CN114805584A

CN114805584A - 抗原结合蛋白及其用途

Info

Publication number: CN114805584A
Application number: CN202210750853.1A
Authority: CN
Inventors: 赵阳兵; 刘晓军; 王杰
Original assignee: Shanghai Youtijisheng Biomedical Co ltd
Current assignee: Shanghai Youtijisheng Biomedical Co ltd
Priority date: 2022-06-30
Filing date: 2022-06-29
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2042-06-30
Also published as: CN114805584B; CN114805584A8; US11767368B1

Abstract

本申请涉及一种抗原结合蛋白及其用途，所述抗原结合蛋白包含VH和VL，其中所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；其中所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。本申请还涉及包含所述原结合蛋白的药物组合物及其治疗癌症的用途。

Description

抗原结合蛋白及其用途

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种抗HER2抗原结合蛋白及其用途。

背景技术

CAR-T细胞用于治疗相关肿瘤，T细胞可由表面嵌合抗原受体与肿瘤表面特异性抗原结合而激活并释放各种细胞因子杀伤肿瘤细胞。肿瘤细胞表面的蛋白质、糖、糖脂都可以作为嵌合抗原受体的潜在靶点，使得CAR-T拥有更广泛的抗原谱。另外，CAR结构中的协同共刺激分子可以提高T细胞增值活性、体内存在时间，从而使CAR-T细胞获得持久的杀瘤作用。

HER2/neu(ErbB2)基因编码185kDa跨膜糖蛋白，其属于表皮生长因子受体(EGFR)家族。HER2蛋白包括由620个氨基酸残基组成的细胞外结构域，由23个氨基酸残基组成的跨膜结构域和由490个氨基酸残基组成的具有酪氨酸激酶活性的细胞内结构域(Akiyama T等人，Science，232(4758)：1644-1646(1986))。HER2（人类表皮生长因子受体2）在正常细胞中的表达水平非常低，但在胚胎发育中的表达水平非常高，在发育过程中对细胞增殖、分化和迁移起着重要作用。HER2的过度表达与许多上皮癌的进展密切相关，尤其是在乳腺癌和胃/胃食管交界癌（GEJ）中。目前针对HER2的疗法容易产生耐药性。HER2高表达的肿瘤具有较强的转移和侵袭能力，对化疗敏感性低，易复发。目前迫切需要新的治疗方法来满足患者的需求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种抗HER2抗原结合蛋白、免疫缀合物、包含抗HER2抗原结合域的嵌合抗原受体、编码基因、构建体及其应用。

一方面，本申请提供一种分离的抗原结合蛋白，其包含抗体重链可变区（VH），其中所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含VH，其中所述VH包括框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，所述HFR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，所述HFR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，所述HFR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，所述HFR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连；其中，所述HFR1包含SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列，所述HFR2包含SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列，所述HFR3包含SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列，HFR4包含SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含VH，其中所述VH包含SEQ IDNO: 22所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含VL，其中所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ IDNO: 4所示的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含VH和VL，其中所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列；其中所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含VL，其中所述VL包括框架区LFR1，LFR2，LFR3和LFR4，其中所述LFR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，所述LFR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，所述LFR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，所述LFR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接相连；其中所述LFR1包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，所述LFR2包含SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列，所述LFR3包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述LFR4包含SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含VL，其中所述VL包含SEQ IDNO: 21所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含VH和VL，其中所述VH包含SEQID NO: 22所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包括抗体或其抗原结合片段。

在某些实施方式中，其中所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)₂，scFv，di-scFv，dAb和/或VHH。

在某些实施方式中，其中所述抗体为嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。

在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包括抗体重链恒定区。

在某些实施方式中，其中所述抗体重链恒定区源自人IgG的恒定区。

在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包括抗体轻链恒定区。

在某些实施方式中，其中所述抗体轻链恒定区包括人Igκ恒定区或人Igλ恒定区。

在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包括scFv，其中所述VH和VL通过接头连接。

在某些实施方式中，其中所述接头包括肽接头。

在某些实施方式中，其中所述接头包含SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列。

另一方面，本申请提供一种免疫缀合物，其包含本申请所述分离的抗原结合蛋白。

另一方面，本申请提供一种嵌合抗原受体，其包含胞外抗原结合结构域，其中所述胞外抗原结合结构域包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白。

在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体还包含跨膜域，所述跨膜域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的跨膜域：CD8、CD28、CD3ε (CD3e)、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、TRAC、TRBC、CD3ζ、CTLA-4、LAG-3、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12，CD40L (CD154)、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、SLAM及它们的变体。

在某些实施方式中，其中所述跨膜域包含源自CD8的跨膜域或其变体。

在某些实施方式中，其中所述跨膜域包含SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体还包含胞内信号转导结构域，所述胞内信号转导结构域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的胞内信号转导结构域：CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD79a、CD79b、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14 Nef、DAP10、DAP-12和至少包含一个ITAM的结构域。

在某些实施方式中，其中所述胞内信号转导结构域包含源自CD3ζ的信号传导结构域。

在某些实施方式中，，其中所述胞内信号转导结构域包含SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，其中所述嵌合抗原受体包含胞外抗原结合结构域、跨膜域和胞内信号转导结构域。

在某些实施方式中，其中所述嵌合抗原受体还包含胞内共刺激信号传导结构域，所述胞内共刺激信号传导结构域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的胞内共刺激信号传导结构域：CD28、4-1BB (CD137)、CD27、CD2、CD7、CD8A、CD8B、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD40、MyD88及它们的变体。

在某些实施方式中，其中所述胞内共刺激信号传导结构域源自4-1BB的共刺激信号传导结构域或其变体。

在某些实施方式中，其中所述胞内共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，由N端至C端，所述嵌合抗原受体依次包含胞外抗原结合结构域、跨膜域、胞内共刺激信号传导结构域和胞内信号传导结构域。

在某些实施方式中，其中所述跨膜域与所述胞外抗原结合结构域之间还包含间隔子，所述间隔子包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的铰链区：CD28、CD8、IgG1、IgG4、IgD、4-1BB、CD4、CD27、CD7、CD8A、PD-1、ICOS、OX40、NKG2D、NKG2C、FcεRIγ、BTLA、GITR、DAP10、TIM1、SLAM、CD30、LIGHT及它们的变体。

在某些实施方式中，所述间隔子包含源自CD8铰链区或其变体。

在某些实施方式中，所述间隔子包含SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，由N端至C端，所述嵌合抗原受体依次包含胞外抗原结合结构域、间隔子、跨膜域、胞内共刺激信号传导结构域和胞内信号传导结构域。

在某些实施方式中，由N端至C端，所述嵌合抗原受体的间隔子、跨膜域、胞内共刺激信号传导结构域和胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体还包含信号肽片段，所述信号肽片段的C端与所述胞外抗原结合结构域的N端连接。

在某些实施方式中，所述信号肽片段包括CD8信号肽片段。

在某些实施方式中，所述信号肽片段包含SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列。

另一方面，本申请提供一种分离的核酸分子，其包含编本申请所述的抗原结合蛋白或编码本申请所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。

另一方面，本申请提供一种构建体，其包含本申请所述的核酸分子。

另一方面，本申请提供一种细胞，其包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的构建体，和/或表达本申请所述的嵌合抗原受体。

在某些实施方式中，其中所述细胞包括免疫效应细胞。

在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞.

