzumab com base de um benefício extra de 5 meses de sobrevivência livre de progressão (Baselga et al. Cortes

2012). Pertuzumabe também se liga erbB-2, mas em uma posição diferente do que o trastuzumabe.

[009] Outras estratégias para o tratamento de tumores positivos ErbB-2 são dirigidos para ErbB-3. ErbB-3 de ligação de anticorpos monoclonais têm demonstrado atividade em estudos pré-clínicos (Schoeberl, Faber et al. 2010). Alguns anticorpos monoclonais que se ligam ErbB-3 podem inibir a proliferação e crescimento de uma variedade de cânceres.

[0010] Outra estratégia envolve a ligação de tanto o receptor de erbB-2 e ErbB-3. A molécula de MM-111, é uma molécula biológica artificial contendo dois fragmentos de cadeia simples Fv (scFv) que se ligam de ErbB-2 e ErbB-3. Os dois scFv estão associados com uma proteína mutada de albumina de soro humano (HSA) para aumentar a meia-vida da molécula. Em testes pré-clínicos foi mostrado a molécula para inibir a ErbB-3 e a proliferação de sinalização. Este efeito foi medido predominantemente em linhagens de células positivas ErbB-3 que expressavam quantidades relativamente elevadas de ErbB-2.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0011] A invenção proporciona um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, e, em que o anticorpo pode reduzir a função do receptor induzida pelo ligante de ErbB- 3 em uma ErbB -2 e celular positiva ErbB-3. O referido primeiro local de ligação ao antígeno é de preferência presente em um domínio variável compreendendo uma cadeia VH com a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF2926; MF2930; MF1849; MF2973; MF3004; MF3958 (MF2971 é humanizado); MF2971; MF3025; MF2916; MF3991 (MF3004 é humanizado); MF3031; MF2889; MF2913; MF1847; MF3001; MF3003 ou MF1898 como representado na figura 16A ou figura 16E. O referido segundo local de ligação ao antígeno é de preferência presente em um domínio variável compreendendo uma cadeia VH com a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 ou MF6074 como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou Figura 37. A imunoglobulina de cadeia leve do domínio variável de um modo preferido compreende a sequência de aminoácidos da figura 16C.

[0012] Um anticorpo da presente invenção é, a menos que de outra forma eespecíficoamente indicado, de preferência, um anticorpo biespecífico.

[0013] A invenção proporciona ainda uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de acordo com a invenção.

[0014] É ainda proporcionado um anticorpo de acordo com a invenção, que compreende ainda um marcador, preferivelmente, um marcador para imagiologia in vivo.

[0015] A invenção também fornece um método para o tratamento de um sujeito tendo uma célula positiva ErbB-2, ErbB-3 ou de ErbB-2 / ErbB-3, incluindo uma célula deletérica, ou tumor ou um sujeito em risco de ter o referido tumor compreendendo administrar para o sujeito um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção. Também é fornecido um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção para utilização no tratamento de um sujeito possuindo, ou em risco de ter um tumor positivo de ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-

3.

[0016] A invenção proporciona ainda um método de tratamento de um indivíduo que tem um tumor positivo de ErbB- 2 ou está em risco de desenvolver um tumor positivo ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3, o método compreendendo a administração ao indivíduo em necessidade do mesmo, um agente de alvejamento ErbB-2, incluindo um inibidor ou agente de ligação de erbB-2, por exemplo, um anticorpo monoespecífico bivalente que compreende um local de ligação ao antígeno que pode se ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB- 2, e um anticorpo biespecífico que compreende um local de ligação ao antígeno que pode se ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-2 e um local de ligação ao antígeno que pode se ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-3.

[0017] Também fornecida é uma combinação de um agente de ErbB-2 de alvejamento, incluindo um inibidor ou agente de ligação de erbB-2, por exemplo, um anticorpo monoespecífico bivalente que compreende locais de ligação ao antígeno que pode se m ligar a um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-2, e um anticorpo biespecífico que compreende um local de ligação ao antígeno que pode se ligar a um epítopo na parte extracelular de ErbB-2 e um local de ligação ao antígeno que pode se ligar a um epítopo na parte extracelular de ErbB-3, para utilização num método de tratamento de um indivíduo que tem um tumor positivo de ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3 ou está em risco de desenvolver o referido tumor.

[0018] Ainda proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um agente de alvejamento ErbB-2, incluindo um inibidor ou agente de ligação de erbB-2, por exemplo, um anticorpo monoespecífico bivalente que compreende locais de ligação ao antígeno que pode se ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-2 e um anticorpo biespecífico que compreende um local de ligação ao antígeno que pode se ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-2 e um local de ligação ao antígeno que pode se ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-3.

[0019] Também é fornecido um kit de partes que compreende um agente de alvejamento ErbB-2, incluindo um inibidor ou agente de ligação de erbB-2, por exemplo, um anticorpo monoespecífico bivalente que compreende locais de ligação ao antígeno que pode se ligar a um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-2 e um anticorpo biespecífico que compreende um local de ligação ao antígeno que pode se ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-2 e um local de ligação ao antígeno que pode se ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-3.

[0020] Também é fornecido um método de tratamento de um indivíduo que tem um tumor positivo erbB-2 e ErbB-3 no cérebro ou está em risco de desenvolver um tumor positivo erbB-2 e ErbB-3 no cérebro. O método compreendendo administrar ao indivíduo em necessidade do mesmo um anticorpo biespecífico que compreende um local de ligação ao antígeno que pode se ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-2 e um local de ligação ao antígeno que pode se ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-3.

[0021] Também é fornecido um anticorpo biespecífico que compreende um local de ligação ao antígeno que pode se ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-2 e um local de ligação ao antígeno que pode se ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-3 para utilização no tratamento de um indivíduo que tem um tumor positivo ErbB-3 e tumor positivo ErbB-2 no cérebro ou está em risco de desenvolver um tumor ErbB-2 positivo e ErbB-3 positivo no cérebro.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0022] A invenção proporciona um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-3, em que o anticorpo biespecífico reduz ou pode reduzir uma função do receptor induzida pelo ligante de ErbB-3 sobre uma célula de ErbB-2 e ErbB-3 positiva.

[0023] Tal como aqui utilizado, o termo "local de ligação ao antígeno" refere-se a um local e derivados de, e, de preferência, como presente num anticorpo biespecífico que é capaz de se ligar ao antígeno. Um local de ligação ao antígeno não modificada é tipicamente formada por e presente no domínio variável do anticorpo. O domínio variável contém o referido local de ligação ao antígeno. Um domínio variável que se liga a um antígeno é um domínio variável que compreende um local de ligação ao antígeno que se liga ao antígeno.

[0024] Em uma concretização, um domínio variável de anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL). O local de ligação ao antígeno pode estar presente no domínio variável VH / VL combinado, ou em apenas a região VH ou da região VL única. Quando o local de ligação ao antígeno está presente em apenas uma das duas regiões de domínio variável, a região variável homóloga pode contribuir para o enrolamento e / ou estabilidade da região variável de ligação, mas não contribui significativamente para a ligação do antígeno em si.

[0025] Tal como aqui utilizado, ligação ao antígeno refere-se à capacidade de ligação típica de um anticorpo para o seu antígeno. Um anticorpo que compreende um local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2, se liga a ErbB-2 e, sob condições de outro modo idêntico, pelo menos 100 vezes mais baixa para os receptores homólogos de ErbB-1 e ErbB-4 da mesma espécie. Um anticorpo que compreende um local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-3, liga-se a ErbB-3 e, sob condições de outro modo idênticas, não para os receptores homólogos ErbB-1 e ErbB-4 da mesma espécie. Considerando que a ErbB-família é uma família de receptores de superfície celular, a ligação é tipicamente avaliada em células que expressam o receptor (s). A ligação de um anticorpo a um antígeno pode ser avaliada de várias maneiras. Uma maneira é a incubar o anticorpo com o antígeno (de preferência células que expressam o antígeno), remover o anticorpo não ligado (de preferência, por uma etapa de lavagem) e a detecção de anticorpo ligado por meio de um anticorpo marcado que se liga ao anticorpo ligado.

[0026] Ligação ao antígeno a um anticorpo é tipicamente mediada pela regiões de complementaridade do anticorpo e a estrutura tridimensional específica de ambos o antígeno e o domínio variável permitindo que estas duas estruturas para se ligarem em conjunto com precisão (uma interação semelhante a uma chave e fechadura), em oposição a colagem aleatória, não-específico de anticorpos. Como um anticorpo geralmente reconhece um epítopo de um antígeno, e, como tal epítopo pode estar presente em outros compostos, bem como, anticorpos de acordo com a presente invenção que se ligam de ErbB-2 e / ou ErbB-3 pode reconhecer outras proteínas, bem como, se tal outros compostos contêm o mesmo epítopo. Assim, o termo "ligação" não exclui a ligação dos anticorpos a uma outra proteína ou proteína (s) que contêm o mesmo epítopo. Tal outra proteína (s) não é de preferência uma proteína humana. Um local de ligação ErbB-2 ao antígeno e um local de ligação ao antígeno ErbB-3, tal como definido na presente invenção tipicamente não se ligam a outras proteínas na membrana de células em um post-natal, de preferência humano adulto. Um anticorpo biespecífico segundo a presente invenção é tipicamente capaz de se ligar de ErbB- 2 e ErbB-3 com uma afinidade de ligação de pelo menos lxlOe- 6 M, conforme descrito em mais detalhe abaixo.

[0027] O termo "interfere com a ligação" como aqui utilizado, significa que o anticorpo é dirigido para um epítopo no ErbB-3 e o anticorpo compete com o ligante para a ligação a ErbB-3. O anticorpo pode diminuir a ligação do ligante, deslocar o ligante quando este já está ligado à ErbB-3 ou pode ser, por exemplo, através de impedimento espacial, pelo menos parcialmente, prevenir que o ligante possa ligar-se a ErbB-3.

[0028] O termo "anticorpo", tal como aqui utilizado, significa uma molécula proteica, de preferência, pertencente à classe de imunoglobulinas de proteínas, contendo um ou mais domínios variáveis que se ligam a um epítopo num antígeno, em que esses domínios são derivados de ou partes de homologia de sequência com o domínio variável de um anticorpo. Os anticorpos para utilização terapêutica são preferivelmente tão próximos de anticorpos naturais do sujeito a ser tratado quanto possível (por exemplo, anticorpos humanos para sujeitos humanos). A ligação do anticorpo pode ser expressa em termos de eespecíficoidade e afinidade. A eespecíficoidade que determina o antígeno ou seu epítopo está eespecíficoamente ligada pelo domínio de ligação. A afinidade é uma medida para a resistência de ligação a um antígeno ou epítopo específico. A ligação específica, é definida como a ligação com afinidades (KD) de, pelo menos, l x l0-6 M, mais preferencialmente, l x l0-7 M, mais preferivelmente superior a l x l0-9 M. Tipicamente, os anticorpos para aplicações terapêuticas têm afinidades de até l x l0-10 M ou superior. Tais anticorpos os anticorpos biespecíficos da presente invenção compreendem os domínios constantes (parte Fc) de um anticorpo natural. Um anticorpo da presente invenção é tipicamente um anticorpo de comprimento completo biespecífico, preferencialmente, da subclasse de IgG humana. De um modo preferido, um anticorpo da presente invenção é da subclasse IgGl humana. Tais anticorpos da invenção tem boas propriedades, tem uma meia vida favorável após administração in vivo a seres humanos e tecnologia de engenharia CH3 existe que pode fornecer para cadeias pesadas modificadas que formam preferencialmente heterodímeros mais de homodímeros por co-expressão em células clonais.

[0029] Um anticorpo da invenção é, preferencialmente, um anticorpo "de comprimento total". O termo 'comprimento total' de acordo com a invenção é definido como um anticorpo que compreende essencialmente completo, o que, no entanto, não têm necessariamente todas as funções de um anticorpo intacto. Para evitar dúvidas, um anticorpo de comprimento completo contém duas cadeias pesadas e duas leves. Cada cadeia contém constante (C) e regiões variáveis (V), que pode ser dividido em domínios designados CH1, CH2, CH3, VH, CL e, VL. Um anticorpo liga-se ao antígeno através dos domínios variáveis contidas na porção Fab, e após a ligação podem interagir com moléculas e células do sistema imunológico através dos domínios constantes, sobretudo através da parte Fe. Os termos 'domínio variável', 'par VH VL', 'VH VL' são aqui utilizados indiferentemente. Por anticorpos de comprimento completo, de acordo com a invenção englobam os anticorpos em que as mutações possam estar presentes que fornecem as características desejadas. Tais mutações não deve ser deleções de porções substanciais de qualquer uma das regiões. No entanto, os anticorpos em que um ou vários resíduos de aminoácidos são eliminados, sem, essencialmente, que altera as características de ligação do anticorpo resultante estão abrangidas no termo "anticorpo de comprimento total". Por exemplo, um anticorpo de IgG pode ter de 1-20 resíduos de aminoácidos por inserções, deleções ou uma sua combinação, na região constante. Por exemplo, a atividade ADCC de um anticorpo pode ser melhorada quando o próprio anticorpo tem uma baixa atividade ADCC, por modificar ligeiramente a região constante do anticorpo (Junttila, T. T., K. Parsons, et al. (2010). "Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer." Cancer Research 70(11): 4481-4489).

[0030] Os anticorpos IgG de comprimento total são preferidos devido à sua meia-vida favorável e a necessidade de manter a moléculas autólogas plenas tão próximo (humanos), por razões de imunogenicidade. Um anticorpo da invenção é preferencialmente, um anticorpo IgG biespecífico, preferencialmente, um anticorpo IgGl de comprimento total biespecífico. IgGl é favorecido com base em sua longa meia- vida circulatória no homem. A fim de evitar qualquer imunogenicidade em seres humanos, é preferível, que o anticorpo IgG biespecífico de acordo com a invenção seja uma IgGl humana.

[0031] O termo 'biespecífico' (bs) significa que uma parte do anticorpo (como definido acima) se liga a um epítopo num antígeno ao passo que uma segunda parte se liga a um epítopo diferente. O epítopo diferente é, tipicamente, presente em um antígeno diferente. De acordo com a presente invenção, os referidos primeiro e segundo antígenos são, de fato, duas proteínas diferentes. Um anticorpo biespecífico preferido é um anticorpo que compreende partes de dois anticorpos monoclonais diferentes e consequentemente se liga a dois tipos diferentes de antígeno. Um braço do anticorpo biespecífico, tipicamente, contém o domínio variável de um anticorpo e o outro braço contém o domínio variável de um outro anticorpo. As regiões variáveis da cadeia pesada do anticorpo biespecífico da presente invenção são tipicamente diferentes um do outro, enquanto que a cadeia leve de regiões variáveis é, de preferência, o mesmo nos anticorpos biespecíficos da invenção. Um anticorpo biespecífico, em que as diferentes regiões variáveis da cadeia pesada estão associadas com o mesmo, ou um comum, de cadeia leve também é referido como um anticorpo biespecífico com uma cadeia de luz comum. É ainda proporcionado, por conseguinte, um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção, em que ambos os braços compreendem uma cadeia leve comum.

[0032] Os anticorpos biespecíficos preferidos pode ser obtida por co-expressão de duas diferentes cadeias pesadas e uma cadeia leve em comum uma única célula. Quando os domínios CH3 tipo selvagem são usadas, a co-expressão de duas diferentes cadeias pesadas e uma cadeia leve comum vai resultar em três espécies diferentes, AA, AB e BB. Para aumentar a percentagem do produto de engenharia CH3 biespecífico desejado (AB) pode ser empregado ou, por outras palavras, pode-se usar cadeias pesadas com domínios de heterodimerização compatíveis, como aqui definido adiante.

[0033] O termo 'domínios de heterodimerização compatíveis' tal como aqui utilizado refere-se a domínios de proteínas que são modificadas de tal modo que domínio modificado A 'serão preferencialmente formar heterodímeros com Engineered domínio B' e vice-versa, ao passo que a homodimerização entre A'-A' e B'-B' é diminuída.

[0034] O termo 'cadeia leve comum' de acordo com a invenção refere-se a cadeias leves que podem ser iguais ou têm algumas diferenças na sequência de aminoácidos, enquanto a eespecíficoidade de ligação do anticorpo de comprimento completo não é afetada. É, por exemplo, possível, no âmbito da definição de cadeias leves comuns, tal como aqui utilizada, para preparar ou encontrar cadeias leves que não são idênticos, mas ainda funcionalmente equivalente, por exemplo, por introdução e testar as alterações de aminoácidos conservativos, mudanças de aminoácidos nas regiões que não ou só contribuem em parte para eespecíficoidade de ligação quando combinado com a cadeia pesada, e assim por diante. Os termos 'cadeia leve comum', 'VL comum', 'cadeia leve única', 'VL única', com ou sem a adição do termo 'rearranjado' são todos utilizados aqui indiferentemente. É um aspecto da presente invenção a utilização de cadeia leve comum como uma cadeia leve humana que pode combinar com diferentes cadeias pesadas para formar anticorpos com domínios de ligação de antígeno funcional (WO2004/009618, WO2009/157771, Merchant et al., 1998 e Nissim et al., 1994). De um modo preferido, a cadeia leve comum tem uma sequência da linhagem germinal. A sequência da linhagem germinal preferida é uma região variável da cadeia leve que é frequentemente usada no repertório humano e tem boa estabilidade termodinâmica, rendimento e solubilidade. Uma cadeia leve de linhagem germinal preferida 012, de um modo preferido, a cadeia leve capa humana de linhagem germinal rearranjados IgVκ1-

39*01/IGJκ1*01 ou um fragmento ou um seu equivalente funcional (ou seja, mesmo segmento do gene IgVKl-39, mas segmento de gene IGJK diferente) da mesma (nomenclatura de acordo à rede mundial de banco de dados IMGT em imgt.org).

[0035] É ainda proporcionado, por conseguinte, um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção, em que a referida cadeia leve comum é uma cadeia leve de linha germinal, de preferência, uma cadeia leve rearranjada de linha germinal kappa humana que compreende o segmento de gene IgVKl-39, mais preferencialmente a rearranjado da cadeia kappa da linha germinal humana da cadeia leve IgVKl- 39*01/IGJKl*01. Os termos rearranjada de linha germinal de cadeia leve humana kapa IgVκ1-39*01/IGJκ1*01, IGKV1-39 / IGKJ1, 1IUVK1-39 cadeia leve ou em curto 1IUVK1-39 são usados alternadamente ao longo do pedido. Obviamente, os técnicos versados no assunto reconhecerão que "comum" também se refere-se a equivalentes funcionais da cadeia leve do que a sequência de aminoácidos não for idêntica. Muitas variantes das ditas cadeia leve existente, em que as mutações (deleções, substituições, adições) estão presentes que não influenciam substancialmente a formação de regiões de ligação funcionais. A cadeia leve da presente invenção também pode ser uma cadeia leve, tal como eespecíficoado aqui acima, possuindo 1-5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos, ou uma combinação dos mesmos.

[0036] Também estão contemplados os anticorpos em que um domínio VH é capaz de reconhecer eespecíficoamente um primeiro antígeno e o VL, VH emparelhado com a de um domínio variável de imunoglobulina, é capaz de reconhecer eespecíficoamente um segundo antígeno. A par VH VL resultante irá ligar-se quer um antígeno ou antígeno 2. Tais assim chamados "anticorpos dois-em-um", descrito em, por exemplo, WO 2008/027236, WO 2010/108127 e Schaefer et al (Cancer Cell 20, 472- 486, Outubro 2011), são diferentes dos anticorpos biespecíficos da invenção e são ainda referidos como anticorpos "de dois em um". Tais "dois-em-um" anticorpos têm braços idênticos e não são anticorpos da presente invenção.

[0037] O termo 'ErbB-2', tal como aqui utilizado refere-se à proteína que em seres humanos é codificada pelo gene erbB-2. Nomes alternativos para o gene ou proteína incluem CD340; HER-2; HER-2 / neu; HOMENS 19; NEU; NGL; TKR1. O gene erbB-2 é frequentemente chamado de HER2 (receptor do fator de crescimento epidérmico humano 2). Sempre que é feita aqui referência a ErbB-2, a referência se refere ao erbB-2 humano. Um anticorpo que compreende um local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2, se liga humano de ErbB-2. O ErbB-2 local de ligação ao antígeno pode, devido a sequência e estrutura terciária similaridade entre outros ortólogos de mamero humano e, também se ligam um ortólogo tal, mas não é necessariamente assim. números de acesso de base de dados para a proteína erbB-2 humano e o gene que a codifica são (NP_0 () 1005862,1, NP_004439.2 NC_000 () 17,10 NT _ () 10783,15 NCJM8928.2). Os números de acesso são indicados principalmente para proporcionar um outro método de identificação de erbB-2 como um alvo, a sequência real da proteína erbB-2 ligado ao anticorpo pode variar, por exemplo devido a uma mutação no gene que codifica tais como aqueles que ocorrem em alguns cânceres ou semelhantes. O local de ligação ao antígeno de ErbB-2 liga-se a ErbB-2 e uma variedade de variantes destes, tais como os expressos por algumas células tumorais positivas de ErbB-2.

[0038] O termo "agente de ligação a ErbB-2 " como aqui utilizado refere-se a qualquer molécula ou composto capaz de se ligar a ErbB-2. Um "inibidor de erbB-2" como aqui utilizado refere-se a qualquer molécula ou composto capaz de reduzir ou atenuar, quer direta ou indiretamente, uma atividade de ErbB-2. Um tal inibidor pode ser uma molécula pequena ou pode ser um produto biológico, por exemplo um anticorpo.

[0039] O termo 'ErbB-3', tal como aqui utilizado refere-se à proteína que em seres humanos é codificada pelo gene erbB-3. Nomes alternativos para o gene ou proteína está HER3; LCCS2; MDA-BF-1; c-erbB-3; c-erbB-3; erbB-3-S; p l8 () - erbB-3; p45-sErbb-3; e p85-sErbb-3. Sempre que é feita aqui referência a ErbB-3, a referência refere-se a ErbB-3 humana. Um anticorpo que compreende um local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, se liga a ErbB-3 humano. O sítio de ligação ErbB-3 ao antígeno, pode, devido a sequência e estrutura terciária similaridade entre outros ortólogos de mamífero humano e, também se ligam um ortólogo tal, mas não é necessariamente assim. números de acesso base de dados para a protea ErbB-3 humana e o gene que a codifica são (NP_001005915.1, NP_001973.2, NC_000012.11 NC_018923.2 NT_029419.12). Os números de acesso são indicados principalmente para proporcionar um outro método de identificação de ErbB-3 como um alvo, a sequência real da proteína de ErbB-3 ligada por um anticorpo podem variar, por exemplo devido a uma mutação no gene que codifica tais como aqueles que ocorre em alguns cânceres ou semelhantes. O local de ligação ao antígeno de ErbB-3 liga-se ErbB-3 e uma variedade de variantes destes, tais como os expressos por algumas células tumorais positivas de ErbB-2.

[0040] O termo "agente de ligação a ErbB-3" como aqui utilizado refere-se a qualquer molécula ou composto capaz de se ligar a ErbB-3. Um "inibidor de ErbB-3", tal como aqui utilizado refere-se a qualquer molécula ou composto capaz de reduzir ou atenuar, tanto direta ou indiretamente, uma atividade de ErbB-3. Um tal inibidor pode ser um anticorpo, por exemplo, patritumab, MM-121 (seribantumab), lumretuzumab.

[0041] Um anticorpo biespecífico do presente invenção que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, pode reduzir ou reduz em função do receptor induzida pelo ligante de ErbB-3 em uma ErbB- 2 e ErbB-3 célula positiva. Na presença de excesso de ErbB-2, heterodímeros ErbB-2 / ErbB-3 podem fornecer um sinal de crescimento para a célula que expressa na ausência de ligando detectável para a cadeia de ErbB-3 no heterodímero. Esta função de receptor ErbB-3 é aqui referida como uma função do receptor independente de ligante de ErbB-3. O heterodímeros ErbB-2 / ErbB-3 também proporcionar um sinal de crescimento para a célula que expressa, na presença de um ligante de ErbB-3. Esta função de receptor ErbB-3 é aqui referida como uma função do receptor induzida pelo ligante de ErbB-3.

[0042] O termo "ligante ErbB-3", tal como aqui utilizado refere-se a polipeptídeos que se ligam e ativam ErbB-3. Exemplos de ligantes ErbB-3 incluem, mas não estão limitados a neuregulina 1 (NRG) e neuregulina 2, betacelulina, fator de crescimento epidérmico de ligação de heparina e epirregulina. O termo inclui fragmentos biologicamente ativos e / ou variantes de um polipeptídeo que ocorre naturalmente.

[0043] Em uma concretização preferida da invenção, a função do receptor induzida pelo ligante de ErbB-3 é ErbB-3 crescimento induzida pelo ligante de uma célula positiva de ErbB-2 e ErbB-3. Em uma concretização preferida, a referida célula é uma célula MCF-7 (ATCC 1 HTB-22 ™); um (ATCC HTB- 30 ™) de células SKBR3; um NCI-87 (ATCC CRL-5822 ™) celular; uma célula BxPC-3-Luc2 (Perkin Elmer 125058), uma célula BT- 474 (ATCC HTB-20 ™) ou uma célula JIMT-1 (DSMZ ACC No.: 589).

[0044] Em uma concretização preferida, a célula positiva de ErbB-2 e ErbB-3 compreendem pelo menos 50.000 receptores erbB-2 na superfície da célula. Em uma concretização preferida, pelo menos, 100.000 receptores erbB-2. Em uma concretização preferida, a célula positiva de ErbB-2 e ErbB-3 compreender pelo menos 1.000.000 de receptores de ErbB-2 na superfície da célula. Em outra concretização preferida, a célula positiva de ErbB-2 e ErbB- 3, compreende não mais de 1.000.000 receptores de ErbB-2 na superfície da célula. As terapias atualmente utilizadas, tais como trastuzumab (Herceptin) e pertuzumab só são prescritas para pacientes com células malignas erbB-2 positivas que possuem mais de 1.000.000 receptores de ErbB-

2 na sua superfície celular, a fim de se obter uma resposta clínica.

Pacientes com ErbB-2 de células tumorais positivas com mais de 1.000.000 receptores de ErbB-2 na sua superfície celular são tipicamente classificadas como ErbB-2 [+++]. Os pacientes são classificados, por exemplo, utilizando imunohistoquímica ou hibridação de fluorescência in situ.

O HercepTest ™ e / ou HER2 PEIXES (Pharm Dx ™) são comercializados tanto por Dako Denmark A / S, e / ou utilizando um ensaio de HERmark®, comercializado pela Biosciences monograma.

Trastuzumab e pertuzumab só são prescritos para erbB-2 [+++] doentes porque os pacientes com baixas concentrações de ErbB-2 normalmente não apresentam uma resposta clínica suficiente quando tratados com trastuzumab e pertuzumab.

A invenção, contudo, proporciona anticorpos biespecíficos, que também têm uma afinidade de ligação melhorada para as células com uma concentração mais baixa do receptor de erbB-2, quando comparado com o trastuzumab.

Como mostrado nos Exemplos, a proliferação de tais células com menor expressão de ErbB2 é eficazmente contrariada com um anticorpo de acordo com a invenção.

Tal concentração baixa de receptor ErbB-2 está presente em células malignas de pacientes que são classificados como ErbB-2 [++] ou ErbB-2 [+]. Além disso, tumores positivos ErbB-2 recindentes, muitas vezes têm uma concentração do receptor de erbB-2 inferior a 1.000.000 receptores por célula.

Tal pacientes ErbB-2 [++] ou ErbB-2 [+], bem como pacientes com um tumor positivo de ErbB-2 reincidente, são, por conseguinte, de preferência, tratados com um anticorpo biespecífico de acordo com a presente invenção.

É ainda proporcionado, por conseguinte, um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, em que o anticorpo pode reduzir o crescimento induzida pelo ligante de um ErbB-2 e ErbB-3 celular positiva que tem menos do que 1.000.000 receptores de ErbB-2 de superfície celular.

Também é proporcionado um método para o tratamento de um sujeito tendo um tumor positivo ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3 ou em risco de ter o referido tumor, em que o referido tumor tem menos do que 1.000.000 receptores ErbB-2 de superfície celular por célula, o método compreendendo a administração ao sujeito de um anticorpo biespecífico ou composição farmacêutica de acordo com a invenção.

Um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção para utilização no tratamento de um sujeito possuindo, ou em risco de ter um tumor positivo ErbB-2, ErbB- 3 ou ErbB-2 / ErbB-3 de, em que o referido tumor tem menos do que 1.000.000 receptores ErbB-2 de superfície celular por célula, é também fornecida em anexo.

O referido anticorpo, de acordo com a presente invenção é tipicamente capaz de reduzir a função do receptor induzida pelo ligante, preferencialmente crescimento induzida pelo ligante, de ErbB-3 em uma célula positiva de ErbB-2 e ErbB-3. O referido anticorpo, de acordo com a invenção compreende de preferência um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga de domínio I de ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga o domínio III de ErbB-3. Em uma concretização preferida, a afinidade do referido segundo local de ligação a antígeno para uma célula positiva ErbB-3 é igual a, ou maior do que, a afinidade do que o referido primeiro local de ligação ao antígeno para uma célula positiva de ErbB-2, tal como explicado aqui abaixo em mais detalhes. A afinidade do dito segundo sítio de ligação a antígeno para uma célula positiva ErbB-3 é de preferência inferior ou igual a 2,0 nM, mais preferivelmente menor do que ou igual a 1,39 nM, mais preferivelmente menor do que ou igual a 0,99 nM. A afinidade do dito primeiro sítio de ligação a antígeno para uma célula positiva de ErbB-2 é, de preferência, inferior ou igual a 5,0 nM, de preferência inferior ou igual a 4,5 nM de preferência inferior ou igual a 4,0 nM.

[0045] Em uma concretização preferida, o referido anticorpo de acordo com a invenção compreende um local de ligação ao antígeno que se liga a pelo menos um aminoácido de domínio I de ErbB-2 selecionado a partir do grupo que consiste de T144, T164, R166, P172, G179, S180 e R181, e os resíduos de aminoácidos expostos à superfície que estão localizados dentro de cerca de cinco posições de aminoácido T144, T164, R166, P172, G179, S180 ou R181.

[0046] Em uma concretização preferida, o referido anticorpo de acordo com a invenção compreende, preferivelmente, um local de ligação ao antígeno que se liga a pelo menos um aminoácido do domínio III de ErbB-3 selecionado a partir do grupo constituído por R426 e resíduos de aminoácidos expostos à superfície que estão localizados dentro 11.2 a partir R426 na proteína nativa ErbB-3.

[0047] Para determinar se um tumor for positivo para ErbB-3, o técnico versado no assunto pode determinar, por exemplo, a amplificação e / ou coloração de ErbB-3 em imuno-

histoquímica. Em células tumorais pelo menos 10% em uma biopsia deve ser positivo. A biopsia também pode conter 20%, 30%. 40% 50% 60% 70% ou mais células positivas.

[0048] Tal como aqui utilizado, a função do receptor induzida pelo ligante é reduzida em pelo menos 20%, de preferência, pelo menos 30, 40, 50 60, ou pelo menos 70% em uma concretização particularmente preferida, a função do receptor induzida pelo ligante é reduzida em cerca de 80, mais preferencialmente, por 90%. A redução é, de preferência, determinada por uma determinação da função do receptor induzida pelo ligante, na presença de um anticorpo biespecífico da presente invenção, e comparando-o com a mesma função na ausência do anticorpo, sob condições de outro modo idênticas. As condições compreendem, pelo menos, a presença de um ligante de ErbB-3. A quantidade de ligante presente é, de preferência, uma quantidade que induz metade do crescimento máximo de uma linhagem de células ErbB-2 e ErbB- 3 positiva. A linhagem de células ErbB-2 e ErbB-3 positiva para este ensaio é, de preferência, a linhagem celular de células MCF-7 (ATCC HTB-22 ™), a linhagem de células SKBR3 (ATCC HTB-30 ™), a linhagem de célula JIMT-1 (DSMZ ACC 589) ou a linhagem celular NCI-87 (ATCC CRL-5822 ™). O teste e / ou o ligante para a determinação da função do receptor induzida pelo ligante de ErbB-3 é, de preferência, um teste para a redução do crescimento de ErbB-3 induzida pelo ligante, tal como eespecíficoado nos exemplos.

[0049] A proteína erbB-2 contém vários domínios (ver, por referência a figura 1 dos Landgraf, câncer da mama R Res 2007; 9 (1):202-). Os domínios extracelulares são referidos como domínios I-IV. O local de ligação para os respectivos domínios de locais de ligação ao antígeno dos anticorpos aqui descritos, tem sido mapeado (ver exemplos). Um anticorpo biespecífico da invenção com um local de ligação ao antígeno (primeiro local de ligação ao antígeno) que se liga ao domínio I ou domínio IV de ErbB-2 (primeiro local de ligação ao antígeno) compreende uma região variável de cadeia pesada que mantém a eespecíficoidade de ligação significativa e afinidade para erbB-2, quando combinado com diferentes cadeias leves. anticorpos biespecíficos, com um sítio de ligação ao antígeno (primeiro local de ligação ao antígeno) que se liga ao domínio I ou domínio IV de ErbB-2 (primeiro local de ligação ao antígeno) e um local de ligação ao antígeno para ErbB-3 (segundo local de ligação ao antígeno) verificou-se ser mais eficaz na redução da função do receptor induzida pelo ligante de ErbB-3, quando em comparação com um anticorpo biespecífico que compreende um local de ligação ao antígeno (primeiro local de ligação ao antígeno) que se liga a outro domínio extracelulares de ErbB-

2. Um anticorpo biespecífico, compreendendo um local de ligação ao antígeno (primeiro local de ligação ao antígeno) que se liga a ErbB-2, em que o referido local de ligação ao antígeno liga-se ao domínio I ou domínio IV de erbB-2 é preferido. De preferência, o referido local de ligação ao antígeno liga-se ao domínio IV de ErbB-2. Um anticorpo biespecífico com um local de ligação ao antígeno (primeiro local de ligação ao antígeno) que se liga a ErbB-2, e que compreende ainda ADCC foi encontrada para ser mais eficaz do que outros anticorpos que se ligam de ErbB-2, que não têm atividade ADCC significativa, particularmente, in vivo. Por conseguinte, prefere-se um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção que exibe ADCC. Verificou-se que os anticorpos em que o referido primeiro local de ligação ao antígeno liga- se ao domínio IV de ErbB-2 tinham atividade ADCC intrínseca. Um domínio I de ligação do anticorpo de ligação de ErbB-2 que tem uma baixa atividade ADCC intrínseca pode ser manipulada para aumentar a atividade de ADCC regiões Fe medeiam a função de anticorpo ligando-se a diferentes receptores das células efetoras imunitárias, tais como macrófagos, células assassinas naturais, células B e neutrófilos. Alguns destes receptores, como CD16A (FcyRIIIA) e CD32A (FcyRIIA), ativar as células para construir uma resposta contra antígenos. Outros receptores, tais como CD32B, inibir a ativação de células imunes. Por engenharia regiões Fc (através de substituições de aminoácidos que introduzem) que se ligam a ativação dos receptores com maior seletividade, os anticorpos podem ser criados que têm uma maior capacidade para mediar atividades citotóxicas desejadas por um agente Mab anti-câncer.

[0050] Uma técnica para aumentar ADCC de um anticorpo é afucosilação. (Ver, por exemplo Junttila, TT, K. Parsons, et al (2010) "Superior Eficácia in vivo de Afucosilated Trastuzumab no tratamento de câncer da mama amplificado- HER2." Cancer Research 70 (11):4.481-4.489). É ainda proporcionado, por conseguinte, um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção, que é afucosylated. Alternativamente, ou adicionalmente, vários outras estratégias pode ser usada para alcançar aperfeiçoamento ADCC, por exemplo incluindo glycoengineering (Kyowa Hakko / Biowa, GlycArt (Roche) e Eureka Therapeutics) e mutagénese (Xencor e MacroGenics), todos os quais procuram melhorar a ligação de Fc a baixa- afinidade activação FcyRIIIa, e / ou para reduzir a ligação para a baixa afinidade FcyRIIb inibidora.

[0051] Vários métodos in vitro existem para a determinação da eficácia de anticorpos ou de células efectoras em induzir ADCC. Entre estas são de crómio-51 [] Cr51, ensaios de libertação de ensaios de liberação de eurio [eu], e [S35] ensaios de liberação de 35-enxofre. Normalmente, uma linha de células alvo marcada que expressam um determinado antígeno exposta à superfície é incubada com um anticorpo específico para esse antígeno. Após a lavagem, as células efetoras que expressam receptor Fc CD 16 são geralmente co-incubado com as células alvo marcadas com anticorpo. lise celular alvo é subsequentemente tipicamente medido pela libertação de marcador intracelular, por exemplo, por um contador de cintilação ou espectrofotometria. Um teste preferido é detalhado nos Exemplos.

[0052] Uma vantagem da presente invenção é o facto de que a ligação de anticorpos de acordo com a invenção, tais como, por exemplo, PB4188 de ErbB-2 e ErbB-3 células positivas resultados na internalização que é o mesmo que o verificado com trastuzumab. Se uma combinação de trastuzumab e pertuzumab é usado, internalização destes anticorpos é reforçada. Esta internalização melhorada, no entanto, resulta em ADCC reduzida. Um anticorpo de acordo com a presente invenção resultando na internalização que é,

essencialmente, na mesma medida, em comparação com o trastuzumab é, portanto, preferido sobre uma combinação de trastuzumab e pertuzumab porque com tal anticorpo a atividade de ADCC é melhor mantida.

[0053] Um anticorpo da invenção compreendendo um sítio de ligação ao antígeno que se liga ErbB-3, interfere com a ligação de um ligando de ErbB-3 e ErbB-3. Tais anticorpos são mais eficazes na redução da função do receptor induzida pelo ligante de ErbB-3 em uma linha de células ErbB- 2 e ErbB-3 positivo, particularmente, no contexto de um anticorpo específico para o bi que também compreende um sítio de ligação ao antígeno que se liga ErbB-2.

[0054] As concretizações preferidas da presente invenção proporcionar um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, em que o referido primeiro local de ligação ao antígeno de domínio I liga-se a ErbB-2. Como se mostra nos Exemplos, os anticorpos biespecíficos que possuem estas características são bem capazes de se ligar de ErbB-2 e ErbB- 3 células positivas e neutralizar a sua atividade (tal como a função do receptor induzida pelo ligante de ErbB-3 e o crescimento induzida pelo ligante de um ErbB-2 e ErbB3 célula positiva).

[0055] Além disso, os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga de domínio I de ErbB-2 são particularmente adequados para utilização em combinação com existentes anti-erbB-2 terapias como trastuzumab e pertuzumab, porque trastuzumab e pertuzumab ligam diferentes domínios de ErbB-2. Trastuzumab se liga domínio IV de ErbB- 2 e pertuzumab liga-se o domínio II de ErbB-2. Por conseguinte, os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção que ligam o domínio I de ErbB-2 são os preferidos, porque eles não competem com trastuzumab e pertuzumab para o mesmo epítopo.

[0056] Outra concretização preferida proporciona um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, em que o referido segundo local de ligação ao antígeno liga-se o domínio III de ErbB-3. Tal anticorpo de acordo com a invenção é particularmente adequado para a terapia de combinação com actualmente usadas moléculas anti-ErbB-3 de ligação que não se ligam o domínio III de ErbB-3, tais como MM-121 (Merrimack Pharmaceuticals; também referido como # AB6) e RG7116 (Roche) que ligam o domínio I de ErbB-3, porque então as moléculas de ligação diferentes não competem umas com as outras para o mesmo epítopo.

[0057] De um modo preferido, um anticorpo biespecífico é fornecido que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, em que o referido primeiro local de ligação ao antígeno liga-se domínio I de ErbB-2 e a dita segunda local de ligação ao antígeno liga- se o domínio III de ErbB-3. Tal anticorpo é particularmente adequado para a terapia de combinação com moléculas anti- erbB-2 de ligação que não se ligam de domínio I de ErbB-2,

tais como trastuzumab, e pertuzumab, e com anti-ErbB-3 moléculas de ligação que não se ligam o domínio III de ErbB -3, tais como MM-121 (# AB6) e RG7116.

[0058] Uma concretização preferida proporciona um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, em que o referido primeiro local de ligação ao antígeno liga-se domínio I de ErbB-2 e a dita segunda local de ligação ao antígeno liga- se o domínio III de ErbB-3 e em que o anticorpo pode reduzir a função do receptor induzida pelo ligante de ErbB-3 em uma célula positiva de ErbB-2 e ErbB-3. O referido anticorpo pode reduzir de um modo preferido de crescimento induzida pelo ligante de uma célula positiva de ErbB-2 e ErbB-3.

[0059] Outras concretizações da presente invenção proporcionam um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, em que a afinidade (KD) do referido segundo local de ligação ao antígeno para uma célula positiva ErbB-3 é igual a, ou maior do que, a afinidade do que o referido primeiro local de ligação ao antígeno para uma célula positiva de ErbB-2. Contrariamente aos compostos biespecíficos arte anterior, tais como, por exemplo, MM-111 a partir de Merrimack

[0060] Produtos farmacêuticos, os quais têm uma afinidade mais elevada para ErbB-2 do que para ErbB-3, a presente invenção proporciona anticorpos biespecíficos, que têm um braço específico de ErbB-3-com uma afinidade para

ErbB-3 nas células que é maior do que a afinidade do ErbB braço específico -2-para erbB-2 em células. Tais anticorpos biespecíficos são mais capazes de ErbB-3 de ligação, apesar da baixa concentração de superfície de células de ErbB-3. Isto proporciona a vantagem de que a atividade funcional contra ErbB-3 é melhorada quando comparados com compostos da do estado da técnica, o que significa que estes anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção são mais capazes de neutralizar a atividade de ErbB-3 (tais como crescimento induzida pelo ligante).

[0061] Tal como aqui utilizado, o termo "afinidade" refere-se ao valor KD.

[0062] A afinidade (KD) do referido segundo local de ligação a antígeno para uma célula positiva ErbB-3 é de preferência, inferior ou igual a 2,0 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 1,5 nM, mais preferivelmente, menor do que ou igual a 1,39 nM, mais de preferência menor do que ou igual a 0,99 nM. Em uma concretização preferida, a afinidade do referido segundo local de ligação ao antígeno para ErbB-3 em SK BR-3 células é inferior ou igual a 2,0 nM, mais preferencialmente inferior ou igual a 1,5 nM, mais preferivelmente menor do que ou igual para 1,39 nM, de preferência inferior ou igual a 0,99 nM. Em uma concretização, a referida afinidade está dentro da faixa de 1,39-0,59 nM. Em uma concretização preferida, a afinidade do referido segundo local de ligação ao antígeno para ErbB- 3 em BT-474 de células é inferior ou igual a 2,0 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 1,5 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 1,0 nM, mais preferencialmente, inferior a 0,5 nM, de um modo mais preferido menor do que ou igual a 0,31 nM, mais preferivelmente menor do que ou igual a 0,23 nM. Em uma concretização, a referida afinidade está dentro da faixa de 0,31-0,15 nM. As afinidades acima mencionadas são, de preferência, conforme medido por meio de medidas de afinidade de células em estado estacionário, em que as células são incubadas a 4° C, utilizando o anticorpo marcado radioativamente, onde depois a radioatividade ligada à célula é medida, como descrito nos Exemplos.

[0063] A afinidade (KD) do referido primeiro local de ligação ao antígeno para uma célula positiva de ErbB-2 é de preferência inferior ou igual a 5,0 nM, mais preferivelmente menor do que ou igual a 4,5 nM, mais preferencialmente inferior ou igual a 3,9 nM. Em uma concretização preferida, a afinidade do que a referida ao primeiro local de ligação ao antígeno para erbB-2 em células SK-BR-3 é menor do que ou igual a 5,0 nM, de preferência, inferior ou igual a 4,5 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 4,0 nM, mais preferivelmente, menor do que ou igual a 3,5 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 3,0 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 2,3 nM. Em uma concretização, a referida afinidade está dentro do intervalo de 3.0 - 1.6 nM. Em uma concretização preferida, a afinidade do que o referido primeiro local de ligação ao antígeno para ErbB-2 em BT-474 de células é inferior ou igual a 5,0 nM, de preferência inferior ou igual a 4,5 nM, mais preferencialmente inferior ou igual a 3,9 nM. Em uma concretização, a referida afinidade está dentro da faixa de

4,5-3,3 nM. As afinidades acima mencionadas são, de preferência, conforme medido por meio de medidas de afinidade de células em estado estacionário, em que as células são incubadas a 4 ° C, utilizando o anticorpo marcado radioativamente, onde depois a radioatividade ligada à célula é medida, como descrito nos Exemplos.

