CN103864939A - mGM-CSF/βhCG融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，公开一种融合蛋白mGM-CSF-X10-βhCGCTP37肽及其制备方法和应用。利用本实验室的融合表达制备技术平台，构建在大肠杆菌细胞内融合表达mGM-CSF-X10-βhCGCTP37肽的工程菌。通过离子交换层析法分离获得目的蛋白。通过体外Western bloting鉴定检测融合蛋白的正确表达及所含抗原表位的免疫原性；体内动物实验预期本融合蛋白体外冲击致敏DC后获得的DC疫苗，回输体内可促使APC具有较高的装载和处理抗原能力，可提高机体对肿瘤细胞的免疫应答，达到识别和杀灭肿瘤细胞的目的，对于抗肿瘤治疗具有很好的临床应用前景。

Description

mGM-CSF/βhCG融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

在基因工程领域，本发明公开了一种新的融合蛋白及其重组工程菌的构建和融合蛋白的纯化方法。

背景技术

融合蛋白是指在基因工程迅速发展的基础上，通过DNA重组技术将两个或多个基因的编码区首尾连接，由同一调控序列控制构成的基因表达后所得的蛋白质产物。融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法。利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。融合蛋白在临床上常用于制备DNA疫苗。DNA疫苗与传统疫苗相比有着明显的优势，如易于生产，稳定性强，成本低廉等，并可同时诱导体液与细胞免疫应答。

鼠源粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(mouse granulocyte-macrophage colonystimulating factor；mGM-CSF)属于造血因子家族，与人源GM-CSF拥有56％的同源性。mGM-CSF含有124个氨基酸两个二硫键的单链糖蛋白。mGM-CSF可以诱导髓样细胞分化为树突状细胞(DC)，促进DC的增殖和成熟，DC是体内功能最强大的抗原提呈细胞(APC)，是初次免疫应答的始动者，由DC激活的细胞免疫应答在机体抗肿瘤中起着主导作用。同时mGM-CSF通过诱导粒细胞，单核细胞以及NK细胞的抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)，促进Th1型细胞因子的分泌来发挥抗肿瘤作用，临床上常用来辅助化疗或作为免疫治疗的佐剂。

人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)在肿瘤细胞表面的异位表达是肿瘤细胞的特征性标志之一，正常情况下成人组织细胞的胚胎基因处于静息状态，不表达或仅表达极其微量的hCG，当细胞发生恶性转化时，静息的胚胎基因被激活而表达。但良性肿瘤细胞一般不表达异位hCG(ectopichuman chorionic gonadotropin，ehCG)，分化程度越低的肿瘤表达越高，恶性程度也越高；而且对肿瘤生长、和逃避免疫系统攻击起重要作用。hCG并不诱发肿瘤的发生，但肿瘤一旦形成就会表达异位hCG，模拟胚胎发育模式促进自身生长。hCGβ亚基C末端37个氨基酸(βhCG-CTP37)部位浓集了ehCGβ所含6条糖链中的4条(在C末端上第121，127，132，138丝氨酸上连有四条O-糖链)，可能与肿瘤的转移、免疫耐受等特性的关系更密切。而且存在βhCG的特异性表位，可诱导特异性的免疫应答避免交叉反应的发生。

βhCG决定糖蛋白激素的生物活性，它是由145个氨基酸组成βhCG的分子形式包括规则游离β亚单位缺口游离β亚单位β单位羧基末端丢失的hCG高糖基化游离的β亚单位等规则游离β单位与组成规则hCG的β亚单位相同；缺口游离β亚单位在大部分在β47-48位发生断裂β亚单位核心碎片是由β亚单位的两个碎片β6-40和β55-92通过二硫键紧密联系在一起的。通过RT-PCR，在正常的和恶性前列腺组织中βhCG，mRNA的能够被检测到145个氨基酸的β亚基，其羧基端109-145残基的37肽(βhCGCTP37)是其特有的片段，并存在βhCG的特异性表位，可诱导特异性的免疫应答避免交叉反应的发生，通常以βhCG109～118，10个氨基酸表位作为靶点。以肿瘤特异性抗原刺激DC的目的在于将肿瘤细胞的抗原转移至DC，从而使DC既具有肿瘤特异性，又能提供激活T细胞所必需的共刺激信号，大大增强其肿瘤免疫原性。用肿瘤抗原在体外冲击致敏DC后，回输体内或接种到荷瘤机体，可诱导抗原特异性的CTL应答，产生保护性免疫反应，并能治疗已建立的荷瘤动物模型，有的瘤苗已进入临床试验。

