CN105647874A - 小鼠抗人her-2单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株 - Google Patents

小鼠抗人her-2单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株 Download PDF

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刘晨
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Abstract

一种小鼠抗人HER-2单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述的分泌HER-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株克隆号为6H8，保藏编号为：CGMCC？No.？6918。本发明还提供了所述杂交瘤细胞株6H8产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ？ID？NO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ？ID？NO:10。该抗体可用于科研或临床免疫组化检测HER-2表达。

Description

小鼠抗人HER-2单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株
技术领域
本发明涉及以原核表达的HER-2蛋白免疫小鼠获得的分泌HER2单克隆抗体的杂交瘤细胞株6H8，属于生物工程技术领域。
背景技术
HER-2是定位于17号染色体短臂(17q21)的原癌基因c-erbB-2的表达产物。HER-2在人和啮齿类中也称作c-erbB-2或neu，是一种由1255个氨基酸残基构成，相对分子质量为185kDa，具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体样蛋白，由胞外区、跨膜区及胞内区构成，是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。目前已知该家族包括四个相关的蛋白酪氨酸激酶受体：HER-1(erbB-1/EGFR)、HER-2(erbB2/neu)、HER-3(erbB3)及HER-4(erbB4)，这些蛋白酪氨酸激酶受体在细胞表面与特异的天然受体或生长因子相互作用。
HER-2在调节肿瘤细胞生长、分化及存活起着重要作用，并参与正常乳腺细胞生长和发展的调节，与肿瘤细胞的生长、侵袭和转移密切相关。通常情况下，HER-2只在胎儿期表达，到成年后，也只在极少数组织内低表达。HER-2的过表达是由原癌基因扩增或转录异常，或基因突变激活所致。在人类肿瘤中，特别是乳腺癌、卵巢癌、非小细胞癌等许多恶性肿瘤中都存在HER-2不同程度的过表达。
HER-2在肿瘤发生中起重要作用，主要通过多种途径促进细胞的增殖、分化以及抑制凋亡。与正常细胞相的HER-2基因相比，从肿瘤中分离出来的HER-2基因由于跨膜区的氨基酸序列变异而具有转化性。有报道HER-2过表达在乳腺腺病与乳腺癌质检差异有高度显著性，在癌旁上皮、乳腺癌组织学类型分级关系密切，对鉴别乳腺良恶性疾病具有辅助价值。HER-2过表达与淋巴结转移、组织学分级呈正相关，与生存期呈负相关，可作为判断乳腺癌预后的指标。
HER-2作为重要的乳腺癌预后判断因子，其阳性（过表达或扩增）乳腺癌的临床特点和生物学行为有特殊表现，治疗模式也与其他类型的乳腺癌有很大的区别。HER-2状态是预后判断的制定有效治疗方案的重要参考指标，更重要的是，HER-2阳性是患者采取HER-2基因靶向治疗药物治疗的先决条件。
随着HER-2相关分子研究的深入，国内外已经获得了多种HER-2的单克隆抗体，但一直以来都需要表达量更多，亲和性更好，稀释度更高，具有更多优良特性的单克隆抗体。获得活性高的HER-2的单克隆抗体对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种高亲和性的、可用于科研或临床免疫组化检测HER-2表达的小鼠抗人HER-2单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
（1）根据HER-2的基因序列（NM_001005862.1）的编码框，设计一对特异引物，TrizolReagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增HER-2基因，构建重组表达载体PET28a-HER-2，转化大肠杆菌BL21感受态，IPTG诱导蛋白表达并亲和纯化蛋白作为抗原；
（2）采用经典的细胞融合技术制备HER-2单克隆抗体。亲和层析纯化抗体蛋白，SDS-PAGE测定抗体纯度，直接ELISA法测定纯化抗体的滴度；
（3）通过免疫组织化学分析HER-2单克隆抗体染色人乳腺癌石蜡切片；
（4）根据抗体基因的恒定区序列合成特异性引物，PCR扩增单克隆抗体HER-2重链可变区和轻链可变区，回收目的片段，克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后筛选阳性克隆，抽提质粒后测序确定了单克隆抗体HER2的重链和轻链可变区序列。
本发明提供的以原核表达的HER-2蛋白为抗原、免疫小鼠获得的分泌HER-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为6H8，分类命名为小鼠抗人HER-2杂交瘤细胞系，该细胞株6H8已于2012年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCCNo.6918。
本发明还提供了所述杂交瘤细胞株6H8，CGMCCNo.6918产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:10。
本发明的优点和有益效果
本发明应用重组人的HER-2蛋白为免疫抗原，免疫Balb/c小鼠,采用经典的细胞融合技术，通过ELISA筛选，获得一株能稳定分泌抗HER-2的杂交瘤细胞株，命名为6H8，亚型鉴定为IgG1，将杂交瘤细胞株扩大培养后收集上清，采用ProteinA亲和层析法对HER2单抗进行纯化。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上；ELISA滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1:10000以上。人乳腺癌石蜡切片经抗HER-2抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到细胞膜出现明显棕黄色颗粒，背景清晰，无非特异性着色。从实验结果上来看，本发明制备了高效价，高特异性的HER-2单克隆抗体，用该抗体检测证实，其对细胞中的HER-2蛋白具有高识别能力，可用于科研或临床免疫组化检测HER-2表达。
