发明内容
本发明要解决的技术问题为提供一种结合特异性较高的抗HER2蛋白的单克隆抗体,产生该抗体的杂交瘤细胞株,及该抗体在制备用于检测HER2蛋白的免疫检测工具中的应用。
为解决上述技术问题,本发明提供了一种杂交瘤细胞株,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC),保藏日期为2012年11月29日,保藏编号为CGMCC No.6908。
本发明还提供了一种特异性结合HER2蛋白的单克隆抗体,由上述杂交瘤细胞株产生。
本发明所述单克隆抗体的制备方法如下:
(1)重组表达载体的构建:根据HER2基因的ORF全序列(如SEQ ID No.1所示)设计引物进行PCR扩增,基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI,并在其C末端引入Myc-DDK标签序列(标签序列如SEQ ID No.2所示),插入表达载体pCMV6-Entry,构建HER2重组表达质粒(简称为pCMV6-HER2);
(2)HER2重组蛋白的表达与纯化:以pCMV6-HER2质粒转染HEK293T细胞,裂解离心取上清,DDK亲和层析柱纯化,获得纯化的HER2重组蛋白;
(3)单抗的筛选与制备:采用上述HER2重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合,有限稀释法获得单克隆,ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,获得能分泌抗HER2特异性抗体的杂交瘤细胞株,即为本发明杂交瘤细胞株,其所分泌的抗体亚型鉴定为IgG2a;制备小鼠腹水,通过亲和层析柱纯化HER2单抗。分别通过Western Blot(结果见图3)、免疫组化实验(结果见图4、图5)验证该单抗的灵敏度和特异性。
发明人还通过OriGene高密度蛋白芯片验证了上述单克隆抗体的特异性:
OriGene高密度蛋白芯片上包含10400种HEK293T细胞蛋白过表达裂解物,每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵,每个亚矩阵上有一些参照,通过参照,可以定量每个芯片点上蛋白的含量,监控每次免疫反应数据的重复性,以及定位阳性信号的方向。
将本发明单克隆抗体与上述芯片杂交并确定阳性信号位点,结果显示:本发明单克隆抗体特异性结合HER2蛋白,与其他蛋白无交叉反应。
本发明还提供了一种免疫组化检测试剂盒,包括上述单克隆抗体;可用于检测组织细胞中HER2蛋白的表达状况。
上述免疫组化检测试剂盒,还包括用于免疫组化检测的其它常规试剂;如采用免疫酶标法的免疫组化试剂盒还包括封闭试剂,针对上述单克隆抗体的生物素标记的二抗,酶标抗生物素组分和底物。
本发明的另一个目的在于提供一种上述单克隆抗体在制备用于检测HER2蛋白的免疫检测工具中的应用。
所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。
本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于诊断HER2相关性肿瘤的病理诊断试剂盒中的应用。由于HER2蛋白的异常表达或扩增与人类多种恶性肿瘤有关,因此使用本发明单克隆抗体检测细胞中HER2蛋白的表达或扩增状况,可用于辅助诊断HER2相关性肿瘤。
所述HER2相关性肿瘤为乳腺癌、胃癌、食管癌、大肠癌、膀胱癌、子宫内膜癌、卵巢癌、甲状腺癌或非小细胞肺癌。
本发明所述针对HER2的特异性单抗,可与HER2蛋白特异结合,提高了实验的特异性和可靠性,并建立了基于该单克隆抗体的免疫组织化学技术,主要用于乳腺癌、大肠癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、食管癌、非小细胞肺癌等肿瘤的辅助诊断。
保藏信息
用于保藏的杂交瘤细胞株的科学描述为:抗人Her2单克隆抗体杂交瘤细胞株;
保藏单位全称:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;
保藏单位简称:CGMCC;
保藏单位地址:北京市朝阳区大屯路,中国科学院微生物研究所;
保藏日期:2012年11月29日;
保藏编号:CGMCC No.6908。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案,下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1抗HER-2单克隆抗体的制备
一、HER2重组表达质粒的构建