[0064] Em uma concretização preferida, um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção é proporcionado, em que a afinidade (KD) do referido anticorpo biespecífico para células BT-474 é inferior ou igual a 5,0 nM, de preferência inferior ou igual a 4,5 nM, mais preferencialmente inferior ou igual a 4,0 nM, mais preferencialmente inferior ou igual a 3,5 nM, mais preferencialmente inferior ou igual a 3,7 nM, de preferência inferior ou igual a 3,2 nM. Em uma concretização, a referida afinidade está dentro da faixa de 3,7-2,7 nM. Em uma concretização preferida, proporciona-se um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção, em que a afinidade do referido anticorpo biespecífico para SK-BR-3 de células é inferior ou igual a 5,0 nM, de preferência inferior ou igual a 4,5 nM, mais preferencialmente inferior que ou igual a 4,0 nM, mais preferencialmente inferior ou igual a 3,5 nM, mais preferencialmente inferior ou igual a 3,0 nM, de preferência inferior ou igual a 2,5 nM, mais preferencialmente inferior ou igual a 2,0 nM. Em uma concretização, a referida afinidade está dentro da faixa de 2,4-1,6 nM. Mais uma vez, as afinidades acima mencionadas são, de preferência, conforme medido por meio de medidas de afinidade de células em estado estacionário, em que as células são incubadas a 4 ° C, utilizando o anticorpo marcado radioativamente, onde depois a radioatividade ligada à célula é medida, como descrito nos Exemplos.

[0065] Outras concretizações preferidas da invenção proporcionam um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, em que a afinidade (KD) do referido segundo local de ligação ao antígeno para um célula positiva ErbB-3 é igual a, ou maior do que, a afinidade do dito primeiro local para uma célula positiva de ErbB-2, e em que o anticorpo pode reduzir a função do receptor induzida pelo ligante de ErbB- 3 em uma ErbB-2 de ligação ao antígeno 2 e ErbB-3 célula positiva. O referido anticorpo pode reduzir de um modo preferido de crescimento induzido pelo ligante de uma célula positiva ErbB-2 e ErbB-3.

[0066] Os anticorpos acima mencionados de acordo com a invenção com uma elevada afinidade para ErbB-3 preferencialmente ligam-se domínio I de ErbB2 e / ou o domínio III de ErbB-3. É ainda proporcionado, por conseguinte, um anticorpo biespecífico, de acordo com a invenção que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga de domínio I de ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, em que a afinidade (KD) dos referidos segundo local de ligação a antígeno para uma célula positiva ErbB-3 é igual a, ou maior do que, a afinidade do que o referido primeiro local de ligação ao antígeno para uma célula positiva de ErbB-2. Também é fornecido um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga o domínio III de ErbB-3, em que a afinidade do dito segundo sítio de ligação ao antígeno de uma célula positiva ErbB-3 é igual a, ou maior do que, a afinidade do que o referido primeiro local de ligação ao antígeno para uma célula positiva de ErbB-2. Em uma concretização particularmente preferida, é fornecido um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga de domínio I de ErbB-2 e um segundo local de ligação do antígeno que se liga o domínio III de ErbB-3, em que a afinidade do referido segundo local de ligação a antígeno para uma célula positiva ErbB-3 é igual a, ou maior do que, a afinidade do que o referido primeiro local de ligação ao antígeno para um erbB-2 positivos célula.

[0067] O referido segundo local de ligação ao antígeno liga-se de preferência o domínio III de ErbB-3 e tem uma afinidade (KD) para uma célula positiva ErbB-3, que é menor do que ou igual a 2,0 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 1,5 nM, de preferência, inferior que ou igual a 1,39 nM, mais preferivelmente, menor do que ou igual a 0,99 nM. Em uma concretização preferida, o referido segundo local de ligação ao antígeno liga-se o domínio III de ErbB- 3 e tem uma afinidade para ErbB-3 em SK-BR-3 de células que é menor do que ou igual a 2,0 nM, mais preferivelmente, menor do que ou igual a 1,5 nM, de preferência, inferior ou igual a 1,39 nM, mais preferivelmente menor do que ou igual a 0,99 nM. Em uma concretização, a referida afinidade está dentro da faixa de 1,39 - 0,59 nM. Em uma concretização preferida,

o referido segundo local de ligação ao antígeno liga-se o domínio III de ErbB-3 e tem uma afinidade para ErbB-3 em células BT-474 que é menor do que ou igual a 2,0 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 1,5 nM , mais preferencialmente, inferior ou igual a 1,0 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 0,5 nM, mais preferivelmente, menor do que ou igual a 0,31 nM, mais preferivelmente, menor do que ou igual a 0,23 nM. Em uma concretização, a referida afinidade está dentro da faixa de 0,31 - 0,15 nM.

[0068] O referido primeiro local de ligação ao antígeno liga-se de preferência o domínio I de ErbB-2 e tem uma afinidade (KD) para uma célula positiva erbB-2 que é menor do que ou igual a 5,0 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 4,5 nM, de um modo mais preferido inferior ou igual a 3,9 nM. Em uma concretização preferida, o referido primeiro local de ligação ao antígeno liga-se domínio I de ErbB-2 e tem uma afinidade para erbB-2 em células SK-BR-3 que é menor do que ou igual a 5,0 nM, mais preferivelmente, menor do que ou igual a 4,5 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 4,0 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 3,5 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 3,0 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 2,5 nM, mais preferivelmente, menor do que ou igual a 2,3 nM. Em uma concretização, a referida afinidade está dentro da faixa de 3,0 - 1,6 nM. A afinidade do dito anticorpo biespecífico para as células SK-BR-3 é de preferência inferior ou igual a 5,0 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 4,5 nM, mais preferencialmente inferior ou igual a 4,0 nM, de um modo mais preferido, menor do que ou igual a 3,5 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 3,0 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 2,5 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 2,4 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 2,0 nM. Em uma concretização, a referida afinidade está dentro da faixa de 2,4 - 1,6 nM.

[0069] Em uma concretização preferida, o referido primeiro local de ligação ao antígeno liga-se domínio I de ErbB-2 e tem uma afinidade (KD) para erbB-2 em células BT- 474 que é menor do que ou igual a 5,0 nM, mais preferivelmente menor do que ou igual a 4,5 nM, de preferência inferior ou igual a 3,9 nM. Em uma concretização, a referida afinidade está dentro da faixa de 4,5-3,3 nM. A afinidade do dito anticorpo biespecífico para as células BT-474 é de preferência inferior ou igual a 5,0 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 4,5 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 4,0 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 3,7 nM , mais preferencialmente, inferior ou igual a 3,2 nM. Em uma concretização, a referida afinidade está dentro da faixa de 3,7 - 2,7 nM.

[0070] Mais uma vez, as afinidades acima mencionadas são, de preferência, conforme medido por meio de medidas de afinidade de células em estado estacionário, em que as células são incubadas a 4 ° C, utilizando o anticorpo marcado radioativamente, onde depois a radioatividade ligada à célula é medida, como descrito nos Exemplos.

[0071] Outra concretização preferida proporciona um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-3, em que o anticorpo pode reduzir a função do receptor induzida pelo ligante de ErbB- 3 em uma célula positiva de ErbB-2 e ErbB-3, em que o referido anticorpo biespecífico não afeta significativamente a sobrevivência dos cardiomiócitos.

Cardiotoxicidade é um fator de risco conhecido na ErbB-2 e as terapias dirigidas a frequência de complicações é aumentada quando o trastuzumab é utilizado em conjunto com antraciclinas induzindo desse modo o esforço cardíaco.

Por exemplo, a combinação de doxiciclina (DOX) com trastuzumab induz efeitos colaterais cardíacos severos.

Estudos clínicos têm estimado que 5% a 10% dos pacientes que recebem o trastuzumab no contexto de adjuvante de câncer de mama desenvolver disfunção cardíaca (GuRNAeri et al, J Clin Oncol, 1985, 3:818-26; Jarro MS et al, Nat Rev Cardiol 2010; 7: 564-75). No entanto, em um estudo retrospectivo, foi demonstrado que o risco para o desenvolvimento de disfunção cardíaca assintomática é realmente tão elevada como cerca de 25% quando o trastuzumab é usado no contexto de adjuvante com DOX (Wadhwa et al, Breast Cancer Res Treat 2009; 117.: 357-64). Como mostrado nos Exemplos, a presente inveno proporciona anticorpos que têm como alvo de ErbB-2 e que não têm, ou a uma significativamente menor medida, em comparação com o trastuzumab e pertuzumab, afectam a sobrevivência dos cardiomiócitos.

Isto proporciona uma vantagem importante, pois cardiotoxicidade reduzida.

Isso já é vantajoso para pessoas que não sofrem de uma função cardíaca comprometida, e mais ainda para as pessoas que sofrem de uma função cardíaca comprometida, ou que estão em risco dos mesmos, como para os indivíduos exemplo que sofrem de insuficiência cardíaca congestiva (ICC ), disfunção ventricular esquerda (LVD) e / ou a> 10% de diminuição do ventrículo esquerdo Fracção de Ejecção (FE), e / ou indivíduos que tiveram um enfarte do miocárdio. Anticorpos de acordo com a invenção, que não afetem significativamente a sobrevivência de cardiomiócitos são, portanto, preferidos. In vitro, a função de cardiomiócitos é por exemplo medida por determinação da viabilidade dos cardiomiócitos, determinando o BNP (peptídeo natriurico do tipo B, que é um biomarcador cardíaco), determinando-se o prolongamento do QT, e / ou por determinação do potencial de membrana mitocondrial.

[0072] O referido anticorpo, de acordo com a invenção compreende de preferência um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga de domínio I de ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga o domínio III de ErbB-3. Uma concretização proporciona um anticorpo de acordo com a invenção, que não afeta significativamente a sobrevivência de cardiomiócitos, que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, em que a afinidade da referida segunda local para uma célula positiva ErbB-3 de ligação ao antígeno é igual a, ou maior do que, a afinidade do que o referido primeiro local de ligação ao antígeno para uma célula positiva de ErbB-2. A afinidade do dito segundo sítio de ligação a antígeno para uma célula positiva ErbB-3 é de preferência menor do que ou igual a 2.0 iiM, mais preferivelmente menor do que ou igual a 1,39 nM, mais preferivelmente menor do que ou igual a 0,99 nM. A afinidade do dito primeiro sítio de ligação a antígeno para uma célula positiva de ErbB-2 é de preferência inferior ou igual a 5,0 nM, de preferência inferior ou igual a 4,5 nM de preferência inferior ou igual a 4,0 nM.

[0073] Em uma concretização preferida, o referido anticorpo, que não afeta significativamente a sobrevivência dos cardiomiócitos compreende:

[0074] - pelo menos a sequência CDR3, de um modo preferido, pelo menos, a CDR1, CDR2 e CDR3, ou pelo menos a sequência da região variável da cadeia pesada, de uma região variável de ErbB-2 específico de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste de MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 e MF1898 como representado na figura 16A ou figura 16E, ou uma sequência de região variável de cadeia pesada que difere em pelo menos 15 aminoácidos, de um modo preferido em, no máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos, mais de preferência no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos, a partir das sequências da região variável da cadeia pesada recitado; e / ou

[0075] - pelo menos a sequência CDR3, de um modo preferido, pelo menos, a CDR1, CDR2 e CDR3, ou pelo menos a sequência da região variável da cadeia pesada, de uma região variável de ErbB-3 específico de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059;

MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 e MF6074 como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou na Figura 37, ou uma sequência de região variável de cadeia pesada que difere em pelo menos 15 aminoácidos, de um modo preferido em, no máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9 ou 10 aminoácidos, mais de preferência, no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos, a partir das sequências da região variável da cadeia pesada recitados. Em uma concretização preferida, o referido anticorpo é PB4188.

[0076] Outro aspecto da presente invenção proporciona um anticorpo de acordo com a invenção, que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-3, em que o referido anticorpo compreende um local de ligação ao antígeno que se liga pelo menos um resíduo de aminoácido de domínio I de ErbB-2 selecionado a partir do grupo que consiste de T144, T164, R166, P172, G179, S180 e R181, e os resíduos de aminoácidos expostos à superfície que estão localizados dentro de posições de cerca de 5 aminoácidos de T144, T164, R166, P172, G179, S180 ou R181. A numeração de resíduos de aminoácidos é a do Protein Data Bank (PDB) ID # 1S78. Como se mostra nos Exemplos, os anticorpos de ligação nessa região do domínio I de particularmente boas características de ligação de ErbB-2 exibem e que são capazes de neutralizar a atividade de células positivas ErbB-2 (tal como, a função do receptor induzida pelo ligante de ErbB-3 em uma ErbB-2 e de células positivas para ErbB-3, e / ou crescimento induzida pelo ligante de tal célula). Além do mais, tais anticorpos são particularmente adequados para terapia de combinação com erbB-2 anti-anticorpos monoclonais atualmente conhecidos como trastuzumab (que se liga ao domínio IV de ErbB-2) e pertuzumab (que se liga ao domínio II de ErbB-2), porque eles ligam-se diferentes domínios de ErbB-2. Assim, estes anticorpos podem ser utilizados simultaneamente, sem competição para o mesmo epítopo. O termo "à superfície

[0077] resíduos de aminoácidos expostas que estão localizados dentro de cerca de cinco posições de aminoácidos a partir de T144, T164, R166, P172, G179, S180 ou R181" refere-se a resíduos de aminoácidos que se encontram na sequência de aminoácidos primária localiza-se dentro de cerca de cinco primeiros resíduos de aminoácidos adjacente aos resíduos citados e que são pelo menos em parte exposta para o exterior da proteína, de modo que eles podem ser ligados por anticorpos (ver por exemplo Figura 2 IB). Preferencialmente, o referido resíduo de aminoácido localizado dentro de posições de ácido de cerca de 5 aminoácidos de T144, T164, R166, P172, G179, S180 ou R181 é selecionado a partir do grupo que consiste em L139, C140, Y141, Q142, 1) 143, 1145, L146, W147, K148, D149, L159, T160, L161, 1162 , D163, N165, S167, R168, A169, C170, H171, C173, S174, P175, M176, C177, K178, C182, W183, G184, E185 e S186. de preferência, o referido anticorpo compreende um local de ligação ao antígeno que se liga a pelo menos 2, ou pelo menos 3 resíduos de aminoácidos de domínio I de ErbB-2 selecionados de entre o grupo que consiste em T 144, T164, R166, P172, G179, S180 e R181, e os resíduos de aminoácidos expostos que estão localizados dentro de 5 posições de aminoácidos a partir de T144, T164, R166, P172, G179, S180 ou R181 superfície.

[0078] Em uma concretização preferida, proporciona- se um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção, em que o referido anticorpo compreende um local de ligação ao antígeno que se liga, pelo menos, T144, R166 e R181 do domínio I de ErbB-2. Outra concretização proporciona um anticorpo biespecífico, de acordo com a invenção, em que o referido anticorpo compreende um local de ligação ao antígeno que se liga, pelo menos, T144, R166, P172, G179 e R181 de domínio I de ErbB-2. Outra concretização proporciona um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção, em que o referido anticorpo compreende um local de ligação ao antígeno que se liga, pelo menos, T144, T164, R166, P172, G179, S180 e R181 de domínio I de ErbB-2.

[0079] Um outro aspecto da presente invenção fornece um anticorpo que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, em que o referido anticorpo compreende um local de ligação ao antígeno que se liga a pelo menos um aminoácido de domínio III de ErbB-3 selecionado a partir do grupo que consiste R426 e resíduos de aminoácidos expostos à superfície que estão localizados dentro de 11,2 à partir do R426 na proteína nativa ErbB-3. A numeração de resíduos de aminoácidos é a da Protein Data Bank (PDB) ID # 4P59. Como se mostra nos Exemplos, os anticorpos de ligação esta região de domínio III de particularmente boas características de ligação de ErbB-3 exibem e que são capazes de neutralizar a atividade de-3 ErbB células positivas (tal como a função do receptor induzida pelo ligante de ErbB-3 em uma ErbB-2 e de células positivas para ErbB-3, e / ou crescimento induzida pelo ligante de tal célula). O termo "resíduos de aminoácidos expostos à superfície que estão localizados dentro de 11,2 à partir do R426 na proteína nativa ErbB-3" refere-se a resíduos de aminoácidos que estão na estrutura terciária da proteína de ErbB-3 espacionariamente posicionado dentro de 11,2 à partir de R426 e que estão pelo menos em parte exposta para o exterior da proteína, de modo que eles podem ser ligados por anticorpos.

[0080] De preferência, os referidos resíduos de aminoácidos que estão localizados dentro de 11,2 à partir do R426 na proteína nativa ErbB-3 são selecionados de entre o grupo que consiste em L423, Y424, N425, G427, G452, R453, Y455, E480, R481, L482, 1) 483 e K485 (ver por exemplo, Figura 21C e Tabela 15). Em uma concretização preferida, um biespecífico é fornecido anticorpo de acordo com a invenção, em que o referido anticorpo compreende um local de ligação ao antígeno que se liga, pelo menos, R426 de domínio III de ErbB-3.

[0081] Preferencialmente, o referido anticorpo compreende um local de ligação ao antígeno que se liga, pelo menos, R426 de domínio III de ErbB-3.

[0082] Um anticorpo biespecífico da presente invenção é, de preferência afucosilatado, a fim de aumentar a atividade de ADCC. Um anticorpo biespecífico da presente invenção compreende preferivelmente uma quantidade reduzida de fucosilação da estrutura de hidrato de carbono ligada em N na regi Fc, quando comparado com o mesmo anticorpo produzido em uma célula normal CHO.

[0083] Um anticorpo biespecífico da presente invenção é utilizado de preferência em seres humanos.

[0084] Para este fim, um anticorpo biespecífico da presente invenção é, de preferência, de um ser humano ou um anticorpo humanizado.

[0085] Tolerância de um ser humano a um polipeptídeo é governada por muitos aspectos diferentes. Imunidade, seja mediada, B-célula mediada por células T ou outro é uma das variáveis que são englobadas na tolerância do humano para um polipeptídeo. A região constante de um anticorpo biespecífico da presente invenção é, de preferência, uma região constante humana. A região constante pode conter um ou mais, preferencialmente não mais do que 10, de preferência não mais do que cinco diferenças de aminoácidos com a região constante de um anticorpo humano de ocorrência natural. Prefere-se que a parte constante é inteiramente derivado de um anticorpo humano de ocorrência natural.

[0086] Vários anticorpos aqui produzidos são derivados a partir de uma biblioteca de domínio variável de anticorpo humano. Como tal, estes domínios variáveis são humanos. As regiões de CDR originais podem ser derivadas a partir de seres humanos, ser sintéticos ou derivados de um outro organismo. A região variável é considerada uma região variável humana quando ele tem uma sequência de aminoácidos que é idêntica a uma sequência de aminoácidos da região variável de um anticorpo humano de ocorrência natural, mas para a região CDR. A região variável de uma ErbB-2 de VH, um VH ligação ErbB-3, ou uma ligação da cadeia leve num anticorpo do invenção pode conter um ou mais, preferencialmente não mais do que 10, de preferência não mais do que 5 diferenças de aminoácido com a região variável de um anticorpo humano de ocorrência natural, não contando possíveis diferenças na sequência de aminoácidos das regiões CDR. Tais mutações ocorrem também na natureza, no contexto de hipermutação somática.

[0087] Os anticorpos podem ser derivados de várias espécies animais, pelo menos no que diz respeito à região variável da cadeia pesada. É prática comum para humanizar tais por exemplo, regiões variáveis de cadeia pesada de murino. Existem várias maneiras pelas quais isto pode ser conseguido entre os quais há enxerto de CDR para uma região variável de cadeia pesada humana com um 3D-estrutura que coincide com a estrutura 3D da região variável de cadeia pesada de murino; de imunização da região variável de cadeia pesada de murino, de preferência feito através da remoção conhecida ou suspeita T- ou B- célula epítopos da região variável da cadeia pesada murina. A remoção é tipicamente por substituição de um ou mais dos aminoácidos no epítopo para o outro (tipicamente conservadora) aminoácido, de tal forma que a sequência do epítopo é modificado de tal modo que ele não é mais um epítopo de T ou de células-B.

[0088] As regiões variáveis, tais desimunizada de murino da cadeia pesada são menos imunogênica em seres humanos do que a região variável da cadeia pesada murina originais. De preferência, uma região variável ou o domínio da invenção é ainda humanizado, tal como, por exemplo folheados. Ao utilizar técnicas de revestimento, resíduos exteriores que são prontamente encontrados pelo sistema imune são seletivamente substituídos com resíduos humanos para fornecer uma molécula híbrida que compreende quer uma superfície folheados fracamente imunogênica, ou substancialmente não imunogênicos. Um animal, tal como utilizado na invenção é preferencialmente um mamífero, mais preferivelmente um primata, com maior preferência um humano.

[0089] Um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende, preferencialmente, uma região constante de um anticorpo humano. De acordo com diferenças nos seus domínios constantes de cadeia pesada, os anticorpos são agrupados em cinco classes ou tipos ISO: IgG, IgA, IgM, IgD, e IgE. Estas classes ou isotipos de compreender pelo menos uma das referidas cadeias pesadas que é nomeado com uma letra grega correspondente. Em uma concretização preferida, a invenção proporciona um anticorpo de acordo com a invenção, em que a referida região constante é selecionada de entre o grupo de IgG, IgA, IgM, IgD, e as regiões constantes de IgE, o referido modo mais preferido regi constante compreende uma regi constante de IgG, mais preferivelmente um IgGI região constante, de preferência, uma região constante de IgGl mutado. Alguma variação na região constante de IgGl ocorre na natureza, tais como por exemplo o alotipos Glml, 17 e Glm3, e / ou é permitido sem alterar as propriedades imunológicas do anticorpo resultante. Tipicamente, entre cerca de 1-10 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos são permitidos na região constante.

[0090] A invenção em uma concretização proporciona um anticorpo compreendendo um domínio variável que se liga a ErbB-2, em que o referido anticorpo compreende pelo menos a sequência CDR3 de uma região variável de ErbB-2 específico de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste de MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 e MF1898 como representado na figura 16A ou figura 16E, ou em que o referido anticorpo compreende uma sequência de CDR3 de cadeia pesada que difere em pelo mais três, de um modo preferido em, no máximo, dois, de preferência em não mais do que um aminoácido a partir de uma sequência de CDR3 de VH de um selecionado a partir do grupo que consiste de MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 e MF1898 como representado na figura 16A ou figura 16E. O referido anticorpo compreende, preferencialmente, pelo menos, a sequência de CDR3 de MF 1849, MF2971, MF3958, MF3004 ou MF3991, mais preferencialmente pelo menos a sequência CDR3 de MF3958.

[0091] O referido anticorpo compreende, preferencialmente, pelo menos, as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de uma região variável de ErbB-2 específico de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste de MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 e MF1898 como representado na figura 16A ou figura 16E, ou sequências de cadeia pesada de CDR1, CDR2 e CDR3 que diferem em no máximo três, de um modo preferido em, no máximo, dois, de um modo preferido em, no máximo, um aminoácido a partir das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 ou MF1898. O referido anticorpo compreende, preferencialmente, pelo menos, a CDR1, CDR2 e CDR3 de MF 1849, MF2971, MF3958, MF3004 ou MF3991, mais preferencialmente, pelo menos, a CDR1, CDR2 e CDR3 de MF3958.

[0092] A invenção também proporciona um anticorpo compreendendo um domínio variável que se liga ErbB-3, em que o referido anticorpo compreende pelo menos a sequência CDR3 de uma região variável de ErbB-3 específico de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 e MF6074 como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou na Figura 37, ou em que o referido anticorpo compreende uma sequência de CDR3 de cadeia pesada que difere no máximo três, de um modo preferido em, no máximo, dois, de preferência em não mais do que um aminoácido a partir de uma sequência de CDR3 de uma VH selecionada de entre o grupo consistindo de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 e MF6074 como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou anticorpo Figura 37. Dito de um modo preferido compreende, pelo menos,

a sequência de CDR3 de MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 ou MF6065, mais preferencialmente pelo menos a sequência CDR3 de MF3178.

[0093] O referido anticorpo compreende, preferencialmente, pelo menos, a CDR1, CDR2 e CDR3 de uma região variável de ErbB-3 específico de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 e MF6074 como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou na Figura 37, ou de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 de sequências que diferem em no máximo três, de um modo preferido em, no máximo, dois, de um modo preferido em, no máximo, um aminoácido da CDR1, CDR2 e CDR3 de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 ou MF6074. O referido anticorpo compreende, preferencialmente, pelo menos, as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 ou MF6065, mais preferencialmente, pelo menos, o CDR1, CDR2 e CDR3 da sequência de MF3178.

[0094] A invenção em uma concretização proporciona um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, em que o referido primeiro local de ligação ao antígeno compreende pelo menos a sequência CDR3 de uma ErbB-2 região variável da cadeia pesada específico selecionado a partir do grupo que consiste de MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 e MF1898 como representado na figura 16A ou figura 16E, ou uma sequência de CDR3 de cadeia pesada que difere em, no máximo, três, de preferência em, no máximo, dois, de preferência em não mais do que um aminoácido a partir de uma sequência de CDR3 de VH de uma selecionada a partir do grupo que consiste de MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 e MF1898 como representado na figura 16A ou figura 16E, e em que o referido segundo local de ligação ao antígeno compreende pelo menos a sequência CDR3 de uma região variável de ErbB-3 específico de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 e MF6074 como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou na Figura 37, ou uma sequência de CDR3 de cadeia pesada que difere no máximo três, de um modo preferido em, no máximo, dois, de preferência em não mais do que um aminoácido a partir de uma sequência de CDR3 de uma VH selecionado a partir do grupo que consiste de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 e MF6074 como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou Figura 37. O referido primeiro local de ligação ao antígeno compreende, de preferência, pelo menos, a sequência de CDR3 de MF1849, MF2971, MF3958, MF3004 ou MF3991, mais preferencialmente pelo menos a sequência CDR3 de MF3958 e disse segundo local de ligação ao antígeno compreende, de preferência, pelo menos, a sequência de CDR3 de MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 ou MF6065, mais preferencialmente pelo menos a sequência CDR3 de MF3178.

[0095] O referido primeiro local de ligação ao antígeno compreende, de preferência, pelo menos, as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de uma região variável de ErbB-2 específico de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste de MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 e MF1898 como representado na figura 16A ou figura 16E, ou sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada que diferem em no máximo três, de um modo preferido em, no máximo, dois, de um modo preferido em, no máximo, um aminoácido a partir do CDR1 , CDR2 e CDR3 de MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 ou MF1898, e o referido segundo local de ligação ao antígeno compreende, de preferência, pelo menos, o CDR1, CDR2 e CDR3 de uma região variável de ErbB-3 específico de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 e MF6074 como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou na Figura 37,

ou de sequências de cadeia pesada de CDR1, CDR2 e CDR3 que diferem em no máximo três, de um modo preferido em, no máximo, dois, de um modo preferido em, no máximo, um aminoácido a partir de sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 ou MF6074 como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou Figura 37. O referido primeiro local de ligação ao antígeno compreende, de preferência, pelo menos, as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de MF1849, MF2971, MF3958, MF3004 ou MF3991, mais preferencialmente, pelo menos, o CDR1, CDR2 e CDR3 de MF3958, e o referido segundo local de ligação ao antígeno compreende, de preferência, pelo menos, as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 ou MF6065, mais preferencialmente, pelo menos, a sequência de CDR1, CDR2 e CDR3 de MF3178.

[0096] Uma concretização preferida proporciona um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, em que o referido primeiro local de ligação ao antígeno compreende pelo menos a sequência CDR3 de MF3958, ou um sequência de CDR3 que difere no máximo três, de um modo preferido em, no máximo, dois, de preferência em não mais do que um aminoácido a partir da sequência de CDR3 de MF3958, e em que o referido segundo local de ligação ao antígeno compreende pelo menos a sequência CDR3 de MF3178, ou uma CDR3 sequência que difere no máximo três, de um modo preferido em, no máximo, dois, de preferência em não mais do que um ácido de amino a partir da sequência de CDR3 de MF3178.

[0097] A invenção em uma concretização proporciona um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, em que o referido primeiro local de ligação ao antígeno compreende pelo menos as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de MF3958, ou sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 que diferem em no máximo três, de um modo preferido em, no máximo, dois, de um modo preferido em, no máximo, um aminoácido a partir das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de MF3958, e em que o referido segundo local de ligação ao antígeno compreende pelo menos a sequência de CDR1, CDR2 e CDR3 de MF3178, ou sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 que diferem em no máximo três, de um modo preferido em, no máximo, dois, de um modo preferido em, no máximo, um aminoácido a partir das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de MF3178.

[0098] A invenção em uma concretização proporciona um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, em que o referido primeiro local de ligação ao antígeno compreende pelo menos a sequência CDR3 de MF3958 e em que o referido segundo local de ligação ao antígeno compreende pelo menos a sequência CDR3 de MF3178.

[0099] A invenção em uma concretização proporciona um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, em que o referido primeiro local de ligação ao antígeno compreende pelo menos as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de MF3958 e em que o referido segundo local de ligação ao antígeno compreende pelo menos a sequência de CDR1, CDR2 e CDR3 de MF3178.

[00100] as sequências CDR estão, por exemplo, variar para fins de optimização, de um modo preferido, a fim de melhorar a eficácia da ligação ou a estabilidade do anticorpo. A otimização é realizada, por exemplo, por meio de procedimentos de mutagênese, onde após a estabilidade e / ou afinidade de ligação dos anticorpos resultantes são de preferência testados e uma sequência CDR de ErbB-2 ou ErbB- 3 específica melhorada é, de preferência, selecionada. Um técnico versado no assunto é bem capaz de gerar variantes de anticorpos compreendendo pelo menos uma sequência CDR alterada de acordo com a invenção. Por exemplo, a substituição de aminoácidos conservativa é aplicada. Exemplos de substituição de aminoácidos conservativas incluem a substituição de um resíduo hidrófobo tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina por um outro resíduo hidrofóbico, e a substituição de um resíduo polar por outro resíduo polar, tal como a substituição de arginina por lisina, ácido glutâmico para o ácido aspártico, ou glutamina por asparagina.

[00101] A invenção, em uma concretização, proporciona um anticorpo compreendendo um domínio variável que se liga a ErbB-2, em que a cadeia VH do referido domínio variável de cadeia compreende a sequência de aminoácidos de VH de MF2926; MF2930; MF1849; MF2973; MF3004; MF3958 (MF2971 é humanizado); MF2971; MF3025; MF2916; MF3991 (MF3004 é humanizado); MF3031; MF2889; MF2913; MF1847; MF3001, MF3003 ou MF1898 como representado na figura 16A ou figura 16E; ou compreende a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF2926; MF2930; MF1849; MF2973; MF3004; MF3958 (MF2971 é humanizado); MF2971; MF3025; MF2916; MF3991 (MF3004 é humanizado); MF3031; MF2889; MF2913; MF1847; MF3001, MF3003 ou MF1898 como representado na figura 16A ou figura 16E ter, no máximo, 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferencialmente, no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à sequência de cadeia VH acima indicado da Figura 16A ou na Figura 16E. A cadeia VH do domínio variável que se liga a ErbB-2 compreende, de preferência, a sequência de aminoácidos de: - MF1849; ou - MF2971 ou uma versão humanizada do mesmo, em que a referida versão humanizada compreende preferencialmente a sequência de aminoácidos de MF3958; ou - MF3004 ou uma versão humanizada do mesmo, em que a referida versão humanizada compreende preferencialmente a sequência de aminoácidos de MF3991;

[00102] como representado na Figura 16A. Em uma concretização, a cadeia VH do domínio variável que se liga a ErbB-2 compreende a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF1849; ou MF2971 ou uma versão humanizada do mesmo, em que a referida versão humanizada compreende,

preferencialmente, a sequência de aminoácidos de MF3958; ou MF3004 ou uma versão humanizada do mesmo, em que a referida versão humanizada compreende, preferencialmente, a sequência de aminoácidos de MF3991, em que as sequências VH recitados têm, no máximo, 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferivelmente, no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à respectiva sequência representada na Figura 16A.

Em uma preferida concretização a cadeia VH do domínio variável que se liga a ErbB-2 compreende a sequência de aminoácidos de MF3958; ou compreende a sequência de aminoácidos de MF3958 representado na figura 16A ter, no máximo, 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferencialmente no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à sequência de cadeia VH.

O anticorpo compreendendo um domínio variável que se liga erbB-2 é de preferência um anticorpo biespecífico que compreende ainda de preferência um domínio variável que se liga ErbB-3. A cadeia VH do domínio variável que se liga Erb-B3 compreende, preferencialmente, a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 ou MF6074 como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou Figura 37; ou compreende a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063;

MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 ou MF6074 como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou na Figura 37 que tem, no máximo, 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferencialmente no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação destes com respeito à sequência de cadeia VH da Figura 16B ou da Figura 16E ou Figura 37. a cadeia VH do domínio variável que se liga a Erb-B3, preferencialmente, compreende a sequência de aminoácidos do MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 ou MF6065; ou compreende a sequência de aminoácidos de MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 ou MF6065 tendo, no máximo, 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferencialmente no máximo 1 , 2, 3, 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à respectiva sequência VH de cadeia Figura 16B ou da Figura 37. Em uma concretização preferida, a cadeia VH do domínio variável que se liga ErbB-3 compreende a sequência de aminoácidos de MF3178; ou compreende a sequência de aminoácidos de MF3178 representado na Figura 16B tendo, no máximo, 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferencialmente no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à sequência de cadeia VH.

De preferência, as acima mencionadas de aminoácidos inserções, deleções e substituições não estão presentes na região do CDR3. Os acima mencionados aminoácidos inserções, deleções e substituições são também, de preferência não está presente nas regiões CDR1 e CDR2. Os acima mencionados aminoácidos inserções, deleções e substituições são também, de preferência não está presente na região de FR4.

[00103] A invenção proporciona ainda um anticorpo que compreende um domínio variável que se liga ErbB-3, em que a cadeia VH da referida região variável compreende a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 ou MF6074 como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou na Figura 37, ou compreende a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 ou MF6074 como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou na Figura 37 que tem, no máximo, 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferencialmente no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito à referida sequência de cadeia VH. A cadeia VH do domínio variável que se liga ErbB3 de um modo preferido compreende a sequência de aminoácidos da cadeia VH de MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 ou MF6065; ou compreende a sequência de aminoácidos da cadeia VH de MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 ou MF6065 tendo, no máximo, 15, de preferência, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferivelmente no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito à referida sequência de cadeia VH. Em uma concretização preferida, a cadeia VH do domínio variável que se liga ErbB-3 compreende a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3178 representado na Figura 16B; ou compreende a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3178 representado na Figura 16B tendo, no máximo, 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferencialmente no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à sequência de cadeia VH. O anticorpo compreendendo um domínio variável que se liga ErbB- 3, é de preferência um anticorpo biespecífico que compreende ainda de preferência um domínio variável que se liga a ErbB-

2. A cadeia VH do domínio variável que se liga a ErbB-2 compreende de preferência a sequência de aminoácidos de uma cadeia VH da Figura 16A ou na Figura 16E. A cadeia VH do domínio variável que se liga a ErbB-2 compreende de preferência a sequência de aminoácidos de MF 1849; ou MF2971 ou uma versão humanizada do mesmo, em que a referida versão humanizada compreende preferencialmente a sequência de aminoácidos de MF3958; ou MF3004 ou uma versão humanizada do mesmo, em que a referida versão humanizada compreende preferencialmente a sequência de aminoácidos de MF3991 como representado na Figura 16A. Em uma concretização, o recitado ligação de sequências VH a Erb-B2 tem, no máximo, 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferencialmente no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à respectiva sequência representada na Figura 16A. Em uma concretização preferida, o referido erbB-2 da cadeia VH de ligação da figura 16A compreende a sequência de aminoácidos de MF3958; ou compreende a sequência de aminoácidos de MF3958 tendo, no máximo, 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferencialmente no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à sequência de cadeia VH. De preferência, as acima mencionadas inserções, deleções e substituições de aminoácidos não estão presentes na região do CDR3. Os acima mencionados aminoácidos inserções, deleções e substituições são também, de preferência não está presente nas regiões CDR1 e CDR2. As acima mencionadas inserções, deleções e substituições de aminoácidos também, de preferência, não estão presentes na região de FR4.

[00104] É ainda proporcionado um anticorpo, de acordo com a invenção, em que o referido anticorpo compreende uma sequência de região variável de ErbB-2 específico de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste nas sequências de região variável de cadeia pesada de MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 e MF1898 como representado na figura 16A ou figura 16E, ou em que o referido anticorpo compreende uma sequência de região variável de cadeia pesada que difere em, no máximo, 15, de preferência, em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferencialmente no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5, os aminoácidos a partir das sequências da região variável da cadeia pesada de MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971,

MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 ou MF1898.

[00105] É ainda proporcionado um anticorpo de acordo com a invenção, em que o referido anticorpo compreende uma sequência de região variável de ErbB-3 específico de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste nas sequências de região variável de cadeia pesada de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 e MF6074 como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou na Figura 37, ou em que o referido anticorpo compreende uma sequência de região variável de cadeia pesada que difere em, no máximo, 15, de preferência em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9 ou 10, mais preferencialmente no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5, os aminoácidos a partir das sequências da região variável da cadeia pesada de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 ou MF6074.

[00106] A invenção em uma concretização proporciona um anticorpo compreendendo dois locais de ligação ao antígeno que se ligam de ErbB-2, em que pelo menos um dos referidos locais de ligação ao antígeno liga-se a domínio I de ErbB-

2. De preferência, ambos os sítios de ligação ao antígeno ligar-se domínio I de ErbB-2. Tal anticorpo de acordo com a invenção é particularmente adequado para a terapia de combinação com atualmente usadas moléculas anti-erbB-2 de ligação que não se ligam de domínio I de ErbB-2, tais como trastuzumab, que se liga domínio IV de ErbB-2 e pertuzumab que liga o domínio II de ErbB-2, porque então as moléculas de ligação diferentes não competem umas com as outras para o mesmo epítopo.

[00107] É ainda proporcionado um anticorpo compreendendo dois locais de ligação ao antígeno que se ligam de ErbB-2, em que pelo menos um dos referidos locais de ligação ao antígeno liga-se domínio I de ErbB-2 e em que a afinidade (KD) do referido pelo menos um local de ligação ao antígeno para uma célula positiva de ErbB-2 é menor do que ou igual a 5,0 nM, de preferência inferior ou igual a 4,5 nM, mais preferencialmente inferior ou igual a 3,9 nM. De preferência, ambos os sítios de ligação ao antígeno ligar- se domínio I de ErbB-2. Em uma concretização preferida, a afinidade do referido pelo menos um células local para ErbB- 2 no de ligação ao antígeno SK-BR-3 é menor do que ou igual a 5,0 nM, de preferência, inferior ou igual a 4,5 nM, de um modo mais preferido menor do que ou igual a 4,0 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 3,5 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 3,0 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 2,3 nM. Em uma concretização, a referida afinidade está dentro da faixa de 3,0-1,6 nM. Em uma concretização preferida, a afinidade do referido pelo menos um local para as células ErbB-2 de ligação ao antígeno em BT-474 é menor do que ou igual a 5,0 nM, de preferência, inferior que ou igual a 4.5 iiM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 3,9 nM. Em uma concretização, a referida afinidade está dentro da faixa de 4,5-3,3 nM.

[00108] As afinidades acima mencionadas são, de preferência, conforme medido por meio de medidas de afinidade de células em estado estacionário, em que as células são incubadas a 4° C, utilizando o anticorpo marcado radioativamente, onde depois a radioatividade ligada à célula é medida, como descrito nos Exemplos.

[00109] A invenção proporciona ainda um anticorpo que compreende dois domínios variáveis que se ligam a ErbB-2, em que uma cadeia VH do referido domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos da cadeia VH de MF2926; MF2930; MF1849; MF2973; MF3004; MF3958 (MF2971 é humanizado); MF2971; MF3025; MF2916; MF3991 (MF3004 é humanizado); MF3031; MF2889; MF2913; MF1847; MF3001, MF3003 ou MF1898 como representado na figura 16A ou figura 16E; ou a sequência de aminoácidos da cadeia VH de MF2926; MF2930; MF1849; MF2973; MF3004; MF3958 (MF2971 é humanizado); MF2971; MF3025; MF2916; MF3991 (MF3004 é humanizado); MF3031; MF2889; MF2913; MF1847; MF3001, MF3003 ou MF1898 VH-cadeias, conforme ilustrado na figura 16A ou figura 16E, tendo, no máximo, 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferencialmente no máximo 1, 2 , 3, 4 ou 5, amino ácidos inserções, deleções, substituições ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à respectiva sequência representada na figura 16A ou figura 16E. Dito de VH compreende, preferencialmente, a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF1849; ou MF2971 ou uma versão humanizada do mesmo, em que a referida versão humanizada compreende preferencialmente a sequência de aminoácidos de MF3958; ou MF3004 ou uma versão humanizada do mesmo, em que a referida versão humanizada compreende preferencialmente a sequência de aminoácidos de MF3991 como representado na Figura 16A; ou compreende a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF1849; ou MF2971 ou uma versão humanizada do mesmo, em que a referida versão humanizada compreende preferencialmente a sequência de aminoácidos de MF3958; ou MF3004 ou uma versão humanizada do mesmo, em que a referida versão humanizada compreende preferencialmente a sequência de aminoácidos de MF3991 como representado na Figura 16A têm, no máximo, 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 , mais de preferência no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à respectiva sequência representada na Figura 16A. Os domínios variáveis do anticorpo compreendem, de preferência cadeias VH idênticos, de preferência tendo uma sequência como representado na figura 16A ou figura 16E. Um anticorpo com os domínios varieis com cadeias VH idênticos não é um anticorpo biespecífico. cadeias VH são idênticos para a presente invenção, se eles compreendem a mesma sequência da cadeia VH, como representado na figura 16A ou figura 16E ou na Figura 37, ou a mesma sequência de cadeia VH, mas para 1, 2, 3, 4 ou 5 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à respectiva sequência representada na figura 16A ou figura 16E ou Figura 37.

[00110] A invenção, em uma concretização, proporciona um anticorpo compreendendo dois locais de ligação ao antígeno que se ligam ErbB-3, em que pelo menos um dos referidos locais de ligação ao antígeno liga-se o domínio III de ErbB-

3. De preferência, ambos os sítios de ligação ao antígeno de domínio de ligação de ErbB III-3. Tal anticorpo de acordo com a invenção é particularmente adequado para a terapia de combinação com atualmente usadas moléculas anti-ErbB-3 de ligação que não se ligam o domínio III de ErbB-3, tais como MM-121 (# AB6) e RG7116 que ligam o domínio I de ErbB-3, porque então as moléculas de ligação diferentes não competem umas com as outras para o mesmo epítopo.

[00111] É ainda proporcionado um anticorpo compreendendo dois locais de ligação ao antígeno que se ligam ErbB-3, em que pelo menos um dos referidos locais de ligação ao antígeno liga-se o domínio III de ErbB-3, e, em que a afinidade (KD) do referido pelo menos um local de ligação ao antígeno para uma célula positiva ErbB-3 é menor do que ou igual a 2,0 nM, de preferência inferior ou igual a 1,5 nM, mais preferivelmente menor do que ou igual a 1,39 nM, mais preferivelmente menor do que ou igual a 0,99 nM. De preferência, ambos os sítios de ligação ao antígeno ligar- se o domínio III de ErbB-3. Em uma concretização preferida, a afinidade do referido pelo menos um células local para ErbB-3 em de ligação ao antígeno SK-BR-3 é menor do que ou igual a 2,0 nM, de preferência, inferior ou igual a 1,5 nM, mais preferivelmente menor do que ou igual a 1,39 nM, mais preferivelmente, menor do que ou igual a 0,99 nM. Em uma concretização, a referida afinidade está dentro da faixa de 1,39-0,59 nM. Em uma concretização preferida, a afinidade do referido pelo menos um células local para ErbB-3 em de ligação ao antígeno BT-474 é menor do que ou igual a 2,0 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 1,5 nM, mais preferivelmente, menor do que ou igual a 1,0 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 0,5 nM, mais preferivelmente, menor do que ou igual a 0,31 nM, mais preferivelmente, menor do que ou igual a 0,23 nM. Em uma concretização, a referida afinidade está dentro da faixa de 0,31 - 0,15 nM.

[00112] Mais uma vez, as afinidades acima mencionadas são, de preferência, conforme medido por meio de medidas de afinidade de células em estado estacionário, em que as células são incubadas a 4 ° C, utilizando o anticorpo marcado radioativamente, onde depois a radioatividade ligada à célula é medida, como descrito nos Exemplos.

[00113] A invenção proporciona ainda um anticorpo que compreende dois domínios variáveis que cada ErbB3 se ligam, em que um domínio VH dos domínios variáveis compreende a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 ou MF6074 como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou Figura 37; ou compreende a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 ou MF6074 tendo, no máximo, 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferencialmente no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito a qualquer uma das referidas sequências de cadeias VH.

A referida VH compreende preferencialmente a sequência de aminoácidos da cadeia VH de MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 ou MF6065; ou compreende a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 ou MF6065 tendo, no máximo, 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferencialmente no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito a qualquer uma das referidas sequências de cadeias VH.

Dito de VH compreende, preferencialmente, a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3178; ou compreende a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3178 representado na Figura 16B tendo, no máximo, 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferencialmente no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à sequência de cadeia VH MF3178. Os domínios variáveis do anticorpo compreendem, de preferência cadeias VH idênticos, de preferência tendo uma sequência como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou Figura 37. Um anticorpo com os domínios varieis com cadeias VH idênticos não é um anticorpo biespecífico.

As cadeias VH são idênticos se compreender a mesma sequência da cadeia VH, como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou na Figura 37, ou a mesma sequência de cadeia VH, mas para 1, 2, 3, 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à sequência de cadeia VH da Figura 16B ou da Figura 16E ou Figura 37.