附图说明
图1SDS-PAGE分析纯化后的HER-2单克隆抗体。
图2ELISA法测定HER-2单克隆抗体滴度。
图3是免疫组织化学检测分析HER-2单克隆抗体染色人乳腺癌石蜡切片。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常施方法。
实施例1：杂交瘤细胞株6H8及其产生的单克隆抗体的获得
1、抗原制备
（1）获得目的基因
在该实施例中，根据HER-2的基因序列（NM_001005862.1）的编码框，设计1对特异引物：
引物1：5'-GGATCCATGAAGCTGCGGCTCCCTGC-3'(SEQIDNO:1)
引物2：5'-5'-CTCGAGTCACACAGGCACGTCCAGACC-3'；(SEQIDNO:2)
TrizolReagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增HER-2基因
（2）构建重组表达载体
将步骤（1）获得的PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入表达载体PET28a，构建重组质粒PET28a-HER-2
（3）获得含重组表达质粒的表达菌种
将步骤（2）获得的连接产物转化大肠杆菌BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞
（4）诱导表达和蛋白纯化
将步骤（2）提取的质粒转化BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑选单克隆至10ml含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中培养，37℃，220rpm培养10h，取5ml液体培养基转移至250ml的大瓶中继续培养，培养至OD值为0.8，加入0.2mM　IPTG诱导表达，16℃诱导过夜，收集菌液超声，取上清用Ni-NTA琼脂糖亲和层析法纯化HER-2蛋白。
2、单抗的制备和纯化
(1)、免疫动物
一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行三次免疫注射。
首次免疫。纯化的重组蛋白HER-2（用适量生理盐水稀释）+完全弗氏佐剂，100μg/只，颈背部皮下多点注射；
二次免疫（间隔两周）。纯化的重组蛋白HER-2（用适量生理盐水稀释）+不完全弗氏佐剂，100μg/只，颈背部皮下多点注射；
三次免疫（间隔两周）。纯化的重组蛋白HER-2（用适量生理盐水稀释），不完全弗氏佐剂，100μg/只，颈背部皮下多点注射；
三次免疫后7～10天采血，用建立的ELISA法检测效价，选择效价最高者用于细胞融合。
加强免疫（融合前3天），用纯化的重组蛋白50μg腹腔注射。3天后，取脾脏融合。
(2)、细胞融合
采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按一定比例混合（1:5~1:10），并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。采用HAT选择性培养基，进行杂交瘤细胞的选择性培养和筛选。
用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清：以纯化的HER-2蛋白（10μg/ml）包被酶标板，每孔100μl，4℃包板过夜。甩掉包被液，加入200μl5%的脱脂奶粉，37℃封闭1h后，洗涤3次，加杂交瘤细胞培养检测上清100μl（阴性对照为PBS100μl），37℃孵育1小时。洗涤3遍后，加酶标记二抗（羊抗鼠IgG-HRP），37℃孵育1小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50μl，室温静置5分钟，加终止液50μl。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。OD值明显高于阴性对照2倍以上者定为阳性。最后筛选得到一株分泌性能最佳的抗HER2杂交瘤细胞株，命名为6H8，亚型鉴定为IgG1。
将选出的阳性杂交瘤细胞株6H8克隆化培养（有限稀释法），获得能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞株扩大培养，并冻存保种。所述的阳性杂交瘤细胞为抗人HER-2杂交瘤细胞系6H8，该细胞系已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.6918。
(3)单克隆抗体的大量制备与纯化
将步骤（2）获得的细胞株6H8接种至Balb/c小鼠腹腔，制备腹水，然后从腹水中提取抗体。单克隆抗体HER-2的纯化：采用ProteinA亲和层析法。首先制备proteinA亲和柱，用PBS平衡柱子后，取抗HER-2的腹水过柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，以50mmol/LPH2.5的甘氨酸-HCl溶液（PH）洗脱，收集峰值区的洗脱液，经透析浓缩后备用。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上(参见图1)。
(4)直接ELISA法测定纯化抗体的滴度
以纯化的HER-2蛋白（10μg/ml）包被酶标板，每孔100μl，4℃包板过夜。甩掉包被液，加入200μl5%的脱脂奶粉，37℃封闭1h后，洗涤3次，将纯化的抗体按1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800进行稀释，以每孔100μl加入酶标板中（阴性对照为PBS100μl），37℃孵育1小时。洗涤3遍后，加酶标记二抗（羊抗鼠IgG-HRP），37℃孵育1小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50μl，室温静置5分钟，加终止液50μl。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。ELISA滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1:10000以上（参见图2）。
