ES2342646B1 - Metodo de diagnostico de canceres que expresan el receptor her-2 o sus variantes truncadas. - Google Patents
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Abstract
Método de diagnóstico de cánceres que expresan
el receptor HER2 o sus variantes truncadas.
La invención se refiere a un método de
diagnóstico y determinación de pronóstico de cánceres del tipo que
expresa el receptor HER2 o sus variantes truncadas. El método
comprende la detección de la presencia en una muestra de una de las
formas truncadas del citado receptor HER2. La invención también
proporciona nuevos anticuerpos específicos de esta forma truncada,
así como kits que los comprenden.
Description
Método de diagnóstico de cánceres que expresan
el receptor HER2 o sus variantes truncadas.
La presente invención se refiere a un método de
diagnóstico y determinación de pronóstico en muestras aisladas de
cánceres en los que se expresa el receptor HER2. La invención
también propone compuestos de aplicación en el diagnóstico e
identificación precoz del cáncer.
HER2 (también conocido como
c-erbB2, ErbB2 o Neu) es una proteína transmembrana
del tipo I que pertenece a la familia del receptor del factor de
crecimiento epidérmico o EGFR (del inglés Epidermal Growth Factor
Receptor), también conocido como HER1 o ErbB1. Dos miembros
adicionales, HER3 y HER4 completan esta familia. Cuando HER1, 3 ó 4
se unen a un ligando tipo EGF, su dominio extracelular adopta la
conformación denominada "abierta", la cual permite la
formación de homodímeros o heterodímeros. Por el contrario, HER2
aunque no se una a ningún ligando, también interacciona con otros
receptores HER unidos a ligando, debido a que su dominio
extracelular está de manera constitutiva en conformación
"abierta".
La dimerización dirigida por el dominio
extracelular conduce a la interacción de las quinasas intracelulares
de los receptores HER y a la subsiguiente transfosforilación de
algunos residuos de tirosina. Estas fosfotirosinas, situadas en el
extremo C-terminal de los receptores HER, actúan
como acopladores de un grupo de proteínas intracelulares de unión a
fosfotirosinas. Las interacciones establecidas en la membrana
plasmática son transducidas al núcleo celular por medio de
distintas vías de señalización, tales como la vía de la proteína
quinasa activada por mitógeno activada por Ras (MAPK), la vía de la
proteína quinasa activada por estrés, la fosfolipasa C gamma, etc.
Todos estos circuitos de señalización controlan la expresión de
genes que actúan de manera coordinada para modificar aspectos
determinantes del estado celular, tales como la proliferación
celular, la migración, la supervivencia y la adhesión. Así,
dependiendo del contexto celular, la activación de los receptores
HER resulta en una respuesta celular dramática que puede ir desde
la transformación a célula maligna a una senescencia prematura.
Además del modo de señalización canónico, los
receptores HER o fragmentos de los mismos pueden ser endocitados y
transportados a núcleo, donde directamente pueden regular la
expresión de ciertos genes. Este hecho se ha observado para el caso
concreto de HER2 (Wang et al., "Binding at and
transactivation of the COX-2 promoter by nuclear
tyrosine kinase receptor ErbB-2", Cancer
Cell-2004, Vol. 6, pp. 251-261), así como
para un fragmento carboxiterminal (CTF, del inglés Carboxy Terminal
Fragments), que consiste en una forma truncada del receptor HER4,
que incluye el dominio citoplasmático entero (Linggi et al.,
"ErbB-4 s80 intracellular domain abrogates
ETO2-dependent transcriptional repression", J.
Biological Chemistry-2006, Vol. 281, pp.
25373-25380).
En tumores mamarios humanos se han encontrado
frecuentemente una serie de fragmentos carboxiterminales o CTFs
(del inglés Carboxy Terminal Fragments), que se asume que incluyen
los dominios transmembrana y citoplasmático de HER2. (Molina et
al, "NH(2)-terminal truncated HER2
protein but not full-length receptor is associated
with nodal metastasis in human breast cancer", Clinical Cancer
Research-2002, Vol. 8, pp. 347-353). Se
conoce además que las pacientes con cáncer de mama que expresan los
CTFs de HER2, o, lo que es lo mismo, formas truncadas que no
incluyen el extremo N-terminal de HER2 (HER2 CTFs),
tienen mayor probabilidad de desarrollar metástasis (Molina et
al. 2002 - supra) y un pronóstico peor que aquellas
pacientes que expresan predominantemente la forma completa de HER2
(Saez et al., "p95HER2 predicts worse outcome in patients
with HER2-positive breast cancer", Clinical
Cancer Research-2006, Vol. 12, pp.
424-431).
Por ello, resulta muy importante poder detectar
a tiempo la presencia de HER2 en tumores y más aún poder determinar
si está en forma completa o truncada (CTF).
Hoy en día, a nivel de clínica rutinaria se
emplean anticuerpos para detectar la presencia de la forma completa
de HER2, a fin de determinar ante qué tipo de tumor mamario nos
encontramos. En el caso de detectarse la presencia de HER2, la
terapia recomendada consiste en la administración de anticuerpos
monoclonales terapéuticos, tal como el trastuzumab de Genentech.
El uso de este anticuerpo monoclonal para el tratamiento del cáncer,
aparece descrito en el documento de solicitud de patente WO 8906692
de Genentech. En WO 8906692 se describen anticuerpos monoclonales o
policlonales dirigidos contra la región extracelular de HER2,
coincidiendo esta región extracelular con el dominio externo
completo de la proteína, que es su extremo
N-terminal. Se relaciona una serie de anticuerpos
monoclonales con líneas de cáncer de mama concretas. Según se ha
indicado anteriormente, los epítopos reconocidos por los
anticuerpos citados en WO 8906692 son regiones antigénicas del
dominio extracelular de la forma completa de HER2 y no incluyen
formas truncadas o fragmentos carboxiterminales de HER2. Por ello,
con los anticuerpos y el método de diagnóstico descritos en WO
8906692 no se podrá detectar la presencia de HER2 truncados (CTFs).