[00114] Os anticorpos monoespecíficos, de acordo com a presente invenção que são específicas para ErbB-3 têm a vantagem de que eles têm uma melhor atividade funcional contra ErbB-3, em comparação com os compostos do estado da técnica, tais como, por exemplo, MM-121 (#Ab6), o que significa que estes os anticorpos de acordo com o invenção são mais capazes de neutralizar a atividade de ErbB-3 (tal como, uma função induzida por ligante de receptores de ErbB- 3 e / ou o crescimento induzido pelo ligante de uma célula positiva de ErbB-2 e ErbB-3). Este é, por exemplo, mostrado na Tabela 7 e na Figura 38.

[00115] Em uma concretização preferida, a invenção proporciona um anticorpo biespecífico que compreende um domínio variável que se liga a ErbB-2, em que a cadeia VH do referido domínio variável compreende

[00116] - a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF1849; ou MF2971 ou uma versão humanizada do mesmo, em que a referida versão humanizada compreende, preferencialmente, a sequência de aminoácidos de MF3958; ou MF3004 ou uma versão humanizada do mesmo, em que a referida versão humanizada compreende, preferencialmente, a sequência de aminoácidos de MF3991, como representado na Figura 16A; ou compreende

[00117] - a sequência de aminoácidos da cadeia VH ou MF1849 MF2971 ou uma versão humanizada do mesmo, em que a referida versão humanizada compreende preferencialmente a sequência de aminoácidos de MF3958; ou MF3004 ou uma versão humanizada do mesmo, em que a referida versão humanizada compreende preferencialmente a sequência de aminoácidos de MF3991, como representado na Figura 16A ter, no máximo, 15,

de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferivelmente no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos em relação ao referido VH.

Tal anticorpo biespecífico de acordo com esta concretização compreende ainda de preferência um domínio variável que se liga ErbB-3. A cadeia VH do domínio variável que se liga ErbB-3, compreende de preferência a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 ou MF6074 como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou na Figura 37, ou mais preferencialmente compreende a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 ou MF6074 como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou Figura 37, possuindo pelo menos 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferencialmente no máximo 1, 2, 3 , 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito a qualquer uma das referidas sequências de cadeia VH da Figura 16B ou da Figura 16E ou Figura 37. a cadeia VH do domínio variável que se liga ErbB- 3, compreende de preferência a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3178 como representado na Figura 16B, ou compreende a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3178 representado na Figura 16B tendo, no máximo, 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferivelmente no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à sequência de cadeia VH da Figura 16B.

[00118] A invenção proporciona de preferência um anticorpo biespecífico que compreende um domínio variável que se liga a ErbB-2 e um domínio variável que se liga ErbB- 3, em que a cadeia VH do domínio variável que se liga a ErbB- 2 compreende

[00119] - a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3958 como representado na Figura 16A; ou

[00120] - a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3958 como representado na Figura 16A ter, no máximo, 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferencialmente no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito ditas VH; e

[00121] em que a cadeia VH do domínio variável que se liga ErbB-3 compreende

[00122] - a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3178 como representado na Figura 16B; ou

[00123] - a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3178 representado na Figura 16B tendo, no máximo, 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferencialmente no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à sequência de cadeia VH da Figura 16B.

[00124] A invenção proporciona de preferência um anticorpo biespecífico que compreende um domínio variável que se liga a ErbB-2 e um domínio variável que se liga ErbB- 3, em que a cadeia VH do domínio variável que se liga a ErbB- 2 compreende

[00125] - a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3991 como representado na Figura 16A; ou

[00126] - a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3991 como representado na Figura 16A ter, no máximo, 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferencialmente no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito ditas VH; e

[00127] em que a cadeia VH do domínio variável que se liga ErbB-3 compreende

[00128] - a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3178 como representado na Figura 16B; ou

[00129] - a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3178 representado na Figura 16B tendo, no máximo, 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferencialmente no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à sequência de cadeia VH da Figura 16B.

[00130] Quando comparado com a sequência na Figura 16, o comportamento de uma cadeia VH tipicamente começa a tornar-se visivelmente diferente quando se tem mais do que 15 modificações de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos de uma cadeia VH, como representado na Figura

16. Uma cadeia VH tendo, no máximo, 15, de preferência, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à cadeia VH representado na Figura 16, de um modo preferido tem uma , 2, inserções 3, 4 ou 5 aminoácidos, deleções, substituições ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à cadeia VH representado na Figura 16, de preferência 1, 2, 3 ou 4 inserções, deleções, substituições ou uma combinação dos mesmos, de preferência 1 , 2 ou 3 inserções, deleções, substituições ou uma combinação destes, mais preferencialmente 1 ou 2 inserções, deleções, substituições ou uma combinação dos mesmos, e de preferência uma inserção, deleção, substituição ou uma combinação destes com respeito à cadeia VH representado na figura 16. A um ou mais inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos não são, de preferência na região de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia VH. Eles também são, de preferência não está presente na região de FR4. Uma substituição de aminoácidos é, de preferência, uma substituição de aminoácidos conservadora.

[00131] Em uma concretização preferida, a invenção proporciona um anticorpo biespecífico compreendendo uma sequência de aminoácidos tal como representada na Figura 16D, ou um anticorpo biespecífico da Figura 16D tem, no máximo, 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferencialmente no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à sequência da Figura 16D, em que a pelo menos 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou

10 substituições de aminoácidos, são preferencialmente, substituições de aminoácidos conservadoras. As inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos não são, de preferência na região CDR3 da cadeia VH, de preferência, não na região de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia VH, e, de preferência, não na região de FR4.

[00132] Os métodos racionais evoluíram para minimizar o conteúdo de resíduos não humanos no contexto humano. Vários métodos estão disponíveis para enxertar com sucesso a propriedade de ligação ao antígeno de um anticorpo para outro anticorpo biespecífico. As propriedades de ligação de anticorpos descansar predominantemente na sequência exata da região do CDR3, muitas vezes suportada pela sequência das regiões CDR1 e CDR2 no domínio variável combinada com a estrutura adequada do domínio variável como um todo. Vários métodos estão presentemente disponíveis para enxertar regiões CDR num domínio variável adequado de outro anticorpo. Alguns destes métodos são revistos em JC Almagrol e J. Fransson (2008) Frontiers in Bioscience 13, 1619-1633, que é aqui incluído por referência. A invenção proporciona, por conseguinte, ainda um anticorpo biespecífico humano ou humanizado que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, em que o domínio variável compreendendo o local de ligação de ErbB-2 compreende uma sequência de CDR3 de VH, tal como representado na figura 16A ou figura 16E, e em que o domínio variável compreendendo o local de ligação de ErbB-3 compreende uma região CDR3 de VH tal como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou região variável Figura 37. O VH compreendendo o local de ligação a ErbB -2 compreende, de preferência a sequência da região de CDR1, região de CDR2 e a região CDR3 de uma cadeia VH na figura 16A ou figura 16E. A região variável VH compreendendo o local de ligação de ErbB-3, de um modo preferido, compreende a sequência da região de CDR1, CDR2 região e a região CDR3 de uma cadeia VH na Figura 16B ou da Figura 16E ou Figura 37. O enxerto de CDR podem também ser usado para produzir uma cadeia VH com as regiões CDR de uma VH da Figura 16 ou na Figura 37, mas tendo uma estrutura diferente. O quadro pode ser diferente do outro VH humano, ou um mamífero diferente.

[00133] O mencionado, no máximo, 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições de aminoácidos são preferencialmente substituições de aminoácidos conservadoras. As inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos não são, de preferência na região CDR3 da cadeia VH, de preferência não na região de CDR1, CDR2 ou CDR3 da cadeia VH e de preferência não na região de FR4.

[00134] A cadeia leve de um domínio variável compreendendo uma sequência variável de cadeia pesada como representada na Figura 16 ou na Figura 37, é de preferência de linhagem germinal de cadeia leve 012, de um modo preferido a cadeia leve Kapa humana de linhagem germinal rearranjados IgVxl- 39 * 1/1 GJK1 * 01 ou um fragmento ou um seu derivado funcional (nomenclatura de acordo com a World Wide web no banco de dados IMGT imgt.org). Os termos rearranjados da linha germinal humana de cadeia leve kapa IgVKl-39 * 01 /

IGJ K L * 01, IGKV1-39 / IGKJ1, huVKl-39 de cadeia leve ou em curto 1IUVK1-39 são utilizados. A cadeia leve pode ter 1, inserções 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos, deleções, substituições ou uma combinação dos mesmos. O mencionado 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições de aminoácidos são substituições preferivelmente conservativas, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos não são, de preferência, na região CDR3 da cadeia VL, de um modo preferido não em CDR1, CDR2 ou a região CDR3 ou região FR4 da cadeia VL.

[00135] Estão disponíveis vários métodos para produzir anticorpos biespecíficos. Um método envolve a expressão de dois diferentes cadeias pesadas e duas cadeias leves diferentes em uma célula e o anticorpo recolha que é produzido pela célula. Anticorpo produzido desta maneira conterão tipicamente um conjunto de anticorpos com diferentes combinações de cadeias pesada e leve, alguns dos quais são o anticorpo biespecífico desejado. O anticorpo biespecífico pode posteriormente ser purificado a partir da colecção. A proporção de biespecífico para outros anticorpos que são produzidos pela célula pode ser aumentado de diversos modos. Em uma concretização preferida da invenção, a proporção é aumentada por não expressar duas cadeias leves diferentes, mas duas cadeias leves essencialmente idênticos na célula. Este conceito é no estado da técnica também referido como o método "cadeia leve comum". Quando as cadeias leves essencialmente idêntica funcionam em conjunto com as duas cadeias pesadas diferentes permitindo a formação de domínios variáveis com diferentes locais de ligação ao antígeno e as propriedades de ligação diferentes concomitantes, a razão de anticorpo biespecífico para outro anticorpo que é produzido pela célula é significativamente melhorado ao longo a expressão de duas cadeias leves diferentes.

A razão de anticorpo biespecífico que é produzido pela célula pode ser ainda melhorada por estimulação do emparelhamento de duas cadeias pesadas diferentes uns com os outros através do emparelhamento de duas cadeias pesadas idênticas.

O estado da técnica descreve várias maneiras em que tais heterodimerização das cadeias pesadas podem ser alcançados.

Uma maneira é a de gerar 'botão no furo' anticorpos biespecíficos.

Ver Pedido de Patente US 20030078385 (Arathoon et al -. Genenteeh). Outro e preferido método é descrito no pedido de patente provisório Norte- Americano US 61/635,935, o qual foi seguido pelo pedido US No. 13 / 866.747 e pedido PCT N° PCT/NL2013/050294 (WO 2013/157954 Al), que são aqui incorporadas por referência.

Os métodos e meios são revelados para a produção de anticorpos biespecíficos a partir de uma única célula, através do qual são fornecidos meios que favorecem a formação de anticorpos biespecíficos através da formação de anticorpos monoespecíficos.

Estes métodos também podem ser favoravelmente empregues na presente invenção.

Assim, o invenção proporciona um método para a produção de um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção (a partir de uma única célula), em que o referido anticorpo biespecífico compreende dois domínios CH3 que são capazes de formar uma interface, o referido método compreendendo proporcionar na referida célula a) uma primeira molécula de ácido nucleico que codifica um primeiro domínio CH3 que compreende cadeia pesada, b) uma segunda molécula de ácido nucleico que codifica um segundo domínio CH3 compreendendo cadeia pesada, em que as referidas moléculas de ácido nucleico são fornecidas com meios para emparelhamento preferencial do referido primeiro e segundo domínio CH3 compreendendo cadeias pesadas, o referido método compreendendo ainda o passo de cultivar a referida célula hospedeira e permitindo a expressão da referida duas moléculas de ácido nucleico e recolher o referido anticorpo biespecífico a partir da cultura. A referida primeira e segunda moléculas de ácido nucleico pode ser parte da mesma molécula de ácido nucleico, vector ou veículo de entrega de genes e pode ser integrada no mesmo local do genoma da célula hospedeira. Alternativamente, as referidas primeira e segunda moléculas de ácido nucleico são fornecidas separadamente à referida célula.

[00136] Uma concretização preferida proporciona um método para a produção de um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção (a partir de uma única célula), em que o referido anticorpo biespecífico compreende dois domínios CH3 que são capazes de formar uma interface, o referido método compreendendo o fornecimento de:

[00137] - uma célula tendo a) uma primeira molécula de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada que compreende um local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e que contém um primeiro domínio CH3, e b) uma segunda molécula de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada compreendendo uma de ligação ao antígeno local que se liga

ErbB-3 e que contém um segundo domínio CH3, em que as referidas moléculas de ácido nucleico são fornecidos com meios para emparelhamento preferencial do referido primeiro e segundo domínios CH3,

[00138] o referido método compreendendo ainda a etapa de cultivar a referida célula e permitindo a expressão da referida duas moléculas de ácido nucleico e recolher o referido anticorpo de IgG biespecíficos a partir da cultura. Em uma concretização particularmente preferida, a referida cula tem também uma terceira molécula de ácido nucleico que codifica uma cadeia leve comum. As referidas primeira, segunda e terceira molécula de ácido nucleico pode ser parte da mesma molécula de ácido nucleico, vetor ou veículo de entrega de genes e pode ser integrada no mesmo local do genoma da célula hospedeira. Alternativamente, as referidas moléculas de primeiro, segundo e terceiro ácidos nucleicos são fornecidos separadamente à referida célula. Uma cadeia leve preferida é comum 012, de preferência a rearranjado da cadeia leve capa humana de linha germinal IgVxl 39 * 01 / * IGJK1 01, como descrito acima. Meios para emparelhamento preferencial do referido l SL e o referido segundo domínio CH3 são de preferência as mutações correspondentes no domínio CH3 da cadeia pesada de regiões de codificação. As mutações preferidas para produzir essencialmente apenas os anticorpos biespecíficos são as substituições de aminoácidos L351K e T366K (numeração de acordo com Kabat) no primeiro domínio CH3 e as substituições de aminoácidos L351D e L368E no segundo domínio CH3, ou vice-versa. É ainda proporcionado, por conseguinte, um método de acordo com a invenção para a produção de um anticorpo biespecífico, em que o referido primeiro domínio CH3 compreende as substituições de aminoácidos L351K e T366K (numeração de acordo com Kabat) e em que o referido segundo domínio CH3 compreende a substituições de aminoácidos L351D e L368E, o referido método compreendendo ainda o passo de cultivar a referida célula e permitindo a expressão das referidas moléculas de ácido nucleico e recolher o referido anticorpo biespecífico a partir da cultura. Também é proporcionado um método de acordo com a invenção para a produção de um anticorpo biespecífico, em que o referido primeiro domínio CH3 compreende as substituições de aminoácidos L351D e L368E (numeração de acordo com Kabat), e, em que o referido segundo domínio CHS compreende as substituições de aminoácidos L351K e T366K, disse método que compreende ainda o passo de cultivar a referida célula e permitindo a expressão das referidas moléculas de ácido nucleico e recolher o referido anticorpo biespecífico a partir da cultura. Os anticorpos que podem ser produzidos por estes métodos também são parte da presente invenção. Os domínios de heterodimerização de HSC são de preferência os domínios de heterodimerização IgGl. As regiões constantes da cadeia pesada compreendendo os domínios de heterodimerização CH3 são de preferência regiões constantes de IgGl.

[00139] Em uma concretização a invenção fornece uma molécula de ácido nucleico que codifica para uma região variável de cadeia pesada de anticorpo de acordo com a invenção. A molécula de ácido nucleico (tipicamente um ácido nucleico in vitro, isolado ou recombinante) codifica de preferência uma região variável da cadeia pesada, como representado na figura 16A ou figura 16B ou da Figura 37, ou uma região variável da cadeia pesada, como representado na figura 16A ou figura 16B ou Figura 37 que tem inserções 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos, deleções, substituições ou uma combinação dos mesmos. Em uma concretização preferida, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência como representada na Figura 16 ou na Figura 37. Em uma outra concretização preferida, a molécula de ácido nucleico que codifica a mesma sequência de aminoácidos como o ácido nucleico representada na Figura 16 ou na Figura 37, mas tem uma sequência diferente porque ela codifica um ou mais códons diferentes. Por exemplo, tal molécula de ácido nucleico é o códon otimizado para as células produtoras de anticorpos, tais como, por exemplo, células de ovário de hamster chinês (CHO), células NSO ou por C6 ™ células. A invenção proporciona ainda uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada da Figura 16D ou Figura 37.

[00140] Uma molécula de ácido nucleico, tal como utilizado na invenção é, tipicamente, mas não exclusivamente, um ácido ribonucleico (RNA) ou um ácido desoxirribonucleico (DNA). ácidos nucleicos alternativos estão disponíveis para uma pessoa perita na arte. Um ácido nucleico de acordo com a invenção é, por exemplo, compreendido em uma célula. Quando o referido ácido nucleico é expresso na referida célula, a referida célula produz um anticorpo de acordo com a invenção.

[00141] Portanto, a invenção em uma concretização proporciona uma célula que compreende um anticorpo de acordo com a invenção e / ou um ácido nucleico de acordo com a invenção. A referida célula é, de preferência, uma célula animal, mais preferencialmente, uma célula de mamífero, mais preferencialmente, uma célula de primata, ainda mais preferencialmente, uma célula humana. Para os fins da presente invenção em uma célula adequada é qualquer célula capaz de que compreende e, preferivelmente, de produzir um anticorpo de acordo com a invenção e / ou um ácido nucleico de acordo com a invenção.

[00142] A invenção proporciona ainda uma célula compreendendo um anticorpo de acordo com a invenção. De preferência, a referida célula (normalmente uma célula in vitro, isolado ou recombinante) produz o referido anticorpo. Em uma concretização preferida, a referida célula é uma célula de hibridoma, de uma célula de CHO, uma célula NSO, ou uma célula PER ™-C6. Em uma concretização particularmente preferida, a referida célula é uma célula CHO. Proporciona- se uma cultura de células compreendendo uma célula de acordo com a invenção. Várias instituições e empresas desenvolveram linhas de células para a produção em grande escala de anticorpos, por exemplo, para uso clínico. Exemplos não limitativos de tais linhas de células são as células CHO, células NSO ou células PER.C6 ™. Estas células são também usadas para outros fins, tais como a produção de proteínas. As linhagens celulares desenvolvidas para a produção em escala industrial de proteínas e anticorpos são aqui a seguir referido como linhas celulares industriais. Assim, em uma concretização preferida, a invenção proporciona a utilização de uma linha de células desenvolvidas para a produção em grande escala de anticorpo para a produção de um anticorpo da invenção.

[00143] A invenção proporciona ainda um método para produzir um anticorpo compreendendo o cultivo de uma célula da invenção e recolher o referido anticorpo a partir da referida cultura. De preferência, a referida célula é cultivada num meio isento de soro. De preferência, a referida célula está adaptada para crescimento em suspensão. É ainda proporcionado um anticorpo obtenível através de um método para a produção de um anticorpo de acordo com a invenção. O anticorpo é de preferência purificado a partir do meio de cultura. Preferencialmente, o referido anticorpo é purificado por afinidade.

[00144] Uma célula da invenção é, por exemplo, uma linha celular de hibridoma, de uma célula de CHO, uma célula NSO, ou outro tipo de células conhecido para a sua adequação para a produção de anticorpos para fins clínicos. Em uma concretização particularmente preferida, a referida célula é uma célula humana. De preferência, uma célula que é transformada por uma região El de adenovírus ou um seu equivalente funcional. Um exemplo preferido de uma tal linha celular é a linha celular PER.C6 ™ ou seu equivalente. Em uma concretização particularmente preferida, a referida célula é uma célula CHO ou uma sua variante. De preferência, uma variante que faz uso de um sistema de vector de glutamina sintetase (GS) para a expressão de um anticorpo.

[00145] A invenção proporciona ainda uma composição, preferivelmente uma composição farmacêutica, que compreende um anticorpo de acordo com a invenção. A composição farmacêutica compreende de preferência um excipiente (farmaceuticamente aceitável) ou veículo. Em uma concretização preferida, a composição farmacêutica compreende Histidme 5-50 mM, Trealose a 100-300 mM, 0,1-03 g / l de polissorbato 20 ou uma combinação dos mesmos. O pH é de preferência ajustado a pH = 5,5-6,5. Em uma concretização preferida, a composição farmacêutica compreende histidina 25 mM, trealose 220 mM, 0,2 g / l de polissorbato 20 ou uma combinação dos mesmos. O pH é de preferência ajustado a um pH = 5,5 - 6,5, mais preferencialmente, a pH = 6.

[00146] Um anticorpo da presente invenção compreende ainda, de preferência, um marcador, preferivelmente uma marcador para imagiologia in vivo. Um tal marcador não é normalmente necessário para aplicações terapêuticas. Em por exemplo, uma definição de diagnóstico, um rótulo pode ser útil. Por exemplo a visualizar as células-alvo no corpo. Vários marcadores são adequados e muitos são bem conhecidos na arte. Em uma concretização preferida, o marcador é um marcador radioativo para detecção. Em outra concretização preferida, a marcador é um marcador de infravermelho. De preferência, a marcador de infravermelhos é adequado para imagiologia in vivo. Vários marcadores infravermelhos estão disponíveis para o técnico versado no assunto. Os marcadores infravermelhos preferidos são, por exemplo, IRDye 800; IRDye 680RD; IRDye 680LT; IRDye 750; IRDye 700DX; IRDye 800RS IRDye 650; IRDye 700 fosforamidite; IRDye 800 da fosforamidite (LI-COR EUA; 4647 Superior Street; Lincoln, Nebraska).

[00147] A invenção proporciona ainda um método para o tratamento de um sujeito tendo um tumor positivo ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / de ErbB-3 ou em risco de ter o referido tumor, compreendendo a administração ao sujeito de um anticorpo ou composição farmacêutica de acordo com a invenção. Antes do começo do tratamento referido, o método preferivelmente compreende a determinação se o referido indivíduo tem, ou está em risco de, tal tumor positivo de ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3. Em algumas concretizações, o indivíduo é classificado como [+] ou em [++] ErbB-2. Em outra concretização o indivíduo é classificado como [+++] para ErbB-2. A invenção proporciona ainda um anticorpo da invenção para utilização no tratamento de um sujeito possuindo, ou em risco de ter um tumor positivo de ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3. Alternativamente formulada, a invenção proporciona uma utilização de um anticorpo de acordo com a invenção para o fabrico de um medicamento ou agente profiláctico para o tratamento de uma ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB- 2 / ErbB-3 de tumor positivo. Tal como aqui utilizado, o termo tratamento inclui a profilaxia.

[00148] O tumor é de preferência um câncer positivo para ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3. De um modo preferido o referido câncer positivo é um câncer da mama, tal como câncer da mama em fase precoce. No entanto, a invenção pode ser aplicada a uma vasta faixa de cânceres positivos ErbB- 2, ErbB-3 ou ErbB-2 / erbB-3, como o câncer gástrico, o câncer colorretal, câncer do cólon, câncer gastresofágico, câncer do esófago, câncer do endométrio, do ovário câncer, câncer do fado, câncer do pulmão incluindo câncer do pulmão de células não pequenas, sarcoma de células claras, câncer da glândula salivar, câncer da cabeça e pescoço, câncer do cérebro, câncer da bexiga, câncer do pâncreas, câncer da próstata, câncer do rim, câncer da pele, melanoma, e similares.

O referido anticorpo, de acordo com a presente invenção é tipicamente capaz de reduzir a função do receptor induzido pelo ligante, preferencialmente, crescimento induzido pelo ligante, de ErbB-3 em uma célula positiva de ErbB-2 e ErbB-3. O referido anticorpo, de acordo com a invenção compreende, de preferência, um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga ao domínio I de ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga ao domínio III de ErbB-3. Em uma concretização preferida, a afinidade (KD) do referido segundo local de ligação ao antígeno para uma célula positiva ErbB-3 é igual a, ou maior do que, a afinidade do que o referido primeiro local de ligação ao antígeno para uma célula positiva de ErbB-2. É ainda proporcionado, por conseguinte, um anticorpo que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB- 2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3 para utilização no tratamento de um sujeito possuindo, ou em risco de ter um tumor positivo ErbB-2, ErbB -3 ou ErbB- 2 / ErbB-3 de, preferivelmente, câncer da mama, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer do cólon, câncer gastroesofágico, câncer do esófago, câncer do endométrio, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer do pulmão incluindo câncer do pulmão de células não-pequenas, sarcoma de células claras, câncer da glândula salivar, câncer da cabeça e pescoço, câncer do cérebro, câncer da bexiga, câncer do pâncreas, câncer da próstata, câncer do rim, câncer da pele, ou melanoma, em que a afinidade do referido segundo local de ligação ao antígeno para uma célula positiva ErbB- 3 é igual a, ou maior do que, a afinidade do que o referido primeiro local de ligação ao antígeno para uma célula positiva de ErbB-2. A afinidade do dito segundo sítio de ligação a antígeno para uma célula positiva ErbB-3 é de preferência inferior ou igual a 2,0 nM, mais preferivelmente, menor do que ou igual a 1,39 nM, mais preferivelmente, menor do que ou igual a 0,99 nM. A afinidade do dito primeiro sítio de ligação a antígeno para uma célula positiva de ErbB-2 é de preferência inferior ou igual a 5,0 nM, de preferência inferior ou igual a 4,5 nM, de preferência, inferior ou igual a 4,0 nM. Em uma concretização preferida, o referido anticorpo é PB4188 anticorpo.

[00149] Em uma concretização preferida, o referido anticorpo de acordo com a invenção compreende um local de ligação ao antígeno que se liga a pelo menos um amino ácido de domínio I de ErbB-2 selecionado a partir do grupo que consiste de T144, T164, R166, P172, G179, S180 e R181 , e os resíduos de aminoácidos expostos à superfície que estão localizados dentro de cerca de cinco posições de aminoácidos de T144, T164, R166, P172, G179, S180 ou R181.

[00150] Em uma concretização preferida, o referido anticorpo de acordo com a invenção compreende, preferivelmente, um local de ligação ao antígeno que se liga a pelo menos um aminoácido do domínio III de ErbB-3 selecionado a partir do grupo que consiste R426 e resíduos de aminoácidos expostos a superfície que estão localizados dentro de 11,2 Um de R426 na proteína nativa ErbB-3.

[00151] É ainda proporcionado, por conseguinte, um anticorpo que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3 para utilização no tratamento de um sujeito possuindo, ou em risco de ter um tumor positivo ErbB-2, ErbB -3 ou ErbB-2 / ErbB-3, preferivelmente câncer da mama, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer do cólon, câncer gastroesofágico, câncer do esófago, câncer do endométrio, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer do pulmão, incluindo células não pequenas câncer do pulmão, sarcoma de células claras, câncer da glândula salivar, câncer da cabeça e pescoço, câncer do cérebro, câncer da bexiga, câncer do pâncreas, câncer da próstata, câncer do rim, câncer da pele, ou melanoma, em que o referido anticorpo de acordo com a invenção compreende um local de ligação ao antígeno que se liga a pelo menos um aminoácido do domínio I de ErbB- 2 selecionado a partir do grupo que consiste de T144, T164, R166, P172, G179, S180 e R181, e os resíduos de aminoácidos expostos à superfície que estão localizados dentro de posições de ácido de cerca de 5 aminoácidos de T144, T164, R166, P172, G179, S180 ou R181, e / ou em que o referido anticorpo de acordo com a invenção compreende, preferivelmente, um local de ligação ao antígeno que se liga a pelo menos um aminoácido de domínio III de ErbB-3 selecionado a partir do grupo que consiste de R426 e resíduos de aminoácidos expostos à superfície que estão localizados dentro de 11,2 à partir do R426 na proteína nativa ErbB-3.

[00152] O indivíduo é de preferência um sujeito humano. O indivíduo é de preferência um sujeito elegível para terapia de anticorpo monoclonal utilizando um anticorpo específico de ErbB-2, tais como trastuzumab. Em uma concretização preferida, o sujeito compreende um tumor, de preferência, um câncer positivo para ErbB-2 / ErbB-3, de preferência, um tumor / câncer com um fenótipo de ErbB-2 terapia resistente e / ou um fenótipo de resistência a heregulina, de preferência, um fenótipo resistente ao anticorpo monoclonal. Um tumor envolvendo tal fenótipo pode escapar ao tratamento com um regime corrente anti-HER2, tais como (mas, não limitados a) terapia com anticorpos monoclonais contra a ErbB-2.

[00153] A quantidade de anticorpo de acordo com a invenção a ser administrada a um doente é tipicamente na janela terapêutica, o que significa que uma quantidade suficiente seja utilizada para a obtenção de um efeito terapêutico, enquanto que a quantidade não exceda um valor limiar que leva a um grau inaceitável de lado -Efeitos. Quanto mais baixa for a quantidade de anticorpos necessária para a obtenção de um efeito terapêutico desejado, quanto maior for a janela terapêutica será tipicamente. Um anticorpo de acordo com a invenção exercer efeitos terapêuticos suficientes em baixa dosagem é, portanto, preferido. A dosagem pode estar no intervalo do regime de dosagem para o trastuzumab ou inferior.

[00154] A presente invenção descreve entre outros anticorpos que têm como alvo a ErbB-2 e receptores ErbB-3 e resultam na inibição da proliferação potente de linhagens celulares de da inibição do câncer in vitro e o crescimento do tumor in vivo, mesmo na presença de um mecanismo de fuga,

tais como, por exemplo, a regulação positiva de NRGl- Ι. Um painel diverso dos braços humanas e murinas de ligação de Fab específico para qualquer um de ErbB-2 ou ErbB-3 foram identificados. Estes foram produzidos anticorpos biespecíficos como por cloná-los em vectores de expressão complementares que contêm mutações na região CH3 que impulsiona a heterodimerização das cadeias pesadas. Mais de 500 anticorpos biespecíficos foram produzidos em pequena escala, e testados em ensaios de ligação e funcionais em três linhas de células de câncer diferentes. Vários anticorpos biespecíficos foram selecionadas e testadas num modelo de xenoenxerto ortotópico utilizando a linha celular BxPC3. Esta linha celular expressa ambos os receptores de ErbB-2 e ErbB-3 e é parcialmente dependente do ligando de ErbB-3 para o crescimento. modelos BxPC3 são um modelo de triagem robusta e rigorosa.

[00155] Além disso, uma atividade anti-tumoral forte in vivo, foi confirmada utilizando um modelo de xenoenxerto utilizando a linha celular JIMT- 1. células JIMT-1 são derivadas de uma metástase pleural de um paciente idoso de 62 anos com câncer da mama que era clinicamente resistente ao trastuzumab. JIMT- um células crescem como uma monocamada aderente e formar tumores de xenoenxerto em camundongos nus. células JIMT-1 têm um amplificado oncogene HER-2, que não mostrou mutações identificáveis na sua sequência de codificação. células JIMT- 1 superexpressão HER-2 mRNA e proteína, e os níveis de Her-1, HER-3, e HER-4 mRNA e proteína são semelhantes à linha de células sensível a trastuzumab SK-BR-3 (Tanner et ai, Câncer Mol Ther 2004).

[00156] Importante ainda, um melhor efeito anti- tumoral foi obtido usando um anticorpo de acordo com a invenção, em comparação com os anticorpos monoclonais trastuzumab actualmente utilizado e pertuzumab, bem como o de lapatinib composto químico.

[00157] Os anticorpos da inveno podem ser produzidos em níveis > 50 mg / L, após transfecção transiente em células 293F suspensão. Os anticorpos biespecíficos podem ser purificados até mais de 98% de pureza com rendimentos> 70%. Estudos de caracterização analíticos mostram perfis de anticorpo biespecífico lgGl que são comparáveis aos monoespecífico bivalente lgGl. Em termos de atividade funcional de um anticorpo biespecífico da presente invenção pode demonstrar potência superior em relação ao trastuzumab + pertuzumab in vitro e in vivo.

[00158] As concretizações preferidas da invenção proporcionar terapia de combinação. Em uma concretização, um anticorpo de acordo com a invenção é combinado com um agente de alvejamento de ErbB-2, incluindo um inibidor de ErbB-2 ou agente de ligação.

[00159] Agentes de alvejamento de ErbB-2 exemplificativos para utilização em terapia de combinação com um anticorpo de ligação bi-específico ErbB-2, ErbB-3, inclui qualquer ErbB-2 agente de alvejamento, por exemplo, um agente de ligação ou inibidor de Erb-B2.

[00160] O agente de alvejamentod de ErbB-2 pode ser uma molécula pequena HER2 inibidor de tirosina quinase, tais como lapatinib (Tyverb / Tykerb¾), afatinib neratinib, tucatinib ou AZD8931

[00161] O agente de alvejamento de ErbB-2 pode ser um anticorpo. Trastuzumab ou pertuzumab, por exemplo, pode ser preferida uma vez que estes anticorpos se ligam diferentes ErbB-2 epítopos de modo a que eles não competem para o mesmo epítopo com um anticorpo de acordo com a invenção, como mostrado nos Exemplos.

[00162] O agente de alvejamento de ErbB-2 pode ser um conjugado de droga anticorpo, por exemplo trastuzumab emtansine ou DS-8201.

[00163] Em outra concretização, um anticorpo de acordo com a invenção é combinado com MM-121 (# AB6) ou RG7116 (Roche), uma vez que estes anticorpos se ligam diferentes epítopos ErbB-3, de modo a que eles não competem para o mesmo epítopo com um anticorpo de acordo com a invenção, como mostrado nos Exemplos.

[00164] Em outra concretização preferida, um composto de ligação que seja específica para ErbB-2 e ErbB-3 é combinada com um inibidor de um componente da via de PI3- quinase e / ou com um inibidor de um componente da via de MAPK, tais como, por exemplo, com um inibidor da tirosina quinase, um inibidor PI3Ka, um inibidor Akt, um inibidor de mTOR ou um inibidor de Src. Em uma concretização de um composto de ligação que seja específica para ErbB-2 e ErbB- 3 é combinado com um fármaco perturbar microtúbulos ou com um inibidor de uma histona-desacetilase (HDAC). Surpreendentemente, os inventores descobriram um efeito sinérgico quando essas combinações são utilizadas.

[00165] É ainda proporcionado, por conseguinte, um método para o tratamento de um sujeito tendo um tumor positivo ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3 ou em risco de ter o referido tumor, compreendendo o método a administração ao indivíduo:

[00166] - um composto de ligação que seja específico para ErbB-2 e ErbB-3, e

[00167] - um ou mais compostos selecionados a partir do grupo consistindo de um inibidor de um componente da via de PI3-quinase, um inibidor de um componente da via de MAPK, uma droga perturbadora de microtúbulo, e um inibidor de uma histona-desacetilase (HDAC). O referido inibidor compreende, de preferência um inibidor de tirosina quinase, um inibidor PI3Ka, um inibidor Akt, um inibidor de mTOR ou um inibidor de Src. O referido inibidor de tirosina quinase é de preferência afatinib, lapatinib e / ou neratinib. Disse inibidor PI3Ka é preferencialmente BYL719. Em uma concretização, o referido inibidor Akt é MK-2206. Em uma concretização preferida, o referido inibidor de mTOR é everolimus. Em uma concretização preferida, o referido inibidor de Src é saracatinib. Em uma concretização preferida, o referido microtúbulos perturbar droga é o paclitaxel. Em uma concretização preferida, o referido inibidor de HDAC é vorinostat. Em uma concretização preferida, o referido composto que é específico para ligação de ErbB-2 e ErbB-3 é MM-111 (Merrimack Pharmaceuticals). Em uma concretização preferida, o referido composto que é específico para ligação de ErbB-2 e ErbB-3 é um anticorpo biespecífico. Em uma concretização preferida, o referido composto que é específico para ligação de ErbB-2 e ErbB-3 é um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção.

[00168] É ainda proporcionado, por conseguinte, um método para o tratamento de um sujeito tendo um tumor positivo ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3 ou em risco de ter o referido tumor, compreendendo o método a administração ao indivíduo:

[00169] - um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, e

[00170] - um ou mais compostos selecionados a partir do grupo consistindo de um inibidor de um componente da via de PI3-quinase, um inibidor de um componente da via de MAPK, uma droga microtúbulos perturbar, e um inibidor de HDAC.

[00171] Também é fornecido um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3 para utilização no tratamento de um tumor positivo ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3, em que o referido tratamento compreende administrar o referido anticorpo biespecífico e, pelo menos, um composto selecionado a partir do grupo consistindo de um inibidor de um componente da via de PI3-quinase, um inibidor de um componente da via de MAPK, uma microtúbulos perturbar droga, e um inibidor de HDAC a um sujeito com um tumor positivo de ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3. De um modo preferido, um anticorpo biespecífico de acordo com o invenção que tem um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga de domínio I de ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga o domínio III de ErbB-3 é combinada com um ou mais compostos selecionados a partir do grupo consistindo de um inibidor de um componente da via de PI3-quinase, um inibidor de um componente da via de MAPK, uma droga microtúbulos perturbar, e um inibidor de HDAC. O referido inibidor compreende, de preferência um inibidor de tirosina quinase, um inibidor PI3Ka, um inibidor Akt, um inibidor de mTOR ou um inibidor de Src. O referido inibidor de tirosina cinase é de preferência afatinib, lapatinib e / ou neratinib. Disse inibidor PI3Ka é preferencialmente BYL719. Em uma concretização, o referido inibidor Akt é MK-2206. Em uma concretização preferida, o referido inibidor de mTOR é everolimus. Em uma concretização preferida, o referido inibidor de Src é saracatinib. Em uma concretização preferida, o referido microtúbulos perturbar droga é o paclitaxel. Em uma concretização preferida, o referido inibidor de HDAC é vorinostat.

[00172] Dito de ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3 de tumor positivo de um modo preferido câncer da mama, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer do cólon, câncer gastro- esofágico, câncer do esófago, câncer do endométrio, câncer do ovário, câncer do fígado, pulmão câncer, incluindo câncer do pulmão de não pequenas células, do sarcoma de células claras, câncer da glândula salivar, câncer da cabeça e pescoço, câncer do cérebro, câncer da bexiga, câncer do pâncreas, câncer da próstata, câncer do rim, câncer da pele, ou melanoma. Mais preferencialmente, o referido tumor é o câncer da mama. Em uma concretização, o dito tumor positivo ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3 tem menos do que 1.000.000 ErbB-2 receptores da superfície celular por células tumorais.

[00173] Em uma concretização, um anticorpo de acordo com a presente invenção que é combinada com um ou mais compostos selecionados a partir do grupo consistindo de um inibidor de um componente da via de PI3-quinase, um inibidor de um componente da via de MAPK, uma microtúbulos perturbar droga e um inibidor de HDAC, de preferência com, pelo menos, um composto selecionado a partir do grupo consistindo de um inibidor de tirosina quinase, um inibidor PI3Ka, um inibidor Akt, um inibidor de mTOR, um inibidor de Src, vorinostat e paclitaxel, com maior preferência com pelo menos um composto seleccionado a partir de o grupo que consiste em afatinib, lapatinib, neratinib, BYL719, MK-2206, everolimus, saracatinib, vorinostat e paclitaxel, é tipicamente capaz de reduzir a função do receptor induzida pelo ligante, o crescimento de preferência induzida pelo ligante, de célula positiva ErbB-3 em uma ErbB-2 e ErbB-3. O referido anticorpo, de acordo com a invenção compreende de preferência um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga de domínio I de ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga o domínio III de ErbB-3. Em uma concretização preferida, a afinidade (KD) do referido segundo local de ligação a antígeno para uma célula positiva ErbB-3 é igual a, ou maior do que, a afinidade do que o referido primeiro local de ligação ao antígeno para uma célula positiva de ErbB-2. A afinidade do dito segundo sítio de ligação a antígeno para uma célula positiva ErbB-3 é de preferência inferior ou igual a 2,0 nM, mais preferivelmente menor do que ou igual a 1,39 nM, mais preferivelmente menor do que ou igual a 0,99 nM.

A afinidade do dito primeiro sítio de ligação a antígeno para uma célula positiva de ErbB-2 é de preferência inferior ou igual a 5,0 nM, de preferência inferior ou igual a 4,5 nM de preferência inferior ou igual a 4,0 nM.

[00174] Em uma concretização preferida, um anticorpo de acordo com a invenção que é combinada com um ou mais compostos selecionados a partir do grupo consistindo de um inibidor de um componente da via de PI3-quinase, um inibidor de um componente da via de MAPK, uma microtúbulos perturbar droga e um inibidor de HDAC, de preferência com, pelo menos, um composto selecionado a partir do grupo consistindo de um inibidor de tirosina quinase, um inibidor PI3Ka, um inibidor Akt, um inibidor de mTOR, um inibidor de Src, vorinostat e paclitaxel, com maior preferência com pelo menos um composto seleccionado a partir de o grupo que consiste em afatinib, lapatinib, neratinib, BYL719, MK-2206, everolimus, saracatinib, vorinostat e paclitaxel, compreende um local de ligação ao antígeno que se liga a pelo menos um aminoácido do domínio I de ErbB-2 selecionado a partir do grupo que consiste de T144, T164, R166, P172, G179, S180 e R181, e os resíduos de aminoácidos expostos à superfície que estão localizados dentro de cerca de cinco posições de aminoácidos a partir de T144, T164, R166, P172, G179, S180 ou R181.

[00175] Em uma concretização preferida, um anticorpo de acordo com a invenção que é combinada com um ou mais compostos selecionados a partir do grupo consistindo de um inibidor de um componente da via de PI3-quinase, um inibidor de um componente da via de MAPK, uma microtúbulos perturbar droga e um inibidor de HDAC, de um modo preferido com, pelo menos, um composto selecionado a partir do grupo consistindo de um inibidor de tirosina quinase, um inibidor PI3Ka, um inibidor Akt, um inibidor de mTOR, um inibidor de Src, vorinostat e paclitaxel, com maior preferência com pelo menos um composto seleccionado a partir do grupo que consiste de afatinib, lapatinib, neratinib, BYL719, MK-2206, everolimus, saracatinib, vorinostat e paclitaxel, compreende um local de ligação ao antígeno que se liga a pelo menos um aminoácido do domínio III de ErbB-3 selecionado a partir do grupo constituído por R426 e superfície - resíduos de aminoácidos expostas que estão localizados dentro de 11,2 à partir do R426 na proteína nativa ErbB-3.

[00176] De um modo preferido, um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção que compreende pelo menos a sequência CDR3, de um modo preferido, pelo menos, as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3, de um erbB-2 da região variável da cadeia pesada específico selecionado a partir do grupo que consiste de MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 e MF1898 como representado na figura 16A ou figura 16E, e / ou compreende pelo menos a sequência CDR3, de um modo preferido, pelo menos, o sequências CDR1, CDR2 e CDR3, de uma região variável de ErbB- 3 específico de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 e MF6074 como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou Figura 37 é combinado com um ou mais compostos selecionados a partir do grupo consistindo de um inibidor de um componente da via de PI3-quinase, um inibidor de um componente da via de MAPK, uma desregulação microtúbulos fármaco e um inibidor de HDAC, de preferência com, pelo menos, um composto selecionado a partir do grupo consistindo de um inibidor de tirosina quinase, um inibidor PI3Ka, um inibidor Akt, um inibidor de mTOR, um inibidor de Src, vorinostat e paclitaxel, com maior preferência com pelo menos um composto seleccionado a partir do grupo que consiste em afatinib, lapatinib, neratinib, BYL719, MK-2206, everolimus, saracatinib, vorinostat e paclitaxel

[00177] Em uma concretização preferida, um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreendendo:

[00178] - uma sequência de região variável de ErbB-2 específico de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste nas sequências de região variável de cadeia pesada de MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 e MF1898 como representado na figura 16A ou figura 16E, ou compreendendo uma sequência de região variável de cadeia pesada de ErbB-2 específico que difere em no mimo 15 aminoácidos, de um modo preferido em, no máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos, mais de preferência, em, no máximo, 1, 2, 3, ácidos 4 ou 5 aminoácidos, a partir das sequências da região variável da cadeia pesada de MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 ou MF1898 e

[00179] - uma sequência de região variável de ErbB-3 específico de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste nas sequências de região variável de cadeia pesada de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 e MF6074 como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou na Figura 37, ou que compreende uma sequência de região variável de cadeia pesada de ErbB-3 específico que difere em pelo menos 15 aminoácidos, de um modo preferido em, no máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos, mais de preferência no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos, a partir das sequências da região variável da cadeia pesada de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 ou MF6074, é combinado com um ou mais compostos selecionados a partir do grupo consistindo de um inibidor de um componente da via de PI3- quinase, um inibidor de um componente da via de MAPK, uma droga perturbar microtúbulos e um inibidor de HDAC, de preferência com pelo menos um composto selecionado a partir do grupo consistindo de um inibidor de tirosina quinase, um inibidor PI3Ka, um inibidor Akt, um inibidor de mTOR, um inibidor de Src, vorinostat e paclitaxel, com maior preferência com pelo menos um composto seleccionado a partir do grupo que consiste em afatinib, lapatinib neratinib, BYL719, MK-2206, everolimus, saracatinib, vorinostat e paclitaxel.

Em uma concretização preferida, anticorpo PB4188 é combinada com um ou mais compostos selecionados a partir do grupo consistindo de um inibidor de um componente da via de PI3-quinase, um inibidor de um componente da via de MAPK, uma droga perturbar microtúbulos e um inibidor de HDAC, de preferência com pelo menos um composto selecionado a partir do grupo consistindo de um inibidor de tirosina quinase, um inibidor PI3Ka, um inibidor Akt, um inibidor de mTOR, um inibidor de Src, vorinostat e paclitaxel, com maior preferência com pelo menos um composto seleccionado a partir do grupo que consiste em afatinib , lapatinib, neratinib, BYL719, MK-2206, everolimus, saracatinib, vorinostat e paclitaxel.