实施例2：单克隆抗体免疫组化应用检测
用HER-2单抗，按常规法作病理切片，对人乳腺癌石蜡切片进行免疫组化染色。
具体方法为
(1)脱蜡
切片依次置于二甲苯I、II、III中脱蜡，每次5分钟，移至无水乙醇I、II中各浸泡4分钟，移至95%酒精中浸泡4分钟，移至85%酒精中浸泡4分钟，再移至70%酒精中浸泡4分钟，流水冲洗2分钟
(2)抗原修复
将已冲洗干净组织切片放入高压锅内，加入约3000ml左右的柠檬酸盐抗原修复液（pH6.0），高火加热煮沸后调至低火保持沸腾喷气3分钟，关掉电磁炉开关，两分钟后将高压锅移至冷水中冷却，待高压锅内抗原修复液完全冷却后，打开高压锅将组织切片用流水冲洗干净移至蒸馏水中浸泡2分钟
(3)阻断
将组织切片置于3%H2O2中浸泡10分钟，以流水和蒸馏水分别冲洗。取出切片，擦干组织周围的水，用免疫组化笔在组织块周围画一圆圈，注意圈接头要接好，防止抗体跑出圈外造成假阴性。PBS缓冲液冲洗
(4)滴加一抗
甩去待测组织切片上多余的PBS，滴加一抗，其中一抗为实施例1步骤（3）制备并纯化的HER-2单克隆抗体，稀释度为1:5000。放置在孵育盒内4℃冰箱中过夜孵育约12小时
(5)滴加二抗
将孵育盒从冰箱取出，恢复至室温后取出切片，用PBS洗3次，每次5分钟。滴加通用型二抗-HRP聚合物。将切片放入孵育湿盒中，盖上盖子，连孵育盒一起放入37℃恒温箱中孵育30分钟
(6)显色、衬染、封片
取出切片，擦掉组织周围的多余的PBS，加入DAB显色液中显色3～5分钟，在显微镜下控制染色的强度。待强度适中后将切片置自来水中终止显色，再用流水冲洗5～10分钟，苏木素染液复染1分钟，0.5%盐酸酒精分化3秒钟，流水冲洗5～10分钟，脱水、透明、封片、镜检
结果判定：按照国外学者对组织中HER-2的判定标准，HER-2蛋白阳性反应为出现明显棕黄色颗粒，定位于细胞膜。人乳腺癌组织（参见图3）经抗HER-2抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到细胞膜出现明显棕黄色颗粒，背景清晰，无非特异性着色，说明此HER-2小鼠单克隆抗体可以特异性的应用于免疫组织化学实验。
实施例3：单克隆抗体可变区测序
根据抗体基因的恒定区序列合成以下引物:
zh085'-GGGGATATCCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT-3'　(SEQIDNO:3)
zhr115'-GACHGATGGGGSTGTYGTGCTAGCTGNRGAGACDGTGA-3'　　(SEQIDNO:4)
zl01　5'-GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3'　　(SEQlDNO:5)
zlr055'-GGATACAGTTGGTGCAGTCGACTTACGTTTKATTTCCARCTT-3'(SEQIDNO:6)
TrizolReagent试剂分别提取5×106杂交瘤细胞6H8的总RNA，将总RNA逆转录成cDNA。用zh08和zhr11为引物进行PCR扩增单克隆抗体HER2重链可变区，用zl01和zlr05为引物进行PCR扩增单克隆抗体HER2轻链可变区，PCR反应均采用热启动，反应条件：94℃5分钟；94℃45秒，60℃45秒，72℃1分10秒，30个循环；72℃7分钟。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片段（轻链长度391bp，重链长度420bp）。克隆到pGEM-T（Promega）载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后在IPTGIX-gal平板上进行筛选，取白色菌斑接种于含有氨韦青霉素的LB液体培养基中扩增。筛选阳性克隆，用QIAGEN的质粒抽提试剂盒抽提质粒并进行测序，确定了单克隆抗体HER2的重链和轻链可变区序列。
单克隆抗体HER-2可变区的DNA序列和氨基酸序列:
单克隆抗体HER-2重链可变区DNA序列(5'→3'，398bp)(SEQIDNO:7)；
单克隆抗体HER-2的轻链可变区DNA序列(5'→3'，418bp)(SEQ1DNO:8)；
单克隆抗体HER-2重链可变区的推断氨基酸序列(139氨基酸)(SEQIDNO:9)；
单克隆抗体HER-2轻链可变区的推断氨基酸序列(131氨基酸)(SEQ10IDNO:10)。
序列表SEQUENCELISTING
<110>天津三箭生物技术股份有限公司
<120>小鼠抗人HER-2单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株
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LeuValLeuLysGlyValGlnCysGluValGlnLeuValGluSerGly
202530
GlyGlyLeuValLysProGlyGlySerLeuLysLeuSerCysAlaAla
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SerGlyPheThrPheSerAspTyrTyrMetTyrTrpValArgGlnThr
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ProGluLysArgLeuGluTrpValAlaSerIleSerAlaGlyGlyThr
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TyrThrTyrTyrProAspSerValLysGlyArgPheThrIleSerArg
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130

Claims (2)

1.一种以原核表达的HER-2蛋白免疫小鼠获得的分泌HER-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株6H8，保藏编号为CGMCCNo.6918。
2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株6H8产生的重链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:10的免疫球蛋白。
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