Además, en tumores mamarios donde dichos CTFs de HER2 se expresan,
los anticuerpos como el trastuzumab no resultan terapéuticos,
puesto que no reconocen a ningún epítopo. Este hecho explica la
resistencia al tratamiento con trastuzumab que se observa en los
pacientes que expresan formas truncadas (CTFs) de HER2.
Los pacientes que mayoritariamente expresan
formas truncadas o CTFs de HER2 deberían ser tratados con terapias
alternativas para evitar las cifras de pronóstico pobre observadas
por Sáez et al 2006 (supra). En cualquier caso, con
la finalidad de detectar (diagnosticar) y tratar cuanto antes a las
personas que tengan tumores en los que se expresan formas truncadas
de HER2, resulta muy interesante poder diferenciar qué tipo de forma
de HER2 se expresa para luego actuar en consecuencia.
En el documento de Anido et al.,
"Biosíntesis of tumorigenic HER2 C-terminal
fagments by alternative initiation of translation", European
Molecula Biology Organization (EMBO) Journal-2006, Vol.
25, pp. 3234-3244, se describe que, además del
fragmento generado por la acción de las
alfa-secretasas sobre HER2, que da lugar a una
forma truncada CTF conocida como P95, que incluye el fragmento
transmembrana y citoplasmático del receptor, también se generan dos
formas truncadas CTF, mediante un mecanismo de iniciación
alternativa de la traducción a partir de dos metioninas situadas
aguas arriba y aguas abajo, respectivamente, del dominio
transmembrana de HER2. Concretamente, las metioninas para
iniciación alternativa de la traducción corresponden a la metionina
611 y a la metionina 687 de la secuencia de aminoácidos con el
número de acceso M11730.1 de la base de datos UniGene del National
Center for Biotechnology Information (NCBI). Este documento también
demuestra que estas formas alternativas del receptor HER2 (CTFs)
están presentes en tumores mamarios. Concretamente, se indica que
la más abundante corresponde a la forma denominada CTF687, o lo que
es lo mismo, a la proteína obtenida por la iniciación alternativa
de la traducción a partir de la metionina en posición 687. Anido
et al. propone como terapia el uso de inhibidores de la
actividad tirosinquinasa de HER2, tal como lapatinib, para minimizar
el crecimiento de los tumores que expresan esta formas truncadas de
HER2. Los inhibidores de la tirosinquinasa actúan interaccionando
con el extremo C-terminal del receptor HER2 que está
presente de forma íntegra tanto en el receptor completo como en los
CTFs derivados del mismo o producidos por iniciación alternativa de
la traducción.
El documento de Scaltriti et al,
"Expresión of p95HER2, a truncated form of the HER2 Receptor, and
response to anti-HER2 therapies in breast
cancer", Journal of National Cancer Institute-2007,
Vol. 99, pp. 628-368, representa un ejemplo de
estudio de metodología alternativa para detectar la presencia de una
de las formas truncadas del receptor HER2 y detalla algunas de las
posibles causas de la resistencia al tratamiento con trastuzumab
(Herceptin). Concretamente, se hace hincapié en la acumulación del
fragmento p95HER2 (producto de proteólisis de HER2 por
alfa-secretasas) y otras formas truncadas del
receptor, las cuales no poseen el dominio extracelular reconocido
por el Trastuzumab. Scaltriti propone un método de
inmunofluorescencia para detectar el fragmento p95HER2 (producto de
proteólisis por alfa-secretasas). Este nuevo método
de detección puede realizarse en secciones de tejido embebidas en
parafina y fijadas con formalina según los protocolos de rutina
clínicos. La nueva metodología deriva de observar que la forma
truncada p95HER2, y no la forma entera del receptor, se localiza
tanto en la membrana plasmática como en el citoplasma de la célula.
Este método propone comparar si existe expresión de p95HER2
mediante tinción del citoplasma detectada con un anticuerpo
anti-HER2 que se une al dominio citoplasmático del
receptor; y en confirmar estos resultados con los de una detección
con un anticuerpo anti-citoqueratina, una proteína
cuya distribución ha sido ampliamente utilizada como herramienta
para el diagnóstico de tumores. Sin embargo no está claro que este
método distinga eficientemente aquellos tumores que expresan la
forma completa de HER2 de aquellos que expresen las formas
truncadas.
Existe la necesidad de localizar nuevas y
eficientes dianas diagnósticas y terapéuticas, que correlacionen
bien con el tipo de cáncer y permitan tratar a tiempo con terapias
eficientes aquellos tumores de peor pronóstico, descartando de
entrada aquellas terapias que se ha visto que no resultan
eficaces.
La presente invención aporta ventajas a los
problemas citados anteriormente y supone una solución novedosa en
la clasificación precoz del cáncer, especialmente el cáncer de
mama.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha determinado que, sorprendentemente, la
detección diferencial de una de las formas truncadas (CTF) de HER2,
generada por iniciación alternativa de la traducción, correlaciona
muy bien con la predicción del tipo de cáncer que debe ser tratado,
facilitando la tarea del facultativo a la hora de prescribir una
pauta de tratamiento. Esta forma truncada (CTF) de HER2 ha sido
aislada y se ha empleado para el desarrollo de múltiples
herramientas para poder detectar su presencia en muestras de tejidos
aportándose, de esta forma, un conjunto diagnóstico nuevo y sólido,
que además es aplicable a la rutina clínica. Otro objeto de la
invención son, precisamente, nuevos anticuerpos que reconocen esta
forma truncada o CTF de HER2, que no es reconocida por
trastuzumab.
La presente invención se refiere a un método de
diagnóstico y determinación de pronóstico en muestras aisladas de
cánceres del tipo que expresa el receptor HER2 y/o sus variantes
truncadas, que en esencia se caracteriza porque comprende la
detección de la presencia en la citada muestra de la forma truncada
del receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1.
Dentro del conjunto de cánceres que expresan el
receptor HER2 o sus variantes truncadas, destaca el cáncer de mama.