以从ATCC获得的质粒BC167147.1(含SEQ ID No.1所示HER2ORF序列)为模板,设计两条引物并分别引入酶切位点SgfI、MluI,以及C末端Myc-DDK标签(标签序列如SEQ ID No.2所示),并克隆入表达载体pCMV6-Entry,构建HER2重组表达质粒(简称为pCMV6-HER2)。
二、HER2重组蛋白的表达与纯化
1、转染HEK293T细胞
HEK293T细胞以1:3传至直径10cm的细胞培养皿中继续培养;取7.5ml DMEM(无血清及抗生素)培养基至50ml管中,加入300μlPEI MegaTran1.0混匀,然后加入75μg上述HER2重组质粒(pCMV6-HER2)DNA混匀并静置30分钟;分别取515μl上述混合液至各细胞培养皿中,于37℃、5%CO2培养箱中继续培养。转染24小时后,每培养皿细胞添加25μl2M丁酸钠至终浓度5mM。
2、裂解细胞
转染48小时后,进行细胞裂解。吸去培养基,加入1ml PBS进行漂洗,吸去PBS。加入1ml裂解缓冲液,使用前加入蛋白酶抑制剂PI和PMSF。置于冰盒中在摇床上振荡,收集所有培养皿中的裂解液,4℃离心,收集上清。
3、DDK亲和层析柱纯化
以孔径为0.45μm,直径为33mm的PVDF膜滤器过滤离心后的裂解液上清并转入15ml管中,加入混合好的Sepharose Beads1ml,封口后放入360度混匀器中,于4℃结合2小时;取出15ml管,将裂解液倒入BIO-RAD层析柱中,并接住穿透液,滴尽后穿透液取样WB检测,见图1(图1显示:HER2重组质粒在HEK293T细胞中正常表达);以裂解缓冲液冲洗柱料1-2次,滴尽后再用TBST冲洗Beads3次,滴尽后用0.1M Glycine(pH3.5)洗脱,第一次200μl,滴尽不收集,第二、三次各500μl,第四次250μl,收集至一个1.5ml Tube中,并迅速加入NaH2PO4(pH=11.0)中和至pH7.0左右,每管加入甘油至终浓度为10%,Tween-80至终浓度为0.1%。纯化后HER2重组蛋白用SDS-PAGE鉴定,结果见图2。
三、单抗的筛选与制备
1、动物免疫:上述纯化的HER2重组蛋白以完全弗氏佐剂乳化,采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠,免疫剂量为50μg/只,间隔两周后进行第二次免疫,以不完全弗氏佐剂乳化,免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价;根据结果确定是否加强免疫,选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。
2、细胞融合:骨髓瘤细胞采用BALB/c小鼠来源的sp2/0,融合时处于对数生长期;取上述免疫的小鼠脾脏,制成淋巴细胞单细胞悬液;免疫小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合,滴加37℃的50%PEG(PH8.0)1ml,加入不完全培养基及其余终止液,离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀,MC定容到50ml,分装到3.5cm培养皿中,放于湿盒中,置于37℃、5%CO2恒温培养箱中进行培养。
3、筛选和克隆:融合7-10天内挑选细胞克隆,使用上述纯化的HER2重组蛋白进行ELISA测试,标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释,每次有限稀释后5-6天测定ELISA值,挑取OD280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释,直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性;挑取阳性值高的单克隆定株,即为本发明杂交瘤细胞株。
4、腹水单抗的制备与纯化:10-12周龄的雄性BALB/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷,一周后每只小鼠用1ml注射器腹腔注射经PBS洗涤重悬的单克隆细胞悬液,细胞用量为5×106/只,每株抗体打2只小鼠。待小鼠腹水积聚后收集腹水,离心取上清,亲和层析法进行腹水纯化,根据抗体亚型选择相应柱料,本发明杂交瘤细胞株所分泌的抗体亚型为IgG2a,采用protein G进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、分装、冻存在-20℃。
以本发明单克隆抗体为一抗,对HepG2、HeLa、A549、MCF7四种细胞系的蛋白裂解液进行杂交、显色,其结果如图3所示,由图3可见:HER2蛋白在HeLa、A549、MCF7细胞中均有表达。
实施例2以本发明单克隆抗体为一抗的免疫组化试验
1、取膀胱癌或乳腺癌组织进行石蜡包埋,使用Finesse组织切片机进行切片,组织厚度为6μm;