由于单独使用βhCG免疫原性相对较低，且易产生免疫逃逸和耐药性，本发明构建了mGM-CSF/βhCG基因重组菌，表达纯化融合蛋白后同APC体外共培养获得DC疫苗，回输体内可促使APC具有较高的装载和处理抗原能力，可提高机体对肿瘤细胞的免疫应答，达到识别和杀灭肿瘤细胞的目的，进一步增强抗肿瘤作用。

发明内容

本发明公开一种新型融合蛋白mGM-CSF/βhCG。

本发明的一个目的是提供相应重组菌的构建方法。

本发明的另一个目的是公开该重组蛋白的用途。

在本发明的第一个方面，提供了mGM-CSF-X10-βhCGCTP37多肽，该多肽是由mGM-CSF和X10-βhCGCTP37通过柔性肽DPTGG相连接。

在本发明的第二个方面，提供了mGM-CSF-X10-βhCGCTP37多肽的制备方法，其技术路线详述如下：

1.重组质粒pET-28a-mGM-CSF-X10-βhCGCTP37及相应基因工程菌的构建

根据GeneBank NM_009969.4中mGM-CSF的序列信息设计特异性，利用引物设计软件Oligo分别设计两对引物P1、P2。上游引物P1中引入NcoI酶切位点，下游引物P2中引入EcoR I酶切位点和DPTGG连接肽序列。采用PCR技术从pET-28a-mGM-CSF质粒中克隆得到mGM-CSF的cDNA。将PCR产物插入本实验室保存的pET-28a-X10-βhCGCTP37质粒载体的相应酶切位点中，组成融合表达的重组质粒pET-28a-mGM-CSF-X10-βhCGCTP37，重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21获得重组基因工程菌。

2.融合蛋白的诱导表达

从平板上挑取工程菌单菌落，接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中震荡培养过夜，按1∶100转接于新鲜LB培养液中，37℃培养至A600值为0.6-0.8时，加入乳糖(终浓度5mM)进行诱导表达，37℃继续培养，每小时取样1mL，8h后离心收取菌体沉淀，进行12％SDS-PAGE分析，观察目的蛋白条带位置和表达量。

3.融合蛋白的分离纯化

收集菌体，每克湿菌体加入10mL菌体裂解液(pH8.0Tris·HCl50mM，EDTA5mM，NaCl10mM，溶菌酶0.2mg/mL，DnaseI10μg/mL)，反复冻融后进行超声裂解操作，以充分裂解菌体；裂解至溶液不粘滞时取出裂解液，离心收集上清，弃沉淀。取裂解上清液于冰浴中边搅拌边缓慢加入研细的硫酸铵粉末至相应饱和度，4℃静置30min后离心，每一级饱和度各取上清和沉淀制备样品，进行12％SDS-PAGE电泳检测。保留含目的蛋白组分最多的蛋白沉淀，并将沉淀复溶于缓冲液A(pH8.0Tris·HCl25mM，EDTA5mM，NaCl10mM)中，12000r/min，离心20min后将上清液对层析缓冲液(pH8.0Tris·HCl25mM，EDTA5mM)于4℃充分透析，再4℃，12000r/min，离心20min，弃沉淀，上清液过阴离子交换柱DEAE-cellulose做进一步纯化，用浓度梯度为0-500mM NaCl层析缓冲液梯度洗脱，收集洗脱峰，检测合并目的蛋白峰组分，对蒸馏水充分透析后冻干保存。