Otros cánceres en los que también se expresan estas proteínas son el
cáncer de pulmón, páncreas, colon, estómago, próstata, cabeza y
cuello, piel, riñón, testículo, tiroides, vejiga urinaria, útero,
vulva, endometrio, ovario, esófago, boca, glándula salivar,
laringe, peritoneo, región nasofaríngea, las trompas de Falopio,
Wilms, así como linfomas, sarcomas de Swing, sarcoma synovial,
meduloblastomas, trofoblásticos, gliomas, glioblastomas,
colangiocarcinomas, colesteatoma, condrosarcoma, ependimoma,
neurilemmomas, neuromas, rhabdomiosarcomas.
\newpage
Evidentemente, dicha SEQ ID NO: 1 incluye todas
aquellas variantes procedentes de variaciones alélicas entre
individuos, las cuáles suponen variaciones en número y tipo, de
algunos aminoácidos, tal como dos o tres aminoácidos de más o de
menos, o la sustitución de un aminoácido por otro que no modifica la
estructura global del receptor.
En el método de diagnóstico según la invención
la detección de la presencia de la forma truncada del receptor HER2
se lleva a cabo con medios seleccionados independientemente del
grupo formado por: detección por migración diferencial en un
sistema de fase móvil - fase estacionaria de la forma truncada del
receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1 respecto de la forma
completa del citado receptor HER2; y detección por unión con
anticuerpos específicos de la forma truncada del receptor HER2 que
contiene la SEQ ID NO: 1.
Por detección por migración diferencial debe
entenderse, en el contexto de la presente invención, toda técnica
analítica que permita separar los compuestos a detectar en base a su
distinta movilidad en un sistema fase móvil-fase
estacionaria determinado, tal como una electroforesis. Dicha
movilidad distinta puede venir originada por distinta carga
eléctrica en el compuesto, distinto peso molecular o distinta
afinidad por otros compuestos.
Según otra característica de la invención, la
etapa de detección de la presencia en la muestra de la forma
truncada del receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1,
comprende la detección, con al menos un anticuerpo, de un epítopo
definido por una secuencia incluida en la SEQ ID NO: 2. En una
realización particular, el método de diagnóstico según la
invención, comprende la detección del epítopo definido por la SEQ ID
NO: 3.
Por epítopo se entiende en el contexto de la
presente invención aquella parte de una macromolécula (o de un
antígeno) de naturaleza peptídica, cuya secuencia y/o configuración
espacial es reconocida por el sistema inmune (anticuerpos, células
T, células B).
Otro objeto de la invención es un péptido
aislado que consiste en la SEQ ID NO: 3.
Es también objeto de la invención un anticuerpo
o fragmento del mismo que reconoce un epítopo de la forma truncada
del receptor HER2, dicho epítopo definido por una secuencia de
aminoácidos incluida en la SEQ ID NO: 2.
El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo
con la invención, reconoce un epítopo definido por la SEQ ID NO:
3.
El anticuerpo o fragmento del mismo según la
invención es un anticuerpo policlonal.
En el sentido de la presente invención debe
entenderse por "anticuerpo policlonal" al conjunto de
anticuerpos producidos por distintas líneas de células B
(linfocitos B). Los anticuerpos policlonales son mezclas de
inmunoglobulinas secretadas contra un antígeno (macromolécula),
cada una de estas inmunoglobulinas capaz de reconocer un epítopo
diferente, por proceder de una célula B diferente. Así, dentro de
las distintas poblaciones de inmunoglobulinas contenidas en un
anticuerpo policlonal existe un tipo de inmunoglobulina que reconoce
el epítopo o epítopos de interés de un determinado antígeno.
Según otra característica de la invención, el
anticuerpo o fragmento del mismo es un anticuerpo monoclonal. Dicho
anticuerpo monoclonal está producido, preferentemente, por la línea
celular hibridoma con número de acceso DSM ACC2904, depositada en
la "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH
(DSMZ)" de acuerdo con el Tratado de Budapest en fecha 9 de
Abril de 2008.
Según otra característica de la invención, los
fragmentos del anticuerpo se seleccionan del grupo formado por
F(ab), F(ab') y Fv. En el contexto de la presente
invención, un fragmento de un anticuerpo significa una parte del
mismo, que es de un tamaño suficiente y conformación adecuada para
unirse a un epítopo presente en la forma truncada del receptor HER2
y así permitir su detección en una muestra.
Otro objeto de la presente invención es una
línea celular hibridoma con número de acceso DSM ACC2904, depositada
en la "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GMBH (DSMZ)".
Es también objeto de la invención un método de
obtención de un anticuerpo monoclonal, donde se cultiva la línea
celular hibridoma según la reivindicación 11 en un medio de cultivo
apropiado y se recupera el anticuerpo monoclonal de este medio.
Es también objeto de la invención el uso de un
anticuerpo o fragmento del mismo según se han descrito anteriormente
para el diagnóstico y determinación de pronóstico en muestras
aisladas de cánceres en los que se expresa el receptor HER2.
Es también objeto de la presente invención un
agente de diagnóstico y determinación de pronóstico en muestras
aisladas de cánceres en los que se expresa el receptor HER2 y/o
fragmentos C-terminales, que comprende al menos un
anticuerpo o un fragmento del mismo según se ha descrito
anteriormente.
El agente diagnóstico según la invención, se
caracteriza porque el anticuerpo o fragmento del mismo está
dispuesto en un soporte sólido.
Otro objeto de la presente invención es un kit
de diagnóstico y de determinación de pronóstico en muestras
aisladas de cánceres en los que se expresa el receptor HER2 que
comprende medios de detección de la presencia, en la citada
muestra, de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la
SEQ ID NO: 1. El kit de diagnóstico y determinación de pronóstico,
está caracterizado también porque los medios de detección consisten
en al menos un agente de diagnóstico según se ha descrito
anteriormente.
Según otra característica de la invención, el
kit de diagnóstico y determinación de pronóstico comprende medios
de detección que consisten en la detección por migración diferencial
de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la SEQ ID
NO: 1, respecto de la forma completa del citado receptor HER2.
Es también objeto de la invención el uso de un
anticuerpo o un fragmento del mismo según se ha detallado
anteriormente para la preparación de un medicamento. Concretamente,
el medicamento es para el tratamiento o la prevención de cánceres
en los se expresa al menos la forma truncada del receptor HER2 que
consiste en la SEQ ID NO: 1.