[00180] As concretizações preferidas da invenção proporcionar utilizações de anticorpos de acordo com a invenção, sob condições de stress heregulina. Heregulina é um fator de crescimento que esteja envolvido no crescimento de ErbB-3 células de tumor positivas. Tipicamente, quando as células tumorais expressam níveis elevados de heregulina (referido como tensão heregulina), as terapias actualmente conhecidas como trastuzumab, pertuzumab e lapatinib já não são capazes de inibir o crescimento do tumor. Este fenômeno é chamado de resistência de heregulina. Surpreendentemente, no entanto, um anticorpo de acordo com a invenção também é capaz de neutralizar o crescimento de células tumorais que expressam níveis elevados de heregulina. Tal como aqui utilizado, um nível de heregulina expressão é considerada elevada quando uma célula tem um nível de expressão de heregulina que é pelo menos 60%, de preferência pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos, 90% ou 95% do nível de células MCF7 BxPC3 ou expressão heregulina.

[00181] Os níveis de expressão de heregulina, por exemplo, são medidos utilizando qPCR com RNA de tumor (tal como, por exemplo, descritos em Shames et ai. PLoS ONE, Fevereiro de 2013, vol.8, Issue 2, pp 1-10 e em Yonesaka et al., Sci.transl .Med, Vol.3, Edição 99 (2011);. ppl- 11), ou utilizando métodos de detecção de proteína, como por exemplo ELISA, de preferência utilizando-se amostras de sangue, de plasma ou de soro (tais como, por exemplo, descritos em Yonesaka et al, Sci.transl.Med, Vol.3, Edição 99 (2011).; p l-11). É ainda proporcionado, por conseguinte, um anticorpo de acordo com a invenção para utilização no tratamento de um sujeito possuindo, ou em risco de ter uma ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3 de tumor positivo, em que as referidas células do referido tumor têm um nível de exprassão de heregulina que é pelo menos 60%, de preferência, pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente, pelo menos 90% ou 95% do nível de células BxPC3 ou MCF7 expressão heregulina. O referido anticorpo, de acordo com a invenção compreende de preferência um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga de domínio I de ErbB-2. Também é proporcionado um método para o tratamento de um sujeito tendo um tumor positivo ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3, em que as células do referido tumor têm um nível de expressão heregulina que é pelo menos 60%, de preferência, pelo menos 70%, mais preferencialmente, pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90% ou 95% do nível de células BxPC3 ou MCF7 expressão de heregulina, o método compreendendo a administração ao sujeito de um anticorpo ou composição farmacêutica de acordo com a invenção.

Uma concretização preferida proporciona uma utilização de um anticorpo de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3 de tumor positivo, em que as células do referido tumor tem um nível de expressão de heregulina que é de pelo menos 60%, de preferência pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90% ou 95% do nível de células MCF7 BxPC3 ou expressão de heregulina.

Dito tumor positivo ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3 de um modo preferido, é câncer da mama, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer do cólon, câncer gastresofágico, câncer do esófago, câncer do endométrio, câncer do ovário, câncer do fígado, pulmão câncer, incluindo câncer do pulmão de não pequenas células, do sarcoma de células claras, câncer da glândula salivar, câncer da cabeça e pescoço, câncer do cérebro, câncer da bexiga, câncer do pâncreas, câncer da próstata, câncer do rim, câncer da pele, ou melanoma.

Mais preferencialmente, o referido tumor é o câncer da mama.

É ainda proporcionado, por conseguinte, um anticorpo de acordo com a invenção para utilização no tratamento de um sujeito possuindo, ou em risco de ter câncer da mama, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer do cólon, câncer gastroesofágico, câncer do esófago, câncer do endométrio, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer do pulmão incluindo câncer do pulmão de células não pequenas, sarcoma de células claras, câncer da glândula salivar, câncer da cabeça e pescoço, câncer do cérebro, câncer da bexiga, câncer do pâncreas, câncer da próstata, câncer do rim, câncer da pele, ou melanoma, de um modo preferido câncer da mama , em que as células do referido câncer têm um nível de expressão de heregulina que é de pelo menos 60%, de preferência pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%. ou 95% do nível de expressão de células MCF7 BxPC3 ou heregulina. O referido anticorpo, de acordo com a invenção compreende de preferência um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga de domínio I de ErbB-2.

[00182] Altos níveis de heregulina estão tipicamente presentes durante a formação de metástases (isto é, a migração, invasão, crescimento e / ou diferenciação de células de tumor ou células de tumor iniciar). Tipicamente, as células tumorais que inicia são identificados com base em marcadores de células-tronco, tais como, por exemplo, CD44, CD24, CD 133 e / ou ALDH1. Estes processos podem, por conseguinte, apenas ser neutralizada com terapias atualmente conhecido como trastuzumab e pertuzumab. Uma vez que um anticorpo de acordo com a invenção é capaz de contrariar o crescimento e / ou diferenciação de células de tumor ou células de tumor que expressam iniciar elevados níveis de heregulina, tais anticorpos de acordo com a invenção é também particularmente adequado para contrariar a formação de metástases. É ainda proporcionado, por conseguinte, um método para neutralizar a formação de uma metástase de um sujeito tendo um tumor positivo ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3, em que a referida célula tumoral positiva ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3 tem um nível de expressão de heregulina que é pelo menos 60%, de preferência pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90% ou 95% do nível de expressão da heregulina de células BxPC3 ou MCF7, que compreende administração ao indivíduo de um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3. Também é fornecido um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3 para utilização no tratamento ou prevenção da formação de metástases, em que o referido ErbB-2,

[00183] As células de tumor positivo ErbB-3 ou ErbB- 2 / ErbB-3 tem um nível de expressão de heregulina que é pelo menos 60%, de preferência, pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente, pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90% ou 95% do nível de expressão de células MCF7 BxPC3 ou heregulina. Ainda proporcionada uma utilização de um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção da formação de metástases, em que a referida células de tumoral positiva erbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3 tem um nível de expressão de heregulina que é pelo menos 60%, de preferência, pelo menos 70%, mais preferencialmente, pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente, pelo menos 90% ou 95% do nível de expressão de celulas BxPC3 ou MCF7 ou heregulina.

Dito de ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3 de tumor positivo de um modo preferido câncer da mama, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer do cólon, câncer gastroesofágico, câncer do esófago, câncer do endométrio, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer do pulmão, incluindo câncer do pulmão de não pequenas células, do sarcoma de células claras, câncer da glândula salivar, câncer da cabeça e pescoço, câncer do cérebro, câncer da bexiga, câncer do pâncreas, câncer da próstata, câncer do rim, câncer da pele, ou melanoma.

Mais preferencialmente, o referido tumor é o câncer da mama.

É ainda proporcionado, por conseguinte, um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3 para utilização no tratamento ou prevenção da formação de metástases de câncer da mama , câncer gástrico, câncer coloretal, câncer do cólon, câncer gastroesofágico, câncer do esófago, câncer do endométrio, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer do pulmão incluindo câncer do pulmão de células não pequenas, do sarcoma de células claras, câncer da glândula salivar, câncer da cabeça e pescoço, câncer do cérebro , câncer da bexiga, câncer pancreático, câncer da próstata, câncer do rim, câncer da pele, ou de melanoma, de preferência, de câncer da mama, em que as referidas células têm um nível de expressão heregulina que é pelo menos 60%, de preferência, pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90% ou 95% do nível de células MCF7 BxPC3 ou expressão heregulina. O referido anticorpo, de acordo com a presente invenção é tipicamente capaz de reduzir a função do receptor induzida pelo ligante, preferencialmente crescimento induzida pelo ligante, de ErbB-3 em uma célula positiva de ErbB-2 e ErbB-3. O referido anticorpo, de acordo com a invenção compreende de preferência um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga de domínio I de ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga o domínio III de ErbB-3. Em uma concretização preferida, a afinidade (KD) do referido segundo local de ligação a antígeno para uma célula positiva ErbB-3 é igual a, ou maior do que, a afinidade do que o referido primeiro local de ligação ao antígeno para uma célula positiva de ErbB-2. A afinidade do dito segundo sítio de ligação a antígeno para uma célula positiva ErbB-3 é de preferência menor do que ou igual a 2.0 iiM, mais preferivelmente menor do que ou igual a 1,39 nM, mais preferivelmente menor do que ou igual a 0,99 nM. A afinidade do dito primeiro sítio de ligação a antígeno para uma célula positiva de ErbB-2 é de preferência inferior ou igual a 5,0 nM, de preferência inferior ou igual a 4,5 nM de preferência inferior ou igual a 4,0 nM.

[00184] Em uma concretização preferida, o referido anticorpo de acordo com a invenção compreende um local de ligação ao antígeno que se liga a pelo menos um aminoácido de domínio I de ErbB-2 selecionado a partir do grupo que consiste de T144, T164, R166, P172, G179, S180 e R181, e os resíduos de aminoácidos expostos à superfície que estão localizados dentro de cerca de cinco posições de aminoácidos a partir de T144, T164, R166, P172, G179, S180 ou R181.

[00185] Em uma concretização preferida, o referido anticorpo de acordo com a invenção compreende, preferivelmente, um local de ligação ao antígeno que se liga a pelo menos um ácido amino do domínio III de ErbB-3 selecionado a partir do grupo constituído por R426 e superfície resíduos de aminoácidos expostos que estão localizados dentro 11.2 a partir R426 na proteína nativa ErbB-3.

[00186] Uma concretização preferida proporciona um método de acordo com a invenção para o tratamento de um sujeito tendo um ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3 tumoral positiva em que as células do referido tumor têm um nível de expressão de heregulina que é pelo menos 60 %, de preferência pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90% ou 95% do nível de expressão de heregulina de células BxPC3 ou MCF7, ou um anticorpo de acordo com a invenção para utilizar em tal tratamento, em que o referido anticorpo compreende pelo menos a sequência CDR3, de um modo preferido, pelo menos, a CDR1, CDR2 e CDR3, ou pelo menos a sequência da região variável da cadeia pesada, de um erbB-2 da região variável da cadeia pesada específico selecionado a partir do grupo consistindo de MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 e MF1898 como representado na figura 16A ou figura 16E.

[00187] Uma concretização preferida proporciona um método de acordo com a invenção para o tratamento de um sujeito tendo um ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3 tumoral positiva em que as células do referido tumor têm um nível de expressão de heregulina que é pelo menos 60 %, de preferência pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90% ou 95% do nível de expressão de heregulina de células BxPC3 ou MCF7, ou um anticorpo de acordo com a invenção para utilizar em tal tratamento, em que o referido anticorpo compreende pelo menos a sequência CDR3, de um modo preferido, pelo menos, a CDR1, CDR2 e CDR3, ou pelo menos a sequência da região variável da cadeia pesada, de uma região variável de cadeia pesada de ErbB-3 específico selecionado a partir do grupo que consiste de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 e MF6074 como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou Figura 37. Uma concretização proporciona PB4188 anticorpo para utilização no tratamento de um sujeito tendo um ErbB- 2, ErbB-3 ou ErbB-2 / tumor positivo de ErbB-3, em que as células do referido tumor têm um nível de expressão de heregulina que é pelo menos 60%, de preferência pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90% ou 95% do nível de expressão de heregulina células BxPC3 ou MCF7.

[00188] Como já foi descrito, os anticorpos de acordo com a presente invenção são particularmente adequados para o tratamento de células tumorais positivas2-ErbB com menos de a) receptores erbB-2 na sua superfície celular. Os pacientes com tais tumores, que são normalmente classificados como ErbB-2 [++] ou ErbB-2 [+], incluem pacientes com tumores primários, bem como os doentes com tumores positivos de ErbB-2 recidiva. terapias actualmente utilizados, tais como trastuzumab (Herceptin) e pertuzumab só são prescritos para pacientes com erbB-2 positivos células malignas que possuem mais de 1.000.000 de ErbB-2 receptores na sua superfície celular, que são classificados como ErbB- 2 [+++ ].

[00189] Os pacientes que são classificados como ErbB- 2 [++] ou ErbB-2 [+] são, por conseguinte, de preferência, tratados com um anticorpo de acordo com a presente invenção. É ainda proporcionado, por conseguinte, um método ou o anticorpo para utilização de acordo com a invenção, em que o referido indivíduo tem um tumor positivo de ErbB-2 ou ErbB- 2 / ErbB-3 que tem menos do que a) receptores de ErbB-2 da superfície celular por células de tumor. Uma concretização preferida proporciona um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3 para utilização no tratamento ou prevenção da formação de metástases, em que o referido ErbB-3 de células de tumor positivo de ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / tem um nível de expressão de heregulina que é pelo menos 60%, de preferência pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%) , mais de preferência pelo menos 90% ou 95%) do nível de células MCF7 BxPC3 ou expressão heregulina, e em que a referida célula de tumor tem menos do que 1.000.000 receptores de superfície celular de ErbB-2.

[00190] Em outra concretização preferida, um anticorpo de acordo com a invenção é utilizado para neutralizar um tumor positivo de ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3 em um sujeito que tem uma função cardíaca comprometida, ou que está em risco destes. Com uma função cardíaca enfraquecida entende-se que o indivíduo tem uma função cardíaca, tal como, por exemplo, a fração de ejeção ventricular esquerda (FEVE), que é menor do que 90%, de preferência inferior a 85% ou menor do que 80%, de preferência inferior a 75 % ou menor do que 70%, em comparação com uma função cardíaca saudável. A referida função cardíaca saudável é, por exemplo, a função cardíaca média (tal como, por exemplo, a média FEVE) da população saudável. Alternativamente, a referida função cardíaca saudável é a função (tal como o FEVE) tal como medido em um paciente antes do início da terapia anti-tumor com um anticorpo de acordo com a invenção.

[00191] A função cardíaca é monitorizada por exemplo por um exame físico do sujeito e por um exame da FEVE, usando por exemplo um ecocardiograma ou um scan MUGA.

[00192] ErbB-2 está envolvido no crescimento, reparação, e a sobrevivência dos cardiomiócitos adultos como parte de uma rede de sinalização que envolve o complexo receptor de heregulina HER2: HER4. Tal como descrito aqui antes, cardiotoxicidade é um fator de risco conhecido na ErbB-2 e as terapias dirigidas a frequência de complicações é aumentada quando o trastuzumab é utilizado em conjunto com antraciclinas induzindo desse modo o esforço cardíaco.

Por exemplo, a combinação de doxiciclina com trastuzumab induz efeitos colaterais cardíacos severos.

Apesar do número crescente de casos clínicos de disfunção cardíaca induzida por trastuzumab, o seu mecanismo de ação é desconhecido.

Em vista da cardiotoxicidade de terapias atualmente conhecidas contra ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3 tumores positivos, é de particular vantagem para utilizar um anticorpo de acordo com a invenção.

Como se mostra nos Exemplos, os anticorpos foram agora, desde que não faça, ou a uma significativamente menor medida, em comparação com o trastuzumab e pertuzumab, afetar a sobrevivência dos cardiomiócitos.

Isto proporciona uma vantagem importante, pois cardiotoxicidade é reduzida.

Isso já é vantajoso para pessoas que não sofrem de uma função cardíaca comprometida, e mais ainda para as pessoas que sofrem de uma função cardíaca comprometida, como para assuntos da instância que sofrem de insuficiência cardíaca congestiva (ICC), disfunção ventricular esquerda (LVD ) e / ou uma diminuição da fracção de ejecção ventricular esquerda (FEVE), e / ou indivíduos que tiveram um enfarte do miocárdio.

É ainda proporcionado, por conseguinte, um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção para utilização no tratamento de um sujeito possuindo, ou em risco de ter uma ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 ErbB-3 de tumor positivo, em que o referido indivíduo tem uma função cardíaca que é inferior a 90%, de preferência inferior a 85% ou menor do que 80% ou menor do que 75% ou menor do que 70%, em comparação com uma função cardíaca saudável. A referida função cardíaca inclui de preferência a FEVE. Dito de ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB- 2 / ErbB-3 de tumor positivo de um modo preferido câncer da mama, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer do cólon, câncer gastroesofágico, câncer do esófago, câncer do endométrio, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer do pulmão, incluindo câncer do pulmão de células não pequenas, do sarcoma de células claras, câncer da glândula salivar, câncer da cabeça e pescoço, câncer do cérebro, câncer da bexiga, câncer do pâncreas, câncer da próstata, câncer do rim, câncer da pele, ou melanoma. Mais preferencialmente, o referido tumor é o câncer da mama. O referido anticorpo, de acordo com a invenção compreende de preferência um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga de domínio I de ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga o domínio III de ErbB-3. Uma concretização preferida proporciona um método de acordo com a invenção para o tratamento de um sujeito tendo um ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3 de tumor positivo, em que o sujeito tem uma função cardíaca que é menor do que 90%, de preferência inferior a 85%, de preferência inferior a 80%, de preferência, inferior a 75% ou menor do que 70%, em comparação com uma função cardíaca saudável, ou um anticorpo de acordo com a invenção para utilização em tal tratamento, em que o referido anticorpo compreende:

[00193] - pelo menos a sequência CDR3, de um modo preferido, pelo menos, a CDR1, CDR2 e CDR3, ou pelo menos a sequência da região variável da cadeia pesada, de uma região variável da cadeia pesada ErbB-2 específico selecionado a partir do grupo que consiste de MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 e MF1898 como representado na figura 16A ou figura 16E, ou uma sequência de região variável de cadeia pesada que difere no máximo 15 amino ácidos, de preferência no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos, mais de preferência no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos, a partir da cadeia pesada recitado sequências da região variável; e / ou

[00194] - pelo menos a sequência CDR3, de um modo preferido, pelo menos, a CDR1, CDR2 e CDR3, ou pelo menos a sequência da região variável da cadeia pesada, de uma região variável de ErbB-3 específico de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 e MF6074 como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou na Figura 37, ou uma sequência de região variável de cadeia pesada que difere em pelo menos 15 aminoácidos, de um modo preferido em, no máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9 ou 10 aminoácidos, mais de preferência no máximo 1, 2, ácidos 3, 4 ou 5 aminoácidos, a partir das sequências da região variável da cadeia pesada recitados. Em uma concretização preferida, o referido anticorpo é PB4188.

[00195] Em uma concretização, o referido anticorpo biespecífico é para utilização no tratamento de um sujeito sob condições de estresse de heregulina, como explicado em mais detalhe noutra secção.

É ainda proporcionado, por conseguinte, um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção para utilização no tratamento de um sujeito possuindo, ou em risco de ter uma ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / tumor positivo de ErbB-3, em que o referido sujeito tem uma função cardíaca que é menor do que 90%, de preferência inferior a 85%, de preferência inferior a 80%, de preferência inferior a 75% ou menor do que 70%, em comparação com uma função cardíaca saudável, e em que as referidas células do referido tumor têm um nível de expressão de heregulina que é pelo menos 60%, de preferência pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90% ou 95% do nível de expressão células MCF7 BxPC3 ou heregulina.

A referida função cardíaca inclui de preferência a FEVE.

Também é proporcionado um método para o tratamento de um sujeito tendo um ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3 de tumor positivo, em que o sujeito tem uma função cardíaca que é menor do que 90%, de preferência inferior a 85% , preferencialmente inferior a 80%, de preferência inferior a 75%, de preferência inferior a 70%, em comparação com uma função cardíaca saudável, e em que as células do referido tumor têm um nível de expressão de heregulina que é pelo menos 60%, de preferência pelo menos 70% , mais de preferência pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%) ou 95% do nível de expressão de células BxPC3 ou MCF7 ou heregulina, compreendendo o método a administração ao sujeito de um anticorpo biespecífico ou composição farmacêutica de acordo com a invenção. Uma concretização preferida proporciona uma utilização de um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento para o tratamento de um tumor positivo ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / de ErbB-3 em um sujeito que tem uma função cardíaca , de preferência um FEVE, que é menor do que 90%, de preferência inferior a 85%, de preferência, inferior a 80%, de preferência inferior a 75% ou menor do que 70%, enquanto em comparação com uma função saudável cardíaca, de preferência um FEVE saudável, em que as células do referido tumor têm um nível de expressão de heregulina que é pelo menos 60%, de preferência pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais de um modo preferido, pelo menos, 90% ou 95% do nível de expressão de células MCF7 BxPC3 ou heregulina.

[00196] Também é fornecido um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3 para utilização no tratamento ou prevenção da formação de metástases, em que o referido indivíduo tem uma função cardíaca que é inferior a 90%, de preferência inferior a 85%, de preferência inferior a 80%, de preferência inferior a 75%, de preferência inferior a 70%, em comparação com uma função cardíaca saudável. Ainda proporcionada uma utilização de um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção da formação de metástases, em que o referido indivíduo tem uma função cardíaca que é menor do que 90%, de preferência inferior a 85%, de preferência menor do que 80%, de preferência inferior a 75%, de preferência inferior a 70%, em comparação com uma função cardíaca saudável. Dito de ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB- 3 de tumor positivo de um modo preferido câncer da mama, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer do cólon, câncer gastroesofágico, câncer do esófago, câncer do endométrio, câncer do ovário, câncer do fígado, pulmão câncer, incluindo câncer do pulmão de não pequenas células, do sarcoma de células claras, câncer da glândula salivar, câncer da cabeça e pescoço, câncer do cérebro, câncer da bexiga, câncer do pâncreas, câncer da próstata, câncer do rim, câncer da pele, ou melanoma. Mais preferencialmente, o referido tumor é o câncer da mama. A referida função cardíaca inclui de preferência a FEVE. Em uma concretização preferida, o referido anticorpo é PB4188 anticorpo.

[00197] Em outra concretização, é feito uso de anticorpos de acordo com a invenção para contrariar a fosforilação de diversos fatores da via de Akt prosobrevida (também referida como a via de PI3-cinase) e a via da MAP quinase. Estes são a jusante vias de sinalização pró- proliferação de HER3. Surpreendentemente, os inventores conseguiram inibir significativamente a fosforilação de Akt, ERK1 / 2 e a proteína ribossomal S6 (S6-RP) com um anticorpo de acordo com a presente invenção, ao passo que o trastuzumab e pertuzumab não tem essas fortes efeitos anti-fosforilação. Neutralizar a fosforilação de fatores dos pró-proliferativas PIS quinase e MAP quinase vias é vantajosa, uma vez que isso contraria o crescimento de uma célula tumoral positiva ErbB-

3. É ainda proporcionado, por conseguinte, uma utilização de um anticorpo de acordo com a invenção para contrariar, de preferência inibindo, a fosforilação de Akt, ERKl / 2 e / ou S6-RP.

Importante, fosforilação de Akt pode ser significativamente reduzida ou mesmo completamente bloqueada com um anticorpo da invenção, tanto in vitro e in vivo, como mostrado nos Exemplos.

Por conseguinte, uma concretização preferida proporciona uma utilização de um anticorpo de acordo com a invenção para contrariar, de preferência inibindo, a fosforilação de Akt.

Também é proporcionada a utilização de um anticorpo de acordo com a invenção para contrariar a formação de um complexo p85-HER3. Desde a formação de um complexo HER3-p85 é a primeira fase de ativação de Akt, é vantajoso para neutralizar a formação do referido complexo HER3-p85. O referido anticorpo, de acordo com a invenção é preferencialmente um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga de domínio I de ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga o domínio III de ErbB-3. O referido anticorpo compreende, preferencialmente, um local de ligação ao antígeno que se liga a pelo menos um amino ácido de domínio I de aminoácido exposto ErbB-2 selecionado a partir do grupo que consiste em T 144, T164, R166, P172, G179, S180 e R181, e de superfície os resíduos que estão localizados dentro de cerca de cinco posições de aminoácidos a partir de T144, T164, R166, PI 72, G179, S180 ou R181. Além disso, ou em alternativa, o referido anticorpo compreende, preferencialmente, um local de ligação ao antígeno que se liga a pelo menos um ácido amino do domínio III de ErbB-3 selecionado a partir do grupo que consiste em F409 e R426 e resíduos de aminoácidos expostos à superfície que estão localizados dentro de 11,2 de R426 na proteína nativa ErbB-

3. Em uma concretização, o referido anticorpo compreende pelo menos uma sequência de CDR1, CDR2 e CDR3, ou pelo menos uma sequência de VH, como representado na Figura 16 ou na Figura 37. Em uma concretização, o referido anticorpo é PB4188.

[00198] A invenção também fornece um método de tratamento de um indivíduo que tem um tumor positivo de ErbB- 2 ou está em risco de desenvolver um tumor positivo de ErbB- 2, o método que compreende a administração ao indivíduo em necessidade do mesmo de uma agente de alvejamento ErbB-2, incluindo um inibidor de ErbB-2 ou agente de ligação, tal como um anticorpo bivalente monoespecífico que compreende um local de ligação ao antígeno que pode se ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-2, e um anticorpo biespecífico que compreende um local de ligação ao antígeno que pode se ligar a um epítopo sobre uma parte extracelular de ErbB-2 e um local de ligação ao antígeno que pode se ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-3.

[00199] Onde o inibidor de ErbB-2 é um anticorpo monoespecífico, o anticorpo monoespecífico e o anticorpo biespecífico ligam-se preferencialmente a diferentes epítopos em ErbB-2. Os diferentes ErbB-2 epítopos são de preferência em diferentes ErbB-2 domínios extracelulares. O anticorpo monoespecífico pode preferivelmente ligar a um epítopo no ErbB-2 extracelular domínio IV, o domínio II ou o domínio III. O anticorpo biespecífico pode preferivelmente ligar a um epítopo no ErbB-2 domínio extracelular I.

[00200] O ErbB-2 agente de alvejamento pode compreender um conjugado de droga, em particular, onde o inibidor de erbB-2 é um anticorpo monoespecífico, o anticorpo monoespecífico compreende preferivelmente um conjugado de droga, por exemplo, emtansine delongas-trastuzumab (Kadeylat).

[00201] O conjugado de droga também pode ser no anticorpo biespecífico ou em ambos o anticorpo biespecífico e o agente de alvejamento de ErbB2. O conjugado da droga compreende preferencialmente emtansine. Os conjugados anticorpo-droga ou ADCs são uma classe importante de drogas altamente potentes biofarmacêuticas concebidos como uma terapia direcionada para o tratamento de pessoas com câncer. Ao contrário da quimioterapia, os ADCs destinam-se a alvejar e matar apenas as células cancerosas e poupar as células saudáveis. Um conjugado da droga é um anticorpo ligado a um agente citotóxico (anticancerígeno) carga biologicamente ativo ou droga. Ao combinar as capacidades únicas de anticorpos monoclonais com a capacidade de matar câncer de drogas citotóxicas, os conjugados anticorpo-droga sensíveis permite a discriminação entre o tecido saudável e doente. Isto significa que, em contraste com os agentes terapêuticos quimio tradicionais, os conjugados de droga anticorpo-alvo e atacar a célula do câncer de modo que as células saudáveis são menos severamente afetados. Os conjugados anticorpo fármaco são descritos em DiJoseph et al; Sangue. 2004 103 (5): 1807- 14. Mullard A. Nature Reviews Drug Discovery 12, 329-332 (2013); Zolot RS et al; Nature Reviews Drug Discovery 12, 259-260 (2013); Merten et al; Bioconjug Chem 2015; 26:

2176-2185; Schlom et al; Câncer Res. 1992; 52 (5): 1067-

1072. Rohrer T. Jornal de conjugados anticorpo-droga. 21 de junho de 2013. Os medicamentos adequados para incorporação em um ADC são os inibidores da polimerase (Tubulina) auristatinas; Maitansinas (Tubulina de despolimerização); Calicheamicinas (clivagem de DNA); Duocarymycins (DNA do sulco menor, agentes alquilantes); dímeros de PBD (DNA do sulco menor reticuladores); e um-Amanitin (RNA polimerase II inibidor). Em uma concretização preferida, o fármaco é emtansine.

[00202] Onde o inibidor de erbB-2 é um anticorpo monoespecífico, o anticorpo monoespecífico é preferencialmente trastuzumab (Número CAS 180288-69- 1). Ele pode ser substituído ou combinado com pertuzumab (CAS No. 380610-27-5) Em uma concretização particularmente preferida, o anticorpo monoespecífico seja emtansine trastuzumab- (T- DM1 também comercializado sob o nome Kadcyl).

[00203] O anticorpo biespecífico compreende de preferência um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, em que o referido primeiro local de ligação ao antígeno compreende pelo menos a sequência CDR3 de MF3958, ou uma sequência de CDR3 que difere em, no máximo, três, de um modo preferido em, no máximo, dois, de preferência em não mais do que um aminoácido a partir da sequência de CDR3 de MF3958, e em que o referido segundo local de ligação ao antígeno compreende pelo menos a sequência CDR3 de MF3178, ou uma sequência de CDR3 que difere em no máximo três, de um modo preferido em, no máximo, dois, de preferência em não mais do que um ácido de amino a partir da sequência de CDR3 de MF3178. O anticorpo biespecífico compreende de preferência um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, em que o referido primeiro local de ligação ao antígeno compreende pelo menos a sequência CDR3 de MF3958 e em que o referido segundo antígeno local de ligação compreende pelo menos a sequência CDR3 de MF3178.

[00204] Em uma concretização preferida, o anticorpo biespecífico compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, em que o referido primeiro local de ligação ao antígeno compreende pelo menos as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de MF3958, ou CDR1, CDR2 e CDR3 sequências que diferem em no máximo três, de um modo preferido em, no máximo, dois, de um modo preferido em, no máximo, um aminoácido a partir das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de MF3958, e em que o referido segundo local de ligação ao antígeno compreende pelo menos a CDR1, CDR2 e CDR3 da sequência de MF3178, ou CDR1, CDR2 e CDR3 que diferem de m, no máximo três, de um modo preferido em, no máximo, dois, de um modo preferido em, no máximo, um aminoácido a partir das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de MF3178.

[00205] Em uma concretização preferida, o anticorpo biespecífico compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, em que o referido primeiro local de ligação ao antígeno compreende pelo menos as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de MF3958 e em que o referido segundo local de ligação ao antígeno compreende pelo menos a sequência de CDR1, CDR2 e CDR3 de MF3178.

[00206] Em uma concretização preferida, o anticorpo biespecífico compreende um domínio variável que se liga a ErbB-2 e um domínio variável que se liga ErbB-3, em que a cadeia VH do domínio variável que se liga a ErbB-2 compreende - a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3958 como representado na Figura 16A; ou - a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3958 como representado na Figura 16A ter, no máximo, 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferencialmente no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos com respeito ditas VH; e

[00207] em que a cadeia VH do domínio variável que se liga ErbB-3 compreende - a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3178 como representado na Figura 16B; ou - a sequência de aminoácidos de cadeia VH de MF3178 representado na Figura 16B tendo, no máximo, 15, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, mais preferencialmente no máximo 1, 2, 3, 4 ou 5, inserções, deleções, substituições de aminoácidos ou uma combinação dos mesmos no que diz respeito à sequência de cadeia VH da Figura 16B.

[00208] O anticorpo é de preferência anticoprpo biespecífico PB4188. O tratamento pode ser combinado com um medicamento de quimioterapia. Assim, o tratamento compreende ainda de preferência a administração de um medicamento de quimioterapia para o indivíduo em necessidade do mesmo. Muitos medicamentos quimioterápicos diferentes foram desenvolvidos para o tratamento de câncer. Invariavelmente, alguma ou mais ativos do que outros no combate a tumores específicos.

[00209] O medicamento de quimioterapia pode ser, por exemplo, vinorelbina, paclitaxel, docetaxel, gemcitabina, eribulin, capecitabina ou carboplatina.

[00210] A invenção proporciona ainda uma combinação de uma ErbB-2 um agente de ErbB-2 de alvejamento, incluindo um inibidor ou agente de ligação, tal como um anticorpo monoespecífico bivalente, que compreende locais de ligação ao antígeno que pode se m ligar a um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-2 ; e um anticorpo biespecífico que compreende um local de ligação ao antígeno que pode se ligar a um epítopo na parte extracelular de ErbB-2 e um local de ligação ao antígeno que pode se ligar a um epítopo na parte extracelular de ErbB-3, para utilização num método de tratamento de um indivíduo que tem um tumor positivo de ErbB- 2 ou está em risco de desenvolver um tumor positivo de ErbB-

2.

[00211] Ainda proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo um agente de ErbB-2 de alvejamento, incluindo um inibidor de erbB-2 ou agente de ligação, tal como um anticorpo monoespecífico bivalente que compreende locais de ligação ao antígeno que pode se m ligar a um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-2 e um anticorpo biespecífico que compreende um local de ligação ao antígeno que pode se ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-2 e um local de ligação ao antígeno que pode se ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-

3. Também é fornecido um kit de partes que compreende um agente de ErbB-2 de alvejamento, incluindo um inibidor de erbB-2 ou agente de ligação, tal como um anticorpo monoespecífico bivalente que compreende locais de ligação ao antígeno que pode se m ligar a um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-2 e um anticorpo biespecífico que compreende um local de ligação ao antígeno que pode se ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-2 e um local de ligação ao antígeno que pode se ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-3.

[00212] A invenção proporciona ainda um método de tratamento de um indivíduo que tem um tumor erbB-2 positivo e tumor positivo de ErbB-3 no cérebro ou está em risco de desenvolver uma erbB-2 positivos e tumor positivo de ErbB-3 no cérebro o método compreendendo administrar ao indivíduo em necessidade da mesma de um anticorpo que compreende um local de ligação ao antígeno que pode se ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-2 e um local de ligação ao antígeno que pode se ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-3. O tumor é de preferência uma metástase de um tumor da mama. De preferência, o anticorpo pode ligar-se a um epítopo em ErbB-2 domínio extracelular I. De preferência, o anticorpo pode ligar-se a um epítopo em ErbB-3 domínio extracelular III. O método preferivelmente compreende ainda a administração de um agente de alvejamento de ErbB-2, incluindo um inibidor de erbB-2 ou agente, de ligação, tal como um anticorpo monoespecífico bivalente com os locais de ligação ao antígeno que pode se m ligar a um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-2. De preferência, o método compreende ainda a administração de um agente de alvejamento de ErbB-2, incluindo um inibidor de erbB-2 ou agente, de ligação, tal como um anticorpo monoespecífico bivalente com os locais de ligação ao antígeno que pode se m ligar a um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-3. Um inibidor de ErbB-2, tal como um anticorpo monoespecífico bivalente com os locais de ligação ao antígeno que pode se m ligar a um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-2 ou um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-3, pode compreender um conjugado de droga.

A droga compreende preferencialmente emtansine.

O anticorpo monoespecífico bivalente com os locais de ligação ao antígeno que pode se ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-2 é de preferência trastuzumab, pertuzumab ou um bio-similar com a mesma sequência de aminoácidos de domínio variável.

O anticorpo que compreende um local de ligação ao antígeno que pode se ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB- 2 e um local de ligação ao antígeno que pode se ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-3 é de preferência um anticorpo biespecífico.

O anticorpo biespecífico é preferencialmente PB4188 anticorpo.

É ainda proporcionado um anticorpo que compreende um local de ligação ao antígeno que pode se ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB- 2 e um local de ligação ao antígeno que pode se ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-3 para utilização no tratamento de um indivíduo que tem um tumor positivo e ErbB-3 positivo de ErbB-2 no cérebro ou está em risco de desenvolver um tumor de ErbB-2 positivo e ErbB-3 positiva no cérebro.

[00213] Um indivíduo está em risco de desenvolver um tumor, tal como aqui indicado, se o indivíduo teve um tumor e do tumor responderam bem ao tratamento fornecido ao indivíduo. Particularmente quando o indivíduo entrou em remissão completa, de tal modo que o número de células tumorais em que o indivíduo não é mensurável com técnicas convencionais, tais como ressonância magnética regular ou imagiologia de tomografia computadorizada. Tal indivíduo tem, infelizmente, um risco muito maior de desenvolver um tumor quer no local do tumor original (recorrência tumoral) num local distante (tumor metastático) ou desenvolver um tumor de nova origem (por exemplo tratamento induzido). Um indivíduo em risco é, assim, de preferência, um indivíduo que tem tido um tumor e está em remissão completa dos mesmos.

[00214] Proporciona-se um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, em que o anticorpo pode reduzir a função do receptor induzida pelo ligante de ErbB-3 em uma ErbB-2 e célula positiva ErbB-3. O anticorpo preferencialmente pode reduzir o crescimento induzida pelo ligante de uma célula positiva de ErbB-2 e ErbB-3. O anticorpo pode reduzir de um modo preferido de crescimento induzida pelo ligante de uma célula positiva de ErbB-2 e ErbB-3, em que a referida célula possui, pelo menos, 100.000 ErbB-2 receptores de superfície celular por célula. De preferência, a referida célula é uma célula MCF-7, uma célula SK-BR-3, células NCI-N87, uma célula

BxPC-3, uma célula BT-474 ou uma célula JIMT- 1. O primeiro local de ligação ao antígeno podem ligar-se de preferência para o domínio I ou domínio IV de ErbB-2. O segundo local de ligação ao antígeno de um modo preferido interfere com a ligação de um ligando de ErbB-3 e ErbB-3. Também é fornecido um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, em que o referido primeiro local de ligação ao antígeno liga-se domínio I de ErbB-2 e o referido segundo antígeno local de ligação liga-se o domínio III de ErbB-3. Proporciona-se adicionalmente um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, em que a afinidade (KD) do referido segundo local de ligação ao antígeno para uma célula positiva ErbB-3 é igual a, ou maior do que, a afinidade do que o referido primeiro local de ligação ao antígeno para uma célula positiva de ErbB-2. O anticorpo pode reduzir de um modo preferido uma função de receptor induzida por ligando de ErbB-3 em uma célula positiva de ErbB-2 e ErbB-3. O anticorpo pode reduzir de um modo preferido de crescimento induzida pelo ligante de uma célula positiva de ErbB-2 e ErbB-3. A afinidade (KD) do referido segundo local de ligação a antígeno para uma célula positiva ErbB-3 é de preferência menor do que ou igual a 2.0 iiM, de preferência inferior ou igual a 1,39 nM, mais preferivelmente menor do que ou igual a 0,99 nM.

A afinidade (KD) do referido primeiro local de ligação ao antígeno para uma célula positiva de ErbB-2 é de preferência inferior ou igual a 5,0 nM, de preferência inferior ou igual a 4,5 nM de preferência inferior ou igual a 4,0 nM.

A afinidade (KD) do referido anticorpo biespecífico para as células BT 474 é de preferência inferior ou igual a 5,0 nM, de preferência inferior ou igual a 4,0 nM, mais preferencialmente, inferior ou igual a 3,2 nM, e / ou em que a afinidade do referido anticorpo biespecífico para as células SK BR 3 é menor do que ou igual a 5,0 nM, de preferência inferior ou igual a 3,0 nM, mais preferencialmente inferior ou igual a 2,0 nM.

É ainda proporcionado um anticorpo compreendendo dois locais de ligação ao antígeno que se ligam de ErbB-2, em que pelo menos um dos referidos locais de ligação ao antígeno liga- se ao domínio I do ErbB-2. A afinidade (KD) de pelo menos um dos referidos locais de ligação a antígeno para uma célula positiva de ErbB-2 é de preferência inferior ou igual a 5,0 nM, de preferência, inferior ou igual a 4,0 nM, mais preferencialmente inferior ou igual a 4,0 nM . Também é fornecido um anticorpo que compreende dois locais de ligação ao antígeno que se ligam ErbB-3, em que pelo menos um dos referidos locais de ligação ao antígeno liga-se o domínio III de ErbB-3. A afinidade (KD) de pelo menos um dos referidos locais de ligação a antígeno para uma célula positiva ErbB-3 é de preferência inferior ou igual a 2,0 nM, de preferência inferior ou igual a 1,39 nM, mais preferivelmente menor do que ou igual a 0,99 nM . A referida célula positiva ErbB-3 e / ou da referida célula positiva de ErbB-2 é de preferência uma célula BT 474 ou uma célula SK BR 3. O anticorpo compreende, preferencialmente, um local de ligação ao antígeno que se liga a pelo menos um aminoácido do domínio I de ErbB-2 selecionado a partir do grupo que consiste em T144, T164, R166, P172, G179, S180 e R181, e os resíduos de aminoácidos expostos à superfície que estão localizados dentro de cerca de cinco posições de aminoácidos a partir de T144, T164, R166, P172, G179, S180 ou R181. De preferência, compreende um local de ligação ao antígeno que se liga pelo menos um ácido amino do domínio III de ErbB-3 selecionado a partir do grupo que consiste e R426 e superfície resíduos de aminoácidos expostos que estão localizados dentro de 11,2 à partir do R426 na ErbB-3 nativa proteína.

O referido anticorpo compreende, preferencialmente, pelo menos, a sequência de CDR3 de uma região variável de ErbB-2 específico de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste de MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 e MF1898 como representado na figura 16A ou figura 16E.

O referido anticorpo compreende, preferencialmente, pelo menos, a sequência de CDR3 de uma região variável de ErbB-3 específico de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 e MF6074 como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou Figura 37. o referido anticorpo compreende, preferencialmente, pelo menos, as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de uma região variável de ErbB-2 específico de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste de MF2926, MF2930, MF1849;

MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 e MF1898 como representado na figura 16A ou figura 16E, ou em que o referido anticorpo compreende sequências de CDR que diferem entre si em, no máximo, 3 -amino ácidos, de preferência no máximo em 2 aminoácidos, de um modo preferido em, no máximo, um aminoácido a partir das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 de MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 ou MF1898. O referido anticorpo compreende, preferencialmente, pelo menos, a CDR1, CDR2 e CDR3 de uma região variável de ErbB-3 específico de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 e MF6074 como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou na Figura 37, ou em que o referido anticorpo compreende sequências de CDR que diferem em pelo maioria dos ácidos 3 amino, de um modo preferido em, no máximo, 2 aminoácidos, de um modo preferido em, no máximo, um aminoácido da CDR1, CDR2 e CDR3 de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 ou MF6074. O referido anticorpo compreende, preferencialmente, uma sequência de região variável de ErbB-2 específico de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste nas sequências de região variável de cadeia pesada de MF2926,

MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 e MF1898 como representado na figura 16A ou figura 16E, ou em que o referido anticorpo compreende uma sequência de região variável de cadeia pesada que difere em na maioria dos 15 aminoácidos das sequências de região variável de cadeia pesada de MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 ou MF1898. O referido anticorpo compreende, preferencialmente, uma sequência de região variável de ErbB-3 específico de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste nas sequências de região variável de cadeia pesada de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 e MF6074 como representado na Figura 16B ou da Figura 16E ou na Figura 37, ou em que o referido anticorpo compreende uma sequência de região variável de cadeia pesada que difere em pelo menos 15 aminoácidos das sequências de região variável de cadeia pesada de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 ou MF6074. O anticorpo apresenta preferivelmente citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC). O anticorpo é de preferência afucosilatado, a fim de melhorar a ADCC.

É preferivelmente um anticorpo humano ou humanizado.

O anticorpo compreende, preferencialmente, duas cadeias pesadas de imunoglobulina diferente com domínios de heterodimerização compatíveis.

Os domínios de heterodimerização compatíveis referidos são, de preferência, os domínios CH3 heterodimerização de imunoglobulina de cadeia pesada compatíveis.

De preferência, ambos os braços compreendem uma cadeia leve comum.

A referida cadeia leve comum é de preferência uma cadeia leve de linha germinal, de preferência uma cadeia humana de linha germinal rearranjada leve kapa compreendendo o segmento de gene IgVKl- 39, mais preferencialmente a cadeia leve kapa germinal humana rearranjada IgVKl-39 * 01 / * 01 IGJKl.

O anticorpo compreende ainda de preferência um marcador, preferivelmente um marcador para imagiologia in vivo.

Também é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo biespecífico, tal como aqui indicado.

Também é proporcionado um método para o tratamento de um sujeito tendo um ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / tumor positivo de ErbB-3 ou em risco de ter o referido tumor, compreendendo a administração ao sujeito de uma composição de anticorpo ou farmacêutica de acordo com a invenção.

Também é fornecido um anticorpo da invenção para utilização no tratamento de um sujeito possuindo, ou em risco de ter um tumor positivo de ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3. O anticorpo biespecífico de preferência não afeta significativamente a sobrevivência dos cardiomiócitos. anticorpo biespecífico é dito para ser utilizado por um indivíduo que tem uma função cardíaca que é inferior a 90%, em comparação com uma função cardíaca saudável.

Também é proporcionado um método para o tratamento de um sujeito tendo um ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3 de tumor positivo ou em risco de ter o referido tumor que compreende a administração ao indivíduo: - um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3, e - um ou mais compostos selecionados a partir do grupo consistindo de um inibidor de um componente da via de PISKinase, um inibidor de um componente da via de MAPK, uma droga perturbar microtúbulos e um inibidor de HDAC, de preferência um ou mais compostos selecionados a partir do grupo que consiste de um inibidor de tirosina quinase, um inibidor PI3Ka, um inibidor Akt, um inibidor de mTOR, um inibidor de Src, vorinostat e paclitaxel.

