CN101463344A

CN101463344A - 抗人Her2单克隆抗体杂交瘤细胞系、单克隆抗体、试剂盒及其用途

Info

Publication number: CN101463344A
Application number: CNA2009100676988A
Authority: CN
Inventors: 刘红芹; 石琳; 屈浩; 田晨; 王冬梅; 黄丽华; 张丽艳; 冯春玲; 张毅; 何大水; 朱卫彬
Original assignee: XIEHE STEM CELL GENE ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: XIEHE STEM CELL GENE ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2009-01-15
Filing date: 2009-01-15
Publication date: 2009-06-24
Anticipated expiration: 2029-01-15
Also published as: CN101463344B

Abstract

本发明公开了一种抗人Her2单克隆抗体杂交瘤细胞系、单克隆抗体、试剂盒及其用途，能够在体内外特异性结合人类Her2抗原，鉴别不同水平表达Her2的人类正常或肿瘤细胞。所述细胞系的保藏号为CGMCCNO.2748，单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.2748杂交瘤分泌。抗体是鼠源性单克隆抗体，属于IgM/κ亚型。本发明采用经典杂交瘤制备技术成功制备抗人Her2单克隆抗体，为肿瘤特别是乳腺癌的诊断和指导治疗提供了一种有效的检测手段。

Description

抗人Her2单克隆抗体杂交瘤细胞系、单克隆抗体、试剂盒及其用途

技术领域

本发明涉及一种可以特异性识别人Her2分子，用于肿瘤的诊断、预后判断，或指导治疗肿瘤的抗人Her2单克隆抗体杂交瘤细胞系、单克隆抗体、试剂盒及其用途。

背景技术

乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤，仅次于宫颈癌，在女性恶性肿瘤发病率中居第2位。全世界每年约有120万妇女发现乳腺癌，有50万妇女死于乳腺癌。北美、北欧是乳腺癌的高发地区，其发病率约为亚、非、拉美地区的4倍。我国是乳腺癌的低发地区，但其发病率正逐年上升，尤其沪、京、津等大城市及沿海地区。城市和农村女性乳腺癌有差别，城市愈大，乳腺癌发病率愈高，城市各年龄组乳腺癌死亡率均高于农村。乳腺癌在女性的发病率随着年龄的增长而上升，在月经初潮前罕见，20岁前亦少见，但20岁以后发病率迅速上升。45～50岁较高，但呈相对的平坦，绝经后发病率继续上升，到70岁左右达最高峰；死亡率也随年龄而上升，在25岁以后死亡率逐步上升，直到老年时始终保持上升趋势。

人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2，Her2)是表皮生长因子受体家族(EGFR)的第二类成员，目前尚未发现其自身的特异性配体。Her2/neu基因，又名c-erbB2，其编码的产物为185,000的糖蛋白p185，具有酪氨酸激酶活性，在结构上与表皮生长因子受体EGFR具有同源性。p185与许多生长因子受体都参与丝裂原信号转导。Her2/neu基因的过表达在肿瘤形成中起重要作用。人类多种肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌等均有Her2/neu的过表达，其在乳腺癌中的过表达达30％。多项研究表明抗p185蛋白的单抗能在体内和体外实验中抑制Her2/neu过表达的肿瘤细胞的生长。

Her2/neu是跨膜受体，可用多种实验方法直接作用于其胞外域，因而是一种理想的治疗靶向。体内外实验均证明，抗Her2/neu单克隆抗体能抑制过表达Her2/neu的乳腺癌细胞生长。以Her2为靶抗原的抗体介导已成为有效的生物治疗手段。美国FDA于1998年批准一种Her2人源化改良型抗体群司珠单抗(trastuzumab；又称赫赛汀，HERceptin)上市治疗转移性乳腺癌，将乳腺癌的疗效提高了约20％。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种抗人Her2单克隆抗体杂交瘤细胞系、单克隆抗体，其可以识别人类Her2抗原，可以为肿瘤特别是乳腺癌的诊断及治疗提供有力工具。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种抗人Her2单克隆抗体杂交瘤细胞系，所述细胞系的保藏号为CGMCC NO.2748。