Según otra característica de la invención, el
uso de los anticuerpos o fragmentos es para la preparación de un
medicamento para el tratamiento o la prevención de cánceres de mama
en mamíferos, incluyendo humanos.
Según otra característica de la invención, el
uso de los anticuerpos o fragmentos es para la preparación de un
medicamento para el tratamiento o la prevención de cánceres
seleccionados del grupo constituido por cáncer de pulmón, páncreas,
colon, estómago, próstata, cabeza y cuello, piel, riñón, testículo,
tiroides, vejiga urinaria, útero, vulva, endometrio, ovario,
esófago, boca, glándula salivar, laringe, peritoneo, región
nasofaríngea, las trompas de Falopio, Wilms, así como linfomas,
sarcomas de Swing, sarcoma synovial, meduloblastomas,
trofoblásticos, gliomas, glioblastomas, colangiocarcinomas,
colesteatoma, condrosarcoma, ependimoma, neurilemmomas, neuromas,
rhabdomiosarcomas.
Es también objeto de la invención un anticuerpo
o fragmento del mismo, a título de medicamento, que reconoce un
epítopo de la forma truncada del receptor HER2, dicho epítopo
definido por una secuencia de aminoácidos incluida en la SEQ ID NO:
2. En una realización particular, el epítopo queda definido por la
SEQ ID NO: 3.
Es también objeto de la invención un método de
tratamiento de cánceres en los que se expresa al menos la forma
truncada del receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1, en el
cuál se administra una cantidad adecuada de al menos un anticuerpo
según se ha descrito anteriormente.
Otro objeto de la presente invención es una
composición farmacéutica destinada al tratamiento de cánceres en
los que se expresa al menos la forma truncada del receptor HER2 que
consiste en la SEQ ID NO: 1, que comprende un anticuerpo o un
fragmento del mismo según se ha descrito anteriormente y al menos un
excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptables.
Aunque no se especifique, todos los términos
científicos y técnicos utilizados en esta redacción tienen el
significado que de ellos deriva un experto de la técnica a la que la
invención pertenece. Métodos y materiales similares o equivalentes
a aquellos descritos aquí, pueden ser utilizados en la práctica de
la presente invención. A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones el término "comprende" y sus variaciones no
excluyen otras características, aditivos, componentes o etapas.
Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y
características de la invención se desprenderán en parte de la
descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Además, debe entenderse que la presente
invención cubre todas las posibles combinaciones de grupos
preferidos y particulares descritas más arriba.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 1: Esquema de la secuencia proteica de la
forma truncada o CTF-611, comparada con la secuencia
del receptor HER2 completo y con la forma truncada conocida como
p95 (648-CTF/p95), producto de la proteólisis por
alfa-secretasas. El dominio transmembrana está
representado como una línea helicoidal. El resto de la molécula está
indicado con una caja gris. La secuencia del péptido utilizada para
generar anticuerpos mono y policlonales aparece subrayada. Las
posiciones con puentes disulfuro intramoleculares también se indican
con conexiones entre las cisteínas.
Fig. 2: Electroforesis y
Western-blot (transferencia a membrana) de muestras
de cáncer de mama. (S) significa fracción soluble y (M) fracción
membrana. Para la detección de HER2 completo y de la forma
CTF-611 se emplearon anticuerpos dirigidos al
dominio citoplasmático de las proteínas. LDH: Lactato deshidrogenada
(utilizado como control).
Fig. 3: Corresponde a gráficos que muestran los
resultados de la evaluación del número de tumores desarrollados en
ratones transgénicos que expresan la forma truncada
CTF-611 (Fig. 3A) en comparación con ratones
transgénicos expresores del receptor HER2 completo; y los
resultados del volumen de los tumores detectados (Fig. 3B). En el
eje de la Y, N y V significan, respectivamente, Número de tumores y
Volumen de los mismos. En el eje de las X, T, significa tiempo en
semanas.
Fig. 4: La Fig. 4A muestra una electroforesis y
Western-Blot (transferencia a membrana) revelado con
un anticuerpo (CB11) que reconoce el dominio citoplasmático del
receptor HER2 (dominio común en todas las formas completa y
truncadas) o bien con anticuerpos policlonales generados contra el
péptido de SEQ ID NO: 3
(\alpha-611-A y
\alpha-611-B). Los carriles
corresponden a extractos de lisados celulares de células MCF7
(previamente transformadas con las construcciones de la Fig. 1) que
expresan la forma completa del receptor HER2, la forma truncada
CTF-611 y la forma truncada p95. La Fig. 4B muestra
el resultado de un ensayo de inmunoprecipitación con los
anticuerpos \alpha-611-A,
\alpha-611-B y CB11 practicada en
muestras que contenían tanto el receptor HER2 completo, como las
formas truncadas CTF-611 y p95.
Fig. 5: La Fig. 5A muestra una electroforesis y
Western-Blot (transferencia a membrana) revelado con
un anticuerpo (CB11) que reconoce el dominio citoplasmático del
receptor HER2 (dominio común en todas las formas completa y
truncadas) o bien con el sobrenadante del hibridoma DSM ACC2904
generado contra el péptido de SEQ ID NO 3
(\alpha-611-M3-C5).
Los carriles corresponden a mezclas de extractos de lisados
celulares de células MCF7 (previamente transformadas con las
construcciones de la Fig. 1) que expresan la forma completa del
receptor HER2, la forma truncada CTF-611 y la forma
truncada p95. La Fig. 5B muestra el resultado de un ensayo de
inmunoprecipitación con el anticuerpo CB11 y el anticuerpo
monoclonal
\alpha-611-M3-C5,
practicada en muestras que contenían tanto el receptor HER2
completo, como las formas truncadas CTF-611 y
p95.
En base a las figuras aquí aportadas y siempre a
modo de ejemplos ilustrativos y no limitativos, se describen a
continuación el método de diagnóstico y determinación de pronóstico
de cánceres en los que se expresa el receptor HER2 y/o fragmentos
carboxiterminales del mismo (variantes truncadas); nuevos péptidos y
anticuerpos específicos contra tales péptidos; nuevas líneas
celulares; agentes diagnósticos y kits para la detección, todos
ellos objetos de la invención.