附图说明

图1重组质粒构建原理示意图。

图2PCR获得mGM-CSF基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

Marker为DNA Marker，Lane1：PCR产物。

图3融合蛋白的基因正向测序图。

图412％SDS-PAGE电泳检测重组菌经乳糖诱导表达融合蛋白的诱导曲线。

Lanel为Protein Marker，Lane2：诱导前的全菌蛋白样品，Lane3-10：诱导后1-8小时每个小时的全菌蛋白样品。

图512％SDS-PAGE电泳检测超声裂解菌体结果。

Lanel为Protein Marker，Lane2：菌体裂解上清，Lane3：菌体裂解沉淀。

图612％SDS-PAGE电泳检测硫酸铵分级沉淀目的蛋白结果。

Lanel为Protein Marker，Lane2：菌体裂解上清，Lane3：菌体裂解沉淀，Lane4：0％-10％饱和度时蛋白沉淀，Lane5：10％-20％饱和度时蛋白沉淀，Lane6：20％-25％饱和度时蛋白沉淀，Lane7：25％-30％饱和度时蛋白沉淀。

图712％SDS-PAGE电泳检测DEAE52阴离子交换层析对目的蛋白纯化结果。

Lanel为Protein Marker，Lane2-9：蛋白洗脱峰每8mL取样样品。

图812％SDS-PAGE电泳检测融合蛋白冻干粉复溶结果。

Lanel为Protein Marker，Lane2：冻干粉复溶样品。

图9Western bloting检测融合蛋白中βhCG抗原结果。

Lane1：为蛋白预染Marker，Lane2：纯化后的融合蛋白。

图10Western bloting检测融合蛋白中mGM-CSF抗原结果。

Lane1：为蛋白预染Marker，Lane2：纯化后的融合蛋白。

具体实施方式

材料

(1)菌株和质粒

载体pET-28a-X10-βhCGCTP37，Escherichia coli BL21(DE3)，pET-28a-mGM-CSF和pET-28a-X10-βhCGCTP37质粒均为本实验室保存。

(2)酶和试剂

分子克隆工具酶为Fermentas公司产品；质粒抽提试剂盒为上海生工生物科技有限公司；PCR胶回收试剂盒为上海生工生物科技有限公司的产品。

(3)培养基

LB培养基，配方见参考文献Sambrook J，FristshE F，Maniatis T.MolecularCloning；A Laboratory Manual2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。

本说明书所提及的方法中质粒提取、PCR反应、内切酶酶切、DNA片段的回收、连接和转化大肠杆菌，这些都是基因工程研究领域的常规操作方法，具体参见Sambrook J，FristshE F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。

(4)抗体

兔抗人βhCG单克隆抗体为北京博奥森生物技术有限公司产品，兔抗鼠mGM-CSF单抗为南京因贝生物技术有限公司产品，羊抗兔二抗为武汉博士德生物工程有限公司产品。

实施例1mGM-CSF基因的克隆

本实验根据GeneBank NM_009969.4中mGM-CSF的序列信息设计特异性，利用引物设计软件Oligo分别设计两对引物P1、P2：

P1：5’-CATGCCATGGCACCCACCCGCTCACCCATCAC-3’

P2：5’-GGAATTCGCCACCAGTCGGATCTTTTTGGCTTGGTTT-3’

上游引物P1中引入NcoI酶切位点，下游引物P2中引入EcoR I酶切位点和DPTGG连接肽序列。采用PCR技术从pET-28a-mGM-CSF质粒中克隆得到mGM-CSF的cDNA。

引物由捷瑞测序公司合成。PCR反应在eppendorf PCR扩增仪上进行。P1和P2按1∶1比例混合，于94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min。1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物(参见附图2)，条带位置与预期的403bp一致。

PCR产物经切胶回收获得的目的基因片段和pET-28a-X10-βhCGCTP37载体质粒分别经EcoR I和NcoI双酶切，琼脂糖凝胶电泳分别回收目的基因片段与载体基因片段后用DNA连接酶4℃连接，转化至E.coli BL21感受态细胞后涂布到含50mg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，挑取单菌落，酶切方法初筛阳性克隆，将阳性克隆送至生工测序公司进行测序，测序结果经软件比对后完全正确(参见附图3)。至此融合蛋白基因构建完成。