一种抗人HER2单克隆抗体，由保藏号为CGMCC NO.2748杂交瘤分泌。

所述的抗体是鼠源性单克隆抗体，属于IgM/κ亚型。

所述的抗人Her2单克隆抗体在制备肿瘤诊断试剂或指导治疗肿瘤的检测中的应用。

一种免疫检测试剂盒，含有至少一种上述的单克隆抗体。

所述的免疫检测试剂盒在诊断恶性肿瘤；或评价恶性肿瘤的发展和预后；或指导恶性肿瘤的治疗中的用途。

本发明的有益效果：

1、所制备的抗体可以特应性识别人类Her2抗原，其识别表位满足用于免疫组织化学染色法检测人类组织中的Her2抗原的要求。

2、所组装的试剂盒方便有效、灵敏度高，可以用于临床标本检测，为诊断和预后判断提供依据。

附图说明

图1是Her2胞外区编码基因PCR产物凝胶电泳图。1为DL2000标准分子量marker，2为扩增的Her2基因。

图2是纯化的Her2蛋白的SDS-PAGE电泳图。1为未经诱导的全细菌裂解液，2为IPTG诱导的全细菌裂解液，3为诱导的细菌裂解上清，4为诱导的细菌裂解沉淀，5为标准分子量蛋白marker，6为纯化后的Her2蛋白

图3是本发明的试剂盒染色的SK-Br3细胞(标本为于载玻片上培养的SK-Br3细胞)。

图4是本发明的试剂盒染色的293细胞(标本为于载玻片上培养的293细胞)。

图5是本发明试剂盒染色的SK-Br3细胞，左侧为HIHer2抗体染色，右侧为PBS阴性对照(标本为于载玻片上培养的SK-Br3细胞)。

制备特异结合Her2抗原分子的鼠抗人单克隆抗体的杂交瘤保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC NO：2748，保藏日2008—11—19，分类命名为：小鼠抗人Her2杂交瘤细胞系。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

一种抗人Her2单克隆抗体杂交瘤细胞系，所述细胞系的保藏号为CGMCCNO.2748。

所述的抗体是鼠源性单克隆抗体，属于IgM/κ亚型。

一种免疫检测试剂盒，含有至少一种上述的单克隆抗体。

本发明是通过传统杂交瘤融合技术得到一株鼠抗人单克隆抗体。该抗体特异的识别表达在人类细胞上的表皮生长因子受体家族成员erbB-2，即Her2分子。

1、Her2蛋白的制备

(1)引物的设计

根据GenBank中登录的Her2编码基因序列(NM_004448.2)，设计胞外区引物：

Her2-pET41d-F：5′-GGGATCCGAATTCGTGGGCGAGGGCCTGGCCTG-3

Her2-pET41d-R：5′-TGGTGGTGCTCGAGAGGCTGGCATGCGCCCTCCTC-3

(2)Her2胞外区编码基因的扩增

采用RT-PCR方法。使用Trizol试剂盒按说明从高表达Her2的SK-Br3细胞系中提取总RNA。以提取的总RNA为模板，Oligo(dT)为引物，合成cDNA，用于PCR反应。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，共进行30次循环；最后72℃延伸10min。

(3)目的基因的克隆及测序

将回收的目的基因克隆入PMD18-T载体，转化感受态大肠杆菌DH5α。

(4)原核表达载体pET41d/HER2的构建

将质粒PMD18-T/HER2用EcoRI和XhoI双酶切，回收的目的片段与用同样酶酶切的原核表达载体pET41d连接，转化感受态大肠杆菌DH5a。

(5)目的蛋白的诱导表达

将重组质粒pET41d/HER2转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取生长良好的单菌落接种到5ml含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。取过夜培养的菌液5ml转移到500ml含氨苄西林的LB培养基中，继续培养至A₆₀₀＝0.6，加入0.5mmol/L的IPTG，16℃ 200rpm/min过夜诱导大量表达。

(6)表达产物的纯化

收集菌体沉淀，重悬于1/30培养体积的裂解缓冲液(50mmol/LTris-HCl、100mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA)中，超声破菌后，4℃ 12000g离心30min。沉淀重悬于1/30培养体积的包涵体溶解缓冲液(给出成分)，4℃ 12000g离心30min，收集包涵体。用1/40培养体积的6mol/L盐酸胍、0.1mol/L Tris-HCl(pH7.0)溶液于4℃摇动过夜溶解包涵体。收集上清，利用表达载体上的组氨酸标签进行亲和层析纯化。平衡镍柱后上样，分别用6个柱体积的结合缓冲液洗柱，4个柱体积的洗涤缓冲液洗柱，最后用6个柱体积的咪唑洗脱液洗脱结合在镍柱上的目的蛋白。为了去除纯化洗脱时咪唑等小分子成分，将纯化蛋白装入透析袋，置于PBS缓冲液中透析12h，期间更换3次透析液。最后透析袋中即为制备的Her2蛋白