在某些实施方式中，其中所述细胞包括CAR-T细胞和CAR-NK细胞。

另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白，本申请所述的免疫缀合物，本申请所述的嵌合抗原受体，本申请所述的核酸分子，本申请所述的构建体或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载体。

另一方面，本申请提供一种本申请所述的分离的抗原结合蛋白，本申请所述的免疫缀合物，本申请所述的嵌合抗原受体，本申请所述的核酸分子，本申请所述的构建体，本申请所述的细胞，或本申请所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗肿瘤。

在某些实施方式中，其中所述肿瘤包括乳腺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、尿路上皮癌、食管癌、膀胱癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、头颈癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌和/或甲状腺癌。

在某些实施方式中，其中所述肿瘤包括HER2阳性的肿瘤。

另一方面，本申请提供一种本申请所述的分离的抗原结合蛋白，本申请所述的免疫缀合物，本申请所述的嵌合抗原受体，本申请所述的核酸分子，本申请所述的构建体，本申请所述的细胞，或本申请所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗HER2表达异常相关疾病。

在某些实施方式中，其中所述HER2表达异常相关疾病包括肿瘤。

在某些实施方式中，其中所述HER2表达异常相关疾病包括HER2阳性的肿瘤。

在某些实施方式中，其中所述HER2阳性的肿瘤包括乳腺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、尿路上皮癌、食管癌、膀胱癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、胰腺癌、头颈癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、前列腺癌和/或甲状腺癌。

另一方面，本申请提供一种预防和/或治疗肿瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的本申请所述的分离的抗原结合蛋白，本申请所述的免疫缀合物，本申请所述的嵌合抗原受体，本申请所述的核酸分子，本申请所述的构建体，本申请所述的细胞，或本申请所述的药物组合物。

另一方面，本申请提供一种预防和/或治疗HER2表达异常相关疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的本申请所述的分离的抗原结合蛋白，本申请所述的免疫缀合物，本申请所述的嵌合抗原受体，本申请所述的核酸分子，本申请所述的构建体，本申请所述的细胞，或本申请所述的药物组合物。

另一方面，本申请提供一种用于检测生物样本中的HER2的方法，所述方法包括使样本与本申请所述的抗原结合蛋白接触并检测复合物，其中检测所述复合物指示所述样本中的HER2表达。

本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

附图说明

本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下。

图1显示的是本申请用于生成所述CAR mRNA的pGEM-CAR载体的示意图。

图2显示的是本申请CAR-T细胞中表达的抗HER2 scFv与HER2-6His蛋白的结合的FACS染色结果。

图3显示的是本申请CAR-T细胞中表达的抗HER2 scFv与HER2-Fc蛋白和Biotin-SP结合的AffiniPure山羊抗鼠IgG-(Fab)₂ 072蛋白的结合的FACS染色结果。

图4a至图4e显示的是在E/T比=10:1的情况下，本申请所述抗HER2 CAR-T细胞对被电穿孔了10ug（4a）、1ug（4b）、0.1ug（4c）、0.01ug（4d）和0ug（4e）HER2 mRNA的A549-GFP肿瘤细胞的杀伤曲线。

图5a至图5e显示的是在E/T比=1:1的情况下，本申请所述抗HER2 CAR-T细胞对被电穿孔了10ug（5a）、1ug（5b）、0.1ug（5c）、0.01ug（5d）和0ug（5e）HER2 mRNA的A549-GFP肿瘤细胞的杀伤曲线。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。

在本申请中，术语“人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factorreceptor 2，HER2/ErbB2)” 又称HER2/Neu，ErbB-2，CD340或p185，通常是指具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，属于EGFR受体家族。人HER2蛋白的氨基酸序列可以见于UniProt/Swiss-Prot登录号P04626。本申请中，所述分离的抗原结合片段可以结合HER2蛋白。本申请中，术语“HER2蛋白”、“HER2抗原”和“HER2-Fc重组蛋白”可以互换使用，并且包括由细胞天然表达的其任何变体或同种型。

在本申请中，术语“抗体”通常是指在最广泛的意义上加以使用并且具体地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们显示所期望的生物活性(Milleretal(2003)Jour.ofImmunology170:4854-4861)。抗体可以是鼠、人、人源化、嵌合抗体，或源于其它物种。

全长抗体典型地是指由两条“全长抗体重链”和两条“全长抗体轻链”组成的抗体。“全长抗体重链”通常是这样的多肽，其在N端到C端方向由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定重链结构域1(CH1)，抗体铰链区(HR)，抗体重链恒定结构域2(CH2)，和抗体重链恒定结构域3(CH3)组成，缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3；并且在IgE亚类的抗体的情形中，任选地还包括抗体重链恒定结构域4(CH4)。在一些实施方式中，“全长抗体重链”是在N端到C端方向由VH，CH1，HR，CH2和CH3组成的多肽。“全长抗体轻链”通常是在N端到C端方向由抗体轻链可变结构域(VL)，和抗体轻链恒定结构域(CL)组成的多肽，缩写为VL-CL。所述抗体轻链恒定结构域(CL)可以是κ(kappa)或λ(lambda)。两条全长抗体链通过在CL结构域和CH1结构域之间的多肽间二硫键和全长抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接在一起。典型的全长抗体的实例是天然抗体如IgG(例如，IgG1和IgG2)，IgM，IgA，IgD，和IgE)。

在本申请中，术语“抗原结合片段”（在本文中也被称作“靶向部分”或“抗原结合部分”）通常是指抗体分子的一部分，其包含负责抗体与抗原之间的特异性结合的氨基酸。抗原中由抗体特异性地识别和结合的部分是称作如上文所述的“表位”。抗原结合结构域可典型地包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)；然而，其并非必须包含两者。Fd片段例如具有两个VH区并且通常保留完整抗原结合结构域的一些抗原结合功能。抗体的抗原结合片段的实例包括(1)Fab片段，具有VL、VH、恒定轻链(CL)和CH1结构域的单价片段；(2)F(ab’)₂片段，具有由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(3)具有两个VH和CH1结构域的Fd片段；(4)具有抗体单臂的VL和VH结构域的Fv片段，(5)dAb片段(Ward等人,“Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable DomainsSecreted From Escherichia coli,” Nature 341:544-546(1989)，其以引用的方式整体并入本申请)，其具有VH结构域；(6)分离的互补决定区(CDR)；(7)单链Fv(scFv)，例如源于scFV-文库。尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由独立基因编码，但其可通过合成接头使用重组方法接合，合成接头使得其被制备为其中VL和VH区配对以形成单价分子的单一蛋白链(称为单链Fv(scFv))(可参见例如Huston等人,“Protein Engineering of AntibodyBinding Sites: Recovery of Specific Activity in an Anti-Digoxin Single-ChainFv Analogue Produced in Escherichia coli,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883(1988))；和（8）VHH，“VHH”涉及来自骆驼科(骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼等)重链抗体的可变抗原结合结构域(参见Nguyen V.K.等人，2000，The EMBO Journal，19，921-930；Muyldermans S.，2001，J Biotechnol.，74，277-302以及综述Vanlandschoot P.等人，2011，Antiviral Research 92，389-407)。VHH也可称为纳米抗体(Nanobody)(Nb) 和/或单域抗体。这些抗体片段使用所属领域的技术人员已知的常规技术获得，且以与完整抗体相同的方式评估所述片段的功能。

在本申请中，术语“互补决定区”（CDR）通常是指在抗原结合片段可变区内的互补性决定区。在本申请中，所述重链可变区存在3个CDRs，所述CDRs对于每个可变区命名为HCDR1、HCDR2和HCDR3。这些CDRs的确切边界已根据不同系统不同地限定。由Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.(1987)和(1991))描述的系统，不仅提供了可应用于抗原结合片段的任何可变区的明确残基编号系统，还提供了限定3个CDRs的精确残基边界。这些CDRs可以被称为Kabat CDRs。Chothia和同事(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)以及Chothia等人，Nature 342：877-883(1989))发现尽管在氨基酸序列水平上具有大的多样性，但是Kabat CDRs内的某些亚部分采取几乎相同的肽主链构象。这些亚部分命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指轻链和重链区域。这些区域可以被称为ChothiaCDRs，所述Chothia CDRs具有与Kabat CDRs重叠的边界。与Kabat CDRs重叠的限定CDRs的其他边界已由Padlan(FASEB J.9：133-139(1995))和MacCallum(J Mol Biol 262(5)：732-45(1996))描述。另外，其他的CDR边界定义可能不严格地遵循上述系统之一，但仍将与Kabat CDRs重叠，尽管按照特定残基或残基组或甚至整个CDRs并不显著影响抗原结合的预测或实验发现，它们可以缩短或加长。在本申请中，抗体序列可以采用Kabat 规则进行划分。

在本申请中，术语“FR”通常是指抗体可变结构域的更高度保守的部分，其被称为框架区。例如，天然重链和轻链的可变结构域各自可以包含四个FR区，即在VH中四个(H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4)，和在VL中四个(L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4)。“框架区”通常是指本领域识别的抗体可变区中存在于分歧性更高的(即高变)CDR之间的部分。此类框架区典型地称为框架1至4(FR1、FR2、FR3和FR4)且提供用于在三维空间中呈现六个CDR(三个来自重链且三个来自轻链)的骨架，以形成抗原结合表面。