Também é fornecido um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3 para utilização no tratamento de um tumor positivo ErbB-2, ErbB- 3 ou ErbB-2 / ErbB-3, em que o referido tratamento compreende administrar o referido anticorpo biespecífico e, pelo menos, um composto selecionado a partir do grupo consistindo de um inibidor de um componente da via de PI3-quinase, um inibidor de um componente da via de MAPK, uma droga e um perturbar microtúbulos inibidor de HDAC, de um modo preferido administrar o referido anticorpo biespecífico e, pelo menos, um composto selecionado a partir do grupo consistindo de um inibidor de tirosina quinase, um inibidor PI3Ka, um inibidor Akt, um inibidor de mTOR, um inibidor de Src, vorinostat e o paclitaxel, a um sujeito tendo um ErbB -2, ErbB-3 ou ErbB- 2 / ErbB-3 de tumor positivo.

O referido inibidor de tirosina-quinase compreende preferencialmente afatinib,

lapatinib e / ou neratinib.

O referido inibidor de PI3K é preferencialmente BYL719. O referido inibidor Akt é preferencialmente MK 2206. O referido inibidor de mTOR é preferencialmente everolimus.

O referido inibidor de Src é preferencialmente saracatinib.

A referida segmentação microtúbulos droga é preferivelmente paclitaxel.

O referido inibidor de HDAC é preferencialmente vorinostat.

Também é fornecido um método para neutralizar a formação de uma metástase de um sujeito tendo uma célula tumoral positiva ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3, em que o referido ErbB- 2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB -3 tem um nível de expressão de heregulina que é pelo menos 60%, de preferência pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%), mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90% ou 95% de nível de expressão de heregulina de células BxPC3 ou MCF7, que compreende administração ao indivíduo de um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3. Também é fornecido um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB-2 e um segundo local de ligação ao antígeno que se liga a ErbB3 para utilização no tratamento ou prevenção da formação de uma metástase de uma célula de tumor positivo ErbB-2, ErbB -3 ou de ErbB-2 / ErbB-3, em que a referida célula de tumor positivo ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3 tem um nível de expressão de heregulina que é pelo menos 60%, de preferência pelo menos 70 %, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90% ou 95% do nível de expressão de células MCF7 BxPC3 ou heregulina. Proporciona-se um método ou o anticorpo para utilizao de acordo com qualquer uma das reivindicações 36-50, em que o referido indivíduo tem uma erbB-2 ou ErbB-2 / ErbB-3 de tumor positivo que tem menos do que 1.000.000 de receptores de superfície celular-2 ErbB por célula. O referido anticorpo é, preferencialmente, um anticorpo de acordo com a invenção. A referida célula de tumor é de preferência um câncer da mama, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer do cólon, câncer gastroesofágico, câncer do esófago, câncer do endométrio, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer do pulmão incluindo câncer do pulmão de células não pequenas, sarcoma de células claras, câncer da glândula salivar, câncer da cabeça e pescoço, câncer do cérebro, câncer da bexiga, câncer do pâncreas, câncer da próstata, câncer do rim, câncer da pele, ou de células de melanoma. Referido indivíduo tem de preferência uma função cardíaca que é inferior a 90%, em comparação com uma função cardíaca saudável. A referida função cardíaca compreende preferencialmente a Fracção de ejecção ventricular esquerda (FEVE). Referido indivíduo sofre de um modo preferido a partir de insuficiência cardíaca congestiva (CHF), disfunção ventricular esquerda (LVD) e / ou a> 10%> diminuída do ventrículo esquerdo Fracção de Ejecção (FE), e / ou em que o referido sujeito tem tido um enfarte do miocárdio. Também é proporcionada a utilização de um anticorpo da invenção para neutralizar, de preferência, inibindo, a fosforilação de Akt, ERK e / ou proteína ribossômica S6.

[00215] Para efeitos de clareza e de forma concisa características descrição são aqui descritos como parte da mesma ou separada concretizações, no entanto, será apreciado que o âmbito da presente invenção pode incluir concretizações que têm combinações de todas ou algumas das características descritas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00216] A Figura 1 mostra a titulação Antigênica no HER2 monomérica de um painel de braços HER2 que também estão presentes em anticorpos biespecíficos ativos HER2xHER3 em combinação com um braço de PG3178. Todos os anticorpos monoclonais HER2 do painel de HER2xHER3 exceto para PG3025 foram testados sobre uma titulação de antígeno HER2 ELISA.

[00217] A Figura 2 mostra a atividade funcional de HER2 HER3 x anticorpos biespecíficos em células BxPC3 com ou sem estimulação ligante. As linhas a tracejado representam a atividade de trastuzumab, o anticorpo de referência neste ensaio, com ou sem estimulação ligante.

[00218] A Figura 3 mostra as curvas de titulação de anticorpos monoclonais HER2 e HER3 (painel superior) e HER2 HER3 x anticorpos biespecíficos da mesma (painel inferior) no ensaio de células MCF-7

[00219] A Figura 4 mostra o efeito do tratamento de anticorpo no tamanho do tumor BxPC3-Luc2 no dia 31 num modelo murino ortotótico. BLI, o crescimento do tumor conforme medido por bioluminescência.

[00220] A Figura 5 mostra o efeito do tratamento de anticorpo no tamanho do tumor BxPC3-Luc2 no dia 31 num modelo murino ortotico. BLI, o crescimento do tumor conforme medido por bioluminescência.

[00221] A Figura 6 mostra a análise de FACS de um anticorpo biespecífico HER2xHER3 e seus anticorpos monoclonais parentais de MCF-7 e BxPC3-Luc2 células que expressam Her2. IMF, intensidade de fluorescência média.

[00222] A Figura 7 mostra a caracterização analítica por HP-SEC e CIEX-HPLC. PB4188 (painel superior), anticorpo anti-HER2 monoclonal parental (painel do meio), IgG de referência monoclonal anti-RSV (painel inferior).

[00223] A Figura 8 mostra a inibição da proliferação de células JIMT-1 em agar mole por uma série de titulação de anticorpo.

[00224] A Figura 9 mostra a inibição da BT-474 (painel superior) e SKBR3 (painel inferior) a proliferação celular em matrigel por uma série de titulação de anticorpo.

[00225] Figura 10a mostra a indução de proliferação de HRG induzida e ramificação / invasão de céulas SK-BR-3 em matrigel.

[00226] Figura lOb mostra a inibição de HRG a proliferação induzida e ramificação / invasão de células SK- BR-3 em matrigel por PB4188 em contraste com os anticorpos monoclonais parentais.

[00227] Figura 10c mostra a inibição da proliferação induzida por HRG e ramificação / invasão de células SK-BR-3 em matrigel por PB4188 em contraste com os anticorpos monoclonais anti-HER3.

[00228] Figura l0d mostra a inibição da proliferação induzida por HRG e ramificação / invasão de células SK-BR-3 em matrigel por PB4188 em contraste com combinações de anticorpos monoclonais anti-HER3 com trastuzumab.

[00229] Figura 10e mostra a inibição da proliferação induzida por HRG e ramificação / invasão de SK-BR-3 em células de matrigel por PB4188 e PB4188 a combinação mais trastuzumab.

[00230] A Figura 11 mostra a atividade inibidora superior dos PB4188 em HER2 +++ células N87 na presença de 100 ng / ml de HRG.

[00231] A Figura 12 mostra a atividade de ADCC de PB4188 e PB3448 em uma titulação da dose.

[00232] A Figura 13 mostra o aumento da atividade de ADCC do anticorpo biespecífico em comparação com os anticorpos monoclonais parentais ou uma combinação dos mesmos

[00233] A Figura 14 mostra a atividade de ADCC de PB4188 afucosylated comparação com trastuzumab em baixo (painel superior) e alta (painel inferior) células que expressam HER2

[00234] A Figura 15 mostra a atividade de ADCC de PB4188 afucosylated em células SK-BR-3 HER2 +++ na presença de células repórter que expressa uma variante de alta ou baixa FcyR

[00235] A Figura 16 mostra a sequência de ácido nucleico e de aminoácidos de cadeia VH-, cadeia leve comum e cadeias pesadas de anticorpos do invenção. Se, nesta figura uma sequência líder é indicada isso não é parte da cadeia VH ou anticorpo, mas é normalmente clivada de durante o processamento da proteína na célula que produz a proteína.

[00236] A Figura 17 mostra o efeito do tratamento de anticorpo no tamanho do tumor em um modelo de xenoenxerto de murino JIMT- 1. O crescimento do tumor medido pelo volume do tumor medição do calibre dos diferentes grupos de tratamento. crescimento superior, do tumor durante 60 dias; inibição tumor inferior do crescimento (TGI) no final do período de tratamento (29 dias).

[00237] A Figura 18 mostra curvas de sobrevivência Kaplan-Meier de diferentes grupos de tratamento no modelo de xenoenxerto de murino JIMT-1.

[00238] A Figura 19 mostra a inibição do crescimento N87 ligando dirigido. A proliferação HRG conduzida de N87 pode ser superada, através de uma vasta faixa de HRG por PB4188 em contraste com o anticorpo anti-HER3 parental. Os dados apresentados na concentração de anticorpo de 40 ng / ml.

[00239] A Figura 20 mostra o estado estacionário de medições de afinidade de células 125I marcadas com IgG HER2xHER3 (PB4188) em relação às células BT-474 (parte superior, três ensaios independentes) e células SK-BR-3 (em baixo; três ensaios independentes). A ligação não específica foi determinada utilizando um excesso de 100 vezes de HER2xHER3 não marcado.

[00240] A Figura 21a mostra o mapeamento de Epítopos de HER2. Os resíduos críticos identificados são representados como esferas pretas na estrutura de cristal de HER2, resíduos críticos secundárias identificadas são representados como esferas de cinza (PDB ID #1S78).

[00241] A Figura 21b mostra a) estrutura de cristal de HER2 (APO # 1S78) mostrando resíduos epitópicos PG3958 verificados como esferas cinzento claro e resíduos circundantes (+/- cinco resíduos de aminoácidos) como esferas de cinza escuro, b) Solvente superfície exposta da região de epítopo mostrando resíduos epitópicos verificados em cinza e resíduos circundantes (+/- cinco resíduos) em c) vista preto, detalhada da região de epítopo com resíduos epitópicos verificadas em cinzento claro e resíduos circundantes (+/- cinco resíduos) em cinzento-escuro, d) sequência de aminoácidos primária de HER2 PG3958 região de epítopo indicando resíduos verificados epítopo (cinzento sublinhada), em torno de resíduos (preto) e resíduos distantes (em itálico cinza, não mostrado em a, b e c). As Figuras e as análises foram feitas com Yasara (www.yasara.org).

[00242] A Figura 21C mostra a) estrutura HER3 cristal (APO # 4P59) mostrando resíduo epítopo Arg 426 em esferas de cinza e todos os resíduos expostos de superfície dentro de uma 11.2 Um raio de Arg 426 no esferas pretas, b) Solvente superfície exposta da região de epítopo com o Arg 426 e resíduos distantes mostrado em resíduos expostos cinza e toda a superfície dentro de um raio de 11,2 um Arg 426 mostrado em preto, c) resíduos na região do epítopo de Arg 426 a cinzento claro e resíduos circundantes (todos rotulados) em cinzento escuro. As Figuras e as análises foram feitas com Yasara (www.yasara.org).

[00243] A Figura 22 mostra a confirmação dos resíduos de ligação críticos para Fab braço 3958 para HER2. Trastuzumab foi incluído como um anticorpo de controlo. A ligação foi determinada em uma titulação de FACS e a ligação é expressa como AUC em comparação ao trastuzumab ligação.

D143Y não é considerado como sendo parte do epítopo de 3958 como a ligação de Trastuzumab para este mutante é também bloqueada.

[00244] A Figura 23 mostra resíduos críticos para a ligação PG3178 representada na estrutura de cristal de HER3. resíduos críticos identificados para PG3178binding são representados como esferas pretas na estrutura de cristal HER3 (PDB ID # 4P59).

[00245] A Figura 24 mostra a Confirmação de R426 como um resíduo de ligação críticos para PG3175 a HER3. Dois anticorpos anti-HER3 foram incluídos como anticorpos de controlo. A ligação foi determinada em uma titulação de FACS e a ligação é expressa como agosto em comparação com a ligação de WT HER3.

[00246] A Figura 25 mostra a Ausência de toxicidade PB4188 sob tensão cardíaca in vitro. A incubação de cardiomiócitos com PB4188 ou anticorpos monoespecíficos de referência, na presença de 3 μΜ da doxorrubicina antraciclina. Viabilidade dos cardiomiócitos foi determinado por quantificação de ATP e expressa em unidades de luz relativas (RLU). T, trastuzumab; P, pertuzumab.

[00247] A Figura 26 mostra a ligação de PB4188 em comparação com trastuzumab e um anticorpo HER3 para células HER2 amplificados. titulações de FACS foram realizados nas linhas celulares indicadas que expressam diferentes níveis de HER2. Área sob a curva de valores do sinal médio PE foram representados por linha celular.

[00248] A Figura 27 mostra a ligação de uma série de titulação de PB4188 FlTC para as células SKBR-3 pré-incubado com uma concentração saturada de PB4188, trastuzumab ou um anticorpo de controlo negativo. PB4188 Fm: liga-se de forma tão eficaz para SK-BR-3 na presen de anticorpo trastuzumab ou controlo.

[00249] A Figura 28 mostra a inibição da proliferação de células sob condições de stress por HRG anticorpos biespecíficos HER2xHER3 composta pelo mesmo braço HER3 Fab e diferentes braços HER2 que são dirigidos contra os quatro domínios HER2.

[00250] A Figura 29 mostra a combinação sinérgica de PB4188 com lapatinib no crescimento e morfologia de culas SK-BR-3. Esquerda, vistas microscópicas de células tratadas sob condições diferentes; alterações morfológicas direito plotados graficamente em relação às condições de tratamento

[00251] A Figura 30A + B: mostra a nibição da fosforilação mediada por HRG de N87 e culas SK-BR-3 por PB4188 em uma experiência ao longo do tempo. Trastuzumab + pertuzumabe e HRG sozinho foram incluídos como controlos.

[00252] A Figura 31: mostra a inibição da fosforilação mediada por HRG de células N87 por PB4188 em uma experiência ao longo do tempo. Trastuzumab + pertuzumabe e lapatinib foram incluídos como controles.

[00253] A Figura 32 mostra as alterações nos níveis de Akt e a fosforilação de Akt foram avaliados 4 h após uma bissemanal das quatro dose semanal de PB4188. níveis de fosforilação em lisados de tumor foram avaliadas por ensaios de Luminex. As análises foram realizadas em duplicado e cinco tumores foram analisados por grupo.

[00254] A Figura 33 mostra o efeito in vivo mediado de PB4188 em HER2: HER3 mediada sinalização, tal como analisado por análise Tag Vera em JIMT- um material tumoral. Os tumores foram analisados 4H após a dosagem, os tumores derivados de animais tratados com PBS foram incluídos como controlos.

[00255] A Figura 34 mostra que PB4188 reduz a progressão do ciclo celular. De células semeadas em meio de ensaio foram incubados com titulação de anticorpos na presença de um padrão (1 ng / ml) ou alta (/ ml 100 ng) concentração de HRG. 24 horas mais tarde (ou 48 horas para células MCF-7), foram analisadas células para a sua distribuição nas diferentes fases do ciclo celular (G0 / G1, S ou G2 / M fases). índice de proliferação foi calculada como a razão entre a percentagem de células no S e G2 / M fases e a percentagem de células na fase G0 / G1. P + T, pertuzumab + trastruzumab.

[00256] A Figura 35 mostra a internalização de anticorpos marcados com corante sensível ao pH em células cancerosas HER2 sobrexpressa. N87 (A, B) e SK-BR-3 (C, D) semeadas em meio de ensaio suplementado com 1 ng / ml HRG foram incubadas durante 24 horas com anticorpos 100 nM pH- sensíveis marcados com corante. Após a colheita, as células foram coradas com anticorpo secundário anti-IgG humano marcado com APC para detectar anticorpos ligados à superfície de células. As células foram analisadas por FACS quanto à fluorescência no PE (A, C) para determinar os canais de internalização e APC (B, D) para determinar a ligação dos anticorpos da superfície.

[00257] A Figura 36 mostra a atividade de ADCC de

Trastuzumab contra Trastuzumab + pertuzumabe com células derivadas a partir de dois doadores diferentes.

[00258] A Figura 37 mostra aminoácidos e nucleotídeos alinhamentos das variantes F3178. As regiões CDR estão indicadas.

[00259] A Figura 38 mostra as Curvas de titulação de anticorpos monoclonais contra HER3 no ensaio N87 dependente de HRG. PG6058, PG6061 e PG6065 são variantes de PG3178. PG1337 é um controle negativo específico para o toxóide do tétano. Os dados foram normalizados para a proliferação basal com ligando presente em cada placa.

[00260] A Figura 39 mostra os perfis de CIEX-HPLC de anticorpos monoclonais contra HER3. PG6058, PG6061 e PG6065 são variantes de PG3178. O ponto isoelétrico calculado (pi) da região VH e o tempo de retenção (tR) do pico principal são dados para cada anticorpo.

[00261] A Figura 40 mostra a combinação de droga in vitro isobologramas com PB4188 em linhagens celulares de HER2 amplificados em concentrações HRG de stress (A) ou cultivadas em matrigel (B).

[00262] A Figura 41 mostra a curva de crescimento do tumor para tumor subcutâneo (4 passagens) usado para a implantação intracraniana.

[00263] A Figura 42 mostra o sistema de pontuação edema cerebral. imagens de RM ponderadas em T2 representativas dos exemplos das dezenas edema cerebral de 0 a 4. As setas brancas indicam áreas tumorais e setas amarelas apontar edema.

[00264] A Figura 43 mostra o peso corporal e volume tumoral no momento da inclusão de camundongos no grupo AD. Não houve diferença no peso ou volume do tumor foi observada entre os grupos (ANOVA de uma via, p = 0,43 (peso corporal) e p = 0,92 (volume do tumor).

[00265] A Figura 44 mostra o Tumor pós volume de iniciação de terapia para os quatro grupos de tratamento. Sobrepostos é média ± EPM, N = 8-6 / grupo. Para cada grupo, o volume do tumor é traçado até ao momento em que, pelo menos, 6 animais estavam vivos.

[00266] A Figura 45 mostra o Corpo pós peso iniciação da terapêutica para os quatro grupos de tratamento, expressos em gramas (esquerda) e como percentagem de mudança de peso inclusão (direita). Apenas a média é representada graficamente significa, N = 8-6 / grupo. Para cada grupo, o peso corporal é traçado até ao momento em que, pelo menos, 6 animais estavam vivos.

[00267] A Figura 46 mostra o volume do tumor individual para os camundongos tratados com veículo, medida por ressonância magnética ponderadas em T2.

[00268] A Figura 47 mostra o volume do tumor individual para os ratos tratados com T-DM1 medidos por ressonância magnética ponderadas em T2.

[00269] A Figura 48 mostra o volume do tumor individual para os camundongos tratados com MCLA-128 medido por ressonância magnética ponderadas em T2.

[00270] A Figura 49 mostra o volume do tumor individual para os ratos tratados com T-DM1 + MCLA- 128 medido por ressonância magnética ponderadas por T2.

[00271] A Figura 50 mostra as imagens de RM ponderadas em T2 representativos de um rato do grupo A (M23). As imagens mostram coronal (topo) e fatias (inferior) axiais.

[00272] A Figura 51 mostra as imagens de RM ponderadas em T2 representativos de um rato do grupo B (M35). As imagens mostram coronal (topo) e fatias (inferior) axiais.

[00273] A Figura 52 mostra as imagens de RM ponderadas em T2 representativos de um rato do grupo C (M42). As imagens mostram coronal (topo) e fatias (inferior) axiais.

[00274] A Figura 53 mostra as imagens de RM ponderadas em T2 representativos de um rato do grupo D (M03). As imagens mostram coronal (topo) e fatias (inferior) axiais.

[00275] A Figura 54 mostra as medições de peso individuais para os camundongos tratados com veículo expressa em gramas (esquerda) e como percentagem de mudança de peso inclusão (direita).

[00276] A Figura 55 mostra as medições de peso individual para ratos tratados com T-DMl expresso em gramas (esquerda) e como percentagem de mudança de peso inclusão (direita).

[00277] A Figura 56 mostra as medições de peso individuais para os camundongos tratados com MCLA-128, expressos em gramas (esquerda) e como percentagem de mudança de peso inclusão (direita).

[00278] A Figura 57 mostra as medições de peso individual para ratos tratados com T-DM1 + MCLA-128, expressos em gramas (esquerda) e como percentagem de mudança de peso inclusão (direita).

[00279] A Figura 58 mostra a Pontuação do edema no cérebro no último MR digitalização para cada rato. O volume do tumor na altura da pontuação é diferente entre os grupos, e o volume do tumor pode influenciar o grau de edema cerebral. O volume médio do tumor de T-DM1 e T-DM1 + MCLA- 128 animais tratados foi menor em comparação com veículos ou MCLA-128 animais tratados. Como tal, os resultados devem ser interpretados com cuidado.

[00280] A Figura 59 mostra dados de sobrevivência Kaplan-Meier de todos os grupos. A sobrevivência mediana foi de 13, 19,5, 29, e 42 dias para os animais tratados com veículo, TDML, MCLA- 128, e T-DM1 + MCLA- 128, respectivamente. As curvas de sobrevivência foram significativamente diferentes (pO.0001, a Log-rank).

[00281] A Figura 60 mostra curvas de Kaplan-Meier de pares. A sobrevivência mediana mais significativa foi observada para os ratos tratados com T-DM1 (19,5 dias), MCLA- 128 (29 dias), e T-DM1 + MCLA-128 (42 dias), em comparação com os camundongos tratados com veículo (13 dias). Não houve diferença na sobrevivência mediana foi observada entre o t- DML e MCLA- 128 camundongos tratados. Os ratos tratados com T-DML + MCLA-128 tem uma sobrevivência significativamente maior tempo médio em comparação com os ratos tratados com T- DML ou MCLA- 128 sozinho.

[00282] A Figura 61 mostra Desenho de estudo para uma terapia de combinação (dupleto e tripleto) ensaio clínico.

[00283] A Figura 62 mostra a administração tratamento duplicato num ensaio clínico de terapia de combinação.

[00284] A Figura 63 mostra a administração tratamento triplicato no ensaio clínico de terapia de combinação.

EXEMPLOS Exemplo 1 Métodos, materiais e seleção de Anticorpos Linhagens celulares:

[00285] As linhagens celulares BxPC-3-Luc2 (Perkin Elmer 125058), N87 (ATCC CRL-5822 ™), SK-BR-3 (ATCC HTB-30 ™), BT-474 (ATCC HTB-20 ™), JIMT-1 (DSMZ ACC 589), L929 (Sigma Aldrich 85011425), K562 (DSMZ ACC10), HEK293T (ATCC 11268 -CRL- ™), CHO-Kl (DSMZ ACC110), MCF-7 (DSMZ ACC 115), MDA-MB -468 (# 300279-513, serviços de linha celular) SK-OV- 3 (ATCC HTB-77 ® ™), MDA-MB-175 (ATCC-HTB-25), MDA-MB-453 (ATCC-HTB- 131 ), MDA-MB-361 (ATCC-HTB-27), ZR-75- 1 (ATCC- 1500 o LCR) e MKN-45 (DSMZ ACC409) foram adquiridas a partir da ATCC, DSMZ ou Sigma Aldrich e rotineiramente mantidas em o meio de crescimento suplementado com soro fetal bovino a 10% inativado pelo calor (FBS). As células HEK293F Freestyle foram obtidas de Invitrogen e rotineiramente mantidas em meio 293 Freestyle. Geração de vetores de domínios trocados recombinantes humano, de galinha e de rato (clonagem de HER)

[00286] HER2 humano. O comprimento completo HER2 humano foi amplificado por PCR a partir de DNAc derivado a partir de RNA isolado a partir da linhagem celular de câncer da mama JIMT-1. Os iniciadores utilizados para a amplificação de HER2 humano foram como se segue. Iniciador direto: AAGCTGGCTAGCACCATGGAGCTGGCGGCCTTGTGC e iniciador reverso: AATAATTCTAGACTGGCACGTCCAGACCCAGG. O produto amplificado de comprimento completo foi digerido com NheI e XbaI e subsequentemente clonado nos locais correspondentes de pcDNA3.1 (Invitrogen).

[00287] A sequência foi verificada por comparação com a sequência de referência NCBI NM_004448.2. Para gerar construções que expressam apenas o domínio extracelular de HER2 humana (ECD) para transfecção e imunização efeitos do domínio transmembranar e HER2 ECD foram amplificados por PCR e novamente clonado em pVaxl. Para fins de transfecção outra construção foi gerada em pDisplay, amplificando o domínio HER2 ECD, nesta construção o domínio HER2 ECD é fundido com o domínio transmembranar de PDGFR.

[00288] HER3 humano. O comprimento total do clone de DNAc humano dela foi obtido a partir de Origene. Para gerar construções expressando unicamente o HER3 humano ECD para a transfecção e imunização efeitos do domínio transmembranar HER3 e ECD foram amplificados por PCR e novamente clonado em pVaxl. Além disso uma outra construção foi gerada em pVaxl através do qual o domínio DELA ECD foi fundido com o domínio transmembranar de PDGFR. Todas as sequências foram verificadas por comparação com o NCBI NM Referência .001982.3

[00289] domínio extracelular HER2 de Cinomolgus foi amplificado a partir de DNAc PCR cinomolgo - Macaco) tecido do cólon normal (Biochain). Os iniciadores utilizados para a amplificação de HER2 Cynomolgus foram como se segue: Iniciador direto: AAGCTGGCTAGCACCATGGAGCTGGCGGCCTGGTAC Iniciador inverso: AATAATTCTAGACTGGCACGTCCAGACCCAGG. O produto amplificado -comprmento completo foi digerido com Nhel-Xbal e subsequentemente clonado nos locais correspondentes de pcDNA3.1. O clone foi sequenciado e alinhada com sequências disponíveis de macacos rhesus (XM_002800451) para verificar a exatidão do clone de ErbB-

2.

[00290] domínio extracelular HER3 de Cinomolgus foi amplificado a partir de DNAc PGR cinomolgo - Macaco) tecido do cólon normal (Biochain). Os iniciadores utilizados para a amplificação de DELA cynomolgus foram como se segue: Iniciador direto: AAGCTGGCTAGCACCATGAGGGCGAACGGCGCTCTG, Iniciador inverso: AATAATTCTAGATTACGTTCTCTGGGCATTAGC O - comprimento completo do produto amplificado foi digerido com Nhel-Xbal e subsequentemente clonado nos locais de pcDNA3.1 correspondente. O clone foi sequenciado e alinhado com sequências disponíveis de macacos rhesus (ENSMMUP00000027321) para verificar a exatidão do clone de HER3.

[00291] A sequência de galinha HER2 foi baseada na sequência de referência NM_001044661.1. Construções de domínio trocado quiméricos foram gerados por troca de domínios I até IV da sequência de HER2 de galinha para os domínios I até IV humana. Sequências que contenham um marcador myc foram otimizadas para a expressão em células de mamíferos e sintetizado em Geneart.

[00292] A sequência HER3 de rato foi baseada na sequência de referência NM_001044661.1. Construções de domínio trocado quiméricos foram gerados por troca de domínios I até IV da sequência de HER3 de rato para os domínios I até IV humana. Sequências que contenham um marcador myc foram optimizadas para a expressão em células de mamíferos e sintetizado em Geneart.

Geração de linhagens celulares superexpressando HER2 e HER3

[00293] Para gerar linhas de células que expressam elevados níveis de HER3 sobre a superfície da célula de um vector de expressão de mamífero foi gerado por excisão a HER3 comprimento completo por uma digestão Noil e Kpnl. Subsequentemente, o fragmento foi clonado no vetor (-) higro locais de pcDNA3.1 correspondente. Um HER2 comprimento completo e vetor de expressão de HER3 que codifica um gene de resistência à neomicina foi usado para gerar linhagens de células que expressam elevados níveis de HER2 na superfície da célula. Antes de transfecção, os plasmídeos foram linearizados por uma digestão SspI e Fspl. Ambos os vetores foram transfectados separadamente em células K562 e conjuntos estáveis foram gerados seguindo seleção de antibiótico. As linhagens de células resultantes (K562-HER2 e HER3-K562) expressaram níveis elevados de HER2 e HER3 na sua superfície celular. Imunizações

[00294] Imunizações HER2. Quatro estratégias de imunização diferentes foram aplicadas. Para #A coorte, seis camundongos C57B1 / 6 foram imunizados com 2 X 106 células L929 transitoriamente transfectadas com HER2 em 200 μl via injeção intraperitoneal. Subsequentemente, os camundongos foram reforçados com 20 μg de ErbB-2-Fc (sistemas RND) proteína dissolvida em 125 μl Titermax ouro através de injeção intraperitoneal no dia 14, seguido de reforços com 2 XLO 6 L929 células transitoriamente transfectadas com HER2 em 200 μl no dia 28 e 42. Para #C coorte, seis camundongos

C57B1/6 foram imunizados com 2 X 106 células L929 transitoriamente transfectadas com HER2 por meio de injeção intraperitoneal. Subsequentemente, os camundongos foram reforçados com 2 XLO 6 L929 células transitoriamente transfectadas com HER2 em 200 μl através de injeção intraperitoneal no dia 14, seguido por um aumenta de proteína com 20 µg de proteína erbB-2-Fc dissolvidos em 125 μl Titermax ouro através de injeção intraperitoneal no dia 35 e um reforço final com 20 ug de proteína erbB-2-Fc dissolvidos em 200 μl PBS via injeco intraperitoneal no dia

49. Para #E coorte, seis camundongos C57B1 / 6 foram imunizados com 20 µg de proteína erbB-2-Fc dissolvidos em 125 μl Titermax ouro por meio de injeção intraperitoneal. Subsequentemente, aumenta a proteína com 20 µg de proteína erbB-2-Fc dissolvidos em 125 μl Titermax ouro através de injeção intraperitoneal foram feitas no dia 14 e 28 e um reforço final com 20 | ig de proteína erbB-2-Fc dissolvidos em 200 μl PBS via injeção intraperitoneal no dia 42. para #G coorte, seis camundongos C57B1 / 6 foram imunizados por vacinação com DNA em Genovac (Freiburg, Alemanha) de acordo com seus protocolos. Os vetores previstos livres de endotoxinas utilizados para a vacinação de DNA codificado transmembranar e parte extracelular de HER2 clonado em pVaxl.

[00295] Subsequentemente, aumenta de DNA foram dadas ao dia 14, 28 e 66.

[00296] Imunizações HER3. Quatro estratégias de imunização diferentes foram aplicadas. Para #B coorte, seis (C57B1 / 6) os camundongos foram imunizados com 2 XLO 6 L929 células transitoriamente transfectadas com DELA em 200 μl via injeção intraperitoneal. Subsequentemente, os camundongos foram reforçados com 2 XLO 6 L929 células transitoriamente transfectadas com DELA em 200 μl nos dias 14, 28, 49 e 63. Para #D coorte, seis camundongos C57B1 / 6 foram imunizados com 2 XLO 6 L929 células transitoriamente transfectadas com DELA através de injeção intraperitoneal no dia 0, 14 e 28. em seguida, os camundongos foram reforçados com 20 µg de proteína erbB-3-Fc dissolvidos em 125 μl Titermax ouro através de injeção intraperitoneal no dia 49 e um reforço final com 20 | ig de proteína erbB-3-Fc dissolvido em 200 μl PBS via injeção intraperitoneal no dia

66. Para #F coorte, seis camundongos C57B1 / 6 foram imunizados com 20 µg de proteína erbB-3-Fc dissolvidos em 125 μl Titermax ouro por meio de injeção intraperitoneal. Subsequentemente, os camundongos foram reforçados com 20 µg de proteína erbB-3-Fc dissolvidos em 125 μl Titermax ouro através de injeção intraperitoneal no dia 14 e 28 e um reforço final foi dada com 20 µg de proteína erbB-3-Fc dissolvidos em 200 μl PBS via intraperitoneal injeção no dia

42. para #H coorte, seis camundongos C57B1 / 6 foram imunizados por vacinação com DNA em Genovac (Freiburg, Alemanha) de acordo com seus protocolos. Os vectores previstas livres de endotoxinas utilizados para a vacinação de DNA codificado transmembranar de PDGFR e parte extracelular de DELA clonado em pVaxl.

[00297] Subsequentemente, aumenta de DNA foram dadas ao dia 14, 28 e 66. Determinação de títulos de anticorpo.

[00298] Os títulos anti-HER2 no soro a partir camundongos C57B1 / 6 imunizados foram determinados por ELISA contra ECD-erb B-2 da proteína (Bendermedsystems) e análise de FACS na K562 negativa HER2, a linhagem de células que expressam HER2 baixo MCF-7 e HER2 amplificado células SKBR- 3 e BT-474. Os títulos anti-HER3 no soro a partir imunizados camundongos C57B1 / 6 foram determinados por ELISA contra proteína erbB-3-Fc e análise de FACS na K562 HER3 negativo, a linha celular de HER2 baixo expressando MCF-7 e HER2 amplificado SK-BR-3 e BT -474 células.

[00299] Os títulos séricos contra HER2 e HER3 antes de sacrificar os animais estão descritos na Tabela 1 e Tabela 2, respectivamente. Os animais em todos os grupos desenvolveram respostas de anticorpos contra HER2 ou dela. Recuperação do tecido linfoide.

[00300] Baço e os nódulos linfáticos de drenagem foram removidos a partir de todos os ratos vacinados com DNA (coortes #G e #H). As suspensões de células individuais foram gerados a partir de todos os tecidos e, subsequentemente, os tecidos foram lisados em reagente Trizol. De coortes #A até baços #f foram removidos a partir de todos os camundongos, exceto para um camundongo de #C coorte que morreram após o primeiro impulso. As suspensões de células individuais foram geradas a partir de todos os baços e a fracção de células B total foi isolado utilizando o procedimento MACS separação, quer por CD 19 de enriquecimento (coortes # A, E, F) ou a depleção de células não-B (coortes # B, C, D). Geração de bibliotecas de apresentação de fagos a partir de camundongos imunizados

[00301] Uma biblioteca de fagos foi construída para cada rato. Para este fim o material a partir de todos os murganhos por grupo (5 ou 6 ratos por grupo) foi usada para preparar bibliotecas de fagos utilizando a seguinte abordagem. A partir de cada indivíduo, RNA de camundongo foi isolado e o DNAc foi sintetizado e VH-família foram realizadas PCRs específicas. Subsequentemente todos os produtos de PCR VH-familiar per rato foram purificados e a concentração de DNA foi determinada e digerido e ligado num vetor de fagos contendo a cadeia leve comum para gerar uma biblioteca de fago quimérico humano-camundongo. Todas as bibliotecas de fagos continha > 106 clones com uma inserção de frequência > 85%. Seleção de fagos que transportam fragmentos Fab que se liga eespecíficoamente a HER2 e HER3

[00302] Os fragmentos de anticorpo foram selecionados utilizando bibliotecas de apresentação de fagos de anticorpos.

[00303] As bibliotecas imunizadas e bibliotecas sintéticas (como descrito em de Kruif et al., Mol. Biol. (1995), 248, 97-105) foram utilizados para as seleções. Seleção de fagos HER2 e triagem

[00304] As bibliotecas de fagos foram resgatadas com VCS-M13 fago auxiliar (Stratagene) e selecionada para duas rodadas em imunotubos (Nunc) revestidas com proteína recombinante. Na primeira ronda ECD-erb B-2 da proteína (Bendermedsystems) foi revestida sobre imunotubos, enquanto que no segundo turno ErbB-2-Fc (sistemas RND) foi usado para revestir imunotubos. Os imunotubos foram bloqueados com leite seco desnatado a 4% (ELK). As bibliotecas de anticorpos de fagos também foram bloqueadas com 4% ELK antes da adição da biblioteca de fagos para os imunotubos.

A incubação com a biblioteca de fagos com a proteína revestida nos tubos imunes foi realizada durante 2 horas a temperatura ambiente sob condições de rotação.

Imunotubos foram, em seguida, lavou-se cinco a dez vezes com 0,05% de Tween-20 em PBS seguido por 5 a 10 vezes em PBS.

Os fagos ligados foram eluídos utilizando glicina 50 mM (pH 2,2) e adicionado a E. coli XL-1 Blue e incubou-se a 37 ° C durante a infecção do fago.

Subsequentemente, as bactérias infectadas foram semeadas em placas de agar contendo ampicilina, tetraciclina e glucose e incubou-se a 37 ° C durante a noite.

Após o primeiro ciclo, as colónias foram raspadas das placas e combinados e depois resgatado e amplificado para preparar uma primeira biblioteca enriquecida rodada.

A biblioteca foi então selecionada enriquecida em erbB-2-Fc (sistemas RND) utilizando o protocolo descrito acima.

Depois da segunda ronda de seleção de clones individuais foram colhidos e resgatado para preparar uma miniprep de fago monoclonal.

Os clones de fagos positivos ErbB2 de ligação foram, em seguida, identificou em FACS para a ligação à linha de células do câncer da mama BT-474. Os genes de VH de todos os clones específicos ErbB2 foram sequenciados.

Os rearranjos de genes VH foram estabelecidas com software VBASE2 para identificar clones únicos.

Todos os clones originais foram então testados no formato de fagos para a ligação em FACS para células HEK293T (controlo negativo), células HEK293T transientemente transfectadas com células ErbB-2 e BT-474. Seleção de fagos HER3 e triagem

[00305] As bibliotecas de fagos foram resgatadas com VCS-M13 fago auxiliar (Stratagene) e selecionada para duas rodadas em imunotubos (Nunc) revestidos com proteína recombinante. Em ambas as fases de seleção redondos ErbB-3- Fc (sistemas RND) foi usado para revestir imunotubos. Para ultrapassar um preconceito seleção para a parte Fc da proteína de fusão, tanto seleção rodadas em erbB-3-Fc foram realizadas na presença de 150 ug / ml de IgG humano. Os imunotubos foram bloqueadas com 4% ELK. bibliotecas de anticorpos de fagos foram bloqueadas com 4% ELK antes da adição da biblioteca de fagos para os imunotubos. A incubação com a biblioteca de fagos foi realizada durante 2 horas sob condições de rotação. Imunotubos foram, em seguida, lavou- se cinco a dez vezes com 0,05% de Tween-20 em PBS seguido por 5 a 10 vezes em PBS. Os fagos ligados foram eluos utilizando glicina 50 mM (pH 2,2) e adicionado a E. coli XL- 1 Blue e incubou-se durante a infecção do fago. Subsequentemente, as bactérias infectadas foram semeadas em placas de agar contendo ampicilina, tetraciclina e glucose e incubou-se a 37 ° C durante a noite.

[00306] Após o primeiro ciclo, as colónias foram raspadas das placas e os fagos foram combinadas e resgatado e amplificado para preparar uma primeira biblioteca enriquecida rodada. A biblioteca foi então selecionada enriquecida em erbB-3-Fc (sistemas RND) utilizando o protocolo descrito acima. Depois da segunda ronda de seleção de clones individuais foram colhidos e resgatado para preparar uma miniprep de fago monoclonal. Os clones de fagos positivos foram identificados em FAGS para a ligação à linhagem de células do câncer da mama BT-474. Os genes de VH de todos os clones positivos foram sequenciados. Os rearranjos de genes VH foram estabelecidas com software VBASE2 para identificar clones únicos. Todos os clones originais foram testados no formato de fagos para a ligação em FACS para células K562 (controlo negativo), células K562- HER3 estáveis e células BT-474.

[00307] No total 36 seleções foram realizadas em ErbB2 e ErbB3 formatos de antígeno. Todos os procedimentos de rastreio de seleção resultaram em 89 clones Fab únicas dirigidas contra HER2 e 137 clones de Fab únicas dirigidas contra HER3. Um Fab foi considerado única base na sua sequência HCDR3 único, uma indicação de um único evento de recombinação VDJ. Em alguns casos foram obtidas variantes clonais, com um HCDR3 idêntica, mas diferenças na CDR1 e / ou CDR2. A partir das bibliotecas ratos imunizados grupos de variantes clonais que contêm substituições no gene VH refletindo variantes de afinidade foram selecionados. Seleção / caracterização de anticorpo Geração de anticorpos monoclonais

[00308] Genes de VH de anticorpos únicos, como julgado pela sequência do gene de VH e alguma sequência suas variantes, derivados a partir das bibliotecas de fago de camundongo imunizados foram clonados no esqueleto do vector IgGl. Duas linhas celulares de produção diferentes foram usados durante o processo; Células HEK293T e 293F Freestyle. Células HEK293T aderentes foram cultivadas em placas de 6 poços até uma confluência de 80%. As células foram transitoriamente transfectadas com a mistura de DNA-Fugene indivíduo e ainda cultivados. Sete dias após a transfecção, o sobrenadante foi colhido e o meio foi refrescado. Catorze dias após a transfecção os sobrenadantes foram combinados e filtrados através de 0,22 μΜ (Sartorius). O sobrenadante foi esterilizado e armazenado a 4 ° C. Suspensão adaptado 293F células Freestyle foram cultivadas em frascos T125 num patamar agitador até uma densidade de 3,0 x 106 células / ml. As células foram semeadas a uma densidade de 0,3-0,5 x 106 células viáveis / mL em cada poço de uma placa de 24 poço de profundidade. As células foram transitoriamente transfectadas com o DNA estéril individual: mistura PE1 e depois cultivados. Sete dias após a transfecção, o sobrenadante foi colhido e filtrado através 0,22 μΜ (Sartorius). O sobrenadante foi esterilizado e armazenado a 4 ° C. Geração de anticorpos biespecíficos

[00309] Os anticorpos biespecíficos foram produzidos utilizando a tecnologia CHS proprietárias para assegurar eficiente heterodimerização e à formação de um anticorpo biespecífico. A tecnologia utiliza CHS mutações pontuais baseadas em carga na região CH3 para permitir o emparelhamento eficiente de duas moléculas diferentes de cadeias pesadas tal como anteriormente descritos (PCT / NL2013 / 050.294; publicada como WO 2013/157954 Al). Purificação de IgG para o rastreio funcional

[00310] A purificação de IgG foi realizada em pequena escala (<500 ug), escala média (<10 mg) e em larga escala (> 10 mg) utilizando cromatografia de afinidade. purificações de pequena escala foram realizados sob condições estéreis em placas de 24 poços utilizando filtros de filtração sob vácuo. Primeiro, o pH do meio foi ajustado para pH 8,0 e, subsequentemente, as produções de pequena escala foram incubados com esferas de proteína A-Sepharose CL-4B (50% v / v) (Pierce) durante 2 h a 25 ° C em uma plataforma com agitação a 600 rpm (agitador de placas Heidolph). Em seguida, as esferas foram recolhidas por filtração a vácuo. As esferas foram lavadas duas vezes com PBS pH 7,4. IgG foi elua a pH 3,0 com tampão de citrato 0,1 M e a fracção de IgG foi de imediato neutralizada por Tris pH 8,0. troca de tamp foi realizada por centrifugação usando multiscreen Ultracel 10 multiplates (Millipore). As amostras terminaram num tampão final de PBS pH 7,4 Validação de HER2 / HER3 IgGs específico

[00311] Os anticorpos foram testados para a ligação em FACS para BT-474, HEK293T e HEK293T que super-expressam HER3 ou HER2. Portanto, as células foram colhidas utilizando tripsina e diluiu-se para 10 ° células / ml em tampão FACS (PBS / 0,5% de BS A / 0,5 mM de EDTA). 1-2 χ 105 células foram adicionadas a cada poço em uma placa de fundo em U de 96 cavidades. As células foram centrifugadas durante 2 minutos a 300 g a 4 ° C. O sobrenadante foi descartado por inversão da placa (s). 50 μl de cada amostra de IgG foi adicionado a uma concentração de 10 μg / ml e incubadas durante 1 h em gelo. As células foram centrifugadas uma vez, o sobrenadante foi removido e as células foram lavadas duas vezes com tampão de SCAF. 50 μl diluído 1: 100 de camundongo anti IgG humana PE (Invitrogen) e incubou-se durante 30-60 minutos em gelo no escuro. Após a adição de tampão de SCAF,

as células foram centrifugadas uma vez, o sobrenadante foi removido e as células foram lavadas duas vezes com tampão de SCAF. As células foram analisadas num citômetro de fluxo FACSCanto num ambiente HTS. A ligação dos anticorpos às células foi avaliada pela intensidade média de fluorescência (MFI).

[00312] Para testar ensaios de ELISA para reatividade de ligação não específicos foram usadas. anticorpos HER2 e HER3 foram testados quanto a reatividade contra a toxina antígenos fibrinogénio, hemoglobulina e tétano. Para testar a ligação específica a HER2 e dela, os anticorpos foram testados quanto à ligação a domínios extracelulares recombinantes purificadas de EGFR, HER2, HER3 e HER4. Os antígenos foram revestidos durante a noite a placas de ELISA ™ MAXISORP. Poços das placas de ELISA foram bloqueadas com PBS (pH 7,2) contendo 5% de BSA durante 1 hora a 37 ° C. Os anticorpos selecionados foram testados em duplicado em uma concentração de 10 μg / ml diluído em PBS-BSA a 2% e deixado a ligar durante 2 horas a 25 ° C. Como um controlo do procedimento foi realizado simultaneamente com um anticorpo específico para os antígenos revestidos e um anticorpo de controlo negativo. As placas de ELISA foram lavadas 5 vezes com PBS-T (PBS-0,05% v / v de Tween 20). IgG ligada foi detectada com 1: 2000 diluído HRP-conjugado (anticorpo de cabra anti rato-BD) e foi deixada ligar-se durante 2 horas a 25 ° C. As placas de ELISA foram lavadas 5 vezes com PBS- T (PBS-0,05% Tween 20) e a IgG ligada foi detectada por meio de medição OD492nm. Agrupamento epítopo de HER2 / HER3 IgGs específico

[00313] O painel de anticorpos anti-HER2 foi finalmente resolvido com base na sua reatividade com a HER2 ECD derivadas de outras espécies (rato, galinha) e sobre a sua ligação a domínios específicos na molécula HER2 ou seja, os domínios I, II, III e IV, utilizando construções quiméricas.