2、鼠抗人Her2单克隆抗体制备与检定

(1)制备：

I、免疫使用原核表达的Her2融合蛋白常规方法免疫6周龄Balb/c小鼠，皮下注射。首次基础免疫使用福氏完全佐剂，每隔2周进行一次加强免疫，使用不完全福氏佐剂，共三次，每次每只100g，融合前4天末次免疫，脾内注射，每只50g。

II、融合取小鼠脾细胞与NS-1细胞系融合，融合剂采用50％PEG(MW1,540)。

III、筛选用原核表达的Her2融合蛋白包被酶标板，以间接ELISA法进行第一步筛选；转化了Her2基因，表达Her2融合蛋白的酵母细胞为靶细胞，以细胞ELISA法进行第二步筛选；SK-Br3为靶细胞，以免疫组化实验进行第三步筛选，最终得到阳性克隆。

IV、克隆化以有限稀释法克隆化2～3次，取培养上清重复上述第二、三步筛选，得到稳定分泌抗体的细胞株。

V、保存将阳性杂交瘤细胞株于液氮中保存。

VI、抗体工作液制备复苏冻存的杂交瘤细胞株，于RPMI-1640培养液中培养，培养条件为37℃，5％CO2，扩大培养并收集培养上清，其中即含鼠抗人Her2抗体。

3、试剂盒操作方法

(1)标本放入固定液中(甲醇：丙酮＝1：1)固定90秒，晾干，做好标记。

(2)加鼠抗人HER2抗体工作液(盖满标本)30—50分钟，室温。用PBS将抗体冲净，用PBS浸泡2次，每次5分钟。

(3)加生物素—羊抗鼠二抗

(4)加碱性磷酸酶—链霉卵白素(盖满标本)20—40分钟，室温。用PBS将抗体冲净，用PBS浸泡2次，每次5分钟。

(5)显色：取1ml底物液溶解1mg坚固红(现用现配)滴加于标本上，显色10-20分钟。镜下观察，待胞膜或胞浆出现明显的红色，蒸馏水轻轻冲净，晾干。

(6)Mayer苏木素复染60分钟，蒸馏水冲净；用0.5％氨水返蓝5秒，蒸馏水冲净晾干。

标本如需保存用明胶甘油封片。

如图3、4、5所示，图3是本发明的试剂盒染色的于载玻片上培养的SK-Br3细胞。图4是本发明的试剂盒染色的于载玻片上培养的293a细胞。图5是于载玻片上培养的SK-Br3细胞，左侧为Her2单克隆抗体染色，右侧为PBS对照。

本发明的杂交瘤细胞系分泌的能够特异结合人类Her2抗原分子的鼠抗人Her2单克隆抗体，识别人类正常细胞和肿瘤细胞表面表达的Her2分子胞外区部分。该抗体可以用于人类组织特别是乳腺癌组织的诊断和治疗。

本发明利用传统的杂交瘤制备技术，获得稳定分泌抗人Her2分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株，由此获得的单克隆抗体与通用SAP试剂盒组装检测人类Her2抗原的免疫组化试剂盒。

本发明的目的旨在制备抗Her2/neu的特异性单抗，并且筛选出分泌能够结合天然Her2/neu抗原，用于免疫组化抗体的杂交瘤细胞株，用于指导乳腺癌的治疗和预后评估。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims

1、一种抗人Her2单克隆抗体杂交瘤细胞系，其特征是所述细胞系的保藏号为CGMCC NO.2748。

2、一种抗人Her2单克隆抗体，其特征是由保藏号为CGMCC NO.2748杂交瘤分泌。

3、根据权利要求2所述的抗人Her2单克隆抗体，其特征是所述的抗体是鼠源性单克隆抗体，属于IgM/κ亚型。

4、权利要求2-3中任一项所述的抗人Her2单克隆抗体在制备肿瘤诊断试剂或指导治疗肿瘤的检测中的应用。

5、一种免疫检测试剂盒，其特征是含有至少一种权利要求2—3所述的单克隆抗体。

6、权利要求5所述的免疫检测试剂盒在诊断恶性肿瘤；或评价恶性肿瘤的发展和预后；或指导恶性肿瘤的治疗中的用途。