La detección diferencial de la forma truncada
del receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1, también
denominada en esta invención CTF-611, respecto del
receptor HER2 entero o completo, implica poder visualizar dos
proteínas con pesos moleculares distintos y secuencias diferentes
según se desprende de la Fig. 1. La forma truncada con SEQ ID NO: 1
consiste en la proteína resultante de la iniciación alternativa de
la traducción por la metionina 611 de la secuencia completa del
receptor HER2. Esta forma o CTF comprende pues un nuevo dominio
extracelular, un fragmento transmembrana y un dominio citosólico.
El fragmento transmembrana y el dominio citosólico son iguales a
los de la forma completa del receptor HER2. Otra forma truncada
corresponde a la de la Fig. 1 referenciada como p95 o
CTF-648. Esta última forma es el producto de la
acción de las alfa-secretasas sobre el receptor
HER2 completo, las cuales escinden gran parte del dominio
extracelular.
Estas formas truncadas de HER2 pueden contener
neo-epítopes, esto es, nuevos determinantes
antigénicos no presentes en la molécula del receptor entero, con lo
cuál, no interaccionan de la misma manera con las moléculas que sí
lo hacen con el receptor entero (anticuerpos, fármacos, etc.).
Según se ha mencionado anteriormente, los
inventores localizaron que, sorprendentemente, la detección
diferencial de dicha forma truncada de HER2 con SEQ ID NO: 1,
correlaciona muy bien con la manifestación de un tipo de cáncer
común en tejido mamario y de pronóstico pobre. Así, en la Fig. 3
pueden visualizarse gráficos que muestran los resultados de la
evaluación del número de tumores desarrollados en ratones
transgénicos que expresan la forma truncada CTF-611
(SEQ ID NO: 1).
Para obtenerse los resultados de esta Fig. 3, se
expresaron en epitelio mamario de ratones construcciones de cDNA
que codificaban por la SEQ ID NO: 1 humana
(CTF-611), identificados en la figura según
M611-CTF. La construcción comprende la SEQ ID NO: 1
bajo control del promotor del virus de tumor mamario de ratón (MMTV)
(Mouse Mammary Tumor Virus). Como control se utilizó la línea de
ratón FVB/N-Tg(MMTVneu)202J que
expresa la forma completa de HER2, también bajo el control del
promotor del MMTV. Según se desprende de la Fig. 3A, el número de
tumores en los ratones que expresan la construcción de cDNA con la
forma CTF-611 (SEQ ID NO: 1) es mucho mayor que el
de la línea FVB/N-Tg(MMTVneu)202J,
identificados en esta figura con la designación HER2/neu. Los
tumores en los animales trangénicos se detectaron a las 17 semanas
de edad de los animales trangénicos que expresan
CTF-611, que representa tres meses antes de la
primera detección en ratones
FVB/N-Tg(MMTVneu)202J. Este hecho
explicaría la mayor agresividad de tumores expresores de fragmentos
de HER2 respecto de aquellos tumores expresores de la forma
completa. En la Fig. 3B puede verse además, que el volumen de los
tumores es mucho mayor en los animales que expresaban la forma
truncada CTF de HER2 con la SEQ ID NO: 1, respecto de aquellos
animales que expresan de forma constitutiva el receptor entero,
también denominado HER2/neu. Este segundo hecho explica también la
mayor agresividad de este tipo de tumores. Los inventores
determinaron también que aquellos tumores que expresaban la forma
truncada de secuencia SEQ ID NO: 1 presentaban unos índices de
metástasis pulmonar superiores a los observados en los tumores que
expresan HER2/neu.
Todos estos datos con animales transgénicos
ponen de manifiesto que resulta muy necesaria la detección
diferencial de la forma truncada del receptor HER2 de SEQ ID NO: 1
respecto de la forma completa del receptor. Esta detección
diferencial puede llevarse a cabo mediante múltiples técnicas
analíticas ampliamente conocidas por el experto en la materia como
electroforesis de proteínas, cromatografías de exclusión molecular,
ensayos de afinidad con anticuerpos, inmunofluoresecencia,
inmunocitoquímica, citometría de flujo, etc.
En los siguientes ejemplos pueden verse
distintas formas de detectar la presencia de la forma truncada de
secuencia SEQ ID NO: 1, en una muestra aislada de cáncer del tipo
que expresa el receptor HER2 y/o sus variantes truncadas.
En la Fig. 2, que corresponde a una imagen de un
gel de electroforesis y posterior transferencia tipo Western
(Western-blot), se cargaron en los carriles
distintas muestras de cáncer de mama (108, 114,101, 103, 131, 134 y
145). De cada muestra se analizó tanto la fracción soluble del
lisado celular (S), como la fracción membrana (M) para visualizar
qué tipo de molécula de HER2 estaba presente y en qué fracciones. En
principio, se espera que tanto el receptor completo como la forma
de la SEQ ID NO: 1 estén en la membrana celular. Para la detección
de HER2 completo y de la forma CTF-611 se emplearon
anticuerpos (CB11) dirigidos al dominio citoplasmático de las
proteínas, que es un dominio común en ambas formas proteicas. Como
control del análisis se detectó la presencia de la enzima Lactato
deshidrogenada (LDH). En la mayoría de muestras aparecen bandas
correspondientes al receptor HER2 entero y en la fracción membrana,
una banda correspondiente a la forma CTF-611 de SEQ
ID NO: 1.
La Fig. 2 demuestra entonces que la detección
del tipo de formas truncadas del receptor HER2 puede llevarse a
cabo mediante análisis por electroforesis de proteínas. Además, la
presencia de un fragmento de HER2 de secuencia SEQ ID NO: 1 es
indicativo de un determinado tipo de cáncer, en el caso del ejemplo,
cáncer de mama, que debe ser evaluado y tratado como un caso
particular dentro de los cánceres que expresan HER2.