[00314] O painel de anticorpos anti-HER3 foi finalmente resolvido com base na sua reatividade com a HER3 ECD derivadas de outras espécies (cyno, rato) e sobre a sua ligação a domínios específicos na molécula DELA ou seja, os domínios I, II, III e IV, utilizando construções quiméricas.

[00315] Para este efeito, as células CHO-K1 foram transfectadas transitoriamente com as construções relevantes usando misturas Lipofectamin / DNA. Na construção de domínio permutado quimérico, domínios de HER2 HER3 galinha ou de rato são substituídos pela contraparte humana. A ligação dos anticorpos específicos foi medida por FACS. Expressão das construções foi confirmada usando um anticorpo anti-myc. coloração FACS com trastuzumab foi incluído como um controlo para a ligação específica ao domínio IV.

[00316] Os anticorpos em cada grupo poderiam ser classificados com base na intensidade de coloração (MFI). O painel de 65 anticorpos HER2 pode ser mapeado em sete caixas (Tabela 3).

1. Domínio I específico (25)

2. Domínio II específico (2)

3. Domínio III específico (23)

4. Domínio IV específico (7)

5. Domínio IV específico e reação cruzada reativa para rato (2)

6. reativa para todas as construções (2)

7. Apenas reativo a HER2 humano (4) Competição com trastuzumab

[00317] Dois anticorpos de domínio mapeados para HER2 IV inibiu a proliferação de células SK-BR-3. Ambos os anticorpos compartilharam uma CDR3 semelhante exceto para uma diferença de aminoácidos. Um anticorpo, PG1849 foi investigada pela sua capacidade para competir com trastuzumab em uma competição de ELISA. Neste ELISA Fc-HER2 foi revestida e incubada com uma concentração de 15 μg de anticorpo IgG ml. Após uma incubação de 15 minutos, os fagos foram deixados a incubar durante mais uma hora. Depois disso, os fagos foram detectados. A Tabela 4 demonstra que PG1849 e trastuzumab pode ligar simultaneamente a HER2 uma vez que não há perda de sinal apareceu durante a ELISA. Verdadeiro competição foi observada apenas quando o mesmo fago e o anticorpo foram combinados no ensaio.

[00318] O painel de HER3 de 124 anticorpos poderiam ser mapeados em cinco caixas (Tabela 5):

1. Domínio III alta reatividade, de rato e de camundongo reatividade reativo e menor para o domínio IV (8)

2. Alta reatividade Domínio III, rato, humano e cinomolgo reactiva, a reatividade menor para o domínio IV (8)

3. Apenas reatividade de rato, cinomolgo e dela humano (43)

4. Apenas reactivo para HER3 humano (32)

5. reativa para todas as construções (33)

Ensaios de proliferação de linhagem celular

[00319] Células SK-BR-3 foram cultivadas em DMEM-F / 12 suplementado com L-glutamina e 10% de FBS inativado pelo calor. Células BxPC-3-Luc2 foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS inativado pelo calor. As células MCF-7 foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 100 μΜ, NEAA1 piruvato de sódio, 4 µg/ml de insulina e 10% de FBS inativado pelo calor.

[00320] Para o ensaio de proliferação de células SK- BR-3, culturas de células subconfluentes foram lavadas com PBS, tripsinizadas e tripsina foi inativada pela adição de meio de cultura. As células foram diluídas para 6xl0 4 células / ml em meio de cultura. Os anticorpos foram diluídos para as concentrações de 10 e 1 μ / ml e adicionadas num volume de 100 μΐ em placas de 96 poços de fundo preto (ABgene AB-0932). As células foram adicionadas a uma densidade de 6000 células / poço. As células foram cultivadas durante 3 dias a 37 ° C, 5% de CO2, em 95% de umidade relativa. Alamar Blue ™ (Invitrogen) foi adicionado de acordo com as instruções do fabricante e incubaram-se durante 6 horas a 37 ° C, 5%) de CO, com 95% de humidade relativa no escuro. A fluoresccia foi medida a 550 nm de excitação e 590 de comprimento de onda de emissão de execução. A extensão de inibição de crescimento foi comparada com a da mesma concentração de trastuzumab (Tabela 6).

[00321] Para o ensaio de proliferação de células MCF- 7 e células BxPC-3-Luc2, culturas de células subconfluentes foram lavadas com PBS, tripsinizadas e tripsina foi inativada pela adição de meio de cultura. As células foram lavadas duas vezes em grandes volumes de meio de ensaio (RPMI 1640 contendo 0,05% de BSA e 10 ug / ml de transferrina Holo).

[00322] As células MCF-7 foram diluídas para 5xl0 4 células / ml em meio de cultura. Os anticorpos foram diluídos para as concentrações de 10 e uma μ§ / ηι1 e adicionados num volume de 100 μl em placas de 96 poços de fundo preto (ABgene AB-0932). As células foram adicionadas a uma densidade de 5000 células / poço na presença de 1 ng / ml de concentração final humano recombinante humano NRGl-beta 1 / HRGl-beta 1 EOF Domínio; (396-HB-050 RND). Humana NRGl-beta 1 / HRGl- beta 1 de EGF Domínio será daqui em diante referido como HRG. As células foram cultivadas durante 5 dias a 37 ° C, 5%) de CO, com 95% de humidade relativa. Alamar Blue ™ (Invitrogen) foi adicionado de acordo com as instruções do fabricante e incubaram-se durante 24 horas a 37 ° C, 5% C02, em 95% de humidade relativa no escuro. A fluorescência foi medida a 550 nm de excitação com comprimento de onda de 590 nm de emissão. A extensão de inibição de crescimento foi comparada com a da mesma concentração de # AB6 (Tabela 7).

[00323] Os ensaios de proliferação BxPC-3-luc-2 foram utilizados para rastrear os anticorpos biespecíficos. BxPC- 3-luc-2 foram diluídos a 8xl0 4 células / ml em meio de cultura. Os anticorpos foram diluídos para as concentrações de 10 e 1 µg / ml e adicionadas num volume de 100 μl em placas de 96 poços de fundo preto (ABgene AB-0932). As células foram adicionadas a uma densidade de 8000 células / alvéolo na ausência ou na presença de 10 ng / ml concentração HRG humana final. As células foram cultivadas durante 4 dias a 37 ° C, 5% de CO2, em 95% de umidade relativa. Alamar Blue ™ (Invitrogen) foi adicionado de acordo com as instruções do fabricante e incubaram-se durante 4 horas a 37 ° C, 5% de CO, em 95% de humidade relativa no escuro. A fluorescência foi medida a 550 nm de excitação com comprimento de onda de 590 nm de emissão.

[00324] Para minimizar os efeitos de borda, os poços exteriores das placas de 96 poços foram completamente preenchidos Ranking de afinidade de HER2 IgGs específico

[00325] Utilizou-se o método descrito por Devash (PNAS, 1990) para classificar os anticorpos em um antígeno- ELISA limitado. O uso de redução das concentrações de antígeno de revestimento elimina observadas reações atividade -re transversais e pode ser utilizado para detectar anticorpos / avidez de alta afinidade. Por conseguinte, a concentração de antígeno no suporte sólido foi gradualmente diminuída para investigar as atividades imunorreatividade fracos. Uma titulação de série de proteína ECD-erb B-2 a partir de 2,5 ng / ml até 0,019 µg/ml foi revestido durante a noite em placas de ELISA ™ MAXISORP. Poços das placas de ELISA foram bloqueadas com PBS (pH 7,2) contendo 5% de BSA durante 1 hora a 37 ° C. Os anticorpos selecionados foram testados em duplicado em uma concentração de 10 ug / ml diluído em PBS-BSA a 2% e deixado a ligar durante 2 horas a 25 ° C. Como um controlo do procedimento foi realizado simultaneamente com um anticorpo específico para os antígenos revestidos e um anticorpo de controlo negativo. As placas de ELISA foram lavadas 5 vezes com PBS-T (PBS-0,05%

v / v de Tween 20). IgG ligada foi detectada com 1:2000 diluído HRP-conjugado (IgG anti-camundongo de cabra, BD Biosciences) e foi deixada ligar-se durante 2 horas a 25 ° C. As placas de ELISA foram lavadas 5 vezes com PBS-T (PBS- 0,05% Tween 20) e a IgG ligada foi detectada por meio de medição OD492nm. PG1849, PG2916, PG2926, PG2930, PG2971, PG2973, PG3004 PG3031 e foram testados num antígeno HER2 titulação de ELISA (Fig. 1). Ligação de genes de VH de HER2 com várias cadeias leves kappa

[00326] Para investigar a ligação de HER2 VHS derivado de apresentação em fagos diferentes bibliotecas um painel de anticorpos de HER2 foi clonado e expresso no contexto de uma outra cadeia kappa VK, ou seja, a VL do MEHD7945A. IgG produzidas foram sujeitas a análise FACS em células K562 e células K562-HER2 estáveis. genes de VH derivadas das bibliotecas combinatórias e bibliotecas não combinatórias estão listados na Tabela 8. As cadeias VH de MF2971, MF3958, MF2916, MF2973, MF3004, MF3025, MF3031 todas poderiam ser combinados com a cadeia leve MEHD7945A sem perder a eespecíficoidade de antígeno e de ligação significativa como observado quando combinado com a cadeia leve IGKV1-39 comum. A cadeia VH de MF1849 não foi capaz de se combinar com a cadeia leve kapa e variante retêm a eespecíficoidade de antígeno e de ligação. Outros anticorpos de HER2 e HER3

[00327] Os anticorpos que inibem a função de HER2 HER3 ou são conhecidos no estado da técnica.

[00328] Outros anticorpos foram construídos de acordo com a informação publicada e expressos em células 293F

Freestyle. Os anticorpos anti-HER2 pertuzumab e trastuzumab foram gerados com base na informação divulgada no documento US2006 / 0212956 Al (Genentech). O anti-HER3 anticorpo # AB6, baseou-se na informação divulgada no documento WO 2008/100624 (Merrimack Pharmaceuticals, Inc.) e novamente clonado em um vetor IgGl volta osso. A informação dos anticorpos anti-HER3 e 1-53 Ul-59 foi obtido a partir de US 7,705, 103 B2 (U3 Pharma AG). A informação de que o anticorpo anti-HER3 LJM716 foi obtido a partir de US 2012/0107306. A informação para a construção do anticorpo anti-EGFR, anti- HER3 MEHD7945A anticorpo dois-em-um obteve-se a partir de WO2010 / 108127. Rastreio de anticorpos biespecíficos HER2 x HER3

[00329] VH a partir do painel de anticorpos a HER2 e HER3 foram novamente clonadas nos vectores modificados carregados de tal forma que após a expressão do anticorpo cadeias pesadas heterodimerização das cadeias pesadas é forçado resultando na geração de anticorpos biespecíficos após a transfecção. Três estratégias diferentes foram usadas na combinação de HER2 e dela braços em formato IgG biespecífica:

1. HER2 (bloqueando o crescimento independente do ligante) xHER3 (bloqueando o crescimento independente de ligante)

2. HER2 (bloqueando o crescimento independente de ligante) xHER3 (bloqueando o crescimento dependente do ligante)

3. HER2 a partir de diferentes posições no epítopo x HER3 (bloqueando o crescimento dependente do ligante)

[00330] Em algumas combinações biespecíficos, anticorpos gerados no grupo 2 e 3 sobreposto com grupo 1.

[00331] Um total de 495 anticorpos biespecíficos foi produzida no formato de 24 poços e purificada. Todos os anticorpos foram testados quanto à sua capacidade para inibir a proliferação do HER2 e HER3-expressando linhagem celular pancreática BxPC-3-2-luc (Caliper). A potência dos anticorpos foi determinada em uma configuração HRG- dependente e HRG-independente num rastreio preto e branco com anticorpos estar presente a uma concentração de 10 e 1 ng / ml. Trastuzumab foi incluído como um anticorpo de referência, bem como um anticorpo de controle negativo, nas mesmas concentrações. A atividade funcional de topo 80 biespecíficos HER2 x HER3 (com base na inibição combinada) a 1 µg / ml é mostrado na Figura 2.

[00332] Os anticorpos (40 no total) que mostraram uma atividade inibidora mais elevada em comparação com o anticorpo de controle positivo foram selecionados, reproduzidos e purificados num formato de 24 poços e testadas novamente no-luc BxPC-3-2 ecrã preto-e-branco no 10 e 1 ug / ml concentrações. Estes anticorpos foram ainda titulados em ensaio HRG-dependente MCF-7 e em comparação contra a combinação de trastuzumab e pertuzumab (1:1) e um anticorpo de controle negativo. A Figura 3 mostra um exemplo das curvas de titulação de três anticorpos biespecíficos, em comparação com o anticorpo parental HER3 e a combinação de trastuzumab + pertuzumab. Os anticorpos monoclonais parentais são mostrados no painel de topo e os anticorpos biespecíficos são mostrados no painel inferior. (Figura 3).

[00333] O Ic50 para o biespecífico, anticorpos monoclonais e anticorpos comparadores foi calculado usando a análise de regressão não-linear com o software Prism. software Graph Pad lista os valores de IC00 dos anticorpos biespecíficos no ensaio de células MCF-7 e a sua atividade inibitória no ensaio BxPC3 para comparação. Um painel de 12 anticorpos biespecíficos HER2 x HER3 tinha uma atividade inibidora mais potente em comparação com trastuzumab + pertuzumab. Além disso, os anticorpos biespecíficos foram igualmente ou mais potentes do que o PG3178 monoclonal parental (Tabela 9).

[00334] Os anticorpos biespecíficos que inibiram o crescimento de células dependentes de ligando foram feitos de braços HER2 em combinação com os braços HER3 3178, 3163, 3099 e 3176. Tanto a HER2 e dela os braços de biespecíficos mais potentes eram como um anticorpo monoclonal bivalente também capaz de inibir ligante-proliferação de SK-BR-3 independente (tanto a HER2 e dela braços) (Tabela 6) ou MCF- 7 a proliferação dependente de ligando (dela braços) (Tabela 7). A maioria dos anticorpos potentes era composta por um braço de HER2 que reconhece o domínio I em combinação com anti-HER3 anticorpo 3178. Inibição do crescimento do tumor BxPC-3-Luc2

[00335] Os anticorpos descritos na Tabela 9 foram testadas num modelo de xenoenxerto de pâncreas BxPC-3-Luc2. A linha de células BxPC-3-Luc2 expressa tanto HER2 e HER3 e é considerada uma linha celular expressando HER2 baixo. Camundongos fêmea CB17 SCID, com 8-10 semanas de idade no início do estudo foram enxertados ortotopicamente no pâncreas com l x 106 células tumorais em 20μ1. Para este objetivo, os camundongos foram anestesiados e colocada sobre o lado direito para expor o lado esquerdo e um 0,5 centímetros. Foi feita uma incisão na região do flanco esquerdo. O pâncreas e baço foram exteriorizados e lxlO 6 células tumorais em 20μ1 foi injetado no espaço sub- capsulariamente da cauda pâncreas. Uma semana após a implantação, a bioluminescência (BLI) de dados foram gerados. 15 minutos antes da imagiologia, todos os camundongos receberam injeções ip de 150 mg kg de luciferina (D-luciferina-EF sal de potássio, Cat. # E6552, Promega). BLI imagiologia foi realizada uma vez ou duas vezes por semana utilizando a vista lateral esquerda. Animais outlier - com base no BLI / tumor VOLUME- foram removidos e os camundongos foram distribuídos aleatoriamente em grupos de sete murganhos cada. No dia experimental 8, o tratamento foi iniciado. Os animais no grupo de tratamento com anticorpo foram doseados semanalmente durante 3 semanas consecutivas (dias 0, 7, 14 e 21) com 30 mg / kg de anticorpo. No dia 0 do tratamento, os animais receberam duas vezes a dose de carregamento, ou seja, 60 mg / kg de anticorpo. A imagem final foi realizada no dia 31.

[00336] Dois modelos de xenoenxerto BxPC-3-Luc2 foram executados com um painel diferente de anticorpos biespecíficos e anticorpos parentais Na-Luc2 BxPC-3 modelo de xenoenxerto de primeira (Figura 4), um grupo recebeu o controlo negativo de anticorpo anti-RSV (Ctrl IgG), um grupo recebeu o anticorpo trastuzumab controle e um grupo recebeu o anticorpo trastuzumab controlo positivo + pertuzumab (1:

1 v / v). Os sete grupos restantes receberam uma das monoclonal (PG) ou biespecífico (PB) anticorpos PG3004, PG3178, PB3566, PB3710, PB3443, PB3448 e PB3441. Detalhes da composição dos anticorpos biespecíficos são apresentados na Tabela 9.

[00337] Todos os cinco anticorpos biespecíficos testados foram capazes de inibir o crescimento do tumor. A massa média do tumor (BLI) de HER2 biespecífico de anticorpo animais tratados x HER3 foi semelhante à que nos animais tratados com a combinação de trastuzumab + pertuzumab.

[00338] No segundo modelo de xenoenxerto BxPC-34uc2 (Figura 5), um grupo recebeu o anticorpo de controlo negativo anti-RSV (Ctrl IgG) e um grupo recebeu o anticorpo de controlo positivo combinação trastuzumab + pertuzumab (1:1 v / v). Os cinco grupos remanescentes receberam um dos anticorpos PG3163, PB3986, PB3990, PB4011 e PB3883. Para mais detalhes sobre os anticorpos biespecífico PB: Tabela 9. Estes anticorpos biespecíficos continha três braços de ligação HER3 diferentes combinadas com o mesmo MF2971 braço HER2 e HER2 um braço suplementar combinada com a ligação MF3163 braço HER3. Neste experimento, os tumores no grupo de controlo não mostraram o mesmo nível de crescimento acelerado, como na primeira experiência complicando a interpretação dos resultados. No entanto, em comparação com o trastuzumab + pertuzumab o PB3883 e PB3990 biespecíficos HER2xHER3 teve atividades inibidoras semelhantes (Fig. 5).

[00339] Com base na in vivo e in vitro de dados de um painel de anticorpos biespecífico foi selecionado dos quais os braços de HER2 foram feitos de MF2971, MF3004, MF1849 e o braço dela era composta de MF3178. O braço MF2971 e MF3004 eram de origem de rato e foram humanizados. Ligação do anticorpo biespecífico HER2 x HER3 comparados com os anticorpos monoclonais parentais

[00340] A ligação de anticorpos biespecíficos HER2xHER3, em comparação com as suas contrapartes parentais foi determinada por análise de FACS. A FACS foi realizada em células BxPC-3-Luc2 e células MCF-7 com uma série de titulação de anticorpos que varia de 2,5 µg / ml - 0, 01 µg / ml. O painel de anticorpos foi testado composto do PB3566 anticorpo biespecífico e seus anticorpos parentais o anticorpo anti-HER3 PG3178 e o PG3004 anticorpo anti-HER2. Os dados de MFI foram representados graficamente e os gráficos em ambas as linhas de células mostram que o PB3566 biespecífico se liga de forma mais eficaz a ambas as linhas de células de tumor em comparação com o anti-HER3 PG3178 anticorpo e o PG3004 anticorpo anti-HER2. (Fig. 6) Humanização do MF2971 e MF3004

[00341] MF2971 e MF3004 foram humanizados de acordo com a tecnologia conhecida na especialidade. Um total de sete sequências variantes humanizados / imunizado-de de MF2971 foram expressas, validado e caracterizada in vitro, como anticorpos monoclonais e em combinação formato biespecífico com o anticorpo específico MF3178-HER3. O mesmo foi feito para sete sequências variantes de MF3004, que foram criadas por substituição de HCDR3 de MF2971 nos sete MF2971 variantes com a HCDR3 de MF3004. Analisou-se a expressão, a integridade, a estabilidade térmica e atividade funcional de todos os variantes humanizados. Com base na produção, a integridade, a estabilidade e integridade funcionalidade, foi escolhida uma variante de MF2971 (2971-var2) como a variante humanizada óptima de VH para ser usado em um formato biespecífico com MF3178. Este 2971-var2 foi renomeado MF3958. A combinação biespecífico HER2xHER3 MF3958xMF3178 resultou m PB4188. Produção em larga escala, purificação e estudos analíticos de PB4188

[00342] Suspensão adaptada de células 293F Freestyle foram cultivadas em frascos de Erlenmeyer a uma planalto agitador até uma densidade de 3,0 x 106 células / ml. As células foram semeadas em frascos de 4 L Erlen a uma densidade de 0,3 - 0,5 x 106 células viáveis / ml. As células foram transitoriamente transfectadas com o DNA estéril individual: mistura PE1 e depois cultivados. Sete dias após a transfecção, o meio condicionado contendo o anticorpo biespecífico foi colhido por centrifugação a baixa velocidade, 5 minutos, 1,000 g, seguido por centrifugação a alta velocidade, 5 minutos a 4000g. Meio condicionado recolhido foi concentrado através de um cassete hydrosart 5 kDa Satorius para cerca de 600 mL e subsequentemente diafiltrada contra 4 L de PBS. Os anticorpos foram ligados em coluna para - 35 mL MabSelectSure XL (11° C). A- eespecíficoamente proteínas ligadas foram removidas por lavagem da coluna em modo de fluxo invertido com 150 ml de PBS, 150 ml de PBS contendo 1 M de NaCl, 100 ml de PBS. Os anticorpos ligados foram eluídos utilizando 100 Nim citrato de pH 3,0 em modo de fluxo inverso e 5 ml de frações foram recolhidas em tubos de 10 ml contendo 4 ml lTris pH 8,0 para a neutralização. Os anticorpos eluídos foram ainda purificado por filtração em gel utilizando Superdex 200 50/1000. Anticorpo Thepurified foi filtro- esterilizada utilizando um filtro de seringa de 0,22 μl. A concentração de IgG foi determinada por DO280 de medição e a concentração de proteína foi calculada com base na sequência de aminoácidos. A proteína foi testada para a agregação (HPSEC), pureza (por SDS-PAGE, NEM, IEX e IEF). As amostras de proteína foram armazenadas a -80 ° C. Purificação de IgG para estudos analíticos e de xenotransplante.

[00343] As purificações de média escala foram realizadas em um AKTA 100 Explorer usando HiTrap MabSelect colunas Claro e colunas de dessalinização HiTrap. As amostras foram carregadas em 5 ml / min. A coluna foi lavada com 2 volumes de coluna de PBS. IgG foi eluída a pH 3,0 com tampão de citrato 0,1 M. Em seguida a amostra foi dessalinizada e terminou-se em um tampão final de PBS pH 7,4. IgGs foram filtradas através de um filtro de 0,45 μΜ (Sartorius). A concentração de IgG foi medida utilizando Octeto com sensores de proteína A. A proteína foi testada para a agregação (HPSEC), pureza (por SDS-PAGE, NEM, IEX e IEF). As amostras de proteína foram armazenadas a - 80 ° C. Características analíticas de PB4188

[00344] O PB4188 (MF3958xMF3178) foi submetido a análise por HP-SEC e CIEX-HPLC (TSK gel de STAT-7 μηι coluna, 4,6 mm Dl XLO cm L). O perfil analítico do PB4188 foi em geral consistente com o comportamento de monoespecífico normais da IgGl, tal como o braço PG3958 HER2 parental e o anticorpo monoclonal de controlo anti-RSV (fig. 7). Determinação de afinidade

[00345] A afinidade de ligação monovalente de PB4188 e PB3448 para HER2 e HER3 recombinante foi determinada por SPR (Biacore T100). Biacore ™ T100 (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) foi utilizado para realizar todas as experiências descritas. Análises de preparação da superfície do sensor e de interacção foram realizadas a 25 ° C e tampão Biacore reagentes foram adquiridos a partir de GE Healthcare. ErbB2- Fc e Fc-ERbBo (RND) foi revestida sobre a superfície de um chip sensor CMS em tampão de acetato de potássio (pH 5,5) no nível alvo de imobilização 500 RU. O tampão de corrida foi HBS (solução salina tamponada com HEPES): HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,005% de Tween-20; 0,2μm) esterilizada por filtração. Os anticorpos biespecíficos foram diluídos até 100, 50, 20, 10, 1 e 0,1 nM em HBS e funcionar a alta (30μ1 / min) a taxa de fluxo através da superfície de acoplamento de antígeno do chip do sensor CM5. Com o software de avaliação BIA, um modelo de ajuste de curva para 1:1, pode ser determinada uma interação monovalente permitido para a determinação das afinidades de HER2 de armas (interação monovalente), as afinidades dos braços HER2. Devido à taxa de HER3 da baixa fora de armar a afinidade não pôde ser determinada. Para determinar a afinidade do braço PB4188 HER3 foi revestido com um chip sensor CMS no nível alvo de imobilização 500 RU. Her2-Fc e Fc-Her3 antígenos foram diluídos até 100, 50, 20, 10, 1 e 0,1 nM em HBS e executado a uma taxa de fluxo elevada (40μ1 / min) sobre a superfície do PB4188. Para determinar os valores de kon and koff, o software de avaliação BIA foi usado em conjunto com um modelo que tem em conta que uma molécula monovalente foi revestida à superfície do chip sensor e que o antígeno ErbB3- Fc era uma molécula bivalente. As afinidades de PB4188 e PB3448 são mostrados na Tabela 10. Determinação da afinidade PB4188 em células

[00346] As afinidades de ligação foram também determinadas através de medições de afinidade de células em estado estacionário, utilizando células BT-474 e SK-BR-3. Quatro IgG foram analisados: 1) PB4188 (biespecífico HER2xHER3), contendo anticorpo HER2 anti-HER3 3958 e anticorpo anti-3178; 2) PB9215 (biespecífico HER3xTT), contendo anti-HER3 anticorpo 3178 e anti-TT (toxóide tetânico) anticorpo 1337; 3) PB9216 (biespecífico HER2xTT), contendo anti-HER2 de 3958 e anticorpo anti-TT 1337; 4) Herceptin (monoespecíficos HER2). As IgG foram marcadas radioativamente com, 25 I utilizando IODO-GEN® pré- revestidas tubos de Iodonação (Pierce) e instruções associadas. A IgG marcada foram diluídos para uma atividade de - 1-2 x 10 »cpm / mL em Tris-HCl a 25, 0,4 M de NaCl, 0,25% de BSA, EDTA 5 mM, 0,05% NaN¾. As concentrações de proteína foram determinadas com o Kit de ensaio de proteína BCA (Pierce). A citometria de fluxo de análise dos sinais marcados e não marcados com IgG usando BT-474 e culas SK-BR- 3 não mostrou nenhuma ou apenas pequenas de redução na ligação após a marcação. Constantes medições de afinidade de células de estado foram realizadas como se segue. As células foram semeadas em placas de 96 poços e incubou-se a 4 ° C com várias concentrações de IgG marcado. A radioatividade não ligada foi removida depois de 4 horas e a radioatividade ligada às células foi medida utilizando um contador faixa bem. A ligação não-específica foi medida pela adição de uma concentração de bloqueio do receptor (excesso de 100 vezes) de anticorpo não marcado. Cada condição foi testada em triplicado e três experiências independentes foram realizados por anticorpo. valores de KD foram calculados com base em um modelo de regressão não-linear que compensa a ligação não específica, utilizando Prism 6.0d (GraphPad Software). Gráficos incluindo curvas ajustadas são apresentados na Figura 20 para a ligação da IgG HER2xHER3 (PB4188) para ambas as linhas celulares. dados KD para todos os 24 ensaios, incluindo valores médios, são apresentados na Tabela 12. Em resumo, os valores médios de KD como determinado utilizando BT-474 e SK-BR-3 de células foram de 3,2 e 2,0 nM para HER2xHER3, 3,7 e 1,3 nM para Herceptin, 3,9 e 2,3 nM para HER2xTT, e 0,23 e 0,99 nM para HER3xTT, respectivamente. Assim PB4188 mostra uma afinidade mais elevada para DELA comparação com HER2, que está em contraste com a molécula biespecífica HER2xHER3 MM-111 que tem como alvo HER2 com uma afinidade mais elevada em comparação com HER3. Atividade anti-proliferativa em células de câncer da mama HER2 amplificado JIMT-1 em ágar mole

[00347] PB3448 e PB4188 foram testados quanto à sua potência para inibir o crescimento do JIMT- resistente trastuzumab 1 células em agar mole. Para este fim foram preparadas 96 placas de cultura de células em suspensão bem.

100 μl a camada macia de ágar inferior (0,6% de concentração final no meio completo) foi vertida e deixado a solidificar. 50 μί da camada macia de ágar de topo (0,4% concentração final) contendo células 10,000 JIMT- 1 / poço foram então adicionado no topo, solidificou e tais placas de 96 cavidades incubou-se durante a noite a 37 ° C, 10% de C02. No dia seguinte, um anticorpo de controlo negativo, pertuzumab + trastuzumab (1: 1 v / v), PB3448 e PB4188 foram adicionados em meio DMEM em uma titulação semi-log variando de 10-0,003 xg / l. Subsequentemente, o ensaio foi incubado em incubadoras de cultura de células durante 8 dias. Finalmente, as células foram incubadas com azul de Alamar durante 3-5 h a 37 ° C e foi determinada a intensidade de fluorescência (excitação: 560 nm; emissão: 590 nm). Um exemplo de inibição dependente da dose da proliferação JIMT-1 por PB3448 e PB4188 é mostrado. (Figura 8). BT-474 e SI BR-3 em matrigel

[00348] PB3448 e PB4188 foram testados quanto à sua potência para inibir o crescimento de BT-474 e células SK- BR-3. As células foram testadas na empresa Ocello baseado em Leiden, Holanda, que cresce em células de três matrigel dimensional e utiliza a análise de componentes principais para distinguir células não-tratadas a partir de células tratadas. 2000 SK-BR-3 ou 2250 culas BT474 foram semeadas em matrigel 15μ1 por poço de uma placa de 384 cavidades (xreiner 781091). No dia seguinte, uma titulao semi-log variando 10- 0,003 µg / ml de anticorpos foram adicionados no meio de cultura na ausência ou na presença de 5 ng / ml HRG os anticorpos de teste incluía um negativo de anticorpo de controlo, pertuzumab + trastuzumab (1:1 v / v), PB3448, PB4188 e o biespecífico anti-EGFRxHER3 dois-em-um anticorpo MEHD7945A.

Além disso, uma titulação dose-dependente de HRG foi incluído como um controlo positivo.

Cada dose foi testada em quadruplicado. as células foram incubadas durante 7 dias em uma incubadora de cultura de células a 37 ° C, 5% de C02. a seguir, as células eram citoesqueleto fixo e actina das células foi corada com faloidina e os núcleos são corados com Hoechst. em seguida, as imagens fluorescentes foram realizadas a diferentes níveis através do gel (Z-pilha) e as imagens foram sobrepostas.

Uma ampla faixa de características morfológicas foi medida (800 no total). Apenas características que diferiam entre o meio e foram seleccionadas para análise tratamentos HRG.

Características que foram associados com o crescimento, a área média esferóide e núcleos de esferóide por mais foram significativamente diferentes entre os tratamentos HRG médio e.

Ambos multiparâmetros e análises de parâmetros individuais foram feitas.

Para as medições dos parâmetros individuais, testes t foram realizados para comparar tratamentos (HRG ou anticorpos) ao meio.

Foram determinados valores de P para cada ponto.

Análise de componentes principais (PCA), um método para encontrar as combinações de baixa dimensão de dados dimensionais de alta que captura a maior parte da variabilidade foi usado em relação à concentração de anticorpo, para determinar os dados.

A Figura 9 demonstra o efeito de pertuzumab + trastuzumab (1: 1 v / v), PB3448 e PB4188 na presença de HRG.

Em ambos HER2 mama amplificado linhas celulares de câncer PB4188 mostrou atividade superior em comparação com o pertuzumab + trastuzumab, PB3448 e o anticorpo MEHD7945A dois-em-um, na presença de HRG. Atividade anti-proliferativa superior de PB4188 na presença de HRG em células de câncer da mama amplificado HER2

[00349] A atividade de PB4188 na presença de 10 ng / ml HRG em SK-BR-3 e BT-474 foi comparado com um painel de anticorpos HER2, HER3 e suas combinações. O ensaio foi realizado em matrigel, tal como descrito acima, e características morfológicas foram analisadas. dados PCA representados na Figura 10a mostra a HRG induzida

[00350] a proliferação e ramificação / invasão de células SK-BR-3 em matrigel. A Figura 10b mostra que o anticorpo PB4188 pode reverter completamente o fenótipo induzido por HRG, ao passo que a combinação dos anticorpos monoclonais parentais (PG3958 + PG3178) não tem efeito. Além disso, PB4188 era muito mais eficaz em comparação com todos os anticorpos anti-HER3 testadas (Figura 10c). Além disso, as combinações dos anticorpos anti-HER3 individuais com trastuzumab (o padrão atual de cuidados no câncer da mama metastático (MBC)) não foram capazes de reverter o fenótipo induzido por HRG (Figura lOd). Adicionando trastuzumab para PB4188 na presença de HRG reduziu a proliferação e ramificação / invasão de células SK-BR-3 em comparação com PB4188 sozinho (Figura LOE). Atividade anti-proliferativa superior de PB4188 em HER2 amplificado em células de câncer gástrico em comparação com anticorpos monoclonais de HER2 e HER3.

[00351] A regulação positiva de NRGl-βΙ é um mecanismo de resistência a terapias chave contra HER2 segmentados (Wilson, 2012). Para avaliar se a regulação positiva de NRGl- βΙ iria interferir com o antai potência anti-proliferativa de PB4188 um painel de anticorpos foi testado a 100 ng / ml de HRG a N87 (HER2 amplificado) linha celular de câncer gástrico. N87 células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS inativado pelo calor. Para as culturas de células subconfluentes de ensaio de proliferação de células N87 foram lavadas com PBS e tripsinizadas a tripsina foi inativada pela adição de meio de cultura. As células foram lavadas duas vezes em grandes volumes de meio de ensaio (RPMI 1640 meio contendo 0,05% de BSA e 10 ng / ml de transferrina Holo). Os anticorpos foram diluídos em uma titulação de semi-log, que variou de 1-0,0001 ng / ml. As células foram adicionadas a uma densidade de 10000 células / poço na presença de concentração de 100 ng / mL de concentração final de HRG. As células foram cultivadas durante 3 dias a 37 ° C, 5% C02, em 95% de humidade relativa. Alamar Blue ™ (Invitrogen) foi adicionado de acordo com as instruções do fabricante e incubaram-se durante 6 horas a 37 ° C, 5% C02, em 95% de humidade relativa no escuro.

[00352] A fluorescência foi medida a 550 nm de excitação com 590 nm de emissão dcomprimento de onda. PB4188 mostrou atividade superior sobre o anti-HER2 e anti-HER3 anticorpos monoclonais (Figura 11). Anticorpos biespecíficos HER2XHER3 induzem ADCC

[00353] A atividade de ADCC é um mecanismo anti- tumoral importante de ação de anticorpos terapêuticos no câncer. Os anticorpos monoclonais humanos dirigidos à família HER de receptores como cetuximab e trastuzumab induzir ADCC. A linhagem de base e a atividade CCDA aumentada de PB4188 e PB3448 foram determinados em ensaios de CCDA in vitro validados. Trastuzumab e um anticorpo de controle negativo foram incluídos como anticorpos de controlo na experiência. O sangue total e fracções de CMSP foram obtidas a partir de dadores saudáveis. Cada anticorpo foi testado contra as HER2 alta (SK-BR-3) e HER2 baixo (MCF-7), as células alvo que expressam. As células alvo foram carregadas com 51 Cr (Amersham) e opsonizadas com as concentrações indicadas do anticorpo. -Sangue total ou fracção PBMC foram utilizadas como células efetoras em uma reação de 200 pL de RPMI 1640 + 10% de FCS inativadas pelo calor. As células foram incubadas em conjunto durante 4 h, e a lise foi estimada por medição da radioatividade no sobrenadante utilizando um γ-cintilador. Percentagem de lise específica foi calculada como se segue: (cpm experimental - cpm de base) / (cpm máxima - cpm de base) x 100, com a lise máxima determinada na presença de 5% de Triton X- 100 e lise basal na ausência de anticorpo e efetores. Como mostrado na Figura 12 PB3448 anticorpo biespecífico mostrou atividade de ADCC semelhante em comparação com a combinação pertuzumab + trastuzumab. Biespecífico de anticorpo PB4188 era eficaz a concentrações de anticorpo elevadas (10 ng / ml). Anticorpos biespecífico HER2XHER3 mostram maior ADCC em comparação com a combinação de anticorpos parentais

[00354] Em uma configuração ADCC diferente, utilizou- se o Bioensaio ADCC Repórter (Promega). O bioensaio usou células de Jurkat manipuladas que expressam estavelmente o receptor FcyRIIIa, V158 (elevada afinidade) ou F158 (baixa afinidade) variante, e um elemento de resposta de NFAT expressão de luciferase de pirilampo condução. O ensaio foi validado por comparação dos dados obtidos com o ADCC Repórter Bioensaio para o clássico ensaio de liberação de 51Cr. Os ensaios de CCDA foram realizadas utilizando o kit Promega de bioensaio ADCC utilizando placas de 384 poços brancos. Nesta montagem experimental SK-BR-3 de células foram colocadas em placas a uma densidade de 1000 células / poços em 30 de meio de ensaio μl (RPMI com 4% de soro de baixa IgG) 20-24H antes do bioensaio. No dia seguinte, o meio de cultura foi removido. Em seguida, uma diluição em série de anticorpos, PB4188 e a sua parental anti-HER2 PG3958 e anti-HER3 PG3178, bem como a sua combinação foi gerado em duplicado. 10 diluições de anticorpos μl foram adicionados aos poços. A concentração de partida do anticorpo foi de 10 ug / ml e de 10 pontos semi-log de diluição em sie dobra foi gerado para proporcionar uma curva de dose-resposta completa. Finalmente, foram adicionados 5 μΐ de células efetoras ADCC bioensaio (15000 células / cavidade, V158). As células foram incubadas durante 6 horas a 37 ° C. Em seguida, foi adicionado 15 μΐ BIO-Glo substrato de luciferase e 5 minutos mais tarde

[00355] A luminescência foi detectada num leitor de placas. Os dados obtidos são mostrados na Figura 13. O PB4188 anticorpos anti-HER2xHER3 biespecíficos mostrou um potentency ADCC mais elevada em comparação com os anticorpos monoclonais parentais de HER2 e HER3, ou uma combinação dos mesmos.

Realce de ADCC de PB4188

[00356] atividade ADCC pode ser melhorada por meio de técnicas diferentes, sendo um deles a remoção de fucose. Remoção de fucose resultou num aumento da atividade anti- tumoral em vários modelos in vivo [Junttila, 2010]. Para maximizar a atividade PB4188, afucosylation tecnologia foi aplicada (Cheng Liu and Andreia Lee. ADCC Enhancement Technologies for Next Generation Therapeutic Antibody. Antibody therapeutics -Trends in Bio/Pharmaceutical Industry 2009 [13-17]), impedindo assim fucosilação da estrutura de carboidrato ligada em N na regi Fc. A potência de ADCC de PB4188 afucosilatado em comparação com o tipo selvagem PB4188 foi determinada num ADCC 51 ensaio de libertação de Cr utilizando células que expressam Her2 baixas (MCF-7) e HER2 amplificados células (SK-BR-3). Ambos os anticorpos foram aplicados em uma diluição em série e um anticorpo de controlo negativo e trastuzumab foram incluídos no ensaio. A Figura 14 mostra o aumento da potência de ADCC de PB4188 afucosilatado em comparação com a versão de tipo selvagem e / ou trastuzumab em ambas as células de alta e baixa HER2 expressar. PB4188 afucosilatado mostra a atividade de ADCC superior com receptores de baixa afinidade FcyRIII

[00357] A atividade PB4188 afucosilatada foi testada em células repórter de ADCC contendo ou o V158 (elevada afinidade) variante do receptor FcyRIIIa ou a F158 (baixa afinidade) FcyRIIIa variante do receptor. Uma titulação de série do anticorpo, isto é, o anticorpo de controlo,

trastuzumab e PB4188 afucosilatada, foi adicionado em combinação com células repórter ADCC que albergam os diferentes variantes FcyRIIIa para aderente células SK-BR-

3. a atividade de ADCC foi medida por medição da atividade da luciferase. Afucosylated PB4188 mostrou uma atividade igual em comparação com trastuzumab em combinação com a alta afinidade de receptor de variante V158 FcyRIIIa. Em contraste afucosilatada PB4188 apresentada a atividade de ADCC superior em comparação com o trastuzumab em combinação com a baixa afinidade do receptor variante F158 FcyRIIIa. (Figura 15) Estudo JIMT-1 xenoenxerto

[00358] JIMT-1, células de carcinoma da mama humano foram crescidas em DMEM contendo 10% de soro fetal bovino, 100 unidades / mL de penicilina G de sódio, 100 pg / ml de sulfato de estreptomicina, 25 pg / mL de gentamicina, e 2 Nim glutamina até o momento da implantação. No dia de JIMT- 1 células de mama de implante foram colhidas durante a fase de crescimento logarítmico e ressuspensas em PBS frio. Camundongos fêmea CB.17 SCID (Charles River) foram de 8 semanas de idade no dia 1 do estudo e tinham uma faixa de peso corporal de 16,5-20,7 g. Cada rato foi injetado subcutaneamente no flanco direito com 5 XLO 6 células tumorais (0,2 mL de suspensão de células). Os tumores foram medidos com um compasso de calibre em duas dimensões para monitorizar o tamanho como o volume médio duas vezes por semana. Depois dos tumores terem atingido cerca de 100-150 mm 3 em animais de tamanho foram inscritos no estudo de eficácia. Animais outlier -tumor de volume - foram removidos e os camundongos foram distribuídos aleatoriamente em grupos de 10 camundongos cada. Os murganhos foram injetados uma vez por semana (anticorpo) ou diariamente (lapatinib) durante um período de quatro semanas. Os pormenores dos grupos de tratamento estão apresentados na Tabela 11.

[00359] Os tamanhos dos tumores foram medidos semanalmente por medição do calibre. O estudo de eficácia revelou que PB4188 em ambos os esquemas de dosagem era igual eficaz e mais potente do que o de lapatinib ou a combinação pertuzumab e trastuzumab. Os dados são mostrados nas Figuras 17 e 18. PB4188 pode superar a resistência mediada HRG

[00360] A regulação positiva de NRGl-βΙ é um mecanismo de resistência a terapias de chave contra HER2 segmentados (Wilson, 2012). PB4188 foi testada em comparação com a sua parental PG3178 anticorpo monoclonal anti-HER em uma titulação de série na presença de uma concentração crescente de HRG (NRGl-βΙ EGF). Para este objetivo células N87 foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de calor de FBS inativado. Para as culturas de células subconfluentes de ensaio de proliferação de células N87 foram lavadas com PBS e tripsinizadas a tripsina foi inativada pela adição de meio de cultura. As células foram lavadas duas vezes em grandes volumes de meio de ensaio (RPMI 1640 contendo 0,05% de BSA e 10 ug / ml de transferrina Holo). Os anticorpos foram diluídos em um semi-log titulação variando 1-0,0001 pg / ml. As células foram adicionadas a uma densidade de 10000 células / poço na presença de uma concentração crescente de HRG (0.04-39,5 iiM). As células foram cultivadas durante 3 dias a 37 ° C, 5% C02, em 95% de humidade relativa. Alamar Blue ™ (Invitrogen) foi adicionado de acordo com as instruções do fabricante e incubaram-se durante 6 horas a 37 ° C, 5% C02, em 95% de humidade relativa no escuro.

[00361] A fluorescência foi medida a 550 nm de excitação com 590 nm de emissão de comprimento de onda. PB4188 mostrou atividade superior em comparação com o anticorpo monoclonal anti-HER3 parental (Figura 19).