实施例2mGM-CSF-X10-βhCGCTP37肽基因在大肠杆菌中的表达及培养

重组表达菌以1∶100接种量在液体LB培养基中37℃振荡过夜，再1∶100转接摇瓶大批培养，培养3h后加入终浓度为5mM乳糖诱导表达，诱导4h后收集菌体，留样进行SDS-PAGE分析(参见附图5)。融合蛋白在诱导后4h达到稳定的最大表达量，通过Bandscan软件分析融合蛋白的表达量可达菌体总蛋白量的47.7％，并在胞内以可溶性形式表达。

实施例3融合蛋白的初步分离纯化

挑选高表达量菌株，接种于LB培养基中，37℃过夜培养；过夜培养液转接入LB培养基，37℃扩大培养，选取最优发酵条件获得发酵菌体。8000r/min离心15min，上清及沉淀均留样。pH8.0，50mM的Tris·HCl漂洗菌体沉淀2次；向收集的菌体中加入配制好的菌体裂解液(10mL/g菌体)，反复冻融后进行超声裂解操作，以充分裂解菌体；裂解至溶液不粘滞时取出裂解液，12000r/min离心15min，收集上清及沉淀均留样标记。SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白主要存在于菌体裂解上清中，故可判断融合蛋白为胞内可溶性表达。

取裂解上清于冰浴中边搅拌边加入研细的硫酸铵粉末至相应饱和度，4℃静置30min后12000r/min离心20min，每一级饱和度各取上清和沉淀制备样品，进行SDS-PAGE电泳检测(参见附图6)，结果显示目的蛋白主要在硫酸铵溶液20％至25％饱和度时集中沉淀。取上述沉淀复溶于离子交换缓冲液(25mM Tris·HCl，pH8.0)中，于4℃透析过夜，再于4℃，12000r/min，离心20min，弃沉淀，上清用DEAE-52阴离子交换柱进行进一步分离纯化。

实施例4DEAE-52阴离子交换层析

本实验采用的DEAE-纤维素DE52是弱酸型阴离子交换剂，将DEAE-52用HCl和NaOH分别处理后用蒸馏水将其洗至中性，再将DEAE-52装入层析柱中，层析柱上端进液口连接恒流泵，下出口连接核酸蛋白检测仪，利用离子交换缓冲液(pH8.0，25mM Tris·HCl)进行层析柱的平衡，平衡完毕后以1mL/min的速度进行蛋白溶液的上样操作，上样后重复平衡操作，再用NaCl(0-500mM)进行梯度洗脱，收集洗脱峰留样，进行SDS-PAGE电泳分析(参见附图7)。

实施例5脱盐冻干

收集蛋白纯度较高的洗脱液，4℃对其用蒸馏水透析过夜，将透析后的洗脱液平铺于玻璃平皿中，平放入-20℃冰箱中预先冷冻至固体，再迅速转移至冻干机中-40℃冻干12小时，刮取蛋白干粉冷冻保存。

实施例6融合蛋白的Western blotting鉴定

融合蛋白疫苗中βhCG抗原片段的体外Western blotting鉴定方法如下：将蛋白干粉复溶后制备样品进行SDS-PAGE电泳，至溴酚蓝刚跑出胶板停止电泳，剥胶，切胶至合适大小，根据胶的大小裁剪硝酸纤维素(NC)膜，针对40kDa左右的蛋白，稳流110mA转膜3h，蛋白质转移至NC膜上后，用5％的脱脂牛奶封闭液或5％BSA37℃封闭1h。将NC膜取出后置于杂交袋中，于膜正面加入稀释后的一抗(兔抗人βhCG单克隆抗体)，排气泡，封口，37℃孵育2h，将膜取出，TBST(pH7.6，100mM Tris·HCl，0.9％NaCl，0.1％tween-20)洗三次，每次10min。再用稀释后的二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG)同上孵育1h，TBST洗三次，每次10min，再经水洗10min后，取出NC膜进行DAB显色观察结果。