在本申请中，术语“单域抗体”或“VHH”通常是指缺失抗体轻链而只有重链可变区的一类抗体。在某些情形中，单域抗体可以来自双峰驼、单峰驼、羊驼、美洲驼、护士鲨、大星鲨或鳐鱼（例如，可参见康晓圳等，生物工程学报，2018，34(12): 1974-1984）。例如，单域抗体可以来自羊驼。单域抗体可由重链可变区（VH）构成。术语“重链可变区”通常是指抗原结合片段的重链的氨基末端结构域。重链可变区可进一步被区分为称为互补决定区（CDR）的高变区，它们散布在成为框架区（FR）的更保守的区域中。每个重链可变区可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。

在本申请中，术语“单链可变片段”或“scFv”具有其普通和常规的含义，并且可包括但不限于例如包含免疫球蛋白的重链(VH)可变区和轻链(VL)可变区的融合蛋白，其以短接头肽彼此连接。不受限制地，接头可包含甘氨酸(为了柔性)以及亲水性氨基酸(例如丝氨酸或苏氨酸)(为了可溶性)。接头可将VH的N端与VL的C端连接，或者可将VH的C端与VL的N端连接。在一些替代方式中，CAR上存在的配体结合结构域为单链可变片段(scFv)。接头的选择可以影响scFv的溶解度、表达和正确折叠。肽接头的长度可以从10个至25个氨基酸变化，并且通常包括亲水性氨基酸诸如甘氨酸(G)和丝氨酸(S)。亲水序列防止肽在整个蛋白质折叠过程中在可变结构域内或在可变结构域之间的插入。最常用的接头是(Gly4Ser)n基序，n为1-5任意整数，因为它的柔性、中性电荷和溶解度。已知scFv可以根据接头长度、抗体序列和其他因素变成二聚体、三聚体或四聚体(Le Gall F .等人,1999)。这样的形式是有利的，并且具有许多可能的临床应用。在基于scFv的bsAb形式中存在串联scFv，其由通过柔性肽接头连接的两个scFv组成，所述柔性肽接头诸如串联方向的甘氨酸-丝氨酸重复基序。著名的双特异性T细胞衔接器(bis pecif ic T cell engager ,BiTE)技术基于这种形式(Chames P .等人,2009)。

在本申请中，术语“单克隆抗体”通常是指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即集群中的个别抗体是相同的，除了可能存在的少量的自然突变。单克隆抗体通常针对单个抗原位点具有高度特异性。而且，与常规多克隆抗体制剂（通常具有针对不同决定簇的不同抗体）不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以通过杂交瘤培养合成，不受其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，本申请使用的单克隆抗体可以在杂交瘤细胞中制备，或者可以通过重组DNA方法制备。

在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指非人抗体（例如小鼠抗体）的CDR区以外的部分或全部有的氨基酸被源自人免疫球蛋白的相应的氨基酸置换的抗体。在CDR区中，氨基酸的小的添加、缺失、插入、置换或修饰也可以是允许的，只要它们仍保留抗体结合特定抗原的能力。人源化抗体可任选地包含人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。“人源化抗体”保留类似于原始抗体的抗原特异性。非人（例如鼠）抗体的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白（受体抗体）中的CDR区残基用具有所期望性质、亲和力和/或能力的非人物种（供体抗体）（诸如小鼠，大鼠，家兔或非人灵长类动物）的CDR区残基替换。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白的FR区残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有的氨基酸修饰。进行这些修饰可以是为了进一步改进抗体的性能，诸如结合亲和力。

在本申请中，术语“全人源抗体”通常是指将人类编码抗体的基因转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达的抗体。抗体所有部分（包括抗体的可变区和恒定区）均由人类来源的基因所编码。全人源抗体可以大大减少异源抗体对人体造成的免疫副反应。本领域获得全人源抗体的方法可以有噬菌体展示技术、转基因小鼠技术、核糖体展示技术和RNA-多肽技术等。

在本申请中，术语“免疫缀合物”或“抗体缀合物”通常是指抗体或其抗体片段与其它活性剂的连接，诸如化疗剂，细胞毒素（细胞毒性剂），免疫治疗剂，成像探针，光谱探针，等等。所述连接可以是共价键，或例如通过静电力的非共价相互作用。可以使用本领域中已知的多种接头以形成免疫缀合物。此外，该免疫缀合物可以以融合蛋白的形式提供，所述融合蛋白可以从编码该免疫缀合物的多核苷酸表达。如本文所用的“融合蛋白”指的是通过连接两个或多个最初编码独立的蛋白(包括肽和多肽)的基因或基因片段产生的蛋白。融合基因的翻译产生具有来自各原始蛋白的功能特性的单一蛋白。

在本申请中，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”通常是指一组多肽，在最简单的实施方案中通常有两种，其当在免疫效应细胞中时，提供细胞对靶细胞(通常为癌细胞)的特异性，并产生细胞内信号。在一些实施方案中，CAR包含至少一个细胞外抗原结合结构域（如VHH、scFv或其部分），跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文中也称为“胞内信号传导结构域”)，其包含衍生自如下所定义的刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些实施方案中，该组多肽在相同的多肽链中(例如，包含嵌合融合蛋白)。在一些实施方案中，该组多肽彼此不连续，例如在不同的多肽链中。在一些方面，该组多肽包括二聚化开关，其在二聚化分子的存在下可将多肽彼此偶联，例如可将抗原结合结构域偶联至胞内信号传导结构域。一方面，CAR的刺激分子是与T细胞受体复合物相关的ζ链。在一个方面，细胞质信号传导结构域包含一级信号传导结构域(例如，CD3-ζ的一级信号传导结构域)。在一个方面，细胞质信号传导结构域还包含一个或多个衍生自如下定义的至少一种共刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，共刺激分子可以选自4-1BB(即CD137)，CD27，ICOS和/或CD28。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，其可以包含细胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和包含衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，其可以包含细胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，细胞内信号传导结构域包含衍生自共刺激分子的功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，其可以包含细胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，细胞内信号传导结构域包含衍生自一个或多个共刺激分子的功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，CAR包括嵌合融合蛋白，其可以包含细胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，细胞内信号传导结构域包含至少两个衍生自一个或多个共刺激分子的功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR包含CAR融合蛋白的氨基末端(N-ter)上任选的前导序列。在一个方面，CAR进一步包含在细胞外抗原识别结构域的N末端的前导序列，其中前导序列任选地在细胞加工过程中从抗原识别结构域(例如VHH)切除，并将CAR定位于细胞膜。

本申请的CAR可以构造为VH-VL或VL-VH构型，其中具有在接头、铰链、跨膜域、共刺激域和/或传导域的变异，并且该CAR仍然保持其功效。在一些实施方式中，CAR上存在的scFv结构域对肿瘤细胞上存在的HER2而言具有特异性。

本申请的CAR可以包含为了分子的适当间隔和构象而添加的在各个域之间的接头残基，例如包含氨基酸序列的接头，其连接VH域和VL域并提供与两个亚结合域的相互作用相容的间隔区功能，使得所得多肽保持对与包含相同轻链和重链可变区的抗体相同的靶分子的特异性结合亲和力。本申请的CAR可包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个接头。在特别的实施方式中，接头的长度为约1至约25个氨基酸、约5至约20个氨基酸、或约10至约20个氨基酸、或任何介入长度的氨基酸。接头的示例性实例包括甘氨酸聚合物；甘氨酸-丝氨酸聚合物；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；本领域已知的其他柔性接头，例如惠特洛接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，因此可以作为融合蛋白的域(例如本申请的CAR)之间的中性系链。

在本申请中，术语“同源性”通常可以等同于序列“同一性”。同源序列可以包括可以与主题序列是至少80%、85%、90%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%相同的氨基酸序列。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。同源性可以根据相似性（即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基）来考虑，也可以在序列同一性方面表达同源性。在本申请中，提及的氨基酸序列或核苷酸序列的SEQ ID NO中的任一项具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。