[00362] Assim, no caso de um mecanismo de fuga, tal como, por exemplo, a regulação positiva de NRGl-βΙ, um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção é preferido. Mapeamento de epítopos de HER2 / HER3 IgGs específico Experimentos de mutagênese de shotgun

[00363] mutagênese de varrimento de alanina foi utilizada para mapear os epítopos de PG3958 e PG3178 para HER2 e HER3, respectivamente. No ensaio de espingarda mutagênese, os clones são gerados de modo que cada resíduo de aminoácido do domínio extracelular de HER2 HER3 (ECD) é substituído por alanina. Em seguida, um conjunto de células foi preparado por transfecção reversa (patente US2011/0077163A1). Portanto, o DNA de cada clone foi misturado com Lipofectamina e a mistura foi colocada num poço dedicado de uma placa de 384 cavidades. células HEK293T foram adicionados a cada poço e a expressão de proteína foi medida 24H mais tarde. Subsequentemente, a reatividade de anticorpos foi medida por coloração de imunofluorescência que conduz à ligação e mapas de identificação dos resíduos críticos para a ligação do anticorpo. Os níveis de expressão das construções de HER2 e HER3 ECD foram verificados por análise de FACS utilizando anticorpos monoclonais comercialmente disponíveis (Acm de R & D 1129 (HER2) e R & D mAb 66223 (HER3)). HER2

[00364] A ligação de Fab PG3958 monovalente para mutantes HER2 DPI foi testado a uma concentração de 0,25 pg / ml no ensaio e condições de lavagem rigorosas foram usadas (pH 9,0, 350 Nim NaCl). Isto resultou na identificação de três resíduos críticos'(T144, R166, R181) em HER2 que mostraram menos de 35% de ligação residual da PG3958 Fab em comparação com WT HER2 mantendo o controlo de ligação de mAb. Dois resíduos (P172, G179) que estão posicionadas perto dos resíduos críticos na estrutura HER2 mostrou significativa, mas menos grave perda de ligação e foram designados resíduos críticos 'secundárias' (Tabela 13 e Figura 21-A). Todos estes resíduos de superfície expostos estão localizados no domínio I de HER2 e juntos formam um remendo descontínua na superfície da molécula HER2. Experimentos de confirmação de epítopo HER2

[00365] Construções que codificam tipo selvagem (WT) HER2 ECD e o HER2 ECD variantes listadas na Tabela 13 foram expressos em células CHO-K1. Três resíduos de domínio I que são superfície exposta e estruturalmente perto dos resíduos críticos determinados foram selecionados para posterior análise. T164, S180 e 1) 143 mutações pontuais para tirosina foram geradas no HER2 ECD de construção e as construções resultantes também foram expressas em células CHO-K1. A variante L159A HER2 ECD foi expressa em células CHO-K1 como amostra de controlo.

[00366] O anticorpo biespecífico PG3958xTT testados quanto à ligação ao DEC variantes em uma experiência de titulação de FACS. O HER2 anti-trastuzumab anticorpo que se liga domínio IV de HER2 foi utilizado para verificar a expressão de HER2 ECD na superfície da célula. Significam valores de MFI foram representados graficamente e para cada curva a agosto foi calculada utilizando GraphPad Prism 5 software. ligação WT HER2 foi usado para normalizar os dados. Os dados de FACS mostraram que, além de T144A, R166A, R181A, P172A, G179A as mutações T164Y e S180Y resultou na redução significativa na ligação do anticorpo PG3958xTT (Figura 22). A mutação D143Y resultou em perda grave de expressão tal como demonstrado pela diminuição da ligação do controlo NIAB, então o seu papel potencial na epítopo PG3958 não pôde ser determinada. HER3

[00367] A análise de ligação PG3178 IgG a 0,25 µg / ml para os mutantes HER3 de DPI em FACS resultou na identificação de dois chamados resíduos 'críticas' (F409, R426) para o qual a mutação de alanina causaram perda substancial de ligação em comparação com WT HER3, enquanto ligação do mAb de controle foi retido (Tabela 14 e Figura 23). Ambos os resíduos estão localizados no domínio III de HER3 e espacialmente distante. Além disso, F409 é enterrado no núcleo hidrofílico HER3, que faz com que seja improvável que seja parte do epítopo PG3178. Experimentos de confirmação epítopo HER3

[00368] As células CHO-K1 foram transfectadas com constructos de mutação DELA ECD (listado em Tabela 14), WT

DELA ECD e duas construções de controle (H407A e Y424A). A ligação para as variantes HER3 DPI PG3178 foi testada em um experimento de titulação de FACS. Dois anticorpos de controlo, o Domínio I (MM-121) e o Domínio III (MEHD7945A) dela foram incluídos para verificar a expressão do ECD de HER3 na superfície da célula de ligação. Significam valores de MFI foram representados graficamente e para cada curva foi calculada usando software GraphPad Prism 5. ligação WT HER3 foi utilizado para normalizar os dados. A mutação R426A mostrou ser críticos para a ligação PG3178 ao passo que a ligação a F409A não pôde ser confirmado devido à perda de expressão na superfície celular (Figura 24). Atividade PB4188 em cardiomiócitos in vitro

[00369] HER2 está envolvido no crescimento, reparação, e a sobrevivência de cardiomiocitos adultos como parte de uma rede de sinalização que envolve o complexo receptor HER2 heregulina: HER4. Cardiotoxicidade é um fator de risco conhecido na HER2 alvejamento e a frequência de complicações é aumentada quando o trastuzumab é utilizado em conjunto com antraciclinas induzindo desse modo o esforço cardíaco. Um sistema modelo baseado na derivada de células estaminais cardiomiócitos humano foi utilizado para testar a toxicidade potencial de referência e PB4188 contra trastuzumab, e a combinação de trastuzumab e pertuzumab, na presença da antraciclina doxorubicina. cardiomiócitos derivadas de células estaminais humanas (Pluriomics BV) foram semeadas a uma concentração de 20.000 bem em placas de ensaio de fundo plano (Corning branco 655098). No dia 5 de cultura, o meio foi substituído por meio de cultura de glucose e galactose livre suplementado com longas / ml HRG. No dia 7 os anticorpos de teste foram adicionados em combinação com a doxorrubicina (3 μΜ). A viabilidade celular foi ensaiada no dia 9 utilizando o ensaio Glo da Promega Cell Titer. Os anticorpos monoespecif icos foram testados em concentrações individuais de 68 nM enquanto que PB4188 foi testada em três concentrações, na presença de 3 μΜ doxorrubicina. A Figura 25 mostra que a viabilidade da cardiomiócitos não foi afectada por todas as concentrações testadas PB4188. Em contraste, trastuzumab, e a combinação de trastuzumab e pertuzumab tanto reduziu a viabilidade celular de cardiomiócitos. Ligação do PB4188 a células com diferentes níveis de HER2

[00370] A ligação de PB4188 em comparação com trastuzumab e o anticorpo HER3 Ul-59 foi analisada por FACS em linhagens celulares de câncer gástrico e mama expressando diferentes níveis de HER2. As células foram consideradas HER2 +++ se expressam HER2 milhões de cópias e / ou são do gene HER2 amplificado. Foram utilizadas as seguintes linhas celulares: MCF-7 (HER 2 +); MDA-MB-468 (HER2 +, MKN-45 (HER2 +), MDA-MB-175 (HER2 +), MDA-MB-453 (HER2 ++), MDA-MB-361 (HER2 ++), ZR 75- l (HER2 ++), JIMT-1 (HER2 +++), BT-474 (HER2 +++), SK-BR-3 (HER2 +++), SK-OV-3(HER2 +++), N87 (HER2 +++). Células de uma cultura exponencial cultivadas foram recolhidas por tripsina e diluiu-se para 10 e células / ml em tampão FACS (PBS / BSA a 0,5% EDTA 0,5 mM). 1-2 10 5 células foram adicionadas a cada poço em uma placa de fundo em U de 96 cavidades. As células foram centrifugadas durante 2 minutos a 300 g a 4 ° C. O sobrenadante foi descartado por inversão da placa (s) acima, seguido por um movimento súbito uma vez. 50 μl de cada amostra de IgG foi adicionado em uma diluição em série a partir de 3,16 GN 10 ug / ml e incubadas durante 1 h em gelo. As células foram centrifugadas uma vez, o sobrenadante foi removido e as células foram lavadas duas vezes com tampão de SCAF. 50 μl diluído 1:100 de camundongo anti IgG humana faixa PE (Invitrogen) e incubou-se durante 30-60 minutos em gelo no escuro. As células foram centrifugadas uma vez, o sobrenadante foi removido e as células foram lavadas duas vezes com tampão de SCAF. As células foram analisadas num citômetro de fluxo FACSCanto num ambiente HTS. A quantidade de anticorpo ligada foi foi avaliada por fluorescência mediana. Os dados foram representados graficamente e a área sob a curva (AUG, uma medição acumulada da intensidade de fluorescência mediana) foi determinada para cada anticorpo por linhagem de células testadas (Figura 26).

[00371] A partir desta experiência conclui-se que PB4188 tem uma maior afinidade de ligação para células HER2 +++, células HER++ e células HER + em comparação com o trastuzumab. Ligação simultânea com trastuzumab PB4188 e trastuzumab não competem pela ligação a HER2

[00372] PB4188 liga-se ao domínio I da proteína HER2 ao passo que o epítopo de ligação de trastuzumab está localizada no domínio IV. Para demonstrar que ambos os anticorpos não competem para a ligação de HER2, um ensaio de ligação com HER2 amplificados SKBR-3 células de mama foi realizada. primeiro anticorpo não marcado foi deixada ligar-

se SK-BR-3 em concentrações saturantes. Próximo PB4188 marcado com FITC foi adicionado em uma faixa de titulação e a fluorescência foi medida por FACS. A Figura 27 demonstra que PB4188 1 JT ligado como eficazmente às células na presença de trastuzumab ou o controlo negativo. -Incubation Pré de SKBR-3 células com PB4188 impedido PB4188 F1TC de ligação. Assim, trastuzumab e PB4188 não competem pela ligação a HER2 Alvejamento de domínio I de HER2 por uma molécula biespecífica HER2xHER3 pode superar a resistência Heregulina

[00373] Para testar se a orientação do PB4188 no dímero HER2 x HER3 foi preferida para inibição da proliferação de células sob condições de stress HRG, os anticorpos biespecíficos foram gerados composto do braço 3178 HER3 e HER2 braços segmentação qualquer um dos domínios I, II, III ou IV. Dois anticorpos biespecíficos HER2xHER3 foram gerados para cada um dos domínios HER2 I-IV. Os braços HER2 incluído: MF3958 e MF3003 alvo de domínio I; MF2889 e MF2913 segmentação de domínio II; MF1847 e MF3001 segmentação domínio III e MF1849 e MF1898 segmentação domínio IV. Cada braço de HER2 Fab foi combinado com o braço 3178 HER3 Fab e testados quanto à sua potência para inibir a proliferação de células na presença de concentrações elevadas de heregulina. As titulações de anticorpos foram realizadas em HER2 baixo expressando células MCF-7 e o HER2 superexpressando N87 e células SK-BR-3. culturas de células subconfluentes de N87, células SK-BR-3 e MCF-7 foram lavadas com PBS e tripsinizadas a tripsina foi inativada pela adição de meio de cultura. As células foram lavadas duas vezes em grandes volumes de meio de ensaio (RPMI 1640 contendo 0,05% de BSA e 10 µg / ml de transferrina Holo). Os anticorpos foram diluídos em uma titulação semi-log. As células foram adicionadas a uma densidade de 10000 células / poço (N87, SKB-BR-3) e 5000 células / poço MCF-7 na presença do estresse definido experimentalmente concentração de HRG (ΙΟηΜ SK-BR-3, ΙΟΟηΜ N87 e MCF-7). As células foram cultivadas durante 3 - 4 dias a 37 ° C, 5% C02, em 95% de humidade relativa. Alamar BlueTM (Invitrogen) foi adicionado para avaliar a proliferação. A absorvância foi medida com excitação a 550 nm com 590 nm de comprimento de onda de emissão. Em todos os ensaios testados, apenas os anticorpos biespecíficos de segmentação de domínio I de HER2 foram capazes de inibir a proliferação na presença de uma concentração elevada de heregulina (Figura 28). Combinações de fármacos com PB4188 in vitro.

[00374] Para investigar a possibilidade de combinar PB4188 com fármacos de moléculas pequenas PB4188 foi combinada com fármacos que interferem em diferentes níveis da PI3K ou MAPK via. Além disso, a combinação com medicamentos quimioterapêuticos e inibidores de ciclina foram testados. Combinações foram testadas em células que sobreexpressam HER2 que crescem na presença de HRG em matrigel (SK-BR-3 e BT-474), ou na presença de concentrações de tensão HRG (N87 e SK-BR-3 como descrito em ensaios de proliferação). O efeito inibitório de combinações de drogas foi testada por imagiologia ou por medição da proliferação utilizando Azul de Alamar como aqui descrito antes. Em primeiro lugar, determinou-se a CE20 PB4188 e drogas testadas. Em seguida, titulações xadrez foram realizadas com

PB4188 e as drogas. Sinergias foram observadas em todas as linhas celulares testadas com inibidores de tirosina-quinase (afatinib, lapatinib, neratinib), o PI3Ka inibidor BYL719, o inibidor Akt MK-2206, o everolimus inibidor de mTOR, a saracatinib inibidor de Src, os microtúbulos perturbadoras paclitaxel droga, e o vorinostat inibidor de HDAC (que está mal escrito na Figura 40 como "voronistat"). A Figura 29 mostra um exemplo de uma combinação sinérgica de PB4188 com lapatinib em culas SK-BR-3 cresceram em matrigel resultando em alterações morfológicas e redução do crescimento das células. Calculou-se a extensão da inibição do crescimento obtido com cada combinação. deslocamento potência pode ser demonstrado utilizando isobologramas (Greco et al 1995), que mostra como muito menos droga é necessária uma combinação para alcançar um nível desejado, quando comparado com o agente único necessário para alcançar esse efeito. Os valores de inibição das experiências com combinação foram usados pelo software Analyzer ™ CHALICE para gerar os isobologramas. Isobologramas das diferentes combinações de drogas em células de HER2 amplificados são mostrados na figura 40. A análise indicou que Isobolograma PB4188 exibida combinações de fármacos sinergísticas com afatinib, lapatinib, neratinib, BYL719, MK-2206, everolimus, saracatinib, vorinostat e paclitaxel.

[00375] Estes dados demonstram que as drogas que actuam sobre a via PI3K são nomeadamente eficazes em combinação com PB4188. Além disso, as combinações com Tirosina Quinase Os inibidores são eficazes. Além disso, uma combinação com o crescimento e a migração / invasão saracatinib droga pode ser favorável no contexto metastático. PB4188 - Inibição in vitro da fosforilação

[00376] Células de uma cultura exponencial cultivadas foram recolhidas e semeadas em placas de 6 pos (3,75 xl06 e células para N87 e 1,5 x l06 células «para SKBR-3) em meio de fome (células N87: RPMI- 1640, 0,05% de BSA, 10 µg/ml de holo-transferrina; células SK-BR-3: DMEM / F-12, 2 Nim L- glutamina, 0,05% de BSA, 10 µg/ml de holo-transferrina) e incubadas durante a noite a 37 ° C, 5%) C02, em 95% relativamente umidade. No dia seguinte, os anticorpos foram adicionados a uma concentração final de 5 nM e as células foram incubadas durante uma hora a 37 ° C, 5% C02, em 95% de humidade relativa. HRG foi, em seguida, adicionado a uma concentração final de 100 ng / ml. Após 1, 3, 6 ou 24 horas a 37 ° C, 5% C02 e em 95% de humidade relativa, as placas foram colocadas em gelo, as células foram lavadas duas vezes com PBS frio. Subsequentemente, 0,3 ml de tampão de lise arrefecido em gelo foi adicionado (Cell signaling RTK # 9803 ou IC # 7018) e as células foram lisadas por um período mínimo de 30 minutos em gelo. As concentrações de proteína, próximos foram medidos usando BCA (Pierce # 23235). As concentrações de proteínas foram ajustadas a 2 mg / ml com tampão de lise. A seguir, os lisados foram aplicados a PathScan RTK Sinalização Anticorpo matrizes (Cell Signaling # 7949) ou anticorpo PathScan Sinalização Intracelular matrizes. Todas as incubações foram realizadas com poços selados num agitador orbital à temperatura ambiente. Os lisados (75 μl) foram diluídas 2 vezes a 0,8 mg / ml de concentração com 75 μl de matriz Tampão de Diluição suplementado com um coquetel inibidor de protease e mantido em gelo. Cavidades de matriz foram bloqueadas com tampão de bloqueio 100 µl de matriz durante 15 minutos. Tampão de bloqueio foi removida e os lisados foram aplicados aos poços e deixou-se incubar durante 2 horas. O lisado foi aspirado e os poços foram lavados 4 vezes com 100 μl de tampão de lavagem. Em seguida, 100 μl de coquetel de anticorpos de detecção foram adicionados por poço e incubados durante 1 hora.

[00377] O coquetel de anticorpo foi aspirado e os poços foram lavados 4 vezes com 100 μl de tampão de lavagem. 75 μΐ Dylight80 ™ estreptavidina foi adicionado a cada poço. Dylight80 ™

[00378] A estreptavidina foi aspirada e os poços foram lavados 4 vezes com 100 μl tampão de lavagem. A multi-junta foi removido e as lâminas foram lavadas durante 10 segundos em 10 ml de água desionizada. As lâminas foram deixadas a secar e processado para imagens em um OdyseeSOx. Ponto intensidade de fluorescência foi calculado usando o software Imagem Studio.

[00379] Em N87 e SK-BR-3, PB4188 bloqueia completamente a fosforilação de AKT durante o primeiro 6H de incubação, em contraste com a combinação de trastuzumab + pertuzumab. Além disso, uma inibição forte é observada em ERK e S6 fosforilação em contraste com a combinação de trastuzumab + pertuzumab. O PB4188 não inibir a fosforilação de HER2 (Figura 30) Análise de Western blot

[00380] Para verificar a inibição da fosforilação observado na RTK e matrizes Pathscan intracelulares em que Western blot foram realizadas de células tratadas com PB4188, a combinação pertuzumab e trastuzumab, e um anticorpo de controlo na presença de concentrações de tensão HRG.

Células de uma cultura exponencial cultivadas foram recolhidas e semeadas em placas de 10 cm (20 x l06 células para N87 e 7 x lO6 células para SKBR-3) em meio de fome (células N87: RPMI- 1640, 0,05% de BSA, l0 µg/ml de holo-transferrina; culas SK- BR-3: DMEM / F-12, 2 mM de L-glutamina, 0,05% de BSA, 10 µg/ml de holo-transferrina) No dia seguinte, os anticorpos foram adicionados a uma concentração final de 5 nM e as células foram incubadas durante uma hora.

HRG foi, em seguida, adicionado a uma concentração final de 100 ng / ml.

Após 1, 3, 6 ou 24 horas, os pratos foram colocados em gelo, as células foram lavadas duas vezes com PBS frio, transferido para tubos Eppendorf e lisadas com 250 μΐ de tampão de lise RIPA (Tris-HCl 20 mM pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM de EGTA, 1% de NP-40, 1% desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, pirofosfato de sódio a 2,5 mM, beta-glicerofosfato a 1 mM, Na3V04 1 mM, 1 ug / mL de leupeptina). A lise foi deixada prosseguir durante 30 minutos em gelo.

Os lisados celulares foram centrifugadas e os sobrenadantes foram recolhidos em tubos Eppendorf novos.

A concentração de proteína foi determinada utilizando o método BCA (Pierce). 30 µg de lisado foi separado num gel de 4- 12% de Bis-Tris NuPage (Invitrogen) e as proteínas no gel foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose.

As membranas foram bloqueadas durante uma hora com TBS-T contendo 5% de BSA e corados com os anticorpos indicados de acordo com as instruções do fabricante (Cell Signaling Technology).

[00381] As membranas foram depois incubadas com um anticorpo secundário conjugado com HRP, incubadas com substrato ECL e submetido a auto-radiograf ia utilizando filmes de raios-X (Amersham). Todos os anticorpos de detecção foram de Cell Signaling Technology: Fosfo-Akt (Ser 473) # 4060, Total Akt # 4691, fosfo-HER2 (Tyr 1221/1222) # 2243, total HER2 # 2242, fosfo-HER3 (Tyr 1289) # 4791, total DELA # 4754, fosfo-ERKl / 2 (Thr 202 / Tyr 204) # 4377, Total de ERK1 / 2 # 4695, Fosfo-S6 RP ( Ser 235/236) # 2211, total S6 RP # 2217, cabra anti-coelho HRP-linked # 7074. Os resultados mostram que PB4188 mostra uma inibição prolongada de fosforilação HER3que resulta na inibição de tanto a via da cinase MAPK e PI3 com um profundo efeito sobre a inibição da fosforilação de Akt (Figura 31). PB4188 - Farmacodinâmica in vivo Análise da fosfoproteína por Luminex

[00382] Tumores (100 mm3) de JIMT-1 machos transplantados tratados com 2 doses de PB4188 e PB4188 de 4 doses foram removidos 24 horas após a dosagem. Os tumores foram congelados rapidamente e transformados em pó. Os lisados de tumor foram preparados a uma concentração de 50 mg de tumor / mL utilizando frio BioRad Tampão de Lise (suplementado com 0,4% BioRad Fator de 1, 0,2% BioRad Fator 2, e PMSF 2 mM) para as amostras de pó congelado, incubou- se a 4 ° C sobre um balancim para 60 minutos para assegurar uma lise completa. As amostras foram centrifugadas a 4 ° C durante 10 minutos a 16000 xg, e aliquotado. A proteína total foi determinada utilizando os reagentes de ensaio de proteína DC Biorad de acordo com as instruções do fabricante. Luminex Ensaio: As amostras de lisado JIMT-1 de tumor foram processadas e analisadas por: Akt total AKT (Ser473) e de AKT (Thr308using kits Luminex disponíveis comercialmente a partir da Millipore (Cat # 48-618MAG (Lote n ° 2532050), 46- 645MAG (Lote No. 46645M-1K). Cada amostra foi testada em duplicado. as diluições foram preparadas em diluente de amostra para carregar um alvo de aproximadamente 25 ug de proteína por poço para todas as determinações no total e fosforilada de analito. os kits Millipore foram usadas de acordo com as eespecíficoações do fabricante.

[00383] Os tumores tratados com PB4188 mostrou um aumento na expressão de Akt, em comparação com tumores não tratados. A fosforilação de AKT foi completamente inibida por PB4188 tanto após uma dose bi-semanal como depois de uma dose quatro vezes por semana (Figura 32). Análise Fosfoproteína por ensaio VeraTag

[00384] Tumores (100 mm3 ou 400 mm3) de camundongos transplantados JIMT-1 tratados com 1 ou 2 doses de doses de PB4188 foram removidos e fixados em 10% de formalina tamponada neutra. Os camundongos portadores de 100 mm3 de tumores foram sacrificados 24 horas após a dose única PB4188 (25 mg / kg), enquanto que os camundongos portadores de 400 mm3 de tumores receberam duas doses semanais de 25 mg / kg e foram sacrificados 4 h após a dosagem. Em seguida, as amostras foram embebidas em parafina.

[00385] Secções de 7 um de espessura foram cortadas com um micrótomo (Leica) e colocados em lâminas de vidro carregadas positivamente (VWR) com o número de série marcado. As lâminas foram de 30 min e em seguida cozido em conjunto um forno aquecido a 60 ° C. As amostras de Próxima foram processadas para análise VeraTag diferente seco ao ar. análise total HER2 (HT2) de acordo com a publicação de pedido de Patente US No. 12/340,436, análise HER3 total (H3T), de acordo com a Patente US N ° 8,349,574; Patente US Appl. No. 2013/0071859 e finalmente o heterodímero HER2HER3 (H23D), HER3pY1289 (H3pY1289) e HER3-PI3-quinase (H3PI3K) de acordo com o pedido de Patente internacional. N ° PCT/US2014/033208. Em ambos os regimes de dosagem uma redução mediada PB4188 significativa em dímeros HER2:HER3 tornou-se aparente em comparação com controlos não tratados. Não se observou qualquer diferença no total de HER2, HER3 ou fosforilada HER3 entre PB4188 tumores tratados e controlos. Os tumores que foram analisadas após 4H PB4188 dosagem apresentaram uma redução significativa em HER3-p85 (PI3K), em comparação com controles não tratados. PB4188 reduz a progressão do ciclo celular em células cancerosas HRG-estimuladas

[00386] A capacidade de PB4188 para influenciar a progressão do ciclo celular foi investigada em linhas celulares de câncer que expressam vários níveis de proteína de HER2. HER2 + (MCF-7), HER2 +++ (JIMT- 1, SK-BR-3 e células N87) células foram semeadas em meio de ensaio (células MCF- 7: RPMI- 1640, 0,05% de BSA, 10 μg/ml de Holo-transferrm, piruvato de sódio 1 mM, NEAA MEM; JIMT- 1: DMEM, 0,05% de BSA, 10 μg/ml de Holo-transferrm; SK BR 3-células:DMEM / F- 12, 2 mM de L-glutamme, 0,05% de BSA, 10 μg/ml de Holo-

transferrm; N87: células RPMI- 1640, 0,05% de BSA, 10 μg/ml de Holo-transferrina). Por poço da placa de 24 poços, 300,000 MCF-7, ou 400.000, 150.000 N87 ou SK-BR-3 ou 150,000 JIMT- 1 ou células semeadas em 1 ml de meio de ensaio e incubadas durante a noite a 37 ° C, 5% C02, em 95 % humidade relativa. No dia seguinte, PB4188 ou pertuzumab + trastuzumab ou PG3178 ou PG1337 foram adicionados às células, na presença de uma concentração final de HRG de 1 ou 100 ng / ml. Após 24 horas (para JIMT- 1, N87 ou SK-BR-3 células) ou 48 horas (para as células MCF-7) de incubação a 37 ° C, 5% C02, em 95% de humidade relativa, as culas foram suplementadas com EdU ( 10 μΜ concentração final) durante 2 horas antes de serem colhidas e coradas para EdU incorporação utilizando o clique sobre ele EdU kit AlexaFluor488 de acordo com as instruções do fabricante (Life-Technologies, C10425 cat.no.). Pelo menos 30 minutos antes da análise das células por citometria de fluxo em FACSCanto, as células foram incubadas com 200 nM FxCycle corante vermelho longínquo (Life Technologies, N ° de Cat F10348) e 100 ug / ml de RNAse A (Life Technologies, N ° de Cat 12091-039). Os eventos foram adquiridos no canal AlexFluor488 (para detecção EdU) e no canal de APC (por mancha de DNA total com o corante FxCycle). Os dados foram analisados por gating células individuais em um FSC-largura vs gráfico de dispersão FSC-altura, e subgating as fases G0 / G1, S e G2M do ciclo celular em uma APC vs. AlexaFluor488 gráfico de dispersão, como EdU n ¾APO, Edut > 0S e EdU m, SAPC oi e h populações, respectivamente.

[00387] Os dados são representados como o índice de proliferação calculado dividindo-se a percentagem de células na S e G2 / M por fases a percentagem de células na fase G0 / G1. A Figura 34 mostra que PB4188 é sempre mais potente do que PG3178 ou pertuzumab + trastuzumab na inibição da proliferação induzida por um padrão (1 ng / ml) ou uma alta (/ ml 100 ng) concentração de HRG. Em concentrações altas de HRG PB4188 ainda inibe a progressão do ciclo celular.

[00388] PB4188 induz a internalização do receptor

[00389] Padrão internalização dos anticorpos foi medido usando corantes sensíveis ao pH. Isto tem sido descrito na técnica em WO2013134686 Al onde tais corantes, quando acoplado a um anticorpo, exibir um sinal de fluorescência aumentada quando exposta a pH mais baixo. Isto ocorre quando os anticorpos acoplados com corante internalizarem a partir da superfície de células-alvo em endossomas ligeiramente ácidas (pH 6-6,5) para os lisossomas ácidas (pH inferior a 5,5). Para investigar se PB4188 internaliza nas células cancerosas, o anticorpo foi acoplado ao corante sensor de pH com éster de succinimidilo grupo reativo (Promega, N ° de Cat CS1783A01) de acordo com as instruções do fabricante. Como comparadores, anti-HER2 (trastuzumab, pertuzumab, PG3958), foram incluídos anticorpos corantes anticorpo anti-HER3 (PG3178, # AB6) e controlo negativo (toxina anti-tétano, PG1337). SK-BR-3 e N87 células cancerosas que super-expressam HER2 de uma cultura exponencial cultivadas foram recolhidas e semeadas em placas de 96 poços (15xl0 3 células por poço) em meio de ensaio (células 100 μl de N87: RPMI- 1640, 0,05% de BSA, 10 ug / holo ml de transferrina, as células SK-BR-3: DMEM / F- 12, 2 mM de L-glutamina, 0,05% de BSA, 10 ug ml de Holo-

transferrina) contendo 1 ng / ml HRG e incubadas durante a noite a 37 ° C, 5% C02 , em 95% de humidade relativa. No dia seguinte, os anticorpos marcados com corantes sensíveis ao pH 20 μΐ foram adicionados para alcançar uma concentração final de 100 nM e as células foram incubadas durante a noite a 37 ° C, 5% C02, em 95% de humidade relativa. No dia seguinte, as células foram recolhidas por recolha de células não-aderentes e células aderentes trypsinizing. Depois de lavar as células com tampão de SCAF (. STP contendo 0,5% de BSA a 0,1% de azida de sódio), as células foram coradas com APC marcada com IgG anti-humano (Jackson Immunoresearch, 109-136-098 cat.no., diluição 1: 100). As células foram analisadas por citometria de fluxo em FACSCanto (BD Biosciences) medir as intensidades de fluorescência mediana (MFI) dos canais de PE e APC para determinar a internalização e a superfície residual de ligação de anticorpos, respectivamente. Os dados apresentados na Figura 35 mostram que PB4188 internaliza ao mesmo estender como trastuzumab, ao passo que a combinação trastuzumab + pertuzumab conduz à internalização melhorada. A combinação de trastuzumab + pertuzumab reduz o ADCC, em comparação com o trastuzumab sozinho (Figura 36). Portanto, prevê-se que o nível de internalização PB4188 deixa a potência ADCC afetados. Geração e caracterização da variante 3178 de anticorpos anti- HER3

[00390] As variantes de anticorpo anti-HER3 MF3178 foram concebidos com o objetivo de melhorar as propriedades de anticorpos. As mutações foram introduzidas na região VH de quadro do gene 1 (FR1), uma região determinante de complementaridade (CDR1), FR2, CDR2 e / ou FR3, CDR3 e FR4, enquanto não foram modificados.

O desenho incluído, mas não se limitam a, mutações que foram introduzidas para remover modificação pós-translacional motivos (PTM) (por exemplo, alterando o motife NS desamidação para NQ), para reduzir a hidrofobicidade de superfície (por exemplo, alterando I T) ou a aumentar o ponto iso-eléctrico (pi; por exemplo, alterando a Q K). Todos as 20 variantes (Ver Figura 37) foram expressas como anticorpo biespecífico combinado com um (TT) do braço com o toxóide tetânico e testados no ensaio funcional MCF-7 e todos os 20 variantes tinham uma potência semelhante à do anticorpo MF3178 neste formato.

Todos as 20 variantes foram também testadas neste formato em FACS em uma titulação para a ligação a células MCF-7 e todas as variantes tinham perfis de ligação muito semelhantes, sugerindo que as afinidades de todas as variantes são semelhantes.

Três variantes de MF6058, MF6061 e MF6065 foram selecionados para mais experiências que contêm dez, três e sete mutações de aminoácidos, respectivamente (ver sequcias na Figura 16E e Figura 37). O monoespecífico correspondente IgGl PG6058, PG6061 e PG6065 foram produzidas e purificadas em larga escala.

Como mostrado na Figura 38, a atividade inibidora das três variantes do ensaio de linha de células de proliferação N87 HRG-dependente é semelhante ao do PG3178. O perfil CIEX-HPLC das três variantes foi semelhante ao de PG3178 com respeito a cobrar heterogeneidade bem como largura do pico e a simetria, como mostrado na Figura 39. O tempo de retenção (tR) do pico principal correlacionada com aproximadamente o pi de os anticorpos, ou seja, maior do pi resultou no tempo de retenção mais longo. Na concepção de anticorpos biespecíficos ou misturas de anticorpos, seleção de variantes de anticorpos com óptima Tr é valioso desde purificação dos componentes de anticorpo desejados utilizando CIEX pode ser facilitada. Exemplo 2

[00391] Determinou-se a eficácia do anticorpo biespecífico MCLA-128 dirigido contra HER2 e HER3 em ratos com tumores intracranianos PDX. A eficácia de MCLA-128 foi comparada com o t-DM1. Além disso, a combinação de MCLA-128 e T-DMlwas em comparação com tratamentos de agente único. Animais

[00392] O estudo foi realizado em 43 camundongos fêmea NMRI nu (incl. 11 animais sobressalentes) (encomendados com um quadro de uma semana de tempo, cerca de 6 semanas de idade com a mesma idade) do estoque de Janvier Labs, França. Alojamento dos animais e manipulação Monitoramento clínico:

[00393] Os ratos foram examinados clinicamente na chegada ao Departamento de Medicina Experimental, Torre

10.3, Universidade de Copenhaga de acordo com os procedimentos padrão da unidade animal. pessoal educado sob supervisão veterinária lidou com a ratos. Todos os animais eram saudáveis e nenhuma decisão relativa ao bem-estar foram feitas. Aclimatação:

[00394] Um período de aclimatação de 14 dias foi deixado, antes do início dos procedimentos experimentais. Habitação e meio ambiente:

[00395] Os animais foram alojados num biotério de laboratório. O biotério estava iluminado para dar um ciclo de l2 horas de luz e 12 horas de escuridão. Luz estava acesa a partir das 06:00 h às 18:00 h. Os camundongos foram alojados em gaiolas tipo IVc III, TECHNIPLAST (820 cm2, altura 15,5 cm, no máximo 8 / mínimos 2 ratos por gaiola). Os animais foram monitorados por técnicos animais diariamente, enquanto os veterinários monitorar a instalação de animais a cada dois meses ou a pedido dos técnicos. Cada gaiola foi marcada com números de pelo menos ID estudo, grupos e animais e composto de teste. As gaiolas foram equipadas com um inserto de plástico descartável após a implantação do tumor intracraniano. Estrato:

[00396] O estrato era de madeira Aspen, de Brogarden / Finn Tapvei Oy, FIN-73620 Kortteinen, Finlândia. O estrato foi trocado a cada duas semanas. Melhoramento ambiental:

[00397] Aos animais foram oferecidos uma fonte de material de assentamento, Brogarden, em cada mudança de estrato. Além disso, cada gaiola continha varas de madeira a partir de Brogarden / Finn TapveiOy, FIN-73620 Kortteinen, Finlândia e feito à medida que esconde vermelho de plástico transparente. Dieta e água potável:

[00398] A ração peletizada completa "Altromin 1319 ", uma dieta de manutenção de ratos e camundongos, estava disponível ad libitum e trocado a cada 14 dias. Os animais tiveram livre acesso à água da torneira mudadas semanalmente.

Água para beber foi suplementada com estrogénio após a implantação do tumor intra-craniano. Endpoints humanos

[00399] Os animais foram sacrificados por razões humanitárias. As razões humanas para a extinção de um animal incluídos, mas não estão limitados a, casos em que os animais apresentam sinais de permanente sofrimento, dor ou medo. terminais humanas específicas para o estudo são regidas por um sistema de pontuação listados na Tabela 16. Quando indicado, os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical. Métodos

[00400] A linha de tempo para o estudo é apresentado na Tabela 17. Implantação de tumor intracraniano

[00401] Um tumor ST1360B PDX subcutânea (4 th passagem) cultivadas num camundongo nu NMRI foi colhido, por favor ver a Figura 41 para a curva de crescimento do tumor. Os camundongos portadores de tumores foram ST1360B suplementado com estrogénio após a implantação do tumor. O tumor foi lavado com PBS e aparado para tecidos conjuntivos residuais na superfície. O tumor foi cortado em pequenos pedaços e digerido com Accutase e colagenase IV para dar uma suspensão de células individuais. A digestão foi parada pela adição de meio contendo soro fetal de bovino e a suspensão de células foi filtrada através de um filtro de 100 pm, lavadas em PBS e ressuspensas em PBS. Aviabilidade das células de tumor foi verificada por coloração com azul de tripano e a concentração final foi de 18 milhões de células viáveis / ml. A viabilidade de células totais era superior a 80%. Não havia nenhuma diferença entre as células do estroma ou células tumorais e as soluções que também contêm alguns detritos celulares. O ST1360B demonstrar uma celularidade alta tumor. As células foram mantidas em gelo até à inoculação.

[00402] Os camundongos foram anestesiados por Hypnorm / midazolam (1 ml / 100 g de peso corporal) e colocados em uma grelha estereotáxica para fixação da cabeça. Uma incisão longitudinal foi feita no couro cabeludo expondo a calvária. Um furo foi perfurado no mm direita da sutura talis saggi e 0,5 mm posterior ao bregma usando um micro-broca crânio 1,5. Dez ul da suspensão de células (180,000 células) foi injetado a uma profundidade de 2-2,5 mm, com um caudal de 60 nl / seg utilizando uma seringa de 100 μΐ com uma agulha de calibre 25 colocada em uma bomba de infusão de micro. A agulha foi deixada durante 3 minutos, antes de ser retirado. Bupivacaína (0,2 mg / 100 g de peso corporal) e lidocaína (1 mg / 100 g de peso corporal) foram administradas no local da incisão para anestesia local e a pele foi fechada com uma sutura. Os camundongos foram perfurados orelha para identificação e devolvidos às suas gaiolas, onde foram monitorizados até totalmente recuperado da anestesia. Os camundongos foram monitorizados pelo menos duas vezes por semana (de peso e sinais clínicos) após a inoculação do tumor e mais frequentemente se sinais clínicos ou a perda de peso estava presente. Imagem RM

[00403] O desenvolvimento tumoral foi monitorizado duas vezes por semana por imagem ponderada-T2 MR (axial e coronal). A primeira sessão de imagem foi de 19 dias após a inoculação do tumor. Os animais foram anestesiados durante as sessões de imagem MR (sevollurane, 2-4% em ar ambiente suplementado com 100% (32 a, aproximadamente, 4: 1).

[00404] Arrolamento no estudo baseou-se em dois aparelhos de ressonância magnética patológicas que mostram o crescimento do tumor e um volume do tumor de cerca de 10- 20 mm3. Os camundongos que satisfazem os critérios de inclusão foram divididos aleatoriamente em um dos quatro grupos. Os primeiros 32 camundongos que cumprem os critérios de inclusão foram incluídos no estudo. Os murganhos foram distribuídos aleatoriamente para que todos os grupos apresentados com o mesmo volume médio do tumor no início do tratamento. Terapia

[00405] Os murganhos foram doseados com qualquer um, veículo, MCLA- 128, T-DM1 ou MCLA- 128 + T-DM1 de acordo com a Tabela 18. As drogas foram diluídas em soro fisiológico estéril antes de cada dosagem. Os ratos foram colocados sob uma lâmpada de aquecimento durante cerca de 5- 10 minutos antes da injeção do composto de teste para realizar o processo mais rápido e fácil quanto possível. O rato foi colocado em uma caixa de cauda e conter o composto teste foi administrado na veia lateral da cauda como uma única (iv) dose de bolus intravenoso. O volume de dosagem era 5,0 ml / kg. Terapia pós RM e monitoração de peso

[00406] O crescimento do tumor foi monitorado duas vezes por semana por imagem ponderada-T2 MR (axial e coronal) para as primeiras duas semanas após o início da terapia e semanalmente até 6 semanas após a terapia. Os animais foram anestesiados durante as sessões de imagiologia MR (sevoflurano, 2-4% em ar ambiente suplementado com 100% 02 a, aproximadamente, 4:1).

[00407] Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical, em uma base individual, devido a pontos finais humanas, Tabela 16. O cérebro com tumor foi ressecado e preservados em formaldeído a 4% durante 24-48 horas e transferidas para 70% de etanol. O fixador: proporção tecido era, pelo menos, 20:1. Análise de imagem

[00408] Os volumes dos tumores foram medidos nas imagens por desenho região de interesse (ROI) sobre as fatias individuais e o cálculo do volume de ROIs. ROIs foram desenhados em ambos o axial e cortes coronais e a média do volume do tumor nos dois planos foi utilizado como o volume do tumor. Edema no cérebro foi marcado manualmente em uma escala de 0-4, onde o marcador em 0 havia edema cerebral ea pontuação 4 indica edema cerebral maciça, consulte a Figura

42. A análise das imagens foi realizada utilizando Horos. (Horos Projeto (2017). I.) a visualização de imagens I COM e de medição. [Horos]. http://www.horosproject.org/). Resultados Inclusão e randomização

[00409] Os primeiros animais foram incluídos no estudo, 23 dias após a implantação de tumor intracraniano. As datas de inclusão e o volume do tumor a inclusão de todos os animais são listados na tabela 19. O volume e o peso do tumor de ratos no grupo de AD na inclusão são apresentados na Figura 43. Não houve diferença no peso corporal ou o volume do tumor foi observada entre os grupos (one-way ANOVA, p = 0,43 (em peso) e p = 0,92 (volume do tumor) Figura 43: peso do corpo e o volume do tumor no momento da inclusão de camundongos no grupo AD Não houve diferença no peso ou volume tumoral foi observada entre os grupos (one-way ANOVA, p = 0,43 (peso corporal) e p = 0,92 (volume do tumor). Monitoração pós terapia

[00410] T2-ponderado MRI foi realizada no dia 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35 e 42 pós-iniciação da terapêutica para medir o volume do tumor intra-craniano. O volume do tumor pós iniciação significativo de terapia para cada grupo é representada na Figura 44. Os volumes tumorais individuais para os animais em cada grupo são apresentados na Figura 46-

49.

[00411] As imagens ponderadas em T2 representativos de camundongos são apresentados nas figuras 50-53. O crescimento do tumor foi inibido em camundongos tratados com T-DML e T-DML + MCLA-128, ao passo que um atraso do crescimento do tumor foi observada em camundongos tratados com MCLA- 128 em comparação com camundongos tratados com veículo. Houve uma diferença significativa no volume do tumor de 10 dias pós-terapia (p = 0,009, ANOVA com um fator), e o volume mio de tumor de t-DML e T-DM1 + MCLA-128 camundongos tratados era significativamente menor em comparação com camundongos tratados com veículo (p <0,05, corrigido para comparações múltiplas; Tukey).

[00412] O peso dos camundongos foi monitorado após o inicio da terapia. O peso médio dos camundongos em grupos diferentes é mostrado na Figura 45. medições de peso para cada rato nos diferentes grupos está apresentada na Figura 54-57 tanto em gramas e como percentagem de alteração em relação ao peso no momento da inclusão. É evidente a partir das medições de peso individuais que a maioria dos ratos perderam peso antes das humanas de pontos finais foram satisfeitas. Pontuação de edema cerebral

[00413] Estase tumoral (presença de tumor sem crescimento) foi observada para os animais dos grupos B e D. Avaliação das imagens de RM mais próximas do tempo de sacrifício mostrou que alguns animais apresentaram edema cerebral. Isso poderia contribuir para a condição de deterioração dos ratos e da necessidade de eutanásia. Edema no cérebro foi marcado manualmente em uma escala de 0-4, 0 indicando nenhum edema cerebral e 4, indicando edema cerebral massivo (Tabela 20 e Figura 58). Houve uma tendência para o aumento do edema nos grupos tratados com T-DML (grupo B e D). No entanto, não houve diferença significativa no edema cerebral entre os dois grupos foi encontrado (teste não paramétrico de Kruskal-Wallis). Devem ser tomadas precauções na interpretação dos resultados, como o marcador para o edema não foi realizada no mesmo ponto de tempo ou na altura da eutanásia. Além disso, os volumes dos tumores foram diferentes entre os grupos, o que também pode influenciar o edema cerebral. Como tal, o estudo não foi desenhado para investigar a influência do tratamento e edema cerebral em detalhe.

Análise de sobrevida

[00414] Os camundongos foram sacrificados devido a pontos finais humanas de acordo com a Tabela 16. Apesar de monitorização exaustiva, quatro murganhos foram encontrados mortos nas gaiolas durante o estudo. Nenhum material de tumor ex vivo foi preservada a partir de animais que foram encontrados mortos na gaiola. Kaplan-Meier de dados de sobrevivência para todos os grupos estão representados na Figura 59. As curvas de sobrevivência foram significativamente diferentes (p <0,0001, log-rank). A sobrevivência mediana para veículos, t-DM1, MCLA-128 e T-DM1 + MCLA- 128 animais foi de 13, 19,5, 29 e 42 dias após o inicio da terapia, respectivamente. Curvas de Kaplan-Meier de pares estão representados na Figura 60. A (log-rank) significativa foi observada maior sobrevida médio para o t- DM1 comparativamente com o veículo (19.5vs. 13 dias, p = 0,020), MCLA-128 comparativamente com o veículo (29 vs 13 dias, pO.0001), e T-DML + MCLA-128 comparativamente com o veículo (42 vs 13 dias, p <0,0001). Não houve diferença na sobrevivência mediana foi visto para MCLA- 128 vs. T-DM1 (29 vs 19,5 dias, p = 0,10, log-rank). Os ratos tratados com T- DM1 + MCLA- 128 teve uma significativa (log-rank) maior sobrevida médio em comparação com os ratos tratados com T- DM1 (42 vs 19,5 dias, p = 0,0005) ou MCLA- 128 (42 vs 29 dias, p = 0,013). Discussão

[00415] T-DM1 e + MCLA-128 inibiu o crescimento tumoral T-DM1, enquanto MCLA-128 mostraram atraso no crescimento do tumor determinado por ressonância magnética ponderadas em T2. A sobrevivência mediana para veículo, t- DM1, MCLA-128 e T-DM1 + MCLA- 128 camundongos tratados foi de 13, 19,5, 29 e 42 dias após o início da terapia, respectivamente. Ratos tratados com 128 MCLA- tinham uma sobrevivência significativamente maior em comparação com animais tratados com veículo (29 vs 13 dias, pO.0001), e ratos tratados com T-DM1 + MCLA-128 tinham uma sobrevivência significativamente mais longa média em comparação com os camundongos tratados com T-DM1 (42 vs 19,5 dias, p = 0,0005) ou MCLA- 128 (42 vs 29 dias, p = 0,013). Observou-se uma tendência para o aumento do edema nos grupos tratados com T- DML (grupo B e D). No entanto, não houve diferença significativa no edema cerebral entre os dois grupos foi encontrado (teste não paramétrico de Kruskal-Wallis). Em conclusão, MCLA- 128 mostrou eficácia na sobrevivência de ratos com tumores intracranianos ST1360BPDX tanto como um agente único ou em combinação com t-DML. Exemplo 3: Estudo de Fase II de combinações baseadas-MCLA- 128 no câncer da mama metastático (MBC): MC LA- 128 / trastuhumzab / quimioterapia em MBC HER2-positivos

[00416] Enquanto o Exemplo descreve a administração de MCLA- 128 / trastuzumab / quimioterapia, o Exemplo não se destina a ser limitativo para o uso desta agentes terapêuticos específicos estabelecidos, e aplica-se aos anticorpos biespecíficos descritos de ErbB-2 e ErbB-3 de ligação em combinação com um agente de ligação de ErbB-2, incluindo um agente inibidor e quimioterapia.