Con la finalidad de poder detectar la presencia
de la forma truncada de HER2, cuya secuencia es la descrita en SEQ
ID NO: 1, con medios alternativos a los de la detección por
migración diferencial en una electroforesis, se sintetizó un
péptido con la SEQ ID NO: 4 y se inmunizaron cuatro conejos con
dicho péptido. Este péptido corresponde a los 32 amino ácidos del
extremo N-terminal de la forma
CTF-611 o de SEQ ID NO:1, en el que la mayoría de
cisteínas han sido sustituidas por serinas con la finalidad de
conjugarlo con el inmunógeno conocido como
Keyhole-limpet hemocyanin (KLH).
La SEQ ID NO: 4 corresponde pues a un péptido
equivalente al de la SEQ ID NO: 3, aunque adaptado para llevar a
cabo la técnica de inmunización. Un experto en la materia entenderá
que los anticuerpos dirigidos contra el péptido de síntesis SEQ ID
NO: 4 reconocerán también el epítopo definido por la SEQ ID NO: 3
presente en la forma truncada del receptor HER2 (SEQ ID NO: 1 o
CTF-611). Del mismo modo, un experto en la materia
puede deducir que si el péptido de síntesis empleado para la
inmunización consiste en la SEQ ID NO: 2, que comprende todos los
aminoácidos del receptor CTF-611 situados en la zona
extracelular, los resultados con anticuerpos dirigidos contra este
otro péptido son equivalentes y por ello útiles para el mismo
fin.
Se realizó una
electroforesis-SDS y posterior transferencia Western
de extractos de lisados de células MCF7 (previamente transformadas
con las construcciones de la Fig. 1), que expresaban la forma
completa del receptor HER2, la forma truncada
CTF-611 y la forma truncada p95. La forma truncada
de SEQ ID NO: 1 apareció en realidad como dos fragmentos de peso
molecular similar. Según se desprende con ensayos practicados con
Glicosidasa-F, una enzima que elimina
N-glicanos de las proteínas (no representados), el
fragmento CTF-611 es sustrato de modificaciones
post-traduccionales. Concretamente, un fragmento con
aproximadamente 110 kDa corresponde a la forma que se sintetiza y
que posteriormente entra en la ruta secretoria, en la cuál pasa a
ser N-glicosilado.
El suero de dos de los conejos inmunizados
reconoció tanto el receptor HER2 completo, como el
CTF-611. Ello se deriva de la Fig. 4A, donde se
detectan las bandas correspondientes tanto al receptor completo de
HER2, como a la forma de SEQ ID NO: 1 o CTF-611.
Según se indica en la citada Fig. 4A, el Western blot se reveló con
un anticuerpo (CB11) que reconoce el dominio citoplasmático del
receptor HER2 (dominio común en todas las formas, completa y
truncadas); o bien con los anticuerpos policlonales generados contra
el citado péptido de SEQ ID NO: 4
(\alpha-611-A y
\alpha-611-B) y que están
presentes en los sueros de los conejos. Por ser comparable la señal
de HER2 completo y CTF-611, se deduce que los
anticuerpos \alpha-611-A y
\alpha-611-B reconocen un epítopo
lineal que está presente en ambas formas del receptor. Como control
negativo en la electroforesis-SDS y Western blot se
utilizó un lisado de células MCF7 que expresaba la forma del
receptor conocida como p95, la cuál no posee el epítopo contra el
que se habían diseñado los anticuerpos.
En contraposición a dichos resultados, cuando se
llevó a cabo un experimento de inmunoprecipitación con los
anticuerpos \alpha-611-A y
\alpha-611-B y el anticuerpo CB11,
se detectó que los anticuerpos dirigidos contra el péptido de SEQ
ID NO: 4 precipitaban de manera preferente la forma truncada del
receptor (CTF-611). La mezcla que se sometió a
inmunoprecipitación contenía una proporción 1:1:1 de los lisados
celulares que expresaban las formas distintas del receptor HER2.
Estos resultados son visibles en la Fig. 4B. En esta figura,
aparecen las bandas de una electroforesis-SDS y
posterior transferencia Western, en cuyos carriles se cargaron los
resultados de los experimentos de inmunoprecipitación con los
anticuerpos \alpha-611-A,
\alpha-611-B y CB11. Se cargó un
carril control (input) con la mezcla 1:1:1 de los tres tipos de
lisados celulares sometida a inmunoprecipitación con los distintos
anticuerpos. El Western blot se reveló con CB11.
En los carriles correspondientes a la
inmunoprecipitación con los anticuerpos
\alpha-611-A y
\alpha-611-B, se distinguen
claramente bandas más intensas que el resto en aquellos pesos
moleculares correspondientes a la forma glicosilada y no gicosilada
de CTF-611. Esto es, dichos anticuerpos dirigidos
contra el péptido de SEQ ID NO: 4 no inmunoprecipitan la forma
completa del receptor HER2, lo que significa que reconocen realmente
un epítopo que está enmascarado cuando el receptor completo HER2 no
está desnaturalizado. Por ello, puede concluirse que los
anticuerpos \alpha-611-A y
\alpha-611-B son específicos de
CTF-611. Dicha especificidad se corrobora con
ensayos de inmunofluorescencia indirecta (no representados) en los
que los anticuerpos policlonales
\alpha-611-A y
\alpha-611-B únicamente permiten
la tinción en muestras que expresan el fragmento truncado
CTF-611. Este hecho conlleva la ventaja de poder ser
utilizados para detectar de manera diferencial qué forma del
receptor HER2 se expresa en una muestra aislada de tejido
tumoral.
El receptor HER2 completo comprende, próxima a
la membrana celular, una región estructurada mantenida por seis
puentes disulfuro, señalizados en la Fig. 1 mediante líneas de
conexión entre cisteínas. La forma truncada
CTF-611, o de secuencia SEQ ID NO: 1, contiene
únicamente cinco cisteínas entre las que se establecen dichos
puentes disulfuro para estabilizar los homodímeros de esta forma
truncada. Según se desprende de la Fig. 4 en su globalidad, debe
deducirse que la zona próxima a la membrana celular de la forma
truncada de SEQ ID NO: 1 es antigénicamente distinta de su
equivalente en el receptor HER-2 completo. De ello,
se desprende que puede ser detectada de manera diferencial según se
ha indicado anteriormente.