为了确定序列同一性，可进行序列比对，其可通过本领域技术人员了解的各种方式进行，例如，使用BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign（DNASTAR）软件等。本领域技术人员能够确定用于比对的适当参数，包括在所比较的全长序列中实现最优比对所需要的任何算法。

在本申请中，术语“上游”和“下游”是功能上的定义，通常是指编码核苷酸序列链的方向或极性。“上游”方向意指核苷酸位于给定多核苷酸序列的5’方向，即朝向起始核苷酸。就氨基酸序列而言，术语“上游”释为/指位于N-末端方向的氨基酸，即朝向多肽链的起始处。

在本申请中，术语“分离的核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。术语“核酸”或“多核苷酸”或“核酸分子”通常时指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其单链形式或双链形式的聚合物。除非特别限定，否则该术语可以包括含天然核苷酸的类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸（例如示出了序列信息）相似的结合特性并且按照与天然存在核苷酸相似的方式代谢。除非另外说明，核酸的序列可以包括其保守方式修饰的变体，例如简并密码子置换、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列，以及明确指出的序列。

在本申请中，术语“构建体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插

入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述构建体可包括主要用于将DNA或RNA 插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA

的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述构建体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。术语“构建体”包括下述载体(例如，质粒、噬菌体、噬粒、病毒、黏粒、F黏粒，或其它经纯化的核酸载体)，所述载体可以被改变、修饰或工程化，从而使得其含有较之载体所源于的天然或自然核酸分子中包括的那些更多、更少或不同的核酸序列。

在本申请中，术语“细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述分离的核酸分子的载体，或者能够表达本申请所述分离的抗原结合片段的个体细胞，细胞系或细胞培养物。所述宿主细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的，意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述分离的抗原结合片段即可。所述宿主细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述宿主细胞可以是原核细胞（例如大肠杆菌），也可以是真核细胞（例如酵母细胞，例如COS 细胞，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，HeLa 细胞，HEK293 细胞，COS-1 细胞，NS0 细胞或骨髓瘤细胞）。例如，所述的宿主细胞可以是大肠杆菌细胞。例如，所述的宿主细胞可以是酵母细胞。例如，所述的宿主细胞可以是哺乳动物细胞。例如，所述哺乳动物细胞可以是CHO-K1 细胞。

在本申请中，术语“免疫效应细胞”通常是指参与免疫应答，行使效应功能的免疫细胞。例如所述行使效应功能可以包括清除异物抗原或促进免疫效应子应答等。免疫效应细胞可以包括浆细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓源性吞噬细胞。

本申请的免疫效应细胞可以是自体/自身的(autologous/autogeneic) (“自己的”)或非自体的(“非自己的”，例如同种异体的、同基因的或异基因的)。在本申请中，术语“自体的”通常是指来自相同受试者的细胞。“同种异体的”通常是指与相比较的为相同物种但在遗传上不同的细胞。“同基因的”通常是指在遗传上与相比较的细胞相同的不同受试者的细胞。“异基因的”通常是指物种与相比较的细胞不同的细胞。在一些实施方式中，本申请的细胞是自体的或同种异体的。

在本申请中，术语“T细胞”或“T淋巴细胞”可以是任何T细胞，如培养T细胞，例如原代T细胞，或来自培养T细胞系的T细胞，例如Jurkat、SupTI等，或获自哺乳动物的T细胞(优选灵长类动物，物种，包括猴、狗或人)。如果获自哺乳动物，那么T细胞可以获自诸多来源，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其它组织或流体。T细胞还可以被富集或被化。T细胞可以通过在体外或体内将造血干细胞成熟化成T细胞而获得。在示范性方面中，T细胞是人类T细胞。在示范性方面中，T细胞是从人类中分离的T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞，包括NKT细胞，并且可以具有任何发育阶段，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞；CDA+辅助T细胞；例如Th1和Th2细胞，CD8+ T细胞(例如细胞毒性T细胞）；外周血液单核细胞(PBMC)；外周血液白细胞(PBL)；肿瘤浸润细胞(TIL)；记忆T细胞；未处理T细胞等等。优选地，T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。在一些替代方式中，T细胞与接受细胞或待接受细胞(例如所述细胞处于治疗组合物的形式)的接受受试者是同种异体的(来自相同物种的不同供体)；在一些替代方式中，T细胞是自体的(供体和接受者相同)；在一些替代方式中，T细胞是同基因的(syngeneic) (供体和接受者不同，但为同卵双胞胎)。

在本申请中，术语“表达”通常是指特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

在本申请中，术语“肿瘤”和“癌症”可以互换地使用，通常是指以异常细胞快速且失控生长为特征的疾病。癌细胞可以局部地或通过血流和淋巴系统扩散到身体其他部分。本文中描述了各种癌症的例子并且它们包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。术语“癌症”或“肿瘤”包括恶变前以及恶性癌症和肿瘤，还涵盖实体瘤和非实体肿瘤。

在本申请中，术语“预防和/或治疗”不仅包括预防和/或治疗疾病，还通常包括预防疾病的发作，减缓或逆转疾病的进展，预防或减缓与疾病相关的一种或多种症状的发作，减少和/或减轻与疾病相关的一种或多种症状，降低疾病和/或与其相关的任何症状的严重程度和/或持续时间和/或预防疾病和/或与其相关的任何症状的严重程度的进一步增加，预防、减少或逆转由疾病引起的任何生理损伤，以及通常对正在治疗的患者有益的任何药理学作用。本申请的组合物形成可行的治疗剂不需要实现完全治愈或根除疾病的任何症状或表现。如在相关领域中所认识到的，用作治疗剂的药物可降低给定疾病状态的严重程度，但不需要消除疾病的每种表现才能被认为是有用治疗剂。类似地，预防性施用的治疗构成可行的预防剂不需要完全有效地预防病症的发作。简单地在受试者中减少疾病的影响(例如，通过减少其症状的数量或严重程度，或通过提高另一种治疗的有效性，或通过产生另一种有益效果)，或减少疾病发生或恶化的可能性就足够了。

在本申请中，术语“施用”通常是指通过本领域已知的任意途径，将蛋白(包括免疫球蛋白)递送给有此需要的人或动物。药用载体和制剂或组合物也是本领域众所周知的。给药途径可以包括：静脉内的、肌肉内的、真皮内的、皮下的、透皮的、粘膜的、瘤内的或粘膜的。或者，这些术语可以表示，将用于重组蛋白表达的载体递送给细胞或培养的细胞和/或受试者的细胞或器官。这样的施用或导入可以在体内、在体外或先体外后体内地发生。通过下述方式，可以将用于重组蛋白或多肽表达的载体导入细胞中：转染，其通常是指，通过物理方式(例如，磷酸钙转染、电穿孔、显微注射或脂转染)将异源DNA插入细胞中；感染，其通常是指，借助于传染性病原体(即病毒)的导入；或转导，其通常是指，病毒对细胞的稳定感染，或遗传物质通过病毒剂(例如，噬菌体)从一种微生物向另一种微生物的转移。

在本申请中，术语“药学上可接受的”通常是指代与合理的益处/风险比相称、在合理医学判断范围内适合用于与人类和动物的组织接触而不具有过度毒性、刺激、过敏应答或其它问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

本文所用的术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”是指任何和所有溶剂，分散介质，防腐剂，抗氧化剂，涂层，等渗和吸收延迟剂，表面活性剂，填充剂，崩解剂，粘合剂，稀释剂与药物施用相容的润滑剂，助流剂，pH调节剂，缓冲剂，增强剂，湿润剂，增溶剂，表面活性剂，抗氧化剂等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。该组合物可以包含提供补充，附加或增强的治疗功能的其他活性化合物。

在本申请中，术语“有效量”或“有效剂量”通常是指足以实现或至少部分实现所需效果的量。药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”通常是当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时促进疾病消退(这通过疾病症状严重程度的降低、疾病无症状期的频度和持续时间的增加、或者由于罹患疾病而引起的损害或残疾的预防来证明)的任何药物量。

在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。

在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5%-10%的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的范围内变动。

在本申请中，术语“受试者”通常是指人类或非人类动物，包括但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴等。