2、脱蜡与水化:分析纯二甲苯3次×10min,无水乙醇3次×10min,95%乙醇5min,85%乙醇5min,75%乙醇5min,去离子水浸泡3min×3次;
3、加入抗原修复液(0.01M,pH6.0枸橼酸钠缓冲液)高压锅高压热修复2min,待高压锅温度降至约90℃时,打开高压锅,取出标本,然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3min×3次。
4、使用3%过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶,室温静置10min。去离子水浸泡5min×3次。
5、加上封闭液(PBS+5%脱脂奶粉+5%正常山羊血清),37℃孵育60min。
6、去除封闭液,勿冲洗,加入1:150比例稀释的本发明单克隆抗体;置于湿盒中,37℃孵育60min。PBST(含0.1%Tween-20)洗涤2次,每次洗涤5min。PBST(含0.02%Tween-20)洗涤1次,每次洗涤5min。
7、滴加Polink-试剂盒2(Catlog No.D37-15)中的试剂1,37℃孵育10-20分钟。使用PBS洗涤3次,每次5min。滴加Polink-2试剂盒(Catlog No.D37-15)中的试剂2,37℃孵育10-20分钟,使用PBS洗涤3次,每次5min。
8、应用DAB溶液(中杉金桥ZLI-9019)显色,显色3~10min。蒸馏水洗涤。
9、苏木精复染细胞核2min,蒸馏水漂洗,1%盐酸分化。蒸馏水漂洗3次,室温静置1min。
10、脱水和透明:75%乙醇5min,100%乙醇5min×3次,85%乙醇5min,95%乙醇5min,100%乙醇3×5min;二甲苯3×5min,中性树胶封片。
11、镜检,其结果分别见图4、图5。
结果:由图4、图5可见,膀胱癌、乳腺癌组织经染色后,可见大量棕黄色颗粒,为HER2蛋白表达阳性细胞;并且,HER2阳性着色定位准确,染色信号强,未发现非特异染色。
实施例3、本发明单克隆抗体的特异性检测
OriGene高密度蛋白芯片上包含10400种HEK293T细胞蛋白过表达裂解物,每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵,每个亚矩阵上有一些参照,通过参照,可以定量每个芯片点上蛋白的含量,监控每次免疫反应数据的重复性,以及定位阳性信号的方向。
以下为使用OriGene蛋白(OriGene Cat PA100001)芯片对本发明单克隆抗体进行特异性鉴定的具体步骤:
1、将一张蛋白芯片放在50ml离心管中,使用40ml去离子水浸润芯片,置于摇床上,室温混合30分钟;弃掉去离子水,使用10mlPBST平衡芯片,室温处理10分钟。
2、向50ml离心管中加入40ml5%脱脂牛奶(用PBST进行稀释)置于摇床上,室温封闭30分钟。
3、使用封闭液(5%脱脂牛奶)稀释本发明单克隆抗体,稀释比例1:200。
4、将洁净的封口膜粘贴到实验台上,滴加250-300μl上述稀释的单克隆抗体在封口膜上。
5、将蛋白芯片从封闭液中抽出,将蛋白芯片NC膜的一面朝下,从芯片的一边接触抗体,慢慢滑下,依靠液体表面张力,抗体将慢慢浸润芯片NC膜,直至整张NC膜浸润在单抗溶液中。整个操作过程避免产生气泡。将芯片移到4度环境下,静置,单抗孵育过夜。在芯片上加盖培养皿盖,其上黏附一张湿纸巾,以防止长时间孵育导致抗体蒸发。
6、第二天将芯片移至50ml离心管中,使用PBST漂洗芯片两次,去除多余的抗体。使用40ml PBST(含0.1%Tween-20)洗涤芯片,置于摇床上混合均匀,洗涤三次,每次洗涤5min。
7、使用封闭液(5%脱脂牛奶)稀释二抗DyLight649-conjugatedAffiiniPure Fragment Goat-anti-Mouse IgG,稀释比例为1:400。
8、按照上述步骤4,步骤5进行二抗孵育操作。室温孵育1小时。在芯片上方用铝箔纸遮盖,以防止发生信号漂白。
9、按照上述步骤6,使用PBST洗涤芯片。
10、使用去离子水冲洗芯片,以去除残余的盐分和变性剂。
11、室温干燥芯片,确保芯片完全干燥。
12、使用芯片扫描仪读取荧光信号。
13、根据BSA-Cy3以及BSA-Cy5确定芯片方向以及阳性信号的位点。
14、根据阳性信号位点找出对应蛋白裂解液ID,根据裂解液数据库信息,查找到对应蛋白名称,NCBI录入号(accession number),蛋白ID,蛋白大小等信息。
芯片杂交结果如图6所示:实验组芯片上仅出现一个阳性信号点,对应蛋白为ERBB2(即HER2蛋白);结论:本发明抗HER2单克隆抗体仅特异性结合HER2蛋白,而与其他蛋白无交叉反应。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。