Utilizándose el mismo péptido de SEQ ID NO: 4
del ejemplo 2, se obtuvieron anticuerpos monoclonales. De todos
ellos, se selecciona el anticuerpo monoclonal
\alpha-611-M3-C5
producido por la línea celular hibridoma con número de acceso DSM
ACC2904. Los resultados obtenidos con este anticuerpo se detallan en
la Fig. 5.
De igual forma que en el ejemplo 2, se realizó
una electroforesis-SDS y posterior transferencia
Western con una mezcla 1:1:1 de extractos de lisados de células
MCF7 (previamente transformadas con las construcciones de la Fig.
1), que expresaban la forma completa del receptor HER2, o la forma
truncada CTF-611, o la forma truncada p95. En la
Fig. 5A, que es una fotografía de la membrana del Western revelada
con CB11 o con el anticuerpo monoclonal
\alpha-611-M3-C5,
puede verse que este último reconoce de manera específica la forma
truncada de HER2 correspondiente al receptor
CTF-611 de SEQ ID NO: 1 y no presenta reactividad
cruzada detectable con la forma completa del citado receptor, lo
que significa que reconoce realmente un nuevo epítopo
(neo-epítope) que incluye el grupo amino primario
en el extremo N-terminal de la forma del receptor
CTF-611.
De mismo modo, cuando se llevó a cabo un
experimento de inmunoprecipitación con el anticuerpo monoclonal
\alpha-611-M3-C5
en comparación con el anticuerpo CB11 (que reconoce el dominio
citosólico de los receptores), se detectó que el anticuerpo
monoclonal dirigido contra el péptido de SEQ ID NO: 3 precipitaba de
manera exclusiva la forma truncada del receptor
(CTF-611). Estos resultados son visibles en la Fig.
5B. En esta figura, aparecen los resultados de una
electroforesis-SDS y posterior transferencia
Western, en cuyos carriles se cargaron los resultados de los
experimentos de inmunoprecipitación con los anticuerpos
\alpha-611-M3-C5 y
CB11, y un carril control en el que se cargó una representación de
la mezcla 1:1:1 de los distintos lisados celulares sometidos a
inmunoprecipitación con los distintos anticuerpos.
En el carril correspondiente a la
inmunoprecipitación con el anticuerpo
\alpha-611-M3-C5,
se distinguen únicamente las bandas de la forma glicosilada y no
gicosilada de la forma truncada CTF-611. Esto es, el
anticuerpo
\alpha-611-M3-C5
no inmunoprecipita la forma completa del receptor HER2. Por ello,
puede concluirse que el anticuerpo
\alpha-611-M3-C5
es altamente específico de CTF-611 y no reconoce la
forma completa de HER2, pudiendo ser utilizado para detectar de
manera diferencial y altamente selectiva qué forma del receptor HER2
se expresa en una muestra aislada de tejido tumoral.
Los ejemplos 2 y 3 muestran anticuerpos
concretos. Evidentemente, son objeto de la invención otros
anticuerpos policlonales o monoclonales dirigidos contra el epítopo
de la forma truncada CTF-611 que queda definido por
las secuencias SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, puesto que, a partir de
las enseñanzas de esta invención se derivan de manera directa para
un experto en la materia. Del mismo modo, son objeto de la invención
fragmentos de dichos anticuerpos, tal como F(ab),
F(ab'), Fv, etc., o cualquier línea celular hibridoma capaz
de producir anticuerpos monoclonales dirigidos contra los péptidos
de SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 3.
De acuerdo con todo aquello mostrado
anteriormente, los anticuerpos o fragmentos de los mismos objeto de
la presente invención se emplean como agentes de diagnóstico y
determinación de pronóstico, ya sea marcados de manera directa en
su misma secuencia peptídica (por ejemplo con radioisótopos) o de
manera indirecta (por ejemplo por adición o unión a un agente
fluorescente o capaz de producir fluorescencia por reacción en un
medio de reacción seleccionado), todo ello con la finalidad de
generar una señal visible, y a ser posible cuantificable, con la
que detectar en una muestra la presencia de la forma truncada del
receptor HER2 que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 1.
Del mismo modo, se prevé que el agente
diagnóstico conteniendo al menos los anticuerpos pueda estar
adherido a un soporte sólido, directa o indirectamente mediante un
brazo espaciador. Un agente de este tipo permite capturar la forma
de secuencia SEQ ID NO: 1 de una muestra, para determinar luego su
presencia con otros anticuerpos ya no específicos (como el
CB11).
Los agentes diagnósticos y de determinación de
pronóstico objeto de la invención, pueden aplicarse también en
protocolos de immunohistoquímica. Para ello, los anticuerpos
monoclonales o policlonales deben estar debidamente marcados para
dar una señal visible, y en el mejor de los casos cuantificable, una
vez han entrado en contacto con el tejido ensayado y se les ha
permitido interaccionar con las proteínas que pretenden ser
detectadas, esto es, con el fragmento CTF de HER2 de secuencia SEQ
ID NO: 1.
Con la finalidad de facilitar al facultativo la
tarea del análisis, diagnóstico y determinación de pronóstico, se
prevé que el agente diagnóstico esté comprendido en un kit que
incluye, además, los reactivos, tampones y soluciones de detección
adaptados para determinar en una muestra la presencia de la forma
truncada de SEQ ID NO: 1.
Así, la invención proporciona un kit de
diagnóstico y determinación de pronóstico que comprende al menos un
anticuerpo o un fragmento del mismo, dicho anticuerpo o fragmento
capaz de reconocer el epítopo definido por la SEQ ID NO:2 o la SEQ
ID NO: 3, además de los medios de reacción y tampones apropiados
para que se lleve a cabo la interacción del anticuerpo con el
epítopo y que son ampliamente conocidos por los expertos en la
materia.