一方面，本申请提供一种分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白靶向HER2，其包含VH，其中所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQID NO: 12所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含VH，其中所述VH包括框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，所述HFR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，所述HFR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，所述HFR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，所述HFR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连；其中，所述HFR1包含SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列，所述HFR2包含SEQ IDNO: 11所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列，所述HFR3包含SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列，HFR4包含SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列。

例如，分离的抗原结合蛋白包含VH，由N端至C端，所述VH可以依次包含HFR1-HCDR1- HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3- HFR4，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列，所述HFR1包含SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列，所述HFR2包含SEQ IDNO: 11所示的氨基酸序列，所述HFR3包含SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列，HFR4包含SEQID NO: 15所示的氨基酸序。

又例如，所述的分离的抗原结合蛋白包含VH，其中所述VH可以包含SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含VL，其中所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含VH和VL，其中所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO: 10所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQID NO: 14所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列；其中所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列。

例如，所述的分离的抗原结合蛋白包含VH和VL，其中所述HCDR1可以包含SEQ IDNO: 10所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列，所述HCDR3可以包含SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列；其中所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，所述LCDR2可以包含SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，所述LCDR3可以包含SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含VL，其中所述VL包括框架区LFR1，LFR2，LFR3和LFR4，其中所述LFR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，所述LFR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，所述LFR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，所述LFR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接相连；其中所述LFR1包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列，所述LFR2包含SEQID NO: 3所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列，所述LFR3包含SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列，所述LFR4包含SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列。

例如，所述的分离的抗原结合蛋白包含VL，由N端至C端，所述VL可以依次包含LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3- LFR4；其中所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列，所述LFR1包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，所述LFR2包含SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列，所述LFR3包含SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列，所述LFR4包含SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列。

又例如，所述的分离的抗原结合蛋白包含VL，其中所述VL可以包含SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列。

又例如，所述的分离的抗原结合蛋白包含VH和VL，其中所述VH可以包含SEQ IDNO: 22所示的氨基酸序列，所述VL可以包含SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列。

例如，其中所述抗原结合片段可以包括Fab，Fab’， Fv片段，F(ab’)₂，scFv，di-scFv，dAb和/或VHH。

在某些实施方式中，其中所述抗体可以包括单克隆抗体，多克隆抗体（例如双克隆抗体）嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。

例如，所述抗体重链恒定区源自人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4的恒定区.

例如，所述的分离的抗原结合蛋白可以包括抗体重链，所述抗体重链包含抗体重链可变区和抗体重链恒定区，其中所述抗体重链可变区可以包含SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列，所述抗体重链恒定区源自人IgG1的恒定区。

例如，所述的分离的抗原结合蛋白可以包括抗体轻链，所述抗体轻链包含抗体轻链可变区和抗体轻链恒定区，其中所述抗体轻链可变区可以包含SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列，所述抗体轻链恒定区源自人Igκ恒定区。

又例如，所述的分离的抗原结合蛋白可以包括抗体重链和抗体轻链，其中所述抗体重链包含抗体重链可变区和抗体重链恒定区，其中所述抗体重链可变区可以包含SEQ IDNO: 22所示的氨基酸序列，所述抗体重链恒定区源自人IgG1的恒定区；所述抗体轻链包含抗体轻链可变区和抗体轻链恒定区，其中所述抗体轻链可变区可以包含SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列，所述抗体轻链恒定区源自人Igκ恒定区。

在某些实施方式中，其中所述接头包括肽接头。

在某些实施方式中，所述scFv包括VH-接头-VL或VL-接头-VH。

例如，所述scFv包括VH-接头-VL或VL-接头-VH；其中所述VH可以包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，所述VL可以包含SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列。

又例如，所述的分离的抗原结合蛋白可以包含SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列。

另一方面，本申请提供一种分离的多肽，其包含本申请所述分离的抗原结合蛋白。

在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白连接有其他活性剂。非限制性的，所述其他活性剂可以包括化疗剂，细胞毒素（细胞毒性剂），免疫治疗剂，成像探针或光谱探针。

例如，所述免疫缀合物可以是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体缀合至一种或多种药物。

另一方面，本申请提供一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体靶向HER2，其包含胞外抗原结合结构域，其中所述胞外抗原结合结构域包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白。

例如，所述胞外抗原结合结构域可以包含其包含VH，其中所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ IDNO: 12所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列。

又例如，所述胞外抗原结合结构域可以包含其包含VH，其中所述VH可以包含SEQID NO: 22所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 22所示的氨基酸序列。

又例如，所述胞外抗原结合结构域可以包含VH和VL，其中所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1可以包含SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列，所述HCDR3可以包含SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列；所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，所述LCDR2可以包含SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，所述LCDR3可以包含SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列。

又例如，所述胞外抗原结合结构域可以包含VH和VL，其中所述VH可以包含SEQ IDNO: 22所示的氨基酸序列，所述VL可以包含SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，其中所述胞外抗原结合结构域包括全长抗体、Fab、单链可变片段(scFv)或单域抗体(VHH)。例如，所述胞外抗原结合结构域包括scFv。

例如，所述胞外抗原结合结构域包括scFv，所述scFv包含VH和VL，其中所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1可以包含SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列，所述HCDR3可以包含SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列；所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，所述LCDR2可以包含SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，所述LCDR3可以包含SEQID NO: 6所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，其中所述跨膜域包含SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列。

在某些实施方式中，其中所述胞内信号转导结构域包含SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列。

例如，所述嵌合抗原受体包含胞外抗原结合结构域、跨膜域和胞内信号转导结构域；其中所述胞外抗原结合结构域可以包含SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列，所述跨膜域可以包含源自CD8的跨膜域或其变体，所述胞内信号转导结构域可以包含源自CD3ζ的信号传导结构域。

又例如，所述嵌合抗原受体包含胞外抗原结合结构域、跨膜域和胞内信号转导结构域；其中所述胞外抗原结合结构域可以包含SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列，所述跨膜域可以包含SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列，所述胞内信号转导结构域可以包含SEQ IDNO: 19所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，其中所述胞内共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列。

例如，由N端至C端，所述嵌合抗原受体可以依次包含胞外抗原结合结构域、跨膜域、胞内共刺激信号传导结构域和胞内信号传导结构域；其中所述胞外抗原结合结构域可以包含SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列，所述跨膜域可以包含源自CD8的跨膜域或其变体，所述胞内共刺激信号传导结构域可以包含源自4-1BB的共刺激信号传导结构域或其变体，所述胞内信号转导结构域可以包含源自CD3ζ的信号传导结构域。

又例如，所述嵌合抗原受体包含胞外抗原结合结构域、跨膜域、胞内共刺激信号传导结构域和胞内信号传导结构域；其中所述胞外抗原结合结构域可以包含SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列，所述跨膜域可以包含SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列，所述胞内共刺激信号传导结构域可以包含SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列，所述胞内信号转导结构域可以包含SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述间隔子包含SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列或与SEQID NO: 16所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列。

例如，由N端至C端，所述嵌合抗原受体依次包含胞外抗原结合结构域、间隔子、跨膜域、胞内共刺激信号传导结构域和胞内信号传导结构域；其中所述胞外抗原结合结构域可以包含SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列，所述间隔子可以包含源自CD8铰链区或其变体，所述跨膜域可以包含源自CD8的跨膜域或其变体，所述胞内共刺激信号传导结构域可以包含源自4-1BB的共刺激信号传导结构域或其变体，所述胞内信号转导结构域可以包含源自CD3ζ的信号传导结构域

又例如，所述嵌合抗原受体包含胞外抗原结合结构域、间隔子、跨膜域、胞内共刺激信号传导结构域和胞内信号传导结构域；其中所述胞外抗原结合结构域可以包含SEQ IDNO: 23所示的氨基酸序列，所述间隔子包含SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列所述跨膜域可以包含SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列，所述胞内共刺激信号传导结构域可以包含SEQID NO: 18所示的氨基酸序列，所述胞内信号转导结构域可以包含SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，由N端至C端，所述嵌合抗原受体的间隔子、跨膜域、胞内共刺激信号传导结构域和胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列或与SEQID NO: 24所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述信号肽片段包括CD8信号肽片段。

在某些实施方式中，所述信号肽片段包含SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列与SEQID NO: 24所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列。