OBJETIVOS HER2 positivo / amplificado MBC): MCLA-128 + trastuzumab ± vinorelbina

[00417] Objetivo primário: • Avaliar a eficácia de MCLA-128 combinados com trastuzumab ± vinorelbina em termos de taxa de benefício clínico (RBC) em 24 semanas com base na RECIST 1.1 (por avaliação do investigador) em doentes MBC positivos para HER2 / amplificados que tenham progredido em terapia prévia dirigida-HER2 que incluiu trastuzumab com pertuzumab, e um conjugado de droga anticorpo HER2 (ADC)

[00418] Objetivos secundários: • Avaliar CBR em 24 semanas com base em RECIST 1,1 por revisão central • Avaliar a sobrevida livre de progressão (PFS; por investigador e revisão central) • Avaliar a taxa de resposta global (TRG) com base em RECIST 1.1 (por investigador e revisão central). • Avaliar a duração da resposta (DOR) com base na vl.l RECIST (por investigador e revisão central) • Avaliar a sobrevida total (OS) • Avaliar a segurança e tolerabilidade do MCLA-128 em combinação com trastuzumab ± vinorelbina • Caracterizar farmacocinética (PK) de MCLA-128 em combinação com trastuzumab ± vinorelbina • Caracterizar imunogenicidade de MCLA-128 em combinação com trastuzumab

[00419] objetivo exploratório: • avaliar potenciais correlações entre biomarcadores em amostras de tumor ou do sangue e a atividade anti-tumor (incluindo HER2, HER3, HER2: HER3 dímeros, heregulina e outros biomarcadores potenciais)

MODELO DE ESTUDO

[00420] Uma fase 2, de rótulo aberto, estudo multicêntrico internacional é realizado para avaliar a eficácia das combinações baseadas em 128 MCLA- em duas populações de câncer da mama metastático (MBC), HER2- positivos / amplificado. Dois tratamentos combinados são avaliados em 15-20 locais em 7 países na Europa e nos EUA.

[00421] Os pacientes com HER2-positivos / MBC amplificado, tendo confirmado a super-expressão de HER2 por imunohistoquímica (IHC) 3+ ou IHC 2+ combinado com fluorescência positiva de hibridação in situ (FISH), que tenham progredido per RECIST vl.l em 2 a 4 linhas de HER2 terapia dirigida no adjuvante / neoadjuvante, localmente avançado / metastático configuração incluindo trastuzumab com pertuzumab e um HER2 ADC são elegíveis. Para a inscrição, o status HER2 é baseado em registros médicos, e elegibilidade é confirmado posteriormente, logo que possível, pela revisão laboratório central. Pacientes consideradas inelegíveis retrospectivamente não ser avaliáveis para o objetivo principal e pode ser substituído. prova de imagem documentada de progressão da doença na última linha antes da terapia devem ser disponibilizados quando possível.

[00422] Inicialmente MCLA- 128 é administrado com trastuzumab (combinação dupla). Segurança é revisado por um

Comitê de Monitoramento de Dados Independentes (CIMD). Depois da segurança do dupleto foi avaliada, MCLA-128 + trastuzumab + vinorelbina (combinação tripleto) é avaliada em paralelo com a combinação dupleto (ver Figura 61).

[00423] As combinações dupleto e tripleto são ambos avaliados em duas etapas com uma segurança inicial de run- in, em 4 a 6 pacientes que são revistos pelo CIMD, seguido de uma expansão eficácia coorte, como descrito abaixo. A combinação tripla go / no-go decisão é tomada após a avaliação dos pacientes correm-in de segurança gibão pelo IDMC. A expansão eficácia de ambas as combinações continua em paralelo.

[00424] Segurança run-in: Depois de 4-6 pacientes receberam pelo menos 2 ciclos completos (6 semanas) de MCL A-128 + trastuzuniab, uma avaliação de segurança é realizado pelo CIMD, Se a combinação dupleto é considerado seguro, a segurança run- em combinação para o tripleto é iniciada. Segurança do tripleto é avaliada após 4-6 pacientes receberam pelo menos 2 ciclos completos (6 semanas) de MCLA-128 + + trastuzuniab vinorelbina pelo CIMD.

[00425] Com base na segurança observada nos primeiros 4-6 pacientes (eventos adversos [AES], eventos adversos graves [PEA], relação com o fármaco do estudo e outros parâmetros relevantes clinicamente [por exemplo, parâmetros laboratoriais], disponível PK, imunogenicidade, e os dados de citocinas ) o CIMD, investigadores e Patrocinador decidir sobre um potencial período de ain-in adicional para cada combinação (isto é, dupleto e tripleto).

[00426] Expansão: Após a segurança de run-in, cada terapia de combinação considerada tolerável pela CIMD é expandido para um total de até 40 pacientes avaliáveis para eficácia.

POPULAÇÃO DE ESTUDO

[00427] Critério de inclusão

[00428] Os doentes têm de cumprir todos os seguintes requisitos para entrar no estudo:

1. Ter assinado consentimento informado antes do início de quaisquer procedimentos do estudo.

2. As mulheres com diagnóstico histológico ou de citologia da mama confirmou com evidência de metástase ou doença localmente avançada não passível de qualquer terapia local com intenção curativa:

[00429] uma. Documentado super-expressão de HER2 / amplificação, como definido por imuno-histoquímica (IHQ) 3+ positivo, ou IHC 2+ combinado com fluorescência positiva de hibridação in situ (FISH), com base na análise local na biópsia do tumor mais recente (de preferência, metastizado, caso contrário primário), quer fresca ou de arquivo recolhido no prazo de 12 meses antes de triagem.

[00430] b. progressão da doença documentada (por avaliação do investigador) de 2 a 4 linhas de terapia dirigida-HER2 administrado no adjuvante / neoadjuvante, localmente avançado configuração / metastático; trastuzumab mais pertuzumab e um conjugado de droga anticorpo HER2 (por exemplo, t-DM1) devem todos tenham sido previamente administrados (em qualquer ordem).

[00431] 3. doença mensurável, tal como definido por RECIST versão 1.1 por métodos radiológicos na ou após a mais recente linha de terapia.

[00432] 4. Idade > 18 anos na assinatura do consentimento informado.

[00433] 5. Grupo Eastern Cooperative Oncology (ECOG) performance status de 0 ou 1.

[00434] 6. Expectativa de Vida de > 12 semanas, de acordo com o investigador.

[00435] 7. Fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE) > 50% pelo ecocardiograma (ECHO) ou varredura aquisição fechado múltipla (MUGA).

[00436] 8. função de órgão adequada: a. Contagem absoluta de neutrófilos (ANC)> 1,5 x 10 9 / L b. Hemoglobina> 9 g / dL c. As plaquetas> 100 x 10 9 / L d. O cálcio do soro dentro dos limites normais (ou corrigido com suplementos) e. alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST) <2,5 vezes o limite superior do normal (LSN) e biliaibin total de <1,5 x LSN (no caso de envolvimento do fígado, ALT / AST <5 x LSN e bilirrubina total dentro de intervalos normais é permitido ) f. A creatinina do soro <1,5 x ULN ou depuração da creatinina > 60 mL / min calculado de acordo com a fórmula Cockcroft e Gault ou MDRD para os doentes com idade> 65 anos g. albumina Seaini> 3,0 g / dL

[00437] Terapias de investigação e companhia

[00438] MCLA-128: Dose plana 750 mg por via intravenosa ao longo de 2 horas, 1 dia a cada 3 semanas (q3w).

[00439] A pré-medicação com paracetamol / acetaminofeno, anti-histamínicos e corticosteróides (como por práticas padrão) é obrigatória para cada infusão MCLA-

128.

[00440] Trastuzumab: 8 mg / kg de dose de carga intravenosa ao longo de 90 minutos no dia 1 do ciclo 1, em seguida, a partir do ciclo 2, 6 mg / kg é administrada intravenosamente ao longo de 30-90 minutos, no dia 1 de cada ciclo, q3w. Por razões de segurança executado-em pacientes, a administração trastuzumab é adiada para o dia 2 no Ciclo

1.

[00441] Vinorelbina: 25 mg / m 2 por via intravenosa durante 10 minutos, Dias 1 e 8, a cada 3 semanas. Por razões de segurança executado-em pacientes, a administração vinorelbina é atrasada para Dias 2 e 9 no Ciclo 1.

[00442] Regimes de tratamento

[00443] Para todas as combinações de um ciclo é considerado 3 semanas. Um período de observação de 6 horas é implementado seguinte início de infusão para a administração inicial trastuzumab MCLA-128 e / ou, e 2 horas para todas as administrações subsequentes.

[00444] combinação dupleto (ver Figura 62): • Segurança run-in (4-6 pacientes): para o Ciclo 1, MCLA-128 é administrado no dia 1, e trastuzumab no dia 2. A partir do ciclo 2, trastuzumab, é administrado no dia 1, 30 minutos após a conclusão do MCL A-128 administração. • Alargamento: para todos os ciclos, MCLA-128 é administrado no dia 1 seguido por

[00445] trastuzumab 30 minutos após o final da infusão MCLA-128.

[00446] combinação tripleto (ver Figura 63): · Segurança ain-em (4-6 pacientes): para o Ciclo 1, MCLA-128 é administrado no dia 1

[00447] seguido, 30 minutos mais tarde por trastuzumab, e vinorelbina é administrado nos Dias 2 e 9. A partir do ciclo 2, vinorelbina é administrado no dia 1, 30 minutos após o trastuzumab, e no Dia 8. • Alargamento: para todos os ciclos, MCLA-128 é administrado no dia 1, seguido 30 minutos mais tarde por trastuzumab, seguido de vinorelbina 30 minutos após o final da infusão trastuzumab.

[00448] Para ambos o gibão e as combinações tripleto, se um paciente individual não toleram todos os daigs no mesmo dia, a segurança de run-in Ciclo um esquema de dosagem é mantida para o paciente.

[00449] atribuição de tratamento: o Patrocinador atribui alternadamente pacientes elegíveis para a combinação dupleto ou tripleto, na segurança de run-in ou expansão como disponível por combinação.

[00450] Adaptação de tratamento • Não há redução da dose são permitidas para MCLA- 128 ou trastuzumab. • A dose vinorelbina é diminuída ou interrompida nos casos de contagens de neutrófilos diminuída ou níveis elevados de bilirrubina, de acordo com o CCP, e descontinuado se grau> 2 neurotoxicidade (NCI-CTCAE v. 4.03) ocorre.

· MCLA-128 infusão é interrompida no caso de uma reacção relacionadas com a infusão (TRR) e deve ser interrompido definitivamente para RRPs graves. Para eventos de ligeira a moderada a infusão pode ser retomado com uma taxa de infusão de 50% e a duração da infusão estendido a 4 horas. • MCLA-128 e trastuzumab, a administração pode ser retardada por um período máximo de 6 semanas entre as infusões de gerir EAs, eespecíficoamente para clinicamente significativa

[00451] FEVE diminui, sinais de insuficiência cardíaca congestiva ou persistente grau 2 ou diarreia de grau 3-4.

[00452] Duração do tratamento

[00453] O tratamento em estudo é administrado até doença progressiva confirmada (como por RECIST 1,1), toxicidade inaceitável, a retirada do consentimento, paciente não conformidade, o investigador decisão (por exemplo, a deterioração clínica), a interrupção do tratamento> 6 semanas consecutivas, a retirada de qualquer fármaco em estudo. Os pacientes são acompanhados por segurança durante pelo menos 35 ± 5 dias após a administração da droga último estudo e até que a recuperação / estabilização de toxicidades relacionadas, e para a progressão da doença e estado de sobrevivência durante 12 meses.

[00454] Medicação concomitante e profilática

[00455] Permitido · A administração de paracetamol / acetaminofeno,

anti-histamínicos e corticosteróides é obrigatória a cada administração MCLA-128. No caso de uma TIR ou hipersensibilidade, o paciente é controlado de acordo com a prática clínica local, como clinicamente indicado. • não é esperado que todos os medicamentos necessários para o bem-estar do paciente e que a interferir com a avaliação da DAIG estudo, incluindo o tratamento de suporte de sintomas e AEs ou tratamento padrão de condições concomitantes podem ser dadas à discrição do investigador.

[00456] Proibido · Concomitantes corticosteróides orais crónicas (> 10 mg / dia de prednisona equivalente), inibidores de TNF- alfa, anticorpos anti-células T (devido ao risco de imunossupressão). • Quaisquer fármacos investigacionais durante o estudo ou 4 semanas antes da primeira dose do tratamento de estudo. • terapia anticâncer sistémica ou vacina de febre amarela durante o estudo ou no prazo de 3 semanas após a primeira dose do tratamento de estudo.

[00457] Avaliações de segurança / tolerabilidade . parâmetros de laboratório AEs (CTCAE versão 4.03), SAEs • hematologia, bioquímica, coagulação, urinálise, citocinas. ECG, MUGA / ECHO • História médica, sinais vitais, performance status e exame físico · Medicações concomitantes • alterações da dose (reduções, interrupções,

atrasos), a interrupção devido à toxicidade • Avaliações da eficácia

[00458] A avaliação do tumor é baseado em TC / IRM com contraste por RECIST 1,1, a cada 6 semanas após o início do tratamento. respostas objetivas deve ser confirmada pelo menos 4 semanas após a primeira observação. revisão central da imagiologia por um radiologista independente (s) é realizada para todos os pacientes (triagem e on-estudo). exames ósseos são realizadas como clinicamente indicado para pacientes com metástases ósseas na linha de base ou suspeitas de lesões no estudo. Os marcadores tumorais (CA15-3, CEA, CA27-29) são avaliadas no dia 1 de cada ciclo.

BIOMARCADORES

[00459] Candidatos biomarcadores exploratórios são avaliadas em tecido tumoral (triagem, opcional após 12 semanas e EOT) e sangue (pré-dose no Dia 1 a cada 4 ciclos e final do tratamento).

[00460] Tumor: HER2, HER3, HER2: HER3 dimerização, proteínas de sinalização a jusante (por exemplo, PIK3CA), heregulina, fosforilação de HER2, HER3 e proteínas no MAPK e via de sinalização de AKT, expressão de inibidores tais como PTEN, mutações em genes relacionados com o câncer, incluindo HER2 e HER3 sinalização, fusão heregulina-gene.

[00461] Sangue: polimorfismo do receptor FCD, mutações de DNA de tumor em circulação no plasma, soro biomarcadores exploratórias (por exemplo HER2 solúvel, heregulina).

FARMACOCINÉTICA

[00462] As amostras de sangue são recolhidas para medir soro exposição MCLA-128 e trastuzumab.

[00463] Sem amostragem de PK é realizada para vinorelbina.

[00464] amostragem PK é realizada nos seguintes momentos:

[00465] Dupleto e tripleto combinações: MCLA-128 • Ciclo 1: Dia 1, antes da dose, EOI, e aos 2, 4 e 22 horas pós-MDI, em seguida, em qualquer momento, no Dia 8 (Dia ou 9 para a segurança de gerência em pacientes tripleto) • ciclo 2: Dia 1, pré-dose, a MDI (run-in e de expansão), e aos 2, 4 e 22 horas pós-MDI, em seguida, em qualquer momento, no Dia 8 (run-in única) • Ciclos 3 e 5: Dia 1, pré-dose e EOI • A cada 4 ciclos depois: antes da dose

[00466] combinação dupleto: trastuzumab • Ciclo 1 Dia 1: pré-dose e a EOI (expansão única) • Ciclo 1 Dia 2: pré-dose e a EOI (run-in única) • Ciclo 2 Dia 1: pré-dose e a EOI (run-in e expansão)

[00467] combinação tripleto: trastuzumab • Ciclos 1 e 2, Dia 1: pré-dose e a EOI (run-in e expansão)

IMMUNOGENICIDADE

[00468] As amostras de sangue (5 mL) são recolhidas em todos os pacientes para avaliar os tulos no soro de anticorpos anti-MCLA- 128 anticorpos pré-dose no Dia 1 de pré-dose, para uma Ciclos I, 3, 5, a cada 4 ciclos depois disso, e Final do Tratamento.

CITOCINAS

[00469] As amostras de sangue são colhidas para análise de um painel de citoquinas soro (TNFa, IFNy, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, IL-10) na segurança de gerência em pacientes da seguinte forma:

[00470] combinação dupleto (run-in apenas): • Ciclo 1: Dia 1, antes da dose, 2, 4, e 22 horas pós final da infusão (MDI) de 128 MCLA- · Ciclo 1: Dia 2, pré-dose, a 2 horas pós-EOI de trastuzumab • ciclo 2: Dia 1, antes da dose, 2, 4, e 22 horas pós-EOI de MCLA-128 combinação tripleto (run-in apenas):

[00471] Ciclos 1 e 2: Dia 1, antes da dose, 2, 4, e 22 horas pós-EOI de MCLA-128

[00472] Considerações estatísticas

[00473] O tamanho da amostra

[00474] Segurança run-in: 4 a 6 pacientes avaliáveis da segurança de run-in tem poder para detectar um EA com uma verdadeira incidência de 33% é de 80 a 90%.

[00475] Eficácia de expansão: 40 pacientes avaliáveis no combinação dupleto ou tripleto tem precisão adequada para excluir a 30% (limite inferior de 90% CI> 30%). O limiar para a taxa de RBC com 24 semanas é definida com base no pressuposto de que a PFS se segue uma distribuição exponencial, com uma média de 5 meses (clinicamente relevantes) e 3,5 meses (não clinicamente relevantes).

[00476] O número final de pacientes depende dos resultados de segurança e eficácia durante o estudo. Até - 130 pacientes são antecipados, permitindo um total de 40 pacientes em cada um dos dois regimes de combinação projectados e uma taxa de 10% de pacientes não avaliáveis.

[00477] Definições

[00478] Todos os parâmetros de eficácia são definidos e analisadas com base na avaliação do tumor por RECIST 1.1.

[00479] CBR: a proporção de pacientes com uma melhor resposta geral do CR, PR ou SD> 24 semanas.

[00480] TRG: a proporção de pacientes com melhor resposta geral do CR ou PR.

[00481] PFS: o tempo desde o início do tratamento até à progressão radiológico ou morte devido a qualquer causa.

[00482] proporção PFS: a proporção de PFS com o regime anterior, a PFS no tratamento do estudo.

[00483] Dor: o tempo de resposta (RC ou RP) até à progressão ou morte devido ao câncer subjacente.

[00484] OS: o tempo desde o início do tratamento até a morte devido a qualquer causa.

[00485] endpoints

[00486] primário

[00487] CBR por revisão investigador radiológica em 24 semanas

[00488] chave secundária

[00489] CBR às 24 semanas por avaliação central, e Orr, PFS, e DoR por investigador e revisão central

[00490] Outro secundário:

[00491] Segurança: incidência, severidade e relação de EAs, anormalidades laboratoriais, medições PEA, ECG e sinais vitais e FEVE

[00492] Tolerabilidade: suspensões devido a AEs, modificações de dose devido a AEs, imunogenicidade, e citocinas avaliações

[00493] Outras eficácias:

[00494] Farmacocinética: Cmax, Coi AUG, CL, V ss , t, lwx e ti / 2 para MCLA-128, e CEOI e de CO para o trastuzumab.

[00495] Populações de análise

[00496] população tratada: pacientes que recebem pelo menos uma dose de MCLA-128.

[00497] Avaliáveis para a eficácia: pacientes que recebem pelo menos 2 ciclos completos (6 semanas) de tratamento e têm sido objecto de avaliação da linha de base e uma avaliação do tumor no estudo, ou que interrompem o tratamento mais cedo devido a progressão da doença.

[00498] Análise

[00499] disposição do paciente e dados demográficos são analisados na população tratada, a eficácia é analisada no avaliáveis para a população de eficácia, segurança e é analisado na população tratada.

[00500] As variáveis quantitativas são resumidas meio de estatísticas descritivas. As variáveis contínuas são apresentadas como N, média e / ou mediana, desvio padrão, faixa. As variáveis categóricas são apresentadas usando freqüências e percentuais.

[00501] Critérios para o sucesso objetivo primário: A PFS mediana de 5 meses assume-se como relevante, com o limiar de atividade para CBR em 24 semanas definidas para 45%.

[00502] CBR e TGR são resumidos com acompanhamento de 90% CI binomial exata.

[00503] Para o PFS, e OS DoR a função de sobrevivência é estimada usando o método de produto limite de Kaplan-Meier; estimativas de probabilidade e os IC 90% é fornecido em pontos de tempo eespecíficoados; duração média e 90%> CI também é ser fornecido. DoR é estimado apenas para respondedores.

[00504] EAs são tabulados pelo Dicionário Médico para Atividades Regulatórias (MedDRA®) preferido prazo e por classe de órgãos de acordo com a incidência e severidade. Gravidade da AES é baseado em CTCAE 4,03.PK, imunogenicidade, citocinas e os biomarcadores são analisados centralmente e apresentados separadamente.

[00505] Tabelas:

[00506] Os títulos séricos dos diferentes grupos de camundongos imunizados tal como determinado por FACS. D = dia da determinação anticorpo título. Tabela 1: Resposta contra HER2. Tabela 2: resposta contra HER3. As linhagnes celulares utilizadas são indicadas (MCF7, SKBR3, BT474). Os diferentes camundongos estão nas colunas

[00507] Tabela 1, resposta anti-HER2 ErbB2 G, D0 K562 MCF7 SKBR3 BT474 A, D35 236 168 315 148 116 145 5909 5728 6147 5491 4838 4930 67748 29537 45315 44737 33508 38355 38707 18928 27240 24784 17659 18713 C, D42 163 144 154 152 166 2574 3212 2140 2346 2172 15448 17188 12627 12432 12067 10259 9669 7789 6618 6030 E, D35 129 134 152 132 147 157 6214 5542 5625 5634 4812 3905 27730 19765 26863 26232 19478 13968 22716 17413 19139 18317 16397 12787 G, D52 145 129 126 133 163 5752 5088 4268 4899 5240 22769 26157 16726 14633 15783 19413 16640 16424 16959 18633 Averag Averag Averag Averag e D0 130,8 e D0 194,4 e D0 300,2 e D0 241 5x 654 5x 972,2 5x 1501 5x 1205 10x 1308 10x 1944 10x 3002 10x 2410 20x 2616 20x 3889 20x 6004 20x 4819 30x 3924 30x 5833 30x 9005 30x 7229

[00508] Tabela 2, anti-HER3 resposta ErbB3 K562 MCF7 SKBR3 BT474 B, D56 332 356 453 535 417 645 1630 1236 3251 1401 1297 1814 1666 1100 3072 1199 1268 1503 1675 1204 3393 1380 1295 1725 D, D56 336 445 277 185 319 1159 3260 959 643 2362 964 2180 721 510 1577 1030 3754 945 584 2042 F, D35 265 245 249 285 291 262 4370 3985 3445 3428 3579 2718 4139 3378 2676 2659 2674 2414 4618 3690 3522 3144 3208 2776 H, D52 263 289 233 271 242 4083 4239 2970 4167 4584 5183 4319 3256 5408 5474 6326 4920 4542 6653 6938 Avera Avera Avera Avera ge D0 130 ge D0 172 ge D0 200 ge D0 222

2.5x 326 2.5x 430 2.5x 501 2.5x 556 5x 651 5x 859 5x 1002 5x 1112 10x 1303 10x 1718 10x 2004 10x 2223 20x 2605 20x 3437 20x 4008 20x 4446

[00509] Tabela 3

[00510] Armazenagem de anticorpos HER2 em função da sua reatividade com frango-humano-HER2 quimérico de reatividade e de rato HER2. 'Número' indica o número de anticorpos originais em cada grupo Grupo Reatividade do domínio Número 1 Domínio I específico 25 2 Domínio II específico 2 3 Domínio III específico 23 4 Domínio IV específico 7 Domínio IV específico + murine 5 cross-reactive 2 Reativo para todos os 6 constructos 2 7 Apenas realtivo para WT humano 4

[00511] Tabela 4

[00512] ELISA de competição utilizando IgG e anticorpos de fago. Quatro anticorpos IgG são usadas no ensaio de competição: de dois anticorpos que reconhecem HER2 domínio IV (trastuzumab e PG1849); um anticorpo que reconhece o domínio II (PG2971) e um controlo negativo de anticorpo anti-RSV. A perda do sinal é observada quando os fagos e o anticorpo codificado pelos mesmos genes da região variável são concorrentes; ou seja, MF1849 e PG1849 e MF2971 e PG2971.

- MF1849 MF2971 MF2708 Trastuzumab 0,046 1,02 1,115 0,044 PG1849 0,043 0,384 1,139 0,041 PG2971 0,042 1,202 0,091 0,042 Anti-RSV mAb 0,044 0,94 1,003 0,047 - 0,045 1,432 1,481 0,038

[00513] Tabela 5

[00514] Armazenagem de anticorpos contra HER3 em função da sua reatividade com a de rato -human- HER2 quimera de reatividade e de HER3 e dela de outras espécies. 'Número' indica o número de anticorpos únicos em cada grupo. Grupo Reatividade Número Alta reatividade no Domínio III, reativa em ratos e camundongos e menor 1 8 reatividade ao domínio IV Alta reatividade do Domínio III, rato, humano e citoc reativo, menor reatividade ao domínio IV 2 8 Reatividade para ratos, cyno e 3 HER3 hum 43 4 Reativo para HER3 humano 32 Reativo para todas as 5 construções 33

[00515] Tabela 6

[00516] A atividade funcional dos anticorpos monoclonais HER2 mais potentes em 1 ug / ml de IgG. atividade percentual em comparação com anticorpos de referência, ou seja, trastuzumab em SK-BR-3 e # AB6 em células MCF-7. Para anticorpos HER2 os domínios de todos os anticorpos excepto PG2926 foram mapeados para os domínios I, III ou IV. PG ID Alvo Epítopo Domínio SKBR- MCF-7 nr Bin HER2 3 PG2916 HER2 1 I 58% 30% PG2973 HER2 1 I 49% 58% PG3004 HER2 1 I 49% 56%

PG1849 HER2 5 IV 42% 22% PG3025 HER2 1 I 38% 28% PG2971 HER2 1 I 25% 51% PG3031 HER2 1 I 33% 38% PG2926 HER2 7 NA 0% 35% PG2930 HER2 3 III 0% 7%

[00517] Tabela 7

[00518] A atividade funcional dos anticorpos monoclonais contra HER3 mais potentes em 1 ug de IgG ml num ensaio de células MCF-7 dependente de HRG. atividade percentual em relação ao anticorpo de referência # AB6. PG ID Alvo Grupo de MCF-7 nr Epítopo PG3178 HER3 5 162% PG3163 HER3 5 119% PG3176 HER3 5 68% PG3099 HER3 3 ND

[00519] Tabela 8

[00520] Colorações de FACS de anticorpos HER2 por meio de que o HER2 VH é combinado com uma cadeia leve diferente do que a cadeia leve comum indicado na figura 16. IMF, indica Intensidade Média de Fluorescência no FACS. O número MF HER2 é indicado entre parêntesis, clones ligando HER2, no contexto da cadeia leve diferente são indicadas a cinzento.

MFI MFI PGnumber K562 cells (neg control) K562 HER2 PG4462 (MF2971) 267 14900 PG4463 (MF3958) 248 15600 PG4474 (MF2916) 254 14700 PG4478 (MF2973) 254 18000 PG4481 (MF3004) 267 16200 PG4482 (MF3025) 299 12000 PG4483 (MF3031) 260 14900 PG4465 (MF1849) 270 249 Anti-HER2 mAb 309 7618 Anti-RSV mAb 263 276

[00521] Tabela 9

[00522] A atividade funcional de ligação HER2 HER3 x anticorpos biespecíficos (indicada usando o prefixo PB; cada PB compreende um braço de HER2 e HER3 um braço, como indicado na tabela a) em comparação com anticorpos comparador nos dependentes de células MCF-7 e BxPC3 ensaios de HRG. Com base nos perfis de ligação usando anticorpos quiméricos constnicts HER2 e HER3 poderia ser separados ao longo de diferentes compartimentos. Para anticorpos HER2 os domínios exceto todos os anticorpos PG2926 poderia ser mapeado para os domínios I, III ou IV. Nome Braço Domínio Bracço HER3 MCF-7 BxPC3 HER2 HER2 HER3 bin arm IC50 % de (pM) inibição PB3441 2926 NA 3178 5 51,7 -24% PB3443 2930 III 3178 5 136 -31% PB3448 1849 IV 3178 5 371 -22% PB3565 2973 I 3178 5 30,9 -19% PB3566 3004 I 3178 5 7,9 -20%

PB3567 2971 I 3178 5 46,5 -17% PB3709 3025 I 3178 5 34,5 -19% PB3710 2916 I 3178 5 74,2 -19% PB3883 2971 I 3176 5 113 -19% PB3986 3025 I 3163 5 30,7 -21% PB3990 2971 I 3163 5 13 -18% PB4011 2971 I 3099 3 40,2 ND PB3437 3031 I 3178 5 14 -10% PG3178 NA NA 3178 5 139 -17% #Ab6 504 -7% trastuz. + pertuz. 352 ND trastuzumab 500 -3%

[00523] Tabela 10

[00524] afinidades de PB4188 e PB3448 monovalente para HER2 e HER3 de ligação, conforme medido em BIAcore. Ambos os anticorpos biespecíficos compartilham o mesmo braço HER3. ND, não feito. PB KD on Her2 KD on Her3 (nM) (nM) PB3448 5.4* ND PB4188 0.16* 3.9

[00525] Tabela 11 Regime 1 Gr. N Agente Veiculo mg/kg Rota Cronograma qwk x 4 (começa 1# 10 PBS X - ip no dia 1) qd x 28 (começa 2 10 lapatinib - 150 po no dia 1) qwk x 4 (começa 3 10 PB4188 - 2.5 ip no dia 1)

qwk x 4 (começa 4 10 PB4188 - 25 ip no dia 1) Pertuzumab + qwk x 4 (começa 5 10 - 2.5 ip Trastuzumab no dia 1) Pertuzumab + qwk x 4 (começa 6 10 - 25 ip Trastuzumab no dia 1)

[00526] Tabela 12.

[00527] Afinidades de 125 I-IgG marcada HER2xHER3 IgG (PB4188), HER3xTT (PB9215), HER2xTT (PB9216) e Herceptin (monoespecífico para HER2), tal como determinado através de medições de afinidade de células em estado estacionário com células BT-474 e células SK-BR-3. Os dados foram obtidos a partir de três experiências independentes. BT-474 SK-BR-3 Herceptin 3.7 ± 0.5 nM 1.3 ± 0.1 nM PB4188 3.2 ± 0.5 nM 2.0 ± 0.4 nM HER2xTT 3.9 ± 0.6 nM 2.3 ± 0.7 nM HER3xTT 0.23 ± 0.08 nM 0.99 ± 0.4 nM

[00528] Tabela 13. A significa reatividades de ligação das proteínas (e os intervalos indicados) para todos os resíduos críticos identificados. resíduos críticos envolvidos na PG3958Fab ligação foram identificados como aqueles mutados em clones que foram negativas para PG3958Fab de ligação (<35% WT), mas positiva para o mAb de controlo 1129 de ligação (> 80% WT). Dois resíduos críticos adicionais foram identificadas que não cumpria as orientações de limiar, mas cuja mutação reduziu a ligação do anticorpo por um menor grau. a numeração dos resíduos é a de PDB ID # 1 S78.

Resíduo Mutação % de ligação Control mAb Designação HER2 PG3958 Fab de binding ligação wt % de ligação (range) wt (range) 144 T144A 31.9 (11) 82.1 (13) Critica 166 R166A 32.2 (5) 93.7 (17) Critica 181 R181A 10.1 (5) 98.6 (34) Critica 172 P172A 52.5 (2) 94.9 (24) Secundaria 179 G179A 41.7 (18) 87.9 (25) Secundaria

[00529] Tabela 14. As reatividades de proteína de ligação médios e intervalos () são listados por ambos os resíduos críticos. resíduos críticos envolvidos na PG3178 ligação foram identificados como aqueles mutados em clones que foram negativos para mAb de ligação PG3178 (<20% WT), mas positiva para o mAb de controlo de ligação 66223 (> 70% WT). a numeração dos resíduos é a de PDB ID # 4P59. Resíduo Mutação Inibição Ligação do Designação HER3 PG3178 Controle mAb % de ligação % de ligação wt (range) wt (range) 409 F409A 16.74 (8) 79.63 (0) Critica 426 R426A 3.17 (5) 93.08 (36) Critica

[00530] Tabela 15. Lista de resíduos expostos dentro de 11,2 Um raio de Arg 426 no HER3: Leu L423 423 Tyr Y424 424 Asn N425 425 Gly G427 427 Gly G452 452 Arg R453 453

Tyr Y455 455 Glu E480 480 Arg R481 481 Leu L482 482 Asp D483 483 Lys K485 485

[00531] Tabela 16: Sistema de pontuação para monitorização de endpoints humano Variável Pontuação Alterações no peso corporal <20% 0 >20% 3 Aparência física Normal 0 Falta de higiene 1 Pequenas mordidas ou arranhões. Corrimento nasal/ocular 2 Mordidas ou arranhões graves. Postura anormal, membro, tremor etc. 3 Comportamento não provocado Normal 0 Alterações mínimas 1

Anormal, mobilidade reduzida, diminuição da atenção, inativo 2 Vocalizações não solicitadas, automutilação, muito inquieto ou imóvel 3 Respostas de comprtamento para estímulo externo Normal 0 Depressão mínima/exagero da resposta 1 Respostas moderadamente anormal 2 Reações violentas ou em coma 3 Tumor Ocipital Nenhum 0 Palpável 1 Pontuação total* * Eutanasia do camundongo - score total > 5, or - Score of 3 em qualquer variável, independentemente da pontuação total

[00532] Tabela 17: Tempo de linha para a experimentação animal. Data Procedimento 03/08/16 Chegada

10/08/16 Fim da aclimatização 17/08/16 Inoculação do tumor Intracraniano 05/09/16 Primeira pre-terapia de sessões imagem

MR 09/09/16 Primeiro registro e início da terapia 04/10/16 Último registro 25/10/16 Último dia de terapia 12/11/16 Último animal eutanizado Tabela 18: Visão geral dos grupos de estudo e dosagem Grupo # de ratos Composto Dose A 8 Veiculo (salina) 4x twice wk, 5 mL/kg i.v.

B 8 T-DM1 4x qwk, 10 mg/kg diluído em salina, 5 mL/kg i.v.

C 8 MCLA-128 4x twice wk, 25 mg/kg diluído em salina, 5 mL/kg i.v.

D 8 T-DM1+MCLA-128 T-DM1, 10 mg/kg + MCLA, 25 mg/kg diluído em salina: 4x qwk, 5 mL/kg i.v.

MCLA-128: 25 mg/kg diluído em salina: 4x qwk, 5 mL/kg i.v.

Table 19: dados de inclusão e volume tumoral na inclusão. Grupo ID rato data Inclusão volume tumoral (mm3) A 16 09/09/2016 15,9 A 17 09/09/2016 11,1 A 21 13/09/2016 17,6 A 23 13/09/2016 13,5 A 26 13/09/2016 11,6 A 11 16/09/2016 11,0 A 36 20/09/2016 9,3

A 1 27/09/2016 9,5 B 9 09/09/2016 12,3 B 14 09/09/2016 16,7 B 25 13/09/2016 18,6 B 35 13/09/2016 9,2 B 24 16/09/2016 10,0 B 5 20/09/2016 15,7 B 32 23/09/2016 10,1 B 34 04/10/2016 14,4 C 18 09/09/2016 13,7 C 43 09/09/2016 13,2 C 7 13/09/2016 11,2 C 29 13/09/2016 11,4 C 42 13/09/2016 16,6 C 30 20/09/2016 9,8 C 37 20/09/2016 14,8 C 27 04/10/2016 9,5 D 8 09/09/2016 21,7 D 41 09/09/2016 12,5 D 38 13/09/2016 15,9 D 39 13/09/2016 10,6 D 40 13/09/2016 9,7 D 3 16/09/2016 11,6 D 31 20/09/2016 9,8 D 19 23/09/2016 13,8

Tabela 20: Pontuação do edema cerebral

Grupo ID rato Score de edema cerebral final -1 3 7 10 14 21 28 35 42 score

A 01 1 2 3 3 3 3 A 11 0 1 1 2 3 3 A 16 0 0 1 1 1 A 17 0 0 0 1 2 2 A 21 1 2 2 2 2 A 23 1 1 1 2 2 A 26 1 2 2 3 3 A 36 2 2 2 2 2 B 05 0 1 2 2 2 2 B 09 1 1 2 3 3 B 14 0 0 1 2 3 3 B 24 1 2 2 3 3 4 4 4 B 25 0 0 1 0 2 2 B 32 0 0 1 1 2 2 3 3 B 34 2 2 3 3 3 3 B 35 0 0 1 1 2 2 3 3 C 07 1 2 2 2 1 2 3 3 3 3 C 18 0 0 0 0 0 1 1 C 27 1 1 2 2 1 1 1 C 29 1 1 2 2 3 3 4 4 C 30 2 2 3 3 3 3 3 3 3 C 37 1 1 2 2 3 3 3 3 3 C 42 0 1 1 1 1 1 1 C 43 0 0 0 0 1 2 3 3 D 03 0 0 1 2 2 3 3 4 4 4

D 08 0 0 0 1 2 3 4 4 D 19 0 0 0 0 1 1 1 1 NA 1 D 31 2 3 4 4 4 4 4 4 4 D 38 0 1 2 3 3 3 4 4 4 D 39 0 0 0 0 1 2 3 3 4 4 D 40 1 1 1 2 2 3 3 3 4 4 D 41 0 0 0 0 0 0 0 0 Referências

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Combinação de um agente de alvejamento ErbB-2; e um anticorpo biespecífico caracterizada pelo fato de que compreende um local de ligação ao antígeno que pode se ligar a um epítopo na parte extracelular do ErbB-2 e um local de ligação ao antígeno que pode se ligar a um epítopo na parte extracelular do ErbB-3, para uso em um método de tratamento de um indivíduo que tem um tumor positivo em ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3 ou está em risco de desenvolver o referido tumor.

2. Combinação para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente de alvejamento de ErbB-2 é um inibidor de agente de ligação a ErbB-2.

3. Combinação para uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o agente de alvejamento de ErbB-2 é um inibidor de ErbB-2.

4. Combinação para uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o inibidor de ErbB-2 é um anticorpo monoespecífico bivalente que compreende locais de ligação a antígeno que podem se ligar a um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-2.

5. Combinação para uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o anticorpo monoespecífico e o anticorpo biespecífico se ligam a diferentes epítopos em ErbB-2.

6. Combinação para uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que os diferentes epítopos ErbB-2 estão em diferentes domínios extracelulares ErbB-2.

7. Combinação para o uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 6, caracterizada pelo fato de que o anticorpo monoespecífico pode se ligar a um epítopo no domínio extracelular ErbB-2 IV, domínio III e / ou domínio II.

8. Combinação para o uso de qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o anticorpo biespecífico pode se ligar a um epítopo no domínio I extracelular de ErbB-2.

9. Combinação para o uso de qualquer uma das reivindicações 4-8, caracterizada pelo fato de que o anticorpo monoespecífico compreende um conjugado de fármaco.

10. Combinação para o uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o anticorpo biespecífico compreende um conjugado de fármaco.

11. Combinação para uso, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que o conjugado do fármaco compreende emtansina.

12. Combinação para o uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 11, caracterizada pelo fato de que o anticorpo monoespecífico é o Trastuzumab.

13. Combinação para o uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 11, caracterizada pelo fato de que o anticorpo monoespecífico é o trastuzumabe emtansina.

14. Combinação para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que o anticorpo biespecífico compreende o anticorpo PB4188.

15. Combinação para o uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de compreender ainda a administração de um medicamento quimioterápico ao indivíduo em necessidade.

16. Método de tratamento de um indivíduo que tem um tumor positivo em ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB-3 ou corre o risco de desenvolver um tumor positivo ErbB-2, ErbB-3 ou ErbB-2 / ErbB- 3, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo em necessidade um agente de alvejamento de ErbB-2 e um anticorpo biespecífico que compreende um local de ligação ao antígeno que pode ligar um epítopo a uma parte extracelular de ErbB-2 e um local de ligação ao antígeno que pode ligar um epítopo a uma parte extracelular de ErbB-3.

17. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um agente de alvejamento de ErbB-2 e um anticorpo biespecífico que compreende um local de ligação ao antígeno que pode se ligar a um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-2 e um local de ligação ao antígeno que pode se ligar a um epítopo em um extracelular parte do ErbB-

3.

18. Kit de partes caracterizado pelo fato de que compreende um agente de alvejamento de ErbB-2 e um anticorpo biespecífico que compreende um local de ligação ao antígeno que pode se ligar a um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-2 e um local de ligação ao antígeno que pode se ligar a um epítopo no uma parte extracelular de ErbB-3.

19. Método de tratamento, conforme definido pela reivindicação 16, composição farmacêutica conforme definido pela reivindicação 17 ou um kit de partes conforme definido pela reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o agente de alvejamento de ErbB-2 é um agente de ligação ou inibidor de ErbB-2.

20. Método de tratamento, composição farmacêutica ou kit de partes de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação ou inibidor de ErbB-2 é lapatinibe ou neratinibe.

21. Método de tratamento, conforme definido pela reivindicação 16, composição farmacêutica conforme definido pela reivindicação 17 ou um kit de peças conforme definido pela reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o agente de alvejamento de ErbB-2 é um anticorpo monoespecífico bivalente que compreende locais de ligação ao antígeno que podem ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-2.

22. Anticorpo biespecífico caracterizado pelo fato de que compreende um local de ligação ao antígeno que pode se ligar a um epítopo em uma parte extracelular do ErbB-2 e um local de ligação ao antígeno que pode se ligar a um epítopo na parte extracelular do ErbB-3 para uso no tratamento de um indivíduo que tem um tumor positivo para ErbB-2 e positivo para ErbB-3 no cérebro ou corre o risco de desenvolver um tumor positivo para ErbB-2 e positivo para ErbB-3 no cérebro.

23. Anticorpo biespecífico para uso, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o tumor é uma metástase de um tumor da mama.

24. Anticorpo biespecífico para uso, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que o anticorpo biespecífico pode se ligar a um epítopo no domínio extracelular I de ErbB-2.

25. Anticorpo biespecífico para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22-24, caracterizado pelo fato de que o anticorpo biespecífico pode se ligar a um epítopo no domínio extracelular III de ErbB-3.

26. Anticorpo biespecífico para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 25, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a administração de um agente de alvejamento de ErbB-2.

27. Anticorpo biespecífico para uso, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o agente de alvejamento de ErbB-2 é lapatinibe ou neratinibe.

28. Anticorpo biespecífico para uso, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o agente de alvejamento de ErbB-2 é um anticorpo monoespecífico bivalente que compreende locais de ligação a antígeno que podem se ligar a um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-2.

29. Anticorpo biespecífico para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 28, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a administração de um agente de alvejamento de ErbB-3.

30. Anticorpo biespecífico para uso, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o agente de alvejamento de ErbB-3 é um anticorpo, como patritumab, MM- 121 (seribantumab) ou lumretuzumab

31. Anticorpo biespecífico para uso, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o inibidor de ErbB-2 é um anticorpo monoespecífico bivalente que compreende locais de ligação a antígeno que podem se ligar a um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-3.

32. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 28 ou 31, caracterizado pelo fato de que o anticorpo bivalente monoespecífico com locais de ligação ao antígeno que pode ligar um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-2 ou um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-3 compreende um conjugado de medicamento.

33. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreende emtansina.

34. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28, caracterizado pelo fato de que o anticorpo bivalente monoespecífico com locais de ligação ao antígeno que pode se ligar a um epítopo em uma parte extracelular de ErbB-2 é trastuzumabe, pertuzumabe ou um biossimilar com a mesma sequência de aminoácidos de domínio variável .

35. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 34, caracterizado pelo fato de que o anticorpo biespecífico é o anticorpo PB4188.

36. Método de tratamento de um indivíduo que possui um tumor ErbB-2 positivo e ErbB-3 positivo no cérebro ou corre o risco de desenvolver um tumor ErbB-2 positivo e ErbB-3 positivo no cérebro, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar a o indivíduo em necessidade do mesmo um anticorpo biespecífico que compreende um local de ligação ao antígeno que pode se ligar a um epítopo em uma parte extracelular do ErbB-2 e um local de ligação ao antígeno que pode se ligar a um epítopo na parte extracelular do ErbB-3.