Otro tipo de kit también objeto de la invención,
comprende todos aquellos medios necesarios para llevar a cabo una
detección por migración diferencial de la forma truncada del
receptor HER2, que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 1, respecto
de la forma completa del receptor HER2.
Los anticuerpos de esta invención son utilizados
también dentro de composiciones farmacéuticas útiles para el
tratamiento de cánceres en los que se expresa al menos la forma
truncada del receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1. La
composición comprende aquellos vehículos o excipientes aceptables
farmacéuticamente y al menos un anticuerpo que reconoce el epítopo
definido por la secuencias SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.
<110> Institut de Recerca Hospital
Universitari Vall d'Hebron/Fundació Privada Institut d'Investigació
Oncológica de Vall d'Hebron (VHIO)/Institució Catalana de Recerca i
Estudis Avançats
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método de diagnóstico de cánceres
que expresan el receptor HER2 o sus variantes truncadas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> FO1104ES00
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 645
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Epítopo de una forma truncada de la
proteína HER2 humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Epítopo de una forma truncada de la
proteína HER2 humana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido sintético derivado de un
epítopo de una forma truncada de la proteína HER2 humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (23)
1. Método de diagnóstico y determinación de
pronóstico en muestras aisladas de cánceres del tipo que expresa el
receptor HER2 y/o sus variantes truncadas, que comprende la
detección de la presencia en la muestra de la forma truncada del
receptor HER2 que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:
1.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
la detección se lleva a cabo con medios seleccionados
independientemente del grupo formado por: detección por migración
diferencial de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en
la SEQ ID NO: 1, respecto de la forma completa del citado receptor
HER2; y detección por unión con anticuerpos específicos de la forma
truncada del receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1.
3. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-2, en el que la detección se
lleva a cabo con al menos un anticuerpo, específico de un epítopo
definido por una secuencia incluida en la SEQ ID NO: 2.
4. Método según la reivindicación 3, que
comprende la detección del epítopo definido por la SEQ ID NO: 3 con
al menos un anticuerpo.
5. Péptido aislado que consiste en la SEQ ID NO:
3.
6. Anticuerpo o fragmento del mismo que reconoce
un epítopo de una forma truncada del receptor HER2, dicho epítopo
definido por una secuencia incluida en la SEQ ID NO: 2.
7. Anticuerpo o fragmento del mismo que reconoce
un epítopo de una forma truncada del receptor HER2, dicho epítopo
definido por la SEQ ID NO: 3.
8. Anticuerpo o fragmento del mismo según las
reivindicaciones 6 ó 7, que es un anticuerpo policlonal.
9. Anticuerpo o fragmento del mismo según las
reivindicaciones 6 ó 7, que es un anticuerpo monoclonal.
10. Anticuerpo o fragmento del mismo según la
reivindicación 9, producido por la línea celular hibridoma
depositada en el "Deutschland Sammlung von Mikroorganismen und
Zellen - DSMZ" con número de acceso DSM ACC2904.
11. Fragmentos del anticuerpo de las
reivindicación 6 ó 7 seleccionados del grupo formado por
F(ab), F(ab') y Fv.
12. Línea celular hibridoma con número de acceso
DSM ACC2904 depositada en el "Deutschland Sammlung von
Mikroorganismen und Zellen - DSMZ".
13. Uso de un anticuerpo o fragmento del mismo
según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, para el
diagnóstico y determinación de pronóstico en muestras aisladas de
cánceres en los que se expresa el receptor HER2.
14. Agente de diagnóstico y determinación de
pronóstico en muestras aisladas de cánceres del tipo que expresa el
receptor HER2 o sus variantes truncadas, que comprende al menos un
anticuerpo o un fragmento del mismo según una de las
reivindicaciones 6 a 11.
15. Agente diagnóstico según la reivindicación
14, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo está dispuesto en
un soporte sólido.
16. Kit de diagnóstico y determinación de
pronóstico en muestras aisladas de cánceres del tipo que expresa el
receptor HER2 o sus variantes truncadas, que comprende medios de
detección de la presencia en la muestra de la forma truncada del
receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1 donde dichos medios
consisten en al menos un agente según las reivindicaciones 14 ó
15.
17. Kit de diagnóstico y determinación de
pronóstico en muestras aisladas de cánceres del tipo que expresa el
receptor HER2 o sus variantes truncadas, que comprende medios de
detección de la presencia en la muestra de la forma truncada del
receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1, donde dichos medios
consisten en un sistema fase móvil-fase estacionaria
donde se produce la migración diferencial de la forma truncada del
receptor HER2 de SEQ ID NO: 1, respecto de la forma completa del
citado receptor HER2.
18. Uso de un anticuerpo o de un fragmento del
mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11 para la
preparación de un medicamento.
19. Uso según la reivindicación 19, para la
preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención
de cánceres en los se expresa al menos la forma truncada del
receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1.
20. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 20, donde el medicamento es para el
tratamiento o la prevención de cánceres de mama en mamíferos,
incluyendo humanos.
21. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 20, donde el medicamento es para el
tratamiento o la prevención de cánceres seleccionados del grupo
constituido por cáncer de pulmón, páncreas, colon, estómago,
próstata, cabeza y cuello, piel, riñón, testículo, tiroides, vejiga
urinaria, útero, vulva, endometrio, ovario, esófago, boca, glándula
salivar, laringe, peritoneo, región nasofaríngea, las trompas de
Falopio, Wilms, así como linfomas, sarcomas de Swing, sarcoma
synovial, meduloblastomas, trofoblásticos, gliomas, glioblastomas,
colangiocarcinomas, colesteatoma, condrosarcoma, ependimoma,
neurilemmomas, neuromas, rhabdomiosarcomas.
22. Composición farmacéutica destinada al
tratamiento de cánceres en los que se expresa al menos la forma
truncada del receptor HER2 que contiene la SEQ ID NO: 1,
caracterizada porque comprende un anticuerpo o un fragmento
del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11 y al
menos un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptables.
23. Método de obtención de un anticuerpo
monoclonal, donde se cultiva la línea celular hibridoma según la
reivindicación 12 en un medio de cultivo apropiado y se recupera el
anticuerpo monoclonal de este medio.
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