例如，由N端至C端，所述嵌合抗原受体依次包含信号肽片段、胞外抗原结合结构域、间隔子、跨膜域、胞内共刺激信号传导结构域和胞内信号传导结构域；其中所述信号肽片段可以包括CD8信号肽片段，所述胞外抗原结合结构域可以包含SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列，所述间隔子可以包含源自CD8铰链区或其变体，所述跨膜域可以包含源自CD8的跨膜域或其变体，所述胞内共刺激信号传导结构域可以包含源自4-1BB的共刺激信号传导结构域或其变体，所述胞内信号转导结构域可以包含源自CD3ζ的信号传导结构域

又例如，所述嵌合抗原受体包含信号肽片段、胞外抗原结合结构域、间隔子、跨膜域、胞内共刺激信号传导结构域和胞内信号传导结构域；其中所述信号肽片段可以包含SEQID NO: 20所示的氨基酸序列，所述胞外抗原结合结构域可以包含SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列，所述间隔子包含SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列所述跨膜域可以包含SEQ IDNO: 17所示的氨基酸序列，所述胞内共刺激信号传导结构域可以包含SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列，所述胞内信号转导结构域可以包含SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列与SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列具有至少约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，约99.5%同一性的氨基酸序列。

本申请所述的核酸分子可以为分离的。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：（i）在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应（PCR）扩增产生的，（ii）通过克隆重组产生的，（iii）纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者（iv）合成的，例如通过化学合成。在某些实施方式中，所述分离的核酸是通过重组DNA技术制备的核酸分子。

在本申请中，可以通过本领域已知的多种方法来制备编码所述抗体、其抗原结合片段的核酸，这些方法包括但不限于，采用限制性片段操作或采用合成性寡核苷酸的重叠延伸PCR，具体操作可参见Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；和Ausube等人Current Protocols in Molecular Biology ，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York N.Y.，1993。

在某些实施方式中，其中所述构建体是表达载体。

在某些实施方式中，其中所述构建体选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和逆转录病毒载体。

另一方面，本申请提供一种细胞，其包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的构建体，和/或表达本申请所述的嵌合抗原受体。例如，可将本申请所述的载体引入所述细胞中，例如真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。

在某些实施方式中，所述细胞包括免疫效应细胞。

在某些实施方式中，所述细胞包括哺乳动物细胞，例如人细胞。

在某些实施方式中，所述的免疫效应细胞包括人细胞。

在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。例如，所述免疫效应细胞可以是T细胞，如人T细胞。

在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括自体的或非自体的免疫效应细胞。例如，所述免疫效应细胞可以是非自体的人T细胞。

在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括经修饰的免疫效应细胞，例如所述修饰可以包括与免疫排斥相关基因中的一个或多个的表达和/或活性被下调。

例如，所述制备免疫效应细胞的方法可以包括：向免疫效应细胞中引入前述的核酸分子或前述的载体。

另一方面，本申请提供一种制备本申请所述的分离的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在使得本申请所述的分离的抗原结合蛋表达的条件下，培养本申请所述的细胞。

另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白，本申请所述的免疫缀合物，本申请所述的嵌合抗原受体，本申请所述的核酸分子，本申请所述的构建体或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载体。这类载体可以包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本申请所述的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。此外，本申请所述的抗原结合蛋白还可与其他治疗剂一起使用。

本文所述的抗原结合蛋白或药物组合物可以符合良好医疗实践的方式配制、给药和施用。在此情形下的考虑因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、单个患者的临床病状、病症的病因、药剂递送部位、施用方法和医学从业者已知的其他因素。治疗剂（例如，抗HER2抗体或抗HER2 CAR-T细胞）无需但任选地与一种或多种当前用来预防或治疗所考虑的病症的药剂一起配制和/或同时施用。此类其他药剂的有效量取决于制剂中存在的治疗剂的量、病症或治疗的类型以及以上论述的其他因素。这些药剂通常可以凭经验/临床上确定为适当的任何剂量且通过凭经验/临床上确定为适当的任何途径加以使用。与单个治疗相比，可减少组合治疗中施用的治疗剂的剂量。通过常规技术易于监测此疗法的进展。

在某些实施方式中，其中所述肿瘤包括HER2阳性的肿瘤。

一种非诊断性体外检测样品中HER2蛋白的方法，其特征在于，所述方法可以包括步骤：

（1）在体外，将所述样品与前述的分离的抗原结合蛋白或免疫缀合物接触；

（2）检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在HER2蛋白。检测可以是定性的、定量的、或半定量的。

另一方面，本申请提供一种试剂盒，其包含生物素化的前述的分离的抗原结合蛋白或前述的免疫缀合物。在某些情形中，所述的试剂盒还可以包括容器、使用说明书、缓冲剂等。

不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的抗原结合蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。

实施例

实施例1

1.1 用于mRNA生产的抗HER2 CAR载体构建

用EcoRI和SalI酶消化pGEM载体，并用凝胶纯化法纯化。将抗HER2单链抗体（scFv）序列和CAR片段（从铰链结构域到CD3 zeta结构域）通过PCR扩增，用XhoI和EcoRI消化，并通过凝胶纯化法纯化。用T4连接酶连接单链抗体片段、CAR片段（从铰链结构域到CD3 zeta结构域）和pGEM载体，并将其转化为感受态细胞。经sanger测序确认，选择正确的菌落进行进一步实验。图1提供了用于CAR mRNA生成的pGEM CAR载体的示意图。

1.2 CAR mRNA的体外转录（IVT）

用SpeI酶消化pGEM-CAR质粒，使其线性化。用PCR净化试剂盒纯化线性化的载体，用无RNase的水洗脱。用纳米滴管测量DNA的浓度，并通过运行琼脂糖DNA凝胶来检查。按照制造商（ThermoFisher, Cat No: AM13455）的协议进行IVT。具体地，将1 ug模板DNA、NTP/ARCA缓冲液、T7缓冲液、GTP、T7酶混合物和无RNase H₂O以20ul的体积加入到0.2ml PCR管中，并在37℃下孵育3小时。3小时后，在每个反应中加入2ul的DNase，并在37℃下孵育15分钟。然后根据制造商的建议进行尾随程序。使用RNasy试剂盒（Qiagen）纯化IVT mRNA。用纳米滴管测量RNA的浓度，并通过运行PAGE凝胶检查。

1.3 抗HER2 CAR-T细胞的制备和表征

收集A549肿瘤细胞和T细胞，用Opti-MEM培养基清洗3次。用Opti-MEM培养基重悬细胞颗粒，细胞浓度为1×10e⁷/ml。将10 ug、1 ug、0.1 ug、0.01 ug或0ug HER2蛋白mRNA加入到100ul A549细胞中混合均匀；将10 ug 抗HER2 CAR mRNA加入到100ul T细胞中混合均匀。在BTX机上设置参数：对于T细胞。500电压，0.7毫秒；对于A549肿瘤细胞。300电压，0.5毫秒。在BTX电穿孔杯中加入100ul混有RNA的细胞，轻拍以避免产生气泡。进行电穿孔，然后将细胞转移到预热的培养基中，在37℃下培养。

通过FACS染色测定抗HER2 CART细胞与HER2-Fc重组蛋白、HER2-6His和072的结合情况。如图2所示，表达有抗HER2 scFv的CAR-T细胞（#7）能够与HER2-6His蛋白结合，如图3所示，表达有抗HER2 scFv的CAR-T细胞（#7）能够与与HER2-Fc蛋白结合，NO EP是没有CAR分子的对照T细胞，m4D5（SEQ ID NO: 35）、4D5-5（SEQ ID NO: 33）和m4D5-3（SEQ ID NO: 34）为对照CAR-T细胞（Liu etc. Affinity-Tuned ErbB2 or EGFR Chimeric AntigenReceptor T Cells Exhibit an Increased Therapeutic Index against Tumors inMice. Cancer Res 1 September 2015; 75 (17): 3596–3607.）。

实施例2 抗HER2 CAR-T细胞的体外细胞毒性测定

将用不同数量的编码HER2 抗原的mRNA电穿孔的EGFP-A549细胞接种到平底96孔板中，每孔3000个细胞/100 ul/孔。将CAR-T细胞稀释至合适浓度，以100 ul/孔接种细胞至不同E/T比例的肿瘤细胞，如10:1或1:1。将共培养板放入 IncuCyte S3机器中，并设置扫描参数。扫描3天后，分析总绿色物体综合强度 (Total Green Object IntegratedIntensity, GCU x µm²/Well) 以计算杀灭效率。

图4a至图4e显示了，在E/T比=10:1时，抗 HER2 CAR-T 细胞对用 10 ug、1 ug、0.1ug、0.01 ug或 0 ug 编码HER2抗原的mRNA电穿孔的 A549-GFP 肿瘤细胞的杀伤曲线。图4a至图4e显示抗 HER2 CAR-T 细胞（#7）对表达HER2的A549肿瘤细胞的杀伤作用介于m4D5和4D5-5之间。

图5a至图5e显示了，在E/T比=1:1时，抗 HER2 CAR-T 细胞对用 10 ug、1 ug、0.1ug、0.01 ug或 0 ug 编码HER2抗原的mRNA电穿孔的 A549-GFP 肿瘤细胞的杀伤曲线。图5a至图5e显示抗 HER2 CAR-T 细胞（#7）对表达HER2的A549肿瘤细胞的杀伤作用介于m4D5和4D5-5之间。

序列表

<110> 上海优替济生生物医药有限公司

<120> 抗原结合蛋白及其用途

<130> 0260-PA-012

<160> 38

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> LFR1

<400> 1

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys

20

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> LCDR1

<400> 2

Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asp Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> LFR2

<400> 3

Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> LCDR2

<400> 4

Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 5

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> LFR3

<400> 5

Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> LCDR3

<400> 6

Ser Ser Tyr Ala Gly Ser Asn Asn Val Val

1 5 10

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> LFR4

<400> 7

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

1 5 10

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> Linker

<400> 8

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 9

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> HFR1

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> HCDR1

<400> 10

Ser Tyr Ala Ile Ser

1 5

<210> 11

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> HFR2

<400> 11

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

1 5 10

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> HCDR2

<400> 12

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 13

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> HFR3

<400> 13

Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu

1 5 10 15

Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 14

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> HCDR3

<400> 14

Gly Gly Val Gly Ala Val Arg Gly His Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> HFR4

<400> 15

Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 16

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> CD8 hinge

<400> 16

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 17

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> CD8 TM

<400> 17

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 18

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> 4-1BB

<400> 18

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 19

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> CD3 zeta

<400> 19

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 20

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> CD8 signal peptide

<400> 20

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 21

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> VL

<400> 21

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Ser

85 90 95

Asn Asn Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 22

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> VH

<400> 22

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Val Gly Ala Val Arg Gly His Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 23

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> anti-HER2 scFv

<400> 23

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Ser

85 90 95

Asn Asn Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln

115 120 125

Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys

130 135 140

Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile

165 170 175

Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg

180 185 190

Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu

195 200 205

Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly

210 215 220

Gly Val Gly Ala Val Arg Gly His Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Met Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 24

<211> 223

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> CD8(hinge/TM)-4-1BB-CD3 zeta

<400> 24

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

35 40 45

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

50 55 60

Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

65 70 75 80

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

85 90 95

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

100 105 110

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln

115 120 125

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

130 135 140

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

145 150 155 160

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

165 170 175

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

180 185 190

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

195 200 205

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

210 215 220

<210> 25

<211> 470

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> anti-HER2 CAR

<400> 25

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Ser

85 90 95

Asn Asn Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln

115 120 125

Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys

130 135 140

Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile

165 170 175

Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg

180 185 190

Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu

195 200 205

Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly

210 215 220

Gly Val Gly Ala Val Arg Gly His Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Met Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

245 250 255

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

260 265 270

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

275 280 285

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

290 295 300

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg

305 310 315 320

Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln

325 330 335

Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu

340 345 350

Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

355 360 365

Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

370 375 380

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

385 390 395 400

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

405 410 415

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

420 425 430

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

435 440 445

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

450 455 460

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470

<210> 26

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> CD8 signal peptide的核苷酸序列

<400> 26

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 27

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> CD8 Hinge的核苷酸序列

<400> 27

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 28

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> CD8 TM的核苷酸序列

<400> 28

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gc 72

<210> 29

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> 4-1 BB的核苷酸序列

<400> 29

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 30

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> CD3 zeta 的核苷酸序列

<400> 30

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339

<210> 31

<211> 741

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> anti-HER2 scFv的核苷酸序列

<400> 31

caatctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

tcctgcactg gaaccagtag tgacgttggt ggttatgact atgtctcctg gtaccaacaa 120

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgatgtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctcaccat ctctgggctc 240

caggctgagg acgaggcgga ttattactgc agctcatatg caggcagcaa caatgtggta 300

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtggtggtg gttctggcgg cggcggctcc 360

ggaggtggtg gatcccaggt ccagctggtg cagtctgggg ctgaggtgaa gaagcctggg 420

tcctcggtga aggtctcctg caaggcttct ggaggcacct tcagcagcta tgctatcagc 480

tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatgg gagggatcat ccctatcttt 540

ggtacagcaa actacgcaca gaagttccag ggcagagtca cgattaccgc ggacgaatcc 600

acgagcacag cctacatgga gctgagcagc ctgagatctg aggacacggc cgtgtattac 660

tgtgcgagag ggggagtagg agcagtacgt gggcatgctt ttgatatctg gggccaaggg 720

acaatggtca ccgtctcttc a 741

<210> 32

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> anti-HER2 CAR的核苷酸序列

<400> 32

caatctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

tcctgcactg gaaccagtag tgacgttggt ggttatgact atgtctcctg gtaccaacaa 120

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgatgtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctcaccat ctctgggctc 240

caggctgagg acgaggcgga ttattactgc agctcatatg caggcagcaa caatgtggta 300

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtggtggtg gttctggcgg cggcggctcc 360

ggaggtggtg gatcccaggt ccagctggtg cagtctgggg ctgaggtgaa gaagcctggg 420

tcctcggtga aggtctcctg caaggcttct ggaggcacct tcagcagcta tgctatcagc 480

tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatgg gagggatcat ccctatcttt 540

ggtacagcaa actacgcaca gaagttccag ggcagagtca cgattaccgc ggacgaatcc 600

acgagcacag cctacatgga gctgagcagc ctgagatctg aggacacggc cgtgtattac 660

tgtgcgagag ggggagtagg agcagtacgt gggcatgctt ttgatatctg gggccaaggg 720

acaatggtca ccgtctcttc aaccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 780

accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 840

gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc 900

gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga 960

aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1020

gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 1080

aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg tacaagcagg gccagaacca gctctataac 1140

gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1200

cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1260

cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1320

ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1380

gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc taa 1413

<210> 33

<211> 266

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> m4D5-5 signal peptide+scFv

<400> 33

Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Ile Met Ser Arg Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Glu Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

115 120 125

Lys Arg Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu

130 135 140

Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

145 150 155 160

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys

165 170 175

Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

180 185 190

Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp

195 200 205

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr

210 215 220

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Val Ala Met Asp Val Trp

245 250 255

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

260 265

<210> 34

<211> 266

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> m4D5-3 signal peptide+scFv

<400> 34

Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Ile Met Ser Arg Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Glu Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

115 120 125

Lys Arg Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu

130 135 140

Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

145 150 155 160

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys

165 170 175

Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

180 185 190

Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp

195 200 205

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr

210 215 220

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Val Ala Met Asp Val Trp

245 250 255

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

260 265

<210> 35

<211> 266

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> m4D5 signal peptide+scFv

<400> 35

Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Ile Met Ser Arg Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

115 120 125

Lys Arg Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu

130 135 140

Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

145 150 155 160

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys

165 170 175

Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

180 185 190

Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp

195 200 205

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr

210 215 220

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp

245 250 255

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

260 265

<210> 36

<211> 798

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> 编码m4D5-5 signal peptide+scFv的核苷酸序列

<400> 36

atggatttcc aggtccagat cttctcgttc ctcctgatct cggcttccgt gatcatgtcg 60

agaggcgaca tccagatgac ccagtcccca agttccctta gtgcctccgt cggggatcgc 120

gtgactatca cgtgcagggc atcccaggat gtgaacaccg ccgtggcctg gtaccagcag 180

aaacccggca aggcccccaa gctcctgatc tactctgcca gcttcttaga gagtggcgtc 240

ccctcccgct tctcgggcag tcgtagcggc accgacttca cactgaccat ctcgtccctg 300

cagccggagg actttgcaac ctactactgc cagcagcatt acacgacccc acctaccttc 360

ggccagggca ccaaggtgga gattaagcgc accggctcca ccagcggcag tggcaagccg 420

gggagtggcg agggttccga ggtccagctg gtggagtcag gcgggggcct ggtccaaccg 480

gggggttcgc tgaggctgag ctgcgctgca tccggcttca atatcaagga cacttatatt 540

cattgggtgc ggcaagcccc agggaagggc ctggagtggg tcgcccgtat ctaccccact 600

aatggctaca ccaggtacgc ggattctgtg aaggggagat tcaccatttc ggcagacacc 660

tcgaagaata ccgcctacct gcaaatgaac tccctccgcg ctgaggacac tgccgtgtat 720

tactgtagtc gctggggcgg ggacgggttc gtggcaatgg acgtttgggg ccagggcacg 780

ctcgtgaccg tgtcctcc 798

<210> 37

<211> 798

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> 编码m4D5-3 signal peptide+scFv的核苷酸序列

<400> 37

atggatttcc aggtccagat cttctcgttc ctcctgatct cggcttccgt gatcatgtcg 60

agaggcgaca tccagatgac ccagtcccca agttccctta gtgcctccgt cggggatcgc 120

gtgactatca cgtgcagggc atcccaggat gtgaacaccg ccgtggcctg gtaccagcag 180

aaacccggca aggcccccaa gctcctgatc tactctgcca gcttcttaga gagtggcgtc 240

ccctcccgct tctcgggcag tggcagcggc accgacttca cactgaccat ctcgtccctg 300

cagccggagg actttgcaac ctactactgc cagcagcatt acacgacccc acctaccttc 360

ggccagggca ccaaggtgga gattaagcgc accggctcca ccagcggcag tggcaagccg 420

gggagtggcg agggttccga ggtccagctg gtggagtcag gcgggggcct ggtccaaccg 480

gggggttcgc tgaggctgag ctgcgctgca tccggcttca atatcaagga cacttatatt 540

cattgggtgc ggcaagcccc agggaagggc ctggagtggg tcgcccgtat ctaccccact 600

aatggctaca ccaggtacgc ggattctgtg aaggggagat tcaccatttc ggcagacacc 660

tcgaagaata ccgcctacct gcaaatgaac tccctccgcg ctgaggacac tgccgtgtat 720

tactgtagtc gctggggcgg ggacgggttc gtggcaatgg acgtttgggg ccagggcacg 780

ctcgtgaccg tgtcctcc 798

<210> 38

<211> 798

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<223> 编码m4D5 signal peptide+scFv的核苷酸序列

<400> 38

atggacttcc aggtgcagat cttctccttc ttactgatct ccgcctcggt gatcatgagt 60

cgcggggaca tccagatgac acagtcgcca agttccctaa gcgccagtgt gggtgaccga 120

gtcaccatca cgtgtcgggc atcgcaggac gtgaacaccg cggtggcctg gtaccagcag 180

aagcccggca aggcccccaa gcttctgatc tactctgcat cctttctgta ctcgggcgtc 240

ccgtccaggt tctcgggatc ccggagtggg accgacttca ccctcaccat cagcagcctg 300

cagccagagg actttgctac ttactattgt cagcagcatt acacaactcc ccccactttc 360

gggcagggca ccaaggtcga gattaagcgg acaggatcaa cgtccggcag tggcaagccc 420

ggaagcggcg agggatccga ggtccagctg gtggagagtg ggggtggcct ggttcagcct 480

ggcggctcgc tgcgactgag ttgcgctgcc tccggcttca acatcaaaga cacgtacatt 540

cactgggtac gccaggcccc cggcaagggg ctggagtggg tcgcgcgcat ctaccctaca 600

aacggctaca cgcggtatgc cgactctgtg aaaggacgct ttaccatttc ggccgacacc 660

tcgaagaaca cggcttatct ccagatgaac tccctgcgtg ctgaggatac cgcggtgtac 720

tactgctccc gctggggagg cgacggcttc tacgccatgg atgtttgggg ccaaggcacc 780

cttgtgactg tgtcgagt 798

Claims

1.分离的抗原结合蛋白，其结合HER2且包含VH和VL，其中所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO: 12所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示；其中所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO: 4所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示。

2.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ IDNO: 22所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO: 21所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体或其抗原结合片段。

4.根据权利要求3所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包括单克隆抗体，多克隆抗体，嵌合抗体，人源化抗体，全人源抗体，Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)₂，scFv和/或di-scFv。

5.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，所述的分离的抗原结合蛋白包括scFv，其中所述VH和VL通过接头连接。

6.根据权利要求5所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述接头包含SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列。

7.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列。

8.免疫缀合物，其包含权利要求1-7中任一项所述分离的抗原结合蛋白。

9.嵌合抗原受体，其包含胞外抗原结合结构域、跨膜域和胞内信号转导结构域，其中所述胞外抗原结合结构域包含权利要求1-7中一项所述的分离的抗原结合蛋白。

10.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的跨膜域：CD8、CD28、CD3ε (CD3e)、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、TRAC、TRBC、CD3ζ、CTLA-4、LAG-3、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12，CD40L (CD154)、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、SLAM及它们的变体。

11.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜域包含SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列。

12.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号转导结构域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的胞内信号转导结构域：CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD79a、CD79b、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14 Nef、DAP10、DAP-12和至少包含一个ITAM的结构域。

13.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号转导结构域包含SEQ IDNO: 19所示的氨基酸序列。

14.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体还包含胞内共刺激信号传导结构域，所述胞内共刺激信号传导结构域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的胞内共刺激信号传导结构域：CD28、4-1BB (CD137)、CD27、CD2、CD7、CD8A、CD8B、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、MyD88及它们的变体。

15.根据权利要求14所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列。

16.根据权利要求14所述的嵌合抗原受体，由N端至C端，所述嵌合抗原受体依次包含胞外抗原结合结构域、跨膜域、胞内共刺激信号传导结构域和胞内信号传导结构域。

17.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜域与所述胞外抗原结合结构域之间还包含间隔子，所述间隔子包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的铰链区：CD28、CD8、IgG1、IgG4、IgD、4-1BB、CD4、CD27、CD7、CD8A、PD-1、ICOS、OX40、NKG2D、NKG2C、FcεRIγ、BTLA、GITR、DAP10、TIM1、SLAM、CD30、LIGHT及它们的变体。

18.根据权利要求17所述的嵌合抗原受体，所述间隔子包含SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列。

19.根据权利要求17所述的嵌合抗原受体，由N端至C端，所述嵌合抗原受体依次包含胞外抗原结合结构域、间隔子、跨膜域、胞内共刺激信号传导结构域和胞内信号传导结构域。

20.根据权利要求19所述的嵌合抗原受体，由N端至C端，所述嵌合抗原受体的间隔子、跨膜域、胞内共刺激信号传导结构域和胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列。

21.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体还包含信号肽片段，所述信号肽片段的C端与所述胞外抗原结合结构域的N端连接。

22.根据权利要求21所述的嵌合抗原受体，所述信号肽片段包含SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列。

23.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含SEQ ID NO: 25所示的氨基酸序列。

24.分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-7中任一项所述的抗原结合蛋白或编码权利要求9-23中任一项所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。

25.构建体，其包含权利要求24所述的核酸分子。

26.细胞，其包含权利要求24所述的核酸分子或权利要求25所述的构建体，和/或表达权利要求9-23中任一项所述的嵌合抗原受体。

27.根据权利要求26所述的细胞，其中所述细胞包括免疫效应细胞。

28.根据权利要求27所述的细胞，所述免疫效应细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞和/或树突状细胞。

29.根据权利要求26所述的细胞，其中所述细胞包括CAR-T细胞或CAR-NK细胞。

30.药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，权利要求8所述的免疫缀合物，权利要求24所述的核酸分子，权利要求25所述的构建体或权利要求26-29中任一项所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载体。

31.权利要求1-7中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，权利要求8中任一项所述的免疫缀合物，权利要求24所述的核酸分子，权利要求25所述的构建体，权利要求26-29中任一项所述的细胞，或权利要求30所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗肿瘤。