融合蛋白疫苗中mGM-CSF抗原片段的体外Western blotting鉴定方法同上，所不同的是一抗为兔抗鼠mGM-CSF单克隆抗体。其他试剂及操作事项均与上述方法中的一致。

除上述事实外，本发明还可以有其他实施方式，凡采用等同替换或等效变换性的技术方案，均落于本发明要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种新型融合蛋白mGM-CSF-X10-βhCGCTP37的氨基酸序列为： 

Met Ala ProThr Arg Ser Pro Ile Thr Val Thr Arg Pro Trp Lys His Val Glu Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asn Leu Leu Asp Asp Met Pro Val Thr Leu Asn Glu Glu Val Glu Val Val Ser Asn Glu Phe Ser Phe Lys Lys Leu Thr Cys Val Gln Thr Arg Leu Lys Ile Phe Glu Gln Gly Leu Arg Gly Asn Phe Thr Lys Leu Lys Gly Ala Leu Asn Met Thr Ala Ser Tyr Tyr Gln Thr Tyr Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Asp Cys Glu Thr Gln Val Thr Thr Tyr Ala Asp Phe Ile Asp Ser Leu Lys Thr Phe Leu Thr Asp Ile Pro Phe Glu Cys Lys Lys Pro Gly Gln Lys Asp Pro Thr Gly Gly Glu Phe Ala Arg Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ala Arg Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ala Arg Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ala Arg Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ala Arg Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ala Ser Ala Asp Pro Thr Gly Gly Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro GlnAla 。

2.根据权利要求1所述的mGM-CSF-X10-βhCGCTP37，其特征在于，它包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。 

3.根据权利要求1所述的一种新型融合蛋白mGM-CSF-X10-βhCGCTP37，其特征在于：该多肽的理论分子量为32351.42Da，实际分子量约为38kDa，其N端为mGM-CSF(1-124)，C端为X10(βhCG(109-118)的十段串联重复序列)及βhCG的C末端的37个氨基酸(βhCG-CTP37)，N端和C端之间利用DPTGG柔性肽连接。 

4.一种载体，其特征在于：它含权利要求2所述的核苷酸序列及权利要求3所述的重组方法：将mGM-CSF基因插入本实验室保存的pET-28a-X10-βhCGCTP37载体上，筛选克隆，构成新的融合蛋白基因，该融合蛋白基因位于pET-28a-X10-βhCGCTP37载体T7启动子的下游，这个重组的融合表达质粒称pET-28a-mGM-CSF-X10-βhCGCTP37。 

5.一种基因工程菌，其特征在于：含有权利要求4所述的载体。 

6.包括权利要求4所述的mGM-CSF-X10-βhCGCTP37肽的重组方法，其特征在于：包含抗肿瘤疫苗的抗原表位及分子内佐剂X10和mGM-CSF，具有更强的抗肿瘤功能。 

7.一种mGM-CSF-X10-βhCGCTP37肽的制备方法，其特征在于，该方法包含步骤： 

(I)在适合的表达条件下，培养权利要求5所述的宿主菌 

(II)通过溶菌，超声破碎，硫酸铵分级沉淀，初步分离重组后的融合蛋白；该融合蛋白具有权利要求1所示的mGM-CSF-X10-βhCGCTP37的氨基酸序列 

(III)通过DEAE-52离子交换层析分离出mGM-CSF-X10-βhCGCTP37，该融合蛋白纯度可达SDS-PAGE电泳纯。 

8.根据权利要求1所述的重组多肽的活性，其特征在于：所述的mGM-CSF-X10-βhCGCTP37在体外进行蛋白质免疫印迹实验(Western bloting)，可分别与mGM-CSF单抗和βhCG单抗产生阳性反应，表明该融合蛋白同时具有mGM-CSF和βhCG两种抗原表位，且表位间互不干扰，具备正确的空间构象。 

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的步骤(III)中的mGM-CSF-X10-βhCGCTP37肽同抗原递呈细胞(APC)体外共同培养后，可产生相应的DC疫苗，能促使APC具有较高的装载和处理抗原能力，可提高机体对肿瘤细胞的免 疫应答，达到识别和杀灭肿瘤细胞的